一種乙酰化柚皮苷合成物及在成骨細胞增殖中的醫用用圖
【專利摘要】本發明公開了一種乙酰化柚皮苷合成物(NGA)，本發明還進一步提供了該化合物在小鼠成骨細胞增殖中的應用，提供了一種柚皮苷新產物NGA，以天然產物柚皮苷為底物酶促乙酰化合成的新化合物，能夠顯著促進小鼠正常成骨細胞和經TNF?α誘導損傷的成骨細胞增殖，可以制備促進成骨細胞增殖藥物；本發明合成工藝比較簡單，成本較低，有利于工業化成產。
【專利說明】
一種乙酰化柚皮苷合成物及在成骨細胞増殖中的醫用用途
技術領域
[0001] 本發明公開了一種乙酰化柚皮苷合成物(NGA)，本發明還進一步提供了該化合物 在小鼠成骨細胞增殖中的應用，屬于涉及酶合成和醫藥應用技術領域。
【背景技術】
[0002] 骨代謝是成骨細胞和破骨細胞的動態平衡過程，該平衡的失調將引發骨代謝性疾 病。牙周炎是最常見和多發的口腔骨代謝疾病，我國大部分人患有各種牙周炎，且呈現逐年 上升的趨勢，牙周炎主要的病理改變是牙周袋形成和牙槽骨吸收，導致牙松動甚至脫落。長 期以來，國內外學者一直致力于研究牙槽骨再生和重建方法，然而這些方法雖有一定的應 用價值和前景，但是各自都存在著一定的缺憾。至今，臨床上不能根治牙周炎的主要原因之 一是無效果良好的阻斷牙槽骨吸收或促進牙槽骨再生的藥物，因此尋求一種既費用經濟、 療效顯著而又安全無明顯毒副作用的治療方法十分緊迫。
[0003] 中醫認為骨碎補有明顯鎮靜和鎮痛作用，并可刺激成骨細胞代償性增生，改善成 骨細胞功能，推遲其退行性病變。李順祥等報道指出柚皮苷(Naringin，NG)為骨碎補的主要 有效成分，大量存在于柚、葡萄柚和酸橙及其變種的果皮及果實中，屬于二氫黃酮甙類，黃 酮貳的甙元，為黃酮類化合物，藥理作用廣泛，具有促進骨細胞增殖和分化、抗過敏、抗炎、 抗氧化、降血脂、抑癌等多種藥理活性，藥典規定其含量不少于0.5%。國內外學者在大量的 臨床實踐中，發現柚皮苷能促進小鼠 MC3T3-E1細胞、小鼠原代培養成骨細胞、人原代培養成 骨細胞和人骨髓間充質干細胞等多種成骨細胞的增殖和分化，且對牙周炎等骨代謝疾病的 防治和治療有確實療效。但柚皮苷分子中存在多個酚羥基，脂溶性差，化學性質不穩定，限 制了其生物療效的發揮。于人體功效方面，柚皮苷不易透過雙脂層脂質細胞膜，難以到達靶 向作用點而大大降低其應有的藥物效果。本發明涉及一種乙酰化柚皮苷合成物，通過改變 其分子結構，有效的提高柚皮苷對骨代謝疾病的防治療效。
【發明內容】
[0004] 本發明公開一種乙酰化柚皮苷合成物(縮寫:NGA)，是一種以天然產物柚皮苷為底 物酶促乙酰化合成的新化合物，能夠顯著促進小鼠正常成骨細胞和經TNF-α誘導損傷的成 骨細胞增殖。
[0005] 本發明進一步公開了一種酶促乙酰化柚皮苷合成物的制備方法，適用于工業化大 規模生產。
[0006] 本發明還提供NGA在促進小鼠成骨細胞增殖的醫用用途，一定濃度的NGA對小鼠正 常成骨細胞和經TNF-α誘導損傷的成骨細胞的增殖具有顯著的促進作用。
[0007] 本發明所述的一種酶促乙酰化柚皮苷合成物(NGA)，具有以下結構式：
其化學名稱為:NGA;分子式為:C29H34〇i5;相對分子量為:622.19，核磁鑒定圖譜如圖1、 圖2所示。
[0008] 本發明所述的一種乙酰化柚皮苷合成物的合成方法，包括以下步驟： 將0.05-0.4mmol的柚皮苷溶于20mL丙酮溶液中；再加入2-4mmol的乙酸乙稀酯，混合均 勾后，另加入8〇-120mg CSL( 1 ipase from Candida sp)或Novozym 435 (immobilized lipase B from Candida antarctica)酶，放置于30°C，100rpm恒溫搖床中，保持水活度 0.60，反應24h;反應結束時將酶過濾終止反應并將溶劑旋轉濃縮。
[0009] 本發明所述的一種乙酰化柚皮苷合成物的合成方法，最佳制備工藝如下： 柚皮苷和乙酸乙烯酯的摩爾比為〇. 05:2-0.2:3，反應溶劑為20mL丙酮溶液;混合均勻 后，另加入80-120mg CSL或Novozym 435酶，置于30°C，100rpm恒溫搖床中，保持水活度 0.60，反應24h;反應結束時將酶過濾終止反應并將溶劑旋轉濃縮。
[0010] 本發明所述的一種乙酰化柚皮苷合成物在制備促進成骨細胞增殖藥物中的用途。
[0011] 本發明化合物作為藥效活性成分能夠顯著的促進小鼠成骨細胞的增殖，和未修飾 的柚皮苷母體相比，對正常成骨細胞的增殖，相比提高了 1.5-2.8倍;對經TNF-α誘導損傷的 成骨細胞的增殖，相比提高了 2.5-3.6倍。
[0012] 通過以下實驗驗證本發明的乙酰化柚皮苷合成物能夠顯著的促進小鼠成骨細胞 增殖 首先建立小鼠成骨細胞培養體系，通過柚皮苷和乙酰化柚皮苷對正常成骨細胞及經 TNF-a誘導損傷成骨細胞刺激作用，以觀察對比柚皮苷和乙酰化柚皮苷對成骨細胞增殖的 影響，為乙酰化柚皮苷在成骨損傷組織修復應用上提供實驗依據。因此，選用相同濃度梯度 的柚皮苷和乙酰化柚皮苷對小鼠正常成骨細胞及經TNF-a誘導的成骨細胞進行干預，探索 柚皮苷和乙酰化柚皮苷對小鼠成骨細胞增殖的影響。
[0013] 從實驗MTT法結果中可以看出：低濃度組對成骨細胞的增值無明顯促進作用。中濃 度的柚皮苷和乙酰化柚皮苷對正常成骨細胞以及經TNF-a誘導損傷的成骨細胞增殖都具有 促進作用，且乙酰化柚皮苷的促進作用更顯著。高濃度組僅與實驗對照組相比有顯著性差 異。在正常成骨細胞MTT法結果中發現，lOμg/ml的柚皮苷和乙酰化柚皮苷對正常成骨細胞 的具有促進作用，且和柚皮苷相比，乙酰化柚皮苷對正常成骨細胞的促進作用提高了 1.5-2.6倍。在經TTNF-a誘導損傷的成骨細胞增殖結果中發現，20μg/ml的柚皮苷和乙酰化柚皮 苷對經TTNF-a誘導損傷的成骨細胞增殖具有促進作用，且和柚皮苷相比，乙酰化柚皮苷對 經TTNF-α誘導損傷的成骨細胞促進作用提高了 2.5-3.8倍。可見，經酶促合成的乙酰化柚皮 苷對正常成骨細胞和經TTNF-α誘導損傷的成骨細胞的促進作用都顯著提高，分析原因可能 是由于柚皮苷分子結構的改變，增加了其通過磷脂雙分子層細胞的能力，更好的發揮了體 內生物活性作用。
[0014] 本發明的積極效果在于:提供了一種柚皮苷新產物NGA，以天然產物柚皮苷為底物 酶促乙酰化合成的新化合物，能夠顯著促進小鼠正常成骨細胞和經TNF-α誘導損傷的成骨 細胞增殖，可以制備促進成骨細胞增殖藥物;本發明合成工藝比較簡單，成本較低，有利于 工業化成產。
【附圖說明】
[0015] 圖1、圖2為本發明NGA的核磁鑒定圖譜； 圖3為本發明NGA和NG對小鼠正常成骨細胞的增殖作用對比； 圖4為本發明NGA和NG對經TNF-α誘導損傷的小鼠成骨細胞增殖作用對比。
【具體實施方式】
[0016] 現結合實施例，對本發明做進一步具體說明，但本發明的范圍不限于以下實施例。 [0017] 實施例！ 稱取0.05mmol柚皮苷溶于20mL丙酮溶液中，加入2mmo 1乙酸乙稀酯，混合均勾后，另加 入80mg CSL酶，放置于30° C，lOOrpm恒溫搖床中，保持水活度0.60，反應24h。反應結束時將 酶過濾終止反應并將溶劑旋轉濃縮。利用HPLC分離純化反應產物，分離條件為:Thermo C18 (4.6 mmX250 mm Χ5μηι，Agilent, USA)色譜柱；流動相是水(A)和甲醇（13)，〇-5111；[1140-80%(B)，5-15min維持80%(B)，15-20min 80-40%(B);流速1 ·0 ml/min。柱溫30°C，進樣量為 10 μL;檢測波長為330 nm，乙酰化柚皮苷的保留時間分別為10.8 min，收率為89.0%。經核 磁共振譜儀對產物進行結構鑒定，確定反應合成的該物質為目標產物NGA，分子式為： C29H34O15;相對分子量為:622.19。
[0018] 實施例2 稱取0.2mmol柚皮苷溶于20mL丙酮溶液中，加入4mmol乙酸乙稀酯，混合均勾后，另加入 100mg CSL酶，放置于30° C，lOOrpm恒溫搖床中，保持水活度0.60，反應24h。反應結束時將酶 過濾終止反應并將溶劑旋轉濃縮。利用HPLC分離純化反應產物，分離條件為:Therm 〇 C18 (4.6 mmX250 mm Χ5μηι，Agilent, USA)色譜柱；流動相是水(A)和甲醇（13)，〇-5111；[1140-80%(B)，5-15min維持80%(B)，15-20min 80-40%(B);流速1 ·0 ml/min。柱溫30°C，進樣量為 10 μL;檢測波長為330 nm，乙酰化柚皮苷的保留時間分別為10.8 min，收率為92.6%。經核 磁共振譜儀對產物進行結構鑒定，確定反應合成的該物質為目標產物NGA，分子式為： C29H34O15;相對分子量為:622.19。
[0019] 實施例3 稱取0.4mmo 1柚皮苷溶于2OmL乙腈溶液中，加入6mmo 1乙酸乙稀酯，混合均勾后，另加入 120mg CSL酶，放置于30° C，lOOrpm恒溫搖床中，保持水活度0.60，反應24h。反應結束時將酶 過濾終止反應并將溶劑旋轉濃縮。利用HPLC分離純化反應產物，分離條件為:Therm 〇 C18 (4.6 mmX250 mmX 5μηι，Agilent，USA)色譜柱；流動相是水（A)和甲醇（B)，0_5min 40- 80%(B)，5-15min維持80%(B)，15-20min 80-40%(B);流速1 ·0 ml/min。柱溫30°C，進樣量為 10 μL;檢測波長為330 nm，乙酰化柚皮苷的保留時間分別為10.8 min，收率為92.0%。經核 磁共振譜儀對產物進行結構鑒定，確定反應合成的該物質為目標產物NGA，分子式為： C29H34O15;相對分子量為:622.19。
[0020] 實施例4 稱取0.2mmol柚皮苷溶于20mL丙酮溶液中，加入4mmol乙酸乙稀酯，混合均勾后，另加入 lOOmg Novozym 435酶，放置于30°C，100rpm恒溫搖床中，保持水活度0.60,反應24h。反應結 束時將酶過濾終止反應并將溶劑旋轉濃縮。利用HPLC分離純化反應產物，分離條件為： Thermo C18(4.6 mmX250 mmX5ym, Agilent, USA)色譜柱;流動相是水(A)和甲醇(B)，〇-5min 40-80%(B)，5-15min維持80%(B)，15-20min 80-40%(B);流速 1.0 ml/min。柱溫30°C， 進樣量為10 μL;檢測波長為330 nm，乙酰化柚皮苷的保留時間分別為10.8 min，收率為 91.0%。經核磁共振譜儀對產物進行結構鑒定，確定反應合成的該物質為目標產物NGA，分子 式為:C29H34O15;相對分子量為:622.19。
[0021] 以下試驗表明本發明合成化合物NGA在促進小鼠成骨細胞增殖方面的效果 試驗例1對小鼠正常成骨細胞增殖的促進作用 (1)取對數生長期的小鼠成骨細胞MC3T3-E1至離心管內，調整細胞的濃度為5X104個 細胞/ml，每孔100 μL接種于96孔細胞培養板中，過夜培養，保證細胞狀態良好，貼壁正常； (2 )將原料NG和實施例1 -實施例4合成的化合物NGA，過濾除菌，DMEM培養基稀釋，作用 小鼠正常成骨細胞MC3T3-E1 48 h，每一個實驗組均設置三個重復孔； (3) 藥物作用結束后，無菌條件下加入20 μL MTT溶液，在5% C02培養箱中孵育4小時； (4) 加入150 μL DMS0溶解產生的藍紫色晶體，在492 nm波長條件下測定光吸收值即0D 值； (5) 計算細胞增值率，每個實驗組取三個重復孔的平均值； 試驗結果：與原料NG相比，使用實施例1-實施例4合成的化合物NGA處理正常成骨細胞 48 h后，對正常成骨細胞的增殖均表現為促進作用。結果見圖3。
[0022]結論:實施例1-實施例4合成的化合物NGA與NG原料相比，均可顯著促進正常成骨 細胞的增殖，且實施例2合成的化合物NGA對正常成骨細胞的增殖促進作用最顯著，相比NG 提高了2.6倍。
[0023] 試驗例2 本發明合成化合物NGA對經TNF-α誘導損傷成骨細胞增殖的促進作用 (1)取對數生長期的小鼠成骨細胞MC3T3-E1至離心管內，調整細胞的濃度為5X104個 細胞/ml，每孔100 μL接種于96孔細胞培養板中，過夜培養，保證細胞狀態良好，貼壁正常； (2 )將原料NG和實施例1 -實施例4合成的化合物NGA，過濾除菌，DMEM培養基稀釋，作用 加入TNF-a誘導損傷的小鼠成骨細胞MC3T3-E1 48 h，每一個實驗組均設置三個重復孔； (3) 藥物作用結束后，無菌條件下加入20 μL MTT溶液，在5% C02培養箱中孵育4小時； (4) 加入150 μL DMS0溶解產生的藍紫色晶體，在492 nm波長條件下測定光吸收值即0D 值； (5) 計算細胞增值率，每個實驗組取三個重復孔的平均值； 試驗結果:與原料NG相比，實施例1-實施例4合成的化合物NGA處理TNF-a誘導損傷的成 骨細胞48 h后，對TNF-α誘導損傷的成骨細胞的增殖均表現為促進作用。結果見圖4。
[0024] 結論:實施例1-實施例4合成的化合物NGA與NG原料相比，可顯著促進TNF-α誘導損 傷的成骨細胞的增殖，且實施例2合成的化合物NGA對TNF-a誘導損傷的成骨細胞的增殖促 進作用最顯著，相比NG提高了 3.8倍。
【主權項】
1. 一種乙酷化抽皮巧合成物，具有W下結構式：其化學名稱為:NGA;分子式為:C2訊34〇15;分子量為:622.19。2. 根據權利要求1所述的一種乙酷化抽皮巧合成物的合成方法，包括W下步驟： 將0.05-0.4mmol的抽皮巧溶于20血丙酬溶液中；再加入2-4mmol的乙酸乙締醋，混合均 勻后，另加入80-120mg C化或Novozym 435酶，放置于30°C，100rpm恒溫搖床中，保持水活度 0.60，反應2地;反應結束時將酶過濾終止反應并將溶劑旋轉濃縮。3. 根據權利要求1所述的一種乙酷化抽皮巧合成物的合成方法，最佳制備工藝如下： 抽皮巧和乙酸乙締醋的摩爾比為0.05 : 2-0.2 :3，反應溶劑為20mL丙酬溶液;混合均勻 后，另加入80-120mg C化或Novozym 435酶，置于30°C，100巧m恒溫搖床中，保持水活度 0.60，反應2地;反應結束時將酶過濾終止反應并將溶劑旋轉濃縮。4. 根據權利要求1所述的一種乙酷化抽皮巧合成物在制備促進成骨細胞增殖藥物中的 用途。
【文檔編號】C12P19/60GK106083955SQ201610418761
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月13日 公開號201610418761.8, CN 106083955 A, CN 106083955A, CN 201610418761, CN-A-106083955, CN106083955 A, CN106083955A, CN201610418761, CN201610418761.8
【發明人】閆國棟, 張迪, 蓋彥忻, 王雅妮, 葉緒廷, 姜麗艷, 孟慶繁, 滕利榮
【申請人】吉林大學