一種異黃酮類化合物的制備和用圖
【專利摘要】本發明屬醫藥及天然產物化學領域，具體涉及一種新的異黃酮類化合物及其制備方法和醫療用途。本發明所提供的異黃酮類化合物具有以下結構通式：式中，R1、R2=H；(CH2)nCH3；OR’（R’=H；(CH2)nCH3；1~5個糖基）；1~5個糖基，R3、R4=H；(CH2)nCH3；OR’（R’=H；(CH2)nCH3；1~5個糖基），所述糖基為葡萄糖基或芹菜糖基，n=0~3。本發明的異黃酮類化合物具有顯著的抗氧化活性。
【專利說明】
一種異黃酮類化合物的制備和用途
技術領域
[0001] 本發明屬醫藥及天然產物化學領域，具體涉及一種新的異黃酮類化合物及其制備 方法和醫療用途。
【背景技術】
[0002] 綠豆為豆科植物綠豆(Vigna radiate L.)的干燥成熟種子，具有清熱解毒、燥濕 的功效。可用于吐瀉、斑疹、疔瘡、疥癬等疾病的治療。《本草匯言》中記載用綠豆治療疔毒、 癍疹，金、石、丹、火諸毒及霍亂吐下。目前，并未有綠豆植株的藥理活性及活性物質的相關 報道。
[0003] 異黃酮類化合物在植物界普遍存在，但環氧異黃酮類化合物鮮見報道。目前，從綠 豆植株中發現的新異黃酮化合物為2,3_環氧-2'-羥基大豆素結構，是尚未報道的新化合 物。
[0004] 近年來，硅膠與0DS等填料在天然藥物化學成分的提取、分離純化、制劑工藝改革、 制劑質量分析等方面有了較廣泛的應用研究，并明確顯示出其獨特的作用。利用硅膠與0DS 的相反的吸附功能和物質的相似相容原理可從中藥提取液中分離精制有效成分或有效部 位，最大限度地去粗取精，促進中藥現代化研究的發展。
[0005] 自由基在信號傳導和免疫等方面具有重要的作用，但過多的活性氧自由基就會產 生破壞行為，通過鏈式反應攻擊細胞內或體液中的生物分子，如DNA、脂質、蛋白質等，導致 人體正常細胞和組織的損壞，從而引起多種疾病，如癌癥、衰老和各種心血管疾病。與此同 時，具有自由基清除活性的合成抗氧化劑或天然抗氧化劑已成為國內外各學科領域的研究 熱點，其中對異黃酮類化合物的研究是自由基清除劑研究中的熱門領域。
[0006] 異黃酮及其苷類是一大類天然化學產物，在植物界分布廣泛，從植物中提取的該 類化學產物具有保護心腦血管、抗炎、抗氧化等多種生理活性，它是許多中草藥的主要活性 成分，其中有許多被開發成新型植物藥，如大豆異黃酮，獲得良好效果，但是研究人員仍在 不斷探索，以求獲得更多的該類化合物的活性成份，滿足人們對中草藥日益增多的需求。
【發明內容】
[0007] 本發明的一個目的在于提供一種新的異黃酮類化合物。
[0008] 本發明的另一個目的在于提供上述異黃酮類化合物的制備方法。
[0009] 本發明的再一個目的在于提供該化合物的用途。
[0010] 本發明所提供的異黃酮類化合物，在異黃酮C2、C3位雙鍵被環氧化，生成環氧異黃 酮，即2，3-環氧-異黃酮類化合物，并具有以下結構通式：
[0011]
[0012] 式中，= (CH2)nCH3;OR'（R' =H; (CH2)nCH3; 1~5個糖基）；1~5個糖基R3、R4 =H; (CH2)nCH3;OR'（R' =H; (CH2)nCH3; 1 ~5個糖基）
[0013] 所述糖基為葡萄糖基或芹菜糖基
[0014] n = 0 ~3
[0015] 優選地，辦=出1?2、1?3、1?4=〇1?'（1?'=!〇
[0016] 本發明提供其中一個異黃酮類化合物的結構和名稱，即2,3_環氧-2'-羥基大豆 素，英文名為2.3-eD〇xv_2 ' -hvdroxvdaidzein，其具體結構式如下：
[0017]
[0018] 該化合物具有如下光譜學特征:如表1所示。
[0019] 表1.化合物2，3-環氧-2'-羥基大豆素的h-NMR及13C-NMR及HMBC譜數據
[0020]
[0021]
[0022] FT-ICR-MS數據:對于該化合物來說，其高分辨質譜給出分子離子峰(negative ion mode) :m/z = 285.04021[M_H] -(calcd.for Ci5H9〇6,285.04046，er;r:0.9ppm)，分子式： Cl5Hl〇〇6〇
[0023] 本發明所提供的異黃酮類化合物是從綠豆植株中分離制備，其制備方法具體步驟 如下：
[0024] (1)取綠豆植株的干燥莖枝，用乙醇或甲醇提取，過濾，合并濾液，得醇提液;將醇 提液減壓回收醇至無醇味，得粗提液；
[0025] (2)所獲得的粗提液依次用不同極性有機溶劑萃取，棄去萃取液，再用正丁醇萃 取，合并正丁醇萃取液，減壓回收正丁醇，得綠豆植株提取物；
[0026] (3)所得的綠豆植株提取物，用適量甲醇分散，加入適量硅膠，攪拌均勻，裝入預先 處理好的硅膠柱中，以兩種溶劑混合得到的混合有機溶劑（100:0~0:100)進行梯度洗脫， 收集混合有機溶劑(50:50~30:70)洗脫液，濃縮至濃稠狀，加適量甲醇分散;上開放0DS柱， 以醇-水(0:100~100:0)，優選為醇-水(25:75~40:60)進行梯度洗脫，收集醇-水(30:70~ 35:65)洗脫液，經濃縮得到綠豆異黃酮類化合物；
[0027] (4)所得的綠豆異黃酮類化合物，用制備薄層色譜或制備反相高效液相色譜純化， 得到2，3-環氧-2'-羥基大豆素。
[0028] 步驟(1)中所述的乙醇或甲醇的濃度為30 %~100 %。
[0029] 步驟（1)中所述的提取是用5~20倍量的30 %~100 %乙醇或甲醇閃式提取1~3 次，并合并提取液。
[0030] 步驟(2)中所述的不同極性有機溶劑包括，但不限于:石油醚、環己烷、二氯甲烷、 氯仿、醋酸乙酯。
[0031] 步驟(2)中所述的不同極性有機溶劑、正丁醇的用量為0.5~2倍體積，萃取次數為 1~5次。
[0032]步驟(3)中所述的混合有機溶劑為二氯甲烷-甲醇，或氯仿-甲醇，或二氯甲烷-乙 醇，或氯仿-乙醇。
[0033] 步驟(3)中所述的醇-水為甲醇-水或乙醇-水。
[0034]步驟(4)中所述的制備薄層色譜的條件為:二氯甲烷-甲醇(30:1~10:1)或二氯甲 烷-乙醇(30:1~10:1)或氯仿-甲醇(30:1~10:1)或氯仿-乙醇(30:1~10:1)。
[0035]步驟(4)中所述的制備反相高效液相色譜的條件為:十八烷基硅烷鍵合硅膠(0DS) 為填充劑的色譜柱，以甲醇-水或乙醇-水為流動相，梯度洗脫。
[0036]本發明中，首先采用正相(硅膠)柱色譜分離，再采用反相(開放0DS)柱色譜分離， 制備含該化合物的綠豆異黃酮；最后采用制備薄層色譜或制備反高效相液相色譜進行純 化，得到化合物2，3-環氧-2'-羥基大豆素。
[0037]本發明中，采用硅膠柱色譜分離時，采用干法上樣;采用開放0DS柱色譜分離時，采 用濕法上樣。
[0038]本發明中，所述的異黃酮類化合物的藥理作用是具有顯著的抗氧化活性。
[0039] 本發明中，所得到的異黃酮類化合物具有顯著的清除自由基能力，適用于制備預 防和治療由于體內自由基產生過多或清除自由基能力下降引起的各種疾病的藥物，比如心 臟病、老年癡呆癥、腫瘤和衰老等，尤其適用于預防和治療心血管系統疾病。且其制備原料 來源廣泛，成本低廉，有十分喜人的應用前景。
【附圖說明】
[0040] 圖1為2，3-環氧-2'-羥基大豆素的氫譜圖。
[0041]圖2為2，3-環氧-2'-羥基大豆素的碳譜圖。
[0042]圖3為2，3-環氧-2'-羥基大豆素的HMBC譜圖。
[0043]圖4為本發明實施例2,3環氧-2'-羥基大豆素的提取分離流程圖。
【具體實施方式】
[0044] 以下以具體實施例更具體地說明本發明，但并不意味著限制本發明。
[0045] 實施例一、2,3-環氧I'-羥基大豆素的制備
[0046] 1 ·植物材料:豆科植物綠豆(Vigna radiate L.)的干燥莖枝。
[0047] 2.分離制備方法:綠豆植株干燥莖枝25kg，用10、10倍量的95%乙醇閃式提取2次， 過濾，合并濾液，減壓回收乙醇至無醇味，得濃縮液約5L;分別用石油醚5L、二氯甲烷5L、正 丁醇5L各萃取3次，合并正丁醇萃取液，減壓回收正丁醇，得綠豆植株提取物;將綠豆植株提 取物，用適量甲醇分散，并取適量硅膠拌樣;將拌好的樣品裝入硅膠柱中，采用二氯甲烷-甲 醇（100:0~0:100)梯度洗脫，得到6個流分，取流分4〔二氯甲烷-甲醇(45:55~35:65 )〕，經 開放0DS柱，甲醇-水(25:75~40:60)梯度洗脫得7個流分，取流分4〔甲醇-水(32.5:67.5)〕， 經制備薄層色譜得到該化合物，制備薄層色譜的條件：固定相為硅膠H;展開劑為二氯甲烷-甲醇(20:1)。
[0048] 實施例二、2，3-環氧-27 -羥基大豆素的體外抗氧化活性測試
[0049] 1.儀器:U-1900型分光光度計(Hitachi)，AB135-S型電子天平(Mettler Toledo)， 酶標儀(B 10-RAD)，pH-2TC(0.01級)精密數顯酸度計(上海之信儀器有限公司）。
[0050] 2.試劑:氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KC1)、磷酸二氫鉀(KH2P〇4)、磷酸氫二鉀(K 2HP〇4)、 過硫酸鉀(K2S2〇8)、2,2~連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、抗壞 血酸。
[0051] 實驗所用的2,3_環氧-2^羥基大豆素為發明人自制，其化學結構經氫譜、碳譜、質 譜確定無誤，HPLC純度在98 %以上。
[0052] 3 .實驗方法：用pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液（PBS)配制7mmo 1 /L的ABTS溶液和 2.45mmol/L的過硫酸鉀溶液，將兩種溶液等體積混合，并在室溫下、于黑暗處反應12h，得自 由基正離子(ABTS' + ?溶液。然后用PH7.4的PBS溶液稀釋40倍，稀釋后避光放置30min，在 734nm處測定吸光度為0.71 (可用于抗氧化活性的測試）。用甲醇配制2，3-環氧-2'-羥基大 豆素和抗壞血酸的系列濃度溶液，濃度分別為6mmol/L、3mmol/L、1 · 5mmol/L、0 · 3mmol/L和 0.15mmol/L。將各濃度供試品100yL與3mL的ABTS' + '在室溫下避光放置6min，用酶標儀在 734nm下測定吸光度值As。陰性對照用甲醇代替，用酶標儀在734nm下測定吸光度值A^ABTS '+清除率（％)計算公式如下：
[0053] ABTS.+清除率（％ ) = (1-As/Ac) X 100%
[0054] 用SPSS 17.0軟件計算半數抑制濃度（IC50)。
[0055] 4.測試結果:見表2。
[0056] 表2.化合物2,3_環氧-2'-羥基大豆素體外ABTS'+清除結果
[0057]
[0058]該發明測試結果表明，化合物2,3_環氧-2'-羥基大豆素具有ABTS · +抑制活性，且 活性強于維生素 C。故該化合物具顯著的清除自由基能力，適用于制備治療由于體內自由基 產生過多或清除自由基能力下降引起的各種疾病的藥物，比如心臟病、老年癡呆癥、腫瘤和 衰老等，尤其適用于治療心血管系統疾病，具有良好的應用、開發前景。
【主權項】
1. 具有如下通式的異黃酬類化合物：Ri、R2 = H; (C出)nC出；OR'（R' =H; (C出)nC出；1~5個糖基）；1~5個糖基 R3、R4=Η; (C出)nCH3; OR '（ R ' = Η; (CH2) nC出；1 ~5個糖基） 所述糖基為葡萄糖基或芹菜糖基 n = 0~3〇2. 權利要求1的異黃酬類化合物，其特征在于，Ri二H，R2、R3、R4二OR'，R'二H;(CH2)nCH3， η 二 〇D3. 權利要求1或2的異黃酬類化合物，其特征在于，具有如下結構式：2,3-環氧基大豆素。4. 一種如權利要求3所述化合物的制備方法，其特征在于，包括W下步驟： (1) 綠豆植株粗提液的制備：取綠豆植株適量，用乙醇或甲醇提取，過濾，合并濾液，得 醇提液，將醇提液減壓回收醇至無醇味，得粗提液； (2) 綠豆植株提取物的制備:取綠豆植株粗提液，依次用不同極性有機溶劑萃取，棄去 萃取液，再用正下醇萃取，合并正下醇萃取液，減壓回收正下醇，得綠豆植株提取物； (3) 綠豆異黃酬類化合物的制備:所得的綠豆植株提取物，用適量甲醇分散，加入適量 硅膠，攬拌均勻，裝入預先處理好的硅膠柱中，W兩種溶劑混合得到的混合有機溶劑100:0 ~0:100進行梯度洗脫，收集混合有機溶劑50 :50~30: 70洗脫液，濃縮至濃稠狀，加適量甲 醇分散;上開放0DS柱，W醇-水0:100~100:0，優選為醇-水25:75~40:60進行梯度洗脫，收 集醇-水30:70~35:65洗脫液，經濃縮得到綠豆異黃酬類化合物； (4) 環氧異黃酬化合物的制備:取得到的綠豆異黃酬類化合物，經制備薄層色譜或制備 反相高效液相色譜純化，得到高純度的2,3-環氧基大豆素。5. 如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟（1)中采用5~20倍量的30%~ 100%乙醇或甲醇提取1~3次，并合并提取液。6. 如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，先用0.5~2倍體積石油酸或 環己燒萃取1~5次后，再用0.5~2倍體積二氯甲燒或氯仿或醋酸乙醋萃取1~5次，最后用 0.5~2倍體積的正下醇萃取1~5次。7. 如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中所述的混合有機溶劑梯度洗 脫，其混合有機溶劑為二氯甲燒-甲醇，或氯仿-甲醇，或二氯甲燒-乙醇，或氯仿-乙醇，所述 的醇-水梯度洗脫中，其醇-水為甲醇-水或乙醇-水。8. 如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)中，制備薄層色譜的條件為:薄 層板為硅膠Η或硅膠G板;展開劑為二氯甲燒-甲醇(30:1~10:1)，或二氯甲燒-乙醇(30:1~ 10:1)，或氯仿-甲醇(30:1~10:1)，或氯仿-乙醇(30:1~10:1)，制備反相高效液相色譜的 條件為：色譜柱填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠，W甲醇-水或乙醇-水為流動相，梯度洗 脫。9. 一種藥物組合物，包含權利要求1-3任何一項所述的異黃酬類化合物和藥學上可接 受的載體。10. 權利要求1-3任何一項所述的異黃酬類化合物或權利要求9所述的藥物組合物在制 備用于預防和治療由于體內自由基產生過多或清除自由基能力下降引起的各種疾病的藥 物中的應用。11. 如權利要求10所述的應用，其特征在于，所述的由于體內自由基產生過多或清除自 由基能力下降引起的各種疾病包括:屯、臟病、老年癡呆癥、腫瘤或衰老癥。
【文檔編號】A61P9/00GK106083874SQ201610405184
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月8日
【發明人】于治國, 趙云麗, 白巖
【申請人】沈陽藥科大學