氯普噻噸的藥物組合物及對腦缺血再灌注損傷的保護作用

氯普噻噸的藥物組合物及對腦缺血再灌注損傷的保護作用
【專利摘要】本發明公開了氯普噻噸的藥物組合物及對腦缺血再灌注損傷的保護作用，本發明提供的氯普噻噸的藥物組合物中含有氯普噻噸和一種從南沙參中分離得到的結構新穎的天然產物化合物(Ⅰ)，氯普噻噸和該天然產物單獨作用時，可以降低腦缺血再灌注損傷；二者聯合作用時，對腦缺血再灌注損傷的防治作用更優，可以開發成防治腦缺血再灌注損傷的藥物，與現有技術相比具有突出的實質性特點和顯著的進步。
【專利說明】
氯普喔喃的藥物組合物及對腦缺血再灌注損傷的保護作用
技術領域
[0001] 本發明屬于生物醫藥領域，設及氯普嚷噸的新用途，具體設及氯普嚷噸的藥物組 合物及其對腦缺血再灌注損傷的保護作用。
【背景技術】
[0002] 氯普嚷噸為反式-2-氯-9-(3-二甲胺基亞丙基)硫雜蔥，是一種硫雜蔥類抗精神病 藥，具有鎮靜和抗嘔吐作用。臨床主要用于治療精神分裂癥、躁狂癥與反應性精神病，W及 伴有興奮或情感障礙的其他精神失常。適用于伴有焦慮或焦慮性抑郁的精神分裂癥、神經 官能癥及更年期抑郁癥。
[0003] 迄今為止，尚未見氯普嚷噸及其藥物組合物與腦缺血再灌注損傷的相關性報道。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的在于提供一種氯普嚷噸的藥物組合物，該藥物組合物中含有氯普嚷 噸和一種從草本中分離得到的結構新穎的天然產物，氯普嚷噸和該天然產物可W協同治療 腦缺血再灌注損傷。
[0005] 本發明的上述目的是通過下面的技術方案得W實現的：
[0006] -種具有下述結構式的化合物(I)，
[0007]
[000引一種氯普嚷噸的藥物組合物，包括氯普嚷噸、如上所述的化合物（I)和藥學上可W 接受的載體。
[0009]如上所述的化合物（I)的制備方法，包含W下操作步驟：（a)將南沙參粉碎，用60~ 70%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油酸、乙酸乙醋和水飽和的正 下醇萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取物；（b)步驟(a)中正下醇 萃取物用大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫12個柱體積，再用70%乙醇洗脫15個柱體積，收 集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（C)步驟(b)中70%乙醇洗脫濃縮物用正 相硅膠分離，依次用體積比為50:1、25:1、15:1和5:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到4個組 分；（d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為10:1、5:1和2:1的二氯甲 燒-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離， 用體積百分濃度為70 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集7~13個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃 縮得到化合物(I)。
[0010] 進一步地，步驟(a)中用65%乙醇熱回流提取，合并提取液。
[0011] 進一步地，所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。
[0012] 如上所述的化合物(I)在制備治療腦缺血再灌注損傷的藥物中的應用。
[0013] 如上所述的氯普嚷噸的藥物組合物在制備治療腦缺血再灌注損傷的藥物中的應 用。
[0014] 本發明的優點：
[0015] 本發明提供的氯普嚷噸的藥物組合物中含有氯普嚷噸和一種從草本中分離得到 的結構新穎的天然產物，氯普嚷噸和該天然產物單獨作用時，可W降低腦缺血再灌注損傷； 二者聯合作用時，對腦缺血再灌注損傷的防治作用更優，可W開發成防治腦缺血再灌注損 傷的藥物。
【具體實施方式】
[0016] 下面結合實施例進一步說明本發明的實質性內容。
[0017] 實施例1:化合物(I)分離制備及結構確證
[0018] 分離方法：（a)將南沙參(2kg)粉碎，用65%乙醇熱回流提取(2化X3次），合并提取 液，濃縮至無醇味（化），依次用石油酸(化X3次）、乙酸乙醋（化X3次）和水飽和的正下醇 (化X3次）萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取物；（b)步驟(a)中 正下醇萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫12個柱體積，再用70%乙醇洗脫 15個柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（C)步驟(b)中70%乙醇洗 脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為50:1(8個柱體積）、25:1(8個柱體積）、15:1(8個 柱體積)和5:1(10個柱體積)的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到4個組分；（d)步驟(C)中組分4 用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為10:1(8個柱體積）、5:1(10個柱體積)和2:1巧個柱 體積)的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的 反相硅膠分離，用體積百分濃度為70%的甲醇水溶液等度洗脫，收集7~13個柱體積洗脫 液，洗脫液減壓濃縮得到化合物（I) (455mg，HPLC歸一化純度大于98 % )。
[0019] 結構確證:淡黃色無定形粉末，皿斗51-15顯示^+扣+為111八441.2598，結合核磁 特征可得分子式為C27曲6〇5，不飽和度為10。核磁共振氨譜數據SH(ppm，C030D，500MHz):H-1 (6.76，br，s)，H-4(5.96，s)，H-5(5.38，s)，H-8(3.18，m)，H-9(5.82，d，J=15.8Hz)，H-9 (5.94，d，J = 15.8Hz)，H-10(2.67，d，J=11.4Hz)，H-ll(2.08，m)，H-12(1.53，m)，H-12 (2.29，m)，H-13(4.01，tt，J=11.4,4.5Hz)，H-14(2.41，dd，J=13.4，11.3Hz)，H-14(2.85， m)，H-16(1.02，d，J = 6.7Hz)，H-18(2.81，m)，H-18(3.27，dd，J=17.1，1.9Hz)，H-20(2.64， m)，H-21(1.34，m)，H-21(1.67，m)，H-22(1.20，m)，H-22(1.26，m)，H-23(1.24，m，2H)，H-24 (1.24，m，2H)，H-25(1.25，m，2H)，H-26(0.88，t，J = 7.2Hz)，H-27(1.21，d，J = 7.2Hz);核磁 共振碳譜數據 Sc(ppm，CD3〇D，125MHz): 143.3(CH，1-C)，156.6(C，3-C)，110.8(CH，4-C)， 144.2(C，4a-C)，107.3(CH，5-C)，199.8(C，6-C)，149.4(C，7-C)，37.6(CH，8-C)，120.3(C， 8a-C)，130.2(CH2,9-C) ,62.1(CH，10-C),30.1(CH，11-C)，42.6(C出，12-C)，68.5(CH，13-C)， 50.8(C出，14-C),204.1(C，15-C)，20.3(CH3，16-C),51.1(CH2，18-C)，206.3(C，19-C),46.3 (CH，20-C)，32.7(ai2,21-C)，27.6(CH2,22-C)，29.0(CH2,23-C)，31.3(CH2,24-C)，22.2(ai2， 25-C)，14.2(C 出，26-C)，16.6(C 曲，27-C)。紅外波譜中的 1710cm-i 吸收帶與 UV 譜中的 224nm 吸收帶表明該化合物含有α，0-不飽和幾基結構，紅外波譜中的3537cnfi吸收帶表明存在徑 基。Uc-NMR、DEPT和HSQC譜中顯示有27個碳信號，包括Ξ個甲基，九個亞甲基(一個締控碳）， 八個次甲基(一個連氧碳，Ξ個締控碳），W及屯個季碳(Ξ個幾基碳和四個締控碳），W上功 能結構再結合不飽和數表明該化合物為Ξ環結構。iH-NMR譜結合HSQ幻普顯示Ξ個甲基質子 信號 δκ 1.02(3H，d，J = 6.5Hz)、0.88(3H，t，J = 7.2Hz)、1.21(3H，d，J = 7.2Hz)，八組亞甲基 質子信號δκ 2.29(lH，m)與 1.53(lH，m)、2.85(lH，m)與2.41(lH，dd，J=13.4，11.3Hz)、3.27 (lH，dd，J=17.1，1.9Hz)與2.81(lH，m)、1.77(lH，m)與1.34(lH，m)、1.26(lH，m)與1.20(1H， m)、1.24(2H，m)、1.24(2H，m)、1.25(2H，m)，一對端締控質子信號δκ 5.82( 1H，J= 15.8Hz)與 5.94( 1H，J= 15.8Hz)，Ξ個締控質子信號δκ 6.81(lH，s)、6.05(lH，s)、5.38(lH，s)，四個次 甲基質子信號δκ 3.18(lH，m)、2.67(lH，d，J= 11.4Hz)、2.08(lH，m) ,2.64(lH，m)，一個連氧 次甲基質子信號δκ 4.01(lH，tt，J=11.4,4.5Hz)DiH-iH COSY譜中存在H-lO/H-11/出-12/ H-13/出-14、出-27/護20/出-21/出-22/出-23/出-24/出-25/出-26相關信號，結合HMBC譜中顯 示的 H-1 與 C-4a、C-8a 和 C-8，H-4 與 C-3、C-4a 和 C-8a，H-5 與 C-4、C-4a 和 C-6，H-10 與 C-3、C- 1UC-15 和 C-16,出-12 與 C-11、C-13、C-14 和 016，此-14 與 C-12、C-13 和 015，此-18 與 C-8 和 C-19，H-20與C-19相關信號，通過上述NMR譜中的相關信息可W構建該化合物的連接方式， 并且根據上述波譜數據確認該化合為Cohaerin衍生物。綜合氨譜、碳譜、HMB幻普和R0ESY譜， W及文獻關于相關類型核磁數據，可基本確定該化合物如下所示，立體構型進一步通過ECD 試驗確定，理論值與實驗值基本一致。化學結構式及碳原子編號如下：
[0020]
[0021] 實施例2:對大鼠腦缺血再灌注損傷模型的防治作用
[0022] 1、材料與方法
[0023] 1.1 動物
[0024] 60只成年健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，SPF級，體重280-300g，由北京維通 利華實驗動物技術有限公司提供。實驗過程中大鼠的飼養環境穩定，室溫(25±2)°C，相對 濕度(55 ± 5) %，燈光控制1化晝夜交替。
[00巧]1.2試劑與樣品
[0026] 氯普嚷噸購自上海極威生物科技有限公司。化合物（I)自制，制備方法見實施例1。 依達拉奉注射液（國藥集團國瑞藥業有限公司）。兔抗鼠 GFAP抗體，兔抗鼠 Iba 1抗體購自 Ve C tor公司；兔抗鼠 TNF-a抗體、兔抗鼠 IL-1 β、兔抗鼠 VCAM-1抗體、兔抗鼠 I CAM-1抗體購自 San-ta-Cruz;辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG購自美國Pierce Biotechnology公司。
[0027] 1.3 儀器
[0028] SZX16型顯微鏡（日本Olympus公司）；冰凍切片機(萊卡，德國）；化werGen 125型組 織勻漿機(塞默飛世爾公司）;GS-15R離屯、機(Beckinan公司，美國）。
[0029] 1.4動物分組與給藥
[0030] 60只成年健康雄性SD大鼠，隨機分為假手術組、缺血再灌注模型組、伊達拉奉給藥 組（3mg · kg^)、氯普嚷噸組（20mg · kg^)、化合物（I)組（20mg · kg^)、氯普嚷噸與化合物 (I)組合物組【lOmg · kg-i氯普嚷噸+10mg · kg-i化合物（I)】，每組10只。各組分別于再灌注 即刻由尾靜脈注射給藥，假手術組與模型組分別給予2ml生理鹽水。
[0031] 1.5MCA0法建立大鼠腦缺血/再灌注模型
[0032] SD大鼠術前1化禁食，10%水合氯醒(350mg · kg-i)腹腔注射麻醉，仰邸位固定。參 照Longa等的大腦中動脈線栓法，造成左側大腦中動脈阻塞。缺血化后，將栓線向外拉出至 頸內實現再灌注。假手術組只進行術前麻醉和血管分離術，不結扎及導入線栓。
[0033] 1.6神經功能缺損評分
[0034] 再灌注24h后進行大鼠神經行為學觀察。參照Longa等的5級4分制：0分，無神經功 能缺失癥狀;1分，不能完全伸展對側前爪;2分，爬行時出現對側轉圈；3分，行走時向對側傾 倒;4分，不能自發行走，意識喪失。
[0035] 1.7Western Blot檢測TNF-a、比-ie、VCAM-l、ICAM-l的表達
[0036] 動物行I/R手術24h后，4%多聚甲醒灌注固定，斷頭取腦，冠狀切取前畫前1.0mm至 前畫后3.0111111的腦組織，進行勻漿。在冰上加蛋白裂解液裂解，然后在4°(：下1200化-111山-1離 屯、5min，進行蛋白含量的測定，SDS-PAGE電泳，轉膜，封閉，TNF-a(l:500)，IL-ie(l:200)， VCAM-1 (1:200)、ICAM-1 (1:200)-抗4°C 下解育2地后TBST洗涂3次;二抗37°C解育化，ECL化 學發光，暗室顯影，定影，對膠片進行掃描與拍照并進行分析。
[0037] 1.8統計學方法
[0038] 實驗數據用SPSS 11.5統計軟件分析，所得結果Wx±s表示，組間均數的比較采用 t檢驗，2組W上均數的比較采用方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。
[0039] 2實驗結果
[0040] 2.1對腦缺血再灌注大鼠神經癥狀學的影響
[0041 ] 再灌注2地，各組大鼠無死亡，模型組大鼠表現出嚴重的神經功能缺損(P<0.01)， 而化合物（I)組、氯普嚷噸組、依達拉奉組均能顯著降低缺血再灌注造成的神經損害（P< 0.05，P<0.05，P<0.05)，氯普嚷噸和化合物（I)組合物組效果更顯著，P<0.01。結果見表1。
[0042] 表1對腦缺血再灌注大鼠神經癥狀學的影響
[0043]

[0044] 2.2對腦缺血再灌注大鼠 TNF-α、比-ie、VCAM-l、ICAM-1表達的影響
[0045] 腦缺血/再灌注24h后，缺血區皮層組織中細胞因子TNF-a、IL-li3W及黏附分子 ￥〔八1-1、1〔41-1蛋白表達顯著增加，氯普嚷噸組、化合物（1)組于缺血后早期給藥對于了^- α、比-10、￥〔41-1、1〔41-1的表達均有不同程度的抑制作用，均具顯著差異。<〇.〇5);氯普嚷 噸與化合物（I)組合物組進一步抑制各蛋白的表達(Ρ<〇.01)，效果更為顯著。結果見表2。
[0046] 表2各組大鼠腦組織中TNF-a、比-ie、VCAM-l、ICAM-l蛋白表達量 Γ00471
~W上結果表明，氯普嚷噸和化合物（I)均能明顯提高腦缺血再灌注大鼠的神經功I 能評分及明顯降低炎性細胞因子TNF-a、化-1β和黏附分子VCAM-1、ICAM-1的表達水平，兩者 合用效果優于單用，可W開發成為保護腦缺血再灌注損傷的藥物。
[0049]上述實施例的作用在于說明本發明的實質性內容，但并不W此限定本發明的保護 范圍。本領域的普通技術人員應當理解，可W對本發明的技術方案進行修改或者等同替換， 而不脫離本發明技術方案的實質和保護范圍。
【主權項】
1. 一種具有下述結構式的化合物（I)，2. -種氯普嚷噸的藥物組合物，其特征在于:包括氯普嚷噸、如權利要求1所述的化合 物(I)和藥學上可W接受的載體。3. 權利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于，包含W下操作步驟：（a)將南 沙參粉碎，用60~70%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油酸、乙酸乙 醋和水飽和的正下醇萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取物；（b) 步驟(a)中正下醇萃取物用大孔樹脂除雜，先用10 %乙醇洗脫12個柱體積，再用70 %乙醇洗 脫15個柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（C)步驟(b)中70%乙醇 洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為50:1、25:1、15:1和5:1的二氯甲燒-甲醇梯度 洗脫得到4個組分；（d)步驟(C)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為10:1、5:1 和2:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的 反相硅膠分離，用體積百分濃度為70%的甲醇水溶液等度洗脫，收集7~13個柱體積洗脫 液，洗脫液減壓濃縮得到化合物(I)。4. 根據權利要求3所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)中用65%乙醇熱 回流提取，合并提取液。5. 根據權利要求3所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為AB-8型 大孔吸附樹脂。6. 權利要求1所述的化合物（I)在制備治療腦缺血再灌注損傷的藥物中的應用。7. 權利要求2所述的氯普嚷噸的藥物組合物在制備治療腦缺血再灌注損傷的藥物中的 應用。
【文檔編號】A61K31/382GK106083800SQ201610408807
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月13日
【發明人】不公告發明人
【申請人】崔坤峰