卡比多巴的藥物組合物及其治療肝癌的醫藥用圖
【專利摘要】本發明公開了卡比多巴的藥物組合物及其治療肝癌的醫藥用途，本發明提供的卡比多巴的藥物組合物中含有卡比多巴和一種從羌活的干燥根及根莖中分離得到的結構新穎的天然產物化合物(Ⅰ)，卡比多巴和該天然產物單獨作用時，對肝癌具有治療效果；二者聯合作用時，對肝癌的治療效果進一步提高，可以開發成治療肝癌的藥物，與現有技術相比具有突出的實質性特點和顯著的進步。
【專利說明】
卡比多己的藥物組合物及其治療肝癌的醫藥用途
技術領域
[0001] 本發明屬于生物醫藥領域，設及卡比多己的新用途，具體設及一種卡比多己的藥 物組合物及其治療肝癌的醫藥用途。
【背景技術】
[0002] 卡比多己為(s)-a-甲基-α-阱基-3,4-二徑基苯丙酸一水合物。
[0003] 卡比多己具有較強的外周多己脫簇酶抑制劑。不易透過血腦屏障，與左旋多己合 用時，僅抑制外周多己脫簇酶的活性，減少多己胺在外周組織的生成，減輕其外周不良反 應，進而使進入中樞的左旋多己增多，提高腦內多己胺的濃度，增強左旋多己的療效，所W 是左旋多己的重要輔助用藥。卡比多己單用無效，臨床上通常將卡比多己與左旋多己按1: 10或1:4比例配伍制成復方制劑。
[0004] 迄今為止，尚未見卡比多己及其藥物組合物與肝癌的相關性報道。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種卡比多己的藥物組合物，該藥物組合物中含有卡比多 己和一種從弟活的干燥根及根莖中分離得到的結構新穎的天然產物，卡比多己和該天然產 物可W協同治療肝癌。
[0006] 本發明的上述目的是通過下面的技術方案得W實現的：
[0007] -種具有下述結構式的化合物(I)，
[000引
[0009] -種卡比多己的藥物組合物，包括卡比多己、如上所述的化合物（I)和藥學上可W 接受的載體。
[0010] 如上所述的化合物（I)的制備方法，包含W下操作步驟：（a)將弟活的干燥根及根 莖粉碎，用65~85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油酸、乙酸乙醋 和水飽和的正下醇萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取物；（b)步 驟(a)中正下醇萃取物用大孔樹脂除雜，先用6%乙醇洗脫8個柱體積，再用70%乙醇洗脫8 個柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（C)步驟(b)中70%乙醇洗脫 濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為50:1、25:1、15:1和5:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫 得到4個組分；（d)步驟(C)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為10:1、5:1和2:1 的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相 硅膠分離，用體積百分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個柱體積洗脫液，洗 脫液減壓濃縮得到化合物(I)。
[0011] 進一步地，步驟(a)中用75%乙醇熱回流提取，合并提取液。
[0012] 進一步地，所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。
[0013] 如上所述的化合物(I)在制備治療肝癌的藥物中的應用。
[0014] 如上所述的卡比多己的藥物組合物在制備治療肝癌的藥物中的應用。
[001引本發明的優點：
[0016] 本發明提供的卡比多己的藥物組合物中含有卡比多己和一種從弟活的干燥根及 根莖中分離得到的結構新穎的天然產物，卡比多己和該天然產物單獨作用時，對肝癌具有 治療效果;二者聯合作用時，對肝癌的治療效果進一步提高，可W開發成治療肝癌的藥物。
【具體實施方式】
[0017] 下面結合實施例進一步說明本發明的實質性內容，但并不W此限定本發明保護范 圍。盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可W對 本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和范圍。
[0018] 實施例1:化合物(I)分離制備及結構確證
[0019]分離方法：（a)將弟活的干燥根及根莖(3kg)粉碎，用75%乙醇熱回流提取(20LX3 次），合并提取液，濃縮至無醇味(化），依次用石油酸(化X3次）、乙酸乙醋(化X3次)和水飽 和的正下醇(化X3次)萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取物；（b) 步驟(a)中正下醇萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，先用6%乙醇洗脫8個柱體積，再用70%乙 醇洗脫8個柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（C)步驟(b)中70% 乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為50 :1 (8個柱體積）、25 :1 (8個柱體積）、 15:1(8個柱體積)和5:1(10個柱體積)的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到4個組分；（d)步驟(C) 中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為10:1(8個柱體積）、5:1(10個柱體積)和2: 1(5個柱體積）的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基娃 燒鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個柱體 積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物（I) (375mg，HPLC歸一化純度大于98 % )。
[0020] 結構確證:無色結晶，皿斗51-15顯示^+扣+為111八377.2289，結合核磁特征可得 分子式為C22H32O日，不飽和度為7。核磁共振氨譜數據SH(ppm，pyridine-d日，500MHz): H-1 (6.46，dd，J = 4.8，10.細z)，H-2a(3.39，m)，H-化（3.10，m)，H-3(6.85，m)，H-5a(3.23，d，J = 15.細 z)，H-5b(2.98，dd，J=15.6,9.3Hz)，H-6C.06，dd，J = 9.3，1.4Hz)，H-7(1.87，m)，H-8 (1.46，m)，H-9a(2.13，dd J=16.1，2.6Hz)，H-9b(1.67，dd，J=16.1，7.3Hz)，H-lia.80， m)，H-12(0.93，d，J = 5.7Hz)，H-13(1.13，d，J = 5.7Hz)，H-14(1.19，d，J = 6.Wz)，H-2' (2.82，m)，H-3'（5.26，m)，H-4'（1.23，d，J = 6.3Hz)，H-5'（1.09，d，J = 7.1Hz)，H-2"(1.97， s);核磁共振碳譜數據扣(卵m，pyridine-d日，125MHz) :132.4(CH，1-C)，29.6(邸2,2-0131.7 (CH，3-C)，132.4(C，4-C)，28.3(afe，5-C)，77.4(CH，6-C)，52.7(CH，7-C)，22.4(CH，8-C)， 32.5(afe，9-C)，158.6(C，10-C)，26.4(CH，ll-C)，22.1(ai3，12-C)，23.8(CH3，13-C)，18.4 (C 曲，14-C)，171.2(C，15-C)，204.6(C，r-C)，47.6(CH，2'-C)，72.4(CH，3'-C)，17.3(Ol3， 4'-〇，12.7(邸3,5'-〇，170.3似1"-〇,21.4(咖，2"-〇。紅外波譜中的1756畑1-1吸收帶與 UV譜中的236nm吸收帶表明該化合物含有α，β-不飽和內醋結構，紅外波譜中的1715cnfi與 1680cm-i吸收帶表明結構中存在酬基與雙鍵片段。i3C-NMR、DEPT和HSQC譜中顯示有22個碳 信號，包括六個甲基，Ξ個亞甲基，八個次甲基(兩個連氧碳和兩個締控碳），W及五個季碳 (Ξ個幾基碳和兩個締控碳），W上功能結構再結合不飽和數表明該化合物為雙環結構。iH- NMR譜結合HSQC譜顯示五個甲基質子信號δκ 0.93(3H，d，J = 5.7Hz)、1.13(3H，d，J = 5.7Hz)、1.19(3H，d，J = 6.細z)、1.23(3H，d，J = 6.3Hz)、1.09(3H，d，J = 7.1Hz)，一個乙酷基 甲基質子信號δκ 1.97(3H，s)，兩個締控質子信號δH6.46αH，dd，J = 4.8，10.細z)與6.85 (lH，m)，兩個連氧次甲基質子信號 δκ 5.06( lH，dd，J = 9.3,1.4Hz)與 5.26( 1Η，πιΚ1η-1η COSY譜中存在Η-1/Η2-2/Η-3、出-5/護6/護7/護8/出-9、護7/護11/出-12、護11/出-13、^及護 8/出-14相關信號，結合HMBC譜中顯示的出-2和出-9與C-1，出-2、出-5和H-6與C-4相關信號可 W構建吉馬燒型倍半祗骨架。而1H-1h COSY譜中出-5 7H-2 7H-3 7出-4'相關信號與HMBC譜 中H-2 '與C-r、C-3 '和C-5 '，H-3 '與C-2 '、C-4 '和C-r W及曲-2"與C-r相關信號可W構建 另一部分片段，并且運一部分結構中存在的乙酷基通過氧原子與C-3'相連。另外HMB村普中 H-3、此-5和H-6與C-15相關信號暗示C-6與C-15之間存在一個內醋環結構。N0ESY譜中，假設 H-8為β構型，那么H-8與H-10的相關信號表明H-10也為β構型，因此，0-3'-0-乙酷基-2'-甲 基下酬基應該為α構型。此外H-9b與Η-8存在相關信號，所WH-9a與H-2a W及H-9a與H-5a相 關信號可判斷判斷H-2a、H-5a、H-9a皆為α構型，同時H-2a與H-5a相關信號表明Δ3(4)雙鍵為 Ε構型。綜合氨譜、碳譜、ΗΜΒ幻普和N0ESY譜，W及文獻關于相關類型核磁數據，可基本確定該 化合物如下所示，立體構型進一步通過ECD試驗確定，理論值與實驗值基本一致。碳原子編 號如下：
[0021]
ο
[0022] 實施例2:對肝癌的治療作用
[0023] 1、材料和方法
[0024] 1.1細胞及動物
[0025] 實驗室符合DB44/61-94清潔級標準。人肝癌細胞株Be^7402來源于廣州醫學院微 生物免疫學教研室。裸鼠（BALB/C-nu/nu)由南方醫科大學實驗動物中屯、提供，雄性，鼠齡4- 6周，體質量20-25g，平均(23.28 ± 1.62)飼養于SPF環境中。
[0026] 1.2試劑與樣品
[0027] 卡比多己購自中國藥品生物制品檢定所。化合物（I)自制，制備方法見實施例1。卡 比多己、化合物(I)及其組合物先用少量DMS0超聲溶解，再用純化水溶解稀釋灌胃。
[002引1.3小鼠分組及模型制備
[0029] 移植瘤裸鼠動物模型復制:將凍存于液氮罐中肝癌細胞株Bel-7402取出，復蘇，體 外培養于RPM11640中，加入體積分數為0.1的小牛血清，青霉素10萬單位/L，鏈霉素 lOOmg/ L，單層培養于C〇2恒溫解育箱內，細胞為上皮樣貼壁生長，每兩Ξ天傳代1次，取對數生長期 細胞用于實驗。用體積分數為0.1的小牛血清的RPM11640培養液稀釋細胞至含瘤1 X 1010L -1，在裸鼠左前上肢蔽窩皮下接種0.2血。
[0030] 分組:24只接種肝癌細胞株的裸鼠單純隨機分成正常對照組、卡比多己組（lOmg· kg-i)、化合物（I)組（lOmg · kg-i)、卡比多己與化合物（I)組合物組【5mg · kg-i卡比多己+ 5mg · kg-i化合物(I)】，共4組。所有裸鼠自接種肝癌細胞株第3天起開始灌胃給藥，正常對照 組為等量生理鹽水灌胃，隔日1次，灌胃20次。停藥1周后，脫頸處死:完整取出瘤塊，檢測瘤 體質量。按W下公式計算腫瘤抑制率：
[0031] 腫瘤抑制率=(對照組平均瘤質量-給藥組平均瘤質量）/對照組平均瘤質量X 100%。
[0032] 1.4微血管密度的測定
[0033] 采用二步法染色:標本經甲醒固定后，進行3um連續切片:將石蠟切片脫蠟至水:高 壓煮沸抗原修復3min，體積分數為0.03的H202室溫解育lOmin，滴加兔抗人第Μ因子相關抗 體，4攝氏度過液，滴加1:200生物素標記的羊抗兔I gG，37攝氏度解育30min，二氨基聯苯胺 顯色5min，W0.01mol/L憐酸鹽緩沖液代替一抗作為空白對照，W血管瘤為陽性對照。微血 管密度的測J 定參照 C1 inica 1 importance of the determination of tumor angiogenesisin breast carcinoma：much more than a new prognostictool的方法。在 低倍視野下檢查微血管染色情況：W新生血管內皮染為棟黃色為陽性判定標準，取癌巢間 質血管最多的視野，在200倍視野下，按雙盲法由3位觀察者分別計數3個視野:觀察染成棟 色的單個細胞和細胞叢，并W此作為一個血管:血管腔和腔內紅細胞不作為計數，如有肌層 的血管或管腔巧0著者應排除，取3人計數平均值作為該例的微血管密度。
[0034] 1.5裸鼠生存質量評價
[0035] 通過裸鼠精神狀態、活動狀況、對刺激的反應、體質量下降幅度、食欲和尿、便6項 指標的觀察，評價裸鼠生存質量和藥物毒副反應。
[0036] 1.6統計學分析
[0037] 由本課題組應用SPSS11.0軟件進行統計學處理，腫瘤抑制率、微血管密度均值采 用F分析進行組間比較，P<0.05為具有統計學意義。
[0038] 2、實驗結果
[0039] 2.1對肝癌移植瘤裸鼠生存質量的影響
[0040] 治療方案結束時：卡比多己與化合物（I)組合物組6只裸鼠均存活：卡比多己組和 化合物（I)組有5只存活，正常對照組只有4只存活。所有死亡裸鼠均已解剖排除了由于實驗 操作不當致死的可能，裸鼠死亡是由腫瘤本身惡化或藥物毒副反應所致。
[0041] 卡比多己與化合物（I)組合物組裸鼠精神狀態、活動狀況、對刺激的反應、體質量 下降幅度、食欲和尿便等未見明顯異常:其次為化合物(I)組，再次為卡比多己組，最次為正 常對照組
[0042] 2.2對裸鼠肝癌移植瘤的抑制作用
[0043] 與正常對照組比較，卡比多己與化合物（I)組合物組對腫瘤抑制作用明顯較強，表 現為平均瘤質量減少(P<〇.01)，腫瘤抑制率較高(P<〇.01);與正常對照組比較，卡比多己 組、化合物（I)組平均瘤質量減少(P<〇.05)，腫瘤抑制率較高(P<0.05);裸鼠肝癌移植瘤 的形成得到抑制。結果見表1。
[0044] 2.3對腫瘤血管形成的影響
[0045] 與正常對照組比較，卡比多己與化合物（I)組合物組對腫瘤抑制作用明顯較強，表 現為微血管密度降低(P<〇.01);與正常對照組比較，卡比多己組、化合物（I)組微血管密度 降低(P<〇.05);裸鼠腫瘤血管的形成得到抑制。結果見表1。
[0046] 表1對裸鼠肝癌移植瘤和腫瘤血管形成的影響
[0047]
[004引上述結果表明，卡比多己、化合物（I)、卡比多己與化合物（I)組合物均能顯著抑制 肝癌移植瘤的生長，而且，卡比多己與化合物（I)組合物的抑制效果比卡比多己、化合物（I) 單獨抑制效果更好，可W開發成防治肝癌的藥物。
[0049]上述實施例的作用在于說明本發明的實質性內容，但并不W此限定本發明的保護 范圍。本領域的普通技術人員應當理解，可W對本發明的技術方案進行修改或者等同替換， 而不脫離本發明技術方案的實質和保護范圍。
【主權項】
1. 一種具有下述結構式的化合物（I)，2. -種卡比多己的藥物組合物，其特征在于:包括卡比多己、如權利要求1所述的化合 物(I)和藥學上可W接受的載體。3. 權利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于，包含W下操作步驟：（a)將弟 活的干燥根及根莖粉碎，用65~85 %乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用 石油酸、乙酸乙醋和水飽和的正下醇萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下 醇萃取物；（b)步驟(a)中正下醇萃取物用大孔樹脂除雜，先用6%乙醇洗脫8個柱體積，再用 70%乙醇洗脫8個柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（C)步驟(b) 中70 %乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為50:1、25:1、15:1和5:1的二氯甲 燒-甲醇梯度洗脫得到4個組分；（d)步驟(C)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比 為10:1、5:1和2:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基 硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個柱 體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物(I)。4. 根據權利要求3所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)中用75%乙醇熱 回流提取，合并提取液。5. 根據權利要求3所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為AB-8型 大孔吸附樹脂。6. 權利要求1所述的化合物（I)在制備治療肝癌的藥物中的應用。7. 權利要求2所述的卡比多己的藥物組合物在制備治療肝癌的藥物中的應用。
【文檔編號】C07D307/00GK106083771SQ201610421947
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月13日 公開號201610421947.9, CN 106083771 A, CN 106083771A, CN 201610421947, CN-A-106083771, CN106083771 A, CN106083771A, CN201610421947, CN201610421947.9
【發明人】不公告發明人
【申請人】崔坤峰