一類富勒烯氨基酸酯自組裝載藥緩釋囊泡材料及其制備方法和應用
【專利摘要】一類富勒烯氨基酸酯自組裝載藥緩釋囊泡材料及其制備方法和應用，涉及富勒烯。所述囊泡材料以富勒烯分子上通過親核取代連接有氨基酸酯分子，富勒烯為C60富勒烯，囊泡的分子通式為C60R5Cl。制備方法：以C60富勒烯和ICl為原料，以氯苯為溶劑，合成C60Cl6；在鹽酸甲醇飽和溶液中，加入氨基酸，加熱回流后得氨基酸酯；用乙酸乙酯和甲苯的混合溶劑，將C60Cl6和氨基酸酯加熱回流，即得富勒烯氨基酸酯粗產物，再進行色譜分離，得一類富勒烯氨基酸酯自組裝載藥緩釋囊泡材料。可在制備一類富勒烯氨基酸酯未載藥的自組裝載藥緩釋囊泡和一類富勒烯氨基酸酯衍生物自組裝載藥囊泡中應用。
【專利說明】
一類富勒烯氨基酸酯自組裝載藥緩釋囊泡材料及其制備方法和應用
技術領域
[0001]本發明涉及富勒烯，特別是涉及一類具有雙親性的富勒烯氨基酸酯衍生物自組裝載藥緩釋囊泡材料，以及該類自組裝載藥緩釋囊泡材料的制備方法和用途。
【背景技術】
[0002]近年來，具有納米空心球結構的有機超分子結構發展迅速。富勒烯，是單質碳被發現的第三種同素異形體，是20世紀的重大發現之一。因其獨特的結構和性質，富勒烯是一種理想的可用于自組裝納米材料的超分子，其衍生物可自組裝成納米囊泡、納米棒、納米球、納米薄膜、納米線等結構。生物相容性的基團修飾的富勒烯衍生物自組裝形成的囊泡，因其具有類似細胞膜磷脂雙分子層的結構且具有潛在的生物載藥性能，而引起了科學工作者廣泛的研究興趣。然而，富勒烯極其疏水的性質，阻礙了其在極性溶液中的組裝研究，也進一步阻礙了其潛在的生物活性和醫藥領域的應用。進一步針對富勒烯的潛在的醫藥領域的應用研究，取決于合成具有特殊功能基團的兩親富勒稀分子。(R.Bakry ,R.M.Valiant，M.Najam-ul_Haq，M.Rainer，Z.Szabo，C.W.Huck，G.K.Bonn，Medicinal appl icat1ns offullerenes.1nt.J.Nanomed.2007，2(4)，639-649;G.Hong，S.Diao，A.L.Antaris，H.Dai，Carbon Nanomaterials for B1logical Imaging and NanomedicinalTherapy.Chem.Rev.2015，115(SI)，10816-10906.)
[0003]氨基酸酯，是一類通過酯化反應，將氨基酸上羧基進行保護得到的產物。這類化合物具有相當廣泛的用途，可以用作醫藥工業、農藥工業、化妝品工業、食品工業以及有機合成的中間體等。由于氨基酸是生物功能大分子蛋白質的基本組成單位，尤其是在醫藥工業已經具有良好的應用基礎。一方面，以氨基酸酯修飾富勒烯可以得到確定分子結構的富勒烯兩親分子衍生物，可以在極性溶劑中形成具有緩釋性能的載藥囊泡結構;另一方面，氨基酸酯具有良好的生物相容性，使得富勒烯氨基酸衍生物具有潛在的生物醫藥應用價值。(M.BjelakoviIic，T.Kop,V.Maslak，D.MiIic，Synthesis and characterizat1n ofhighly ordered self-assembled b1active fulleropeptides.J.Mater.Sc1.2016,51(2),739-747.)
[0004]自組裝，是指基本結構單元在不受人類外力介入的情況下，自發形成有序結構的現象。在自組裝的過程中，基本結構單元在基于非共價鍵的相互作用下自發地組織或聚集為一個穩定、具有一定規則幾何外觀的結構。在極性溶劑中，具有雙親分子特性的富勒烯氨基酸酯衍生物，由于極其疏水的富勒烯端通過J1-Ji共軛、范德華力等作用力形成親水基團在外疏水基團在內的雙分子層結構。(1'.!101]1111&，1(.]^^110，!1.180匕6 3.如1^11111^，Angew.Chem.2010,122(9),1709-1712；Angew.Chem.1nt.Ed.2010,49(9),1665-1668.)
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供可有效解決富勒烯在藥物載體中應用的一類富勒烯氨基酸酯自組裝載藥緩釋囊泡材料及其制備方法和應用。
[0006]所述一類富勒烯氨基酸酯自組裝載藥緩釋囊泡材料是以富勒烯分子上通過親核取代連接有氨基酸酯分子，富勒烯為C6q富勒烯，囊泡的分子通式為C6qR5CI，氨基酸酯R = 4-氨基丁酸甲酯或谷氨酸二甲酯或苯丙氨酸甲酯，分子量通式為720+5 X (M-l)+5XnX 14+35.5，M為氨基酸分子量，η為相應氨基酸含有的羧基的數量，囊泡半徑為40?160nm，緩釋時間為直接釋放的2?1倍。
[0007]所述一類富勒烯氨基酸酯自組裝載藥緩釋囊泡材料的制備方法，包括以下步驟:
[0008]I)以C6Q富勒烯和ICl為原料，以氯苯為溶劑，合成C6QCl6;
[0009]2)在鹽酸甲醇飽和溶液中，加入氨基酸，加熱回流后得氨基酸酯；
[0010]3)用乙酸乙酯和甲苯的混合溶劑，將步驟I)得到的C6QCl6和步驟2)得到的氨基酸酯加熱回流，即得富勒烯氨基酸酯粗產物；
[0011]4)將步驟3)中得到的富勒烯氨基酸酯粗產物，進行色譜分離，得富勒烯氨基酸酯衍生物，所述富勒烯氨基酸酯衍生物即為一類富勒烯氨基酸酯自組裝載藥緩釋囊泡材料。
[0012]在步驟I)中，所述C6q富勒烯、Icl和氯苯的配比可為500mg:3.5g:150mL，其中，C60富勒稀、Icl以質量計算，氯苯以體積計算。
[0013]在步驟2)中，所述鹽酸甲醇飽和溶液與氨基酸的配比可為250mL:0.05?0.2mol，其中，鹽酸甲醇飽和溶液以體積計算，氨基酸以摩爾計算;所述加熱回流的溫度可為65°C，加熱回流的時間可為10?60min。
[0014]在步驟3)中，所述乙酸乙酯和甲苯的混合溶劑中乙酸乙酯和甲苯的體積比可為1:1;所述混合溶劑、05()(:16、氨基酸的配比可為5001^:0.478:2511111101，其中，混合溶劑以體積計算，C6qCI6以質量計算，氨基酸以摩爾計算;所述加熱回流的溫度可為40?70 °C，加熱回流的時間可為10?48min。
[0015]所述一類富勒烯氨基酸酯自組裝載藥緩釋囊泡材料可在制備一類富勒烯氨基酸酯未載藥的自組裝載藥緩釋囊泡中應用，所述一類富勒烯氨基酸酯未載藥的自組裝載藥緩釋囊泡可采用以下方法制備:
[0016]將一類富勒烯氨基酸酯自組裝載藥緩釋囊泡材料溶解在乙腈中，即得一類富勒烯氨基酸酯未載藥的自組裝載藥緩釋囊泡。
[0017]所述一類富勒烯氨基酸酯自組裝載藥緩釋囊泡材料可在制備一類富勒烯氨基酸酯衍生物自組裝載藥囊泡中應用，所述一類富勒烯氨基酸酯衍生物自組裝載藥囊泡可采用以下方法制備:
[0018]將一類富勒烯氨基酸酯自組裝載藥緩釋囊泡材料以及藥物溶解在乙腈和水混合溶劑中，超聲后熟化，轉入透析袋中透析，除去多余未被載入的藥物，即得富勒烯氨基酸酯衍生物自組裝載藥囊泡。
[0019]所述藥物可采用環磷酰胺、5-氟尿嘧啶或順鉑等;所述超聲的時間可為2h，熟化的時間可為2d。
[0020]所述富勒烯氨基酸酯衍生物自組裝載藥囊泡可在制備用于包裹親水性或疏水性藥物的藥物載體中應用。
[0021]所述富勒烯氨基酸酯衍生物自組裝載藥囊泡的藥物釋放量以及釋放速率可采用以下方法:
[0022]將富勒烯氨基酸酯衍生物自組裝載藥囊泡置于透析袋中，即可檢測其藥物釋放量以及釋放速率。
[0023]對所制備的一類富勒烯氨基酸酯自組裝載藥緩釋囊泡材料進行FTIRjPC1-MSjHNMR和13C NMR表征，確定其結構為C60R5Cl(I，R=4-氨基丁酸甲酯、2，R =谷氨酸二甲酯、3，R=苯丙氨酸甲酯)。
[0024]對所制備的一類富勒烯氨基酸酯未載藥的自組裝載藥緩釋囊泡進行DLS、SEM和TEM表征，考察其半徑約為40?160nm。
[0025]對所制備富勒烯氨基酸酯衍生物自組裝載藥囊泡進行TEM-EDS面掃元素分布和TEM-EDS線掃元素分布表征，確證其具有載藥性能;對富勒烯氨基酸酯衍生物自組裝載藥囊泡進行緩釋性能表征，其緩釋時間約為約為直接釋放的2?10倍，釋放量約為20%?50%。
[0026]—類具有雙親分子特性的富勒烯氨基酸酯衍生物，通過31-31共軛、范德華力等作用力自組裝，形成具有載藥性能的緩釋囊泡材料的制備方法，可有效解決富勒烯在藥物載體中的應用問題。
[0027]本發明所制備的富勒烯氨基酸衍生物自組裝載藥緩釋囊泡材料可有效用于藥物載體和緩釋，制備方法簡單，制備條件較容易滿足，并且對富勒烯本身的特性進行了最大程度的保留，有效解決了富勒烯作為藥物載體的憎水性能。
【附圖說明】
[0028]圖1為本發明所述富勒烯氨基酸酯衍生物的紅外光譜圖。a表示富勒烯4-氨基丁酸甲酯衍生物，b表示富勒烯谷氨酸二甲酯衍生物，c表示富勒烯苯丙氨酸甲酯衍生物。
[0029]圖2為本發明所述富勒烯氨基酸酯衍生物大氣壓化學電離(APCI)質譜圖。在圖2中，橫坐標為質荷比(m/z)，縱坐標為相應強度。a表示富勒烯4-氨基丁酸甲酯衍生物，b表示富勒烯谷氨酸二甲酯衍生物，c表示富勒烯苯丙氨酸甲酯衍生物；I表示實驗的同位素分布圖，2為理論模擬的同位素分布圖。
[0030]圖3為本發明所述富勒烯4-氨基丁酸甲酯衍生物的1H匪R圖。在圖3中，橫坐標為化學位移(ppm)，縱坐標為相應強度。
[0031]圖4為本發明所述富勒烯4-氨基丁酸甲酯衍生物的13CNMR圖。在圖4中，橫坐標為化學位移(ppm)，縱坐標為相應強度。
[0032]圖5為本發明所述富勒烯谷氨酸二甲酯衍生物的1H匪R圖。在圖5中，橫坐標為化學位移(ppm)，縱坐標為相應強度。
[0033]圖6為本發明所述富勒烯谷氨酸二甲酯衍生物的13CNMR圖。在圖6中，橫坐標為化學位移(ppm)，縱坐標為相應強度。
[0034]圖7為本發明所述富勒烯苯丙氨酸甲酯衍生物的1H匪R圖。在圖7中，橫坐標為化學位移(ppm)，縱坐標為相應強度。
[0035]圖8為本發明所述富勒烯苯丙氨酸甲酯衍生物的13CNMR圖。在圖8中，橫坐標為化學位移(ppm)，縱坐標為相應強度。
[0036]圖9為本發明所述富勒烯氨基酸酯衍生物動態光散射半徑分布圖。在圖9中，橫坐標為直徑(nm)，縱坐標為相應強度。
[0037]圖10為本發明所述富勒烯氨基酸酯衍生物所形成的未載藥囊泡掃描電鏡(SEM)圖。a、b、c表示富勒烯4-氨基丁酸甲酯衍生物，d、e、f表示富勒烯谷氨酸二甲酯衍生物，g、h、i表示富勒烯苯丙氨酸甲酯衍生物。
[0038]圖11為本發明所述富勒烯4-氨基丁酸甲酯衍生物所形成的未載藥囊泡透射電鏡(TEM)圖。a的放大倍數為115000倍，b、d的放大倍數245000倍，c的放大倍數為25000倍，e的放大倍數為49000倍。
[0039]圖12為本發明所述富勒烯氨基酸酯衍生物自組裝載藥囊泡的結構組成面掃表征圖。a為負載了 5-氟尿嘧啶載藥囊泡(I)的高角環形暗場-掃描透射電子像(HADDF-STEM)圖，
b、c、d、e為負載了 5-氟尿嘧啶的載藥囊泡(I)的相應的面掃元素分布圖，分別為C、N、0、F;f為負載了5-氟尿嘧啶載藥囊泡(2)的高角環形暗場-掃描透射電子像(HADDF-STEM)圖，g、h、
1、j為負載了 5-氟尿嘧啶的載藥囊泡(2)的相應的面掃元素分布圖，分別為C、N、O、F; k為負載了5-氟尿嘧啶載藥囊泡(3)的高角環形暗場-掃描透射電子像(HADDF-STEM)圖，l、m、n、o為負載了 5-氟尿嘧啶的載藥囊泡(3)的相應的面掃元素分布圖，分別為C、N、0、F。
[0040]圖13為本發明所述富勒烯氨基酸酯衍生物自組裝載藥囊泡的結構組成線掃表征圖。a、b、c分別對應圖12中的a、f、k，分別為載藥囊泡(1)、(2)、(3)的線掃元素分布圖。橫坐標為線掃的位置，縱坐標為各個元素的相對強度。
[0041]圖14為本發明所述富勒烯氨基酸酯衍生物負載5-氟尿嘧啶的載藥囊泡的釋放曲線圖。橫坐標為釋放時間，縱坐標為5-氟尿嘧啶的釋放率。
【具體實施方式】
[0042]以下結合實施例對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0043]實施例1
[0044]I)將500mg富勒烯C6q溶解在150mL氯苯中，室溫下磁力攪拌4h，使其全部溶解，加入3.5g ICl，室溫下反應4h，使用油栗抽濾除去過量的ICl和氯苯溶劑，得到橙黃色固體。使用正己烷洗滌3次，靜置，除去上清液，保留固體，干燥得到產物；
[0045]2)將在甲醇250mL中通入HCl氣體至形成飽和鹽酸甲醇溶液，加入10.31g的4-氨基丁酸甲酯，此時4-氨基丁酸甲酯形成4-氨基丁酸甲酯鹽酸鹽溶于甲醇中，加熱至65°C回流20min，產物使用旋轉蒸發儀旋干除去溶劑和多余的HC1，干燥后，得到4-氨基丁酸甲酯二甲酯鹽酸鹽；
[0046]3)將3.83g的4-氨基丁酸甲酯鹽酸鹽加入250mL乙酸乙酯中，加入1g無水碳酸鈉，室溫攪拌1h，使4-氨基丁酸甲酯充分游離，再加入含有0.47g C60Cl6的250mL甲苯溶液，再加入1g無水碳酸鈉，加熱至50°C反應24h，冷卻至室溫，過濾得到橙紅色溶液，使用蒸饋水洗滌三次，保留有機層，使用無水硫酸鎂干燥，旋蒸除去溶劑，得到粗產物；
[0047]4)富勒烯4-氨基丁酸甲酯衍生物使用C18高效液相色譜柱(250 X 10mm，Discovery)進行分離，得富勒稀4-氨基丁酸甲酯衍生物，流速為4mL/min，柱溫為室溫，流動相使用乙腈/乙酸乙酯/環己烷(60%乙腈+25%乙酸乙酯+15%環己烷)體系，檢測波長為400nm；
[0048]5)將步驟4)中得到的富勒烯4-氨基丁酸甲酯衍生物以0.02mmol/L的濃度溶解在乙腈中，即可制備得到未載藥的富勒烯4-氨基丁酸甲酯衍生物自組裝囊泡；
[0049]6)將8.03mg的富勒烯4-氨基丁酸甲酯衍生物以及1mg的5-氟尿嘧啶溶解在1mL乙腈和水的混合溶劑中(80%乙腈+20%水)，超聲2h后熟化兩天，轉入透析袋(100Da)中，使用乙腈和水的混合溶劑(80 %乙腈+20 %水)進行透析，除去多余未被載入的5-氟尿嘧啶，即得負載5-氟尿嘧啶的富勒烯4-氨基丁酸甲酯自組裝載藥囊泡(I);
[0050]7)取出步驟6)中得到的載藥囊泡置于透析袋中，使用磷酸緩沖溶液進行透析，得到載藥囊泡(I)對5-氟尿嘧啶的釋放量和釋放曲線。
[0051 ] 實施例2
[0052]I)將500mg富勒烯C6q溶解在150mL氯苯中，室溫下磁力攪拌4h，使其全部溶解，加入3.5g ICl，室溫下反應4h，使用油栗抽濾除去過量的ICl和氯苯溶劑，得到橙黃色固體。使用正己烷洗滌3次，靜置，除去上清液，保留固體，干燥得到產物；
[0053]2)將在甲醇250mL中通入HCl氣體至形成飽和鹽酸甲醇溶液，加入10.31g的4-氨基丁酸甲酯，此時4-氨基丁酸甲酯形成4-氨基丁酸甲酯鹽酸鹽溶于甲醇中，加熱至65°C回流20min，產物使用旋轉蒸發儀旋干除去溶劑和多余的HC1，干燥后，得到4-氨基丁酸甲酯二甲酯鹽酸鹽；
[0054]3)將3.83g的4-氨基丁酸甲酯鹽酸鹽加入250mL乙酸乙酯中，加入1g無水碳酸鈉，室溫攪拌1h，使4-氨基丁酸甲酯充分游離，再加入含有0.47g C60Cl6的250mL甲苯溶液，再加入1g無水碳酸鈉，加熱至50°C反應24h，冷卻至室溫，過濾得到橙紅色溶液，使用蒸饋水洗滌三次，保留有機層，使用無水硫酸鎂干燥，旋蒸除去溶劑，得到粗產物；
[0055]4)富勒烯4-氨基丁酸甲酯衍生物使用C18高效液相色譜柱(250 X 10mm，Discovery)進行分離，得富勒稀4-氨基丁酸甲酯衍生物，流速為4mL/min，柱溫為室溫，流動相使用乙腈/乙酸乙酯/環己烷(60%乙腈+25%乙酸乙酯+15%環己烷)體系，檢測波長為400nm；
[0056]5)將步驟4)中得到的富勒烯4-氨基丁酸甲酯衍生物以0.02mmol/L的濃度溶解在乙腈中，即可制備得到未載藥的富勒烯4-氨基丁酸甲酯衍生物自組裝囊泡；
[0057]6)將8.03mg的富勒烯4-氨基丁酸甲酯衍生物以及1mg的環磷酰胺溶解在1mL乙腈和水的混合溶劑中(80%乙腈+20%水)，超聲2h后熟化兩天，轉入透析袋(100Da)中，使用乙腈和水的混合溶劑(80%乙腈+20%水)進行透析，除去多余未被載入的環磷酰胺，即得負載環磷酰胺的富勒烯4-氨基丁酸甲酯自組裝載藥囊泡。
[0058]實施例3
[0059]I)將500mg富勒烯C6q溶解在150mL氯苯中，室溫下磁力攪拌4h，使其全部溶解，加入3.5g ICl，室溫下反應4h，使用油栗抽濾除去過量的ICl和氯苯溶劑，得到橙黃色固體。使用正己烷洗滌3次，靜置，除去上清液，保留固體，干燥得到產物；
[0060]2)將在甲醇250mL中通入HCl氣體至形成飽和鹽酸甲醇溶液，加入10.31g的4-氨基丁酸甲酯，此時4-氨基丁酸甲酯形成4-氨基丁酸甲酯鹽酸鹽溶于甲醇中，加熱至65°C回流20min，產物使用旋轉蒸發儀旋干除去溶劑和多余的HC1，干燥后，得到4-氨基丁酸甲酯二甲酯鹽酸鹽；
[0061 ] 3)將3.83g的4-氨基丁酸甲酯鹽酸鹽加入250mL乙酸乙酯中，加入1g無水碳酸鈉，室溫攪拌1h，使4-氨基丁酸甲酯充分游離，再加入含有0.47g C6QCl6的250mL甲苯溶液，再加入1g無水碳酸鈉，加熱至50°C反應24h，冷卻至室溫，過濾得到橙紅色溶液，使用蒸饋水洗滌三次，保留有機層，使用無水硫酸鎂干燥，旋蒸除去溶劑，得到粗產物；
[0062]4)富勒烯4-氨基丁酸甲酯衍生物使用C18高效液相色譜柱(250 X 10mm，Discovery)進行分離，得富勒稀4-氨基丁酸甲酯衍生物，流速為4mL/min，柱溫為室溫，流動相使用乙腈/乙酸乙酯/環己烷(60%乙腈+25%乙酸乙酯+15%環己烷)體系，檢測波長為400nm；
[0063]5)將步驟4)中得到的富勒烯4-氨基丁酸甲酯衍生物以0.02mmol/L的濃度溶解在乙腈中，即可制備得到未載藥的富勒烯4-氨基丁酸甲酯衍生物自組裝囊泡。
[0064]6)將8.03mg的富勒烯4-氨基丁酸甲酯衍生物以及2mg的順鉑溶解在1mL乙腈和水的混合溶劑中(80%乙腈+20%水)，超聲2h后熟化兩天，轉入透析袋(100Da)中，使用乙腈和水的混合溶劑(80%乙腈+20%水)進行透析，除去多余未被載入的順鉑，即得負載順鉑的富勒烯4-氨基丁酸甲酯自組裝載藥囊泡。
[0065]實施例4
[0066]I)將500mg富勒烯C6q溶解在150mL氯苯中，室溫下磁力攪拌4h，使其全部溶解，加入3.5g ICl，室溫下反應4h，使用油栗抽濾除去過量的ICl和氯苯溶劑，得到橙黃色固體。使用正己烷洗滌3次，靜置，除去上清液，保留固體，干燥得到產物；
[0067]2)將在甲醇250mL中通入HCl氣體至形成飽和鹽酸甲醇溶液，加入14.71g谷氨酸，此時谷氨酸形成谷氨酸鹽酸鹽溶于甲醇中，加熱至65 V回流20min，產物使用旋轉蒸發儀旋干除去溶劑和多余的HC1，干燥后，得到谷氨酸二甲酯鹽酸鹽；
[0068]3)將5.29g谷氨酸二甲酯鹽酸鹽加入250mL乙酸乙酯中，加入1g無水碳酸鈉，室溫攪拌1h，使谷氨酸二甲酯充分游離，再加入含有0.47g C60Cl6的250mL甲苯溶液，再加入1g無水碳酸鈉，加熱至50 V反應24h，冷卻至室溫，過濾得到橙紅色溶液，使用蒸餾水洗滌三次，保留有機層，使用無水硫酸鎂干燥，旋蒸除去溶劑，得到粗產物；
[0069]4)富勒稀谷氨酸二甲酯衍生物使用C18高效液相色譜柱(250 X 10mm,Discovery)進行分離，得富勒烯4-氨基丁酸甲酯衍生物，流速為4mL/min，柱溫為室溫，流動相使用乙腈/乙酸乙酯/環己烷(75%乙腈+15%乙酸乙酯+10%環己烷)體系，檢測波長為400nm;
[0070]5)將步驟4)中得到的富勒烯谷氨酸二甲酯衍生物以0.02mmol/L的濃度溶解在乙腈中，即可制備得到未載藥的富勒烯谷氨酸二甲酯衍生物自組裝囊泡；
[0071]6)將9.78mg的富勒烯谷氨酸二甲酯衍生物以及1mg的5-氟尿嘧啶溶解在1mL乙腈和水的混合溶劑中(80%乙腈+20%水)，超聲2h后熟化兩天，轉入透析袋(100Da)中，使用乙腈和水的混合溶劑(80%乙腈+20%水)進行透析，除去多余未被載入的5-氟尿嘧啶，SP得負載5-氟尿嘧啶的富勒烯谷氨酸二甲酯自組裝載藥囊泡(2);
[0072]7)取出步驟6)中得到的載藥囊泡置于透析袋中，使用磷酸緩沖溶液進行透析，得到載藥囊泡(2)對5-氟尿嘧啶的釋放量和釋放曲線。
[0073]實施例5
[0074]I)將500mg富勒烯C6q溶解在150mL氯苯中，室溫下磁力攪拌4h，使其全部溶解，加入3.5g ICl，室溫下反應4h，使用油栗抽濾除去過量的ICl和氯苯溶劑，得到橙黃色固體。使用正己烷洗滌3次，靜置，除去上清液，保留固體，干燥得到產物；
[0075]2)將在甲醇250mL中通入HCl氣體至形成飽和鹽酸甲醇溶液，加入14.71g谷氨酸，此時谷氨酸形成谷氨酸鹽酸鹽溶于甲醇中，加熱至65 V回流20min，產物使用旋轉蒸發儀旋干除去溶劑和多余的HC1，干燥后，得到谷氨酸二甲酯鹽酸鹽；
[0076]3)將5.29g谷氨酸二甲酯鹽酸鹽加入250mL乙酸乙酯中，加入1g無水碳酸鈉，室溫攪拌1h，使谷氨酸二甲酯充分游離，再加入含有0.47g C60Cl6的250mL甲苯溶液，再加入1g無水碳酸鈉，加熱至50 V反應24h，冷卻至室溫，過濾得到橙紅色溶液，使用蒸餾水洗滌三次，保留有機層，使用無水硫酸鎂干燥，旋蒸除去溶劑，得到粗產物；
[0077]4)富勒稀谷氨酸二甲酯衍生物使用C18高效液相色譜柱(250 X 10mm,Discovery)進行分離，得富勒烯4-氨基丁酸甲酯衍生物，流速為4mL/min，柱溫為室溫，流動相使用乙腈/乙酸乙酯/環己烷(75%乙腈+15%乙酸乙酯+10%環己烷)體系，檢測波長為400nm;
[0078]5)將步驟4)中得到的富勒烯谷氨酸二甲酯衍生物以0.02mmol/L的濃度溶解在乙腈中，即可制備得到未載藥的富勒烯谷氨酸二甲酯衍生物自組裝囊泡；
[0079]6)將9.78mg的富勒烯谷氨酸二甲酯衍生物以及1mg的環磷酰胺溶解在1mL乙腈和水的混合溶劑中(80 %乙腈+20 %水)，超聲2h后熟化兩天，轉入透析袋(I OOODa)中，使用乙腈和水的混合溶劑(80%乙腈+20%水)進行透析，除去多余未被載入的環磷酰胺，即得負載環磷酰胺的富勒烯谷氨酸二甲酯自組裝載藥囊泡。
[0080]實施例6
[0081 ] I)將500mg富勒烯C6q溶解在150mL氯苯中，室溫下磁力攪拌4h，使其全部溶解，加入3.5g ICl，室溫下反應4h，使用油栗抽濾除去過量的ICl和氯苯溶劑，得到橙黃色固體。使用正己烷洗滌3次，靜置，除去上清液，保留固體，干燥得到產物；
[0082]2)將在甲醇250mL中通入HCl氣體至形成飽和鹽酸甲醇溶液，加入14.71g谷氨酸，此時谷氨酸形成谷氨酸鹽酸鹽溶于甲醇中，加熱至65 V回流20min，產物使用旋轉蒸發儀旋干除去溶劑和多余的HC1，干燥后，得到谷氨酸二甲酯鹽酸鹽；
[0083]3)將5.29g谷氨酸二甲酯鹽酸鹽加入250mL乙酸乙酯中，加入1g無水碳酸鈉，室溫攪拌1h，使谷氨酸二甲酯充分游離，再加入含有0.47g C60Cl6的250mL甲苯溶液，再加入1g無水碳酸鈉，加熱至50 V反應24h，冷卻至室溫，過濾得到橙紅色溶液，使用蒸餾水洗滌三次，保留有機層，使用無水硫酸鎂干燥，旋蒸除去溶劑，得到粗產物；
[0084]4)富勒稀谷氨酸二甲酯衍生物使用C18高效液相色譜柱(250 X 10mm,Discovery)進行分離，得富勒烯4-氨基丁酸甲酯衍生物，流速為4mL/min，柱溫為室溫，流動相使用乙腈/乙酸乙酯/環己烷(75%乙腈+15%乙酸乙酯+10%環己烷)體系，檢測波長為400nm;
[0085]5)將步驟4)中得到的富勒烯谷氨酸二甲酯衍生物以0.02mmol/L的濃度溶解在乙腈中，即可制備得到未載藥的富勒烯谷氨酸二甲酯衍生物自組裝囊泡；
[0086]6)將9.78mg的富勒烯谷氨酸二甲酯衍生物以及2mg的順鉑溶解在1mL乙腈和水的混合溶劑中(80%乙腈+20%水)，超聲2h后熟化兩天，轉入透析袋(100Da)中，使用乙腈和水的混合溶劑(80%乙腈+20%水)進行透析，除去多余未被載入的順鉑，即得負載順鉑的富勒烯谷氨酸二甲酯自組裝載藥囊泡。
[0087]實施例7
[0088]I)將500mg富勒烯C6q溶解在150mL氯苯中，室溫下磁力攪拌4h，使其全部溶解，加入3.5g ICl，室溫下反應4h，使用油栗抽濾除去過量的ICl和氯苯溶劑，得到橙黃色固體。使用正己烷洗滌3次，靜置，除去上清液，保留固體，干燥得到產物；
[0089]2)將在甲醇250mL中通入HCl氣體至形成飽和鹽酸甲醇溶液，加入10.31g的苯丙氨酸甲酯，此時苯丙氨酸甲酯形成苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽溶于甲醇中，加熱至65°C回流20min，產物使用旋轉蒸發儀旋干除去溶劑和多余的HCl，干燥后，得到苯丙氨酸甲酯二甲酯鹽酸鹽；
[°09°] 3)將5.39g的苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽加入250mL乙酸乙酯中，加入1g無水碳酸鈉，室溫攪拌1h，使苯丙氨酸甲酯充分游離，再加入含有0.47g C6QCl6的250mL甲苯溶液，再加入1g無水碳酸鈉，加熱至50°C反應24h，冷卻至室溫，過濾得到橙紅色溶液，使用蒸餾水洗滌三次，保留有機層，使用無水硫酸鎂干燥，旋蒸除去溶劑，得到粗產物；
[0091 ] 4)富勒稀苯丙氨酸甲酯衍生物使用C18高效液相色譜柱(250 X 10mm,Discovery)進行分離，得富勒烯4-氨基丁酸甲酯衍生物，流速為4mL/min，柱溫為室溫，流動相使用乙腈/乙酸乙酯/環己烷(60 %乙腈+25 %乙酸乙酯+15 %環己烷)體系，檢測波長為400nm;
[0092]5)將步驟4)中得到的富勒烯苯丙氨酸甲酯衍生物以0.02mmol/L的濃度溶解在乙腈中，即可制備得到未載藥的富勒烯苯丙氨酸甲酯衍生物自組裝囊泡。
[0093]6)將9.90mg的富勒烯苯丙氨酸甲酯衍生物以及1mg的5-氟尿嘧啶溶解在1mL乙腈和水的混合溶劑中(80%乙腈+20%水)，超聲2h后熟化兩天，轉入透析袋(100Da)中，使用乙腈和水的混合溶劑(80%乙腈+20%水)進行透析，除去多余未被載入的5-氟尿嘧啶，SP得負載5-氟尿嘧啶的富勒烯苯丙氨酸甲酯自組裝載藥囊泡(3);
[0094]7)取出步驟6)中得到的載藥囊泡置于透析袋中，使用磷酸緩沖溶液進行透析，得到載藥囊泡(3)對5-氟尿嘧啶的釋放量和釋放曲線。
[0095]實施例8
[0096]I)將500mg富勒烯C6q溶解在150mL氯苯中，室溫下磁力攪拌4h，使其全部溶解，加入3.5g ICl，室溫下反應4h，使用油栗抽濾除去過量的ICl和氯苯溶劑，得到橙黃色固體。使用正己烷洗滌3次，靜置，除去上清液，保留固體，干燥得到產物；
[0097]2)將在甲醇250mL中通入HCl氣體至形成飽和鹽酸甲醇溶液，加入10.31g的苯丙氨酸甲酯，此時苯丙氨酸甲酯形成苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽溶于甲醇中，加熱至65°C回流20min，產物使用旋轉蒸發儀旋干除去溶劑和多余的HCl，干燥后，得到苯丙氨酸甲酯二甲酯鹽酸鹽；
[0098]3)將5.39g的苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽加入250mL乙酸乙酯中，加入1g無水碳酸鈉，室溫攪拌1h，使苯丙氨酸甲酯充分游離，再加入含有0.47g C60Cl6的250mL甲苯溶液，再加入1g無水碳酸鈉，加熱至50°C反應24h，冷卻至室溫，過濾得到橙紅色溶液，使用蒸餾水洗滌三次，保留有機層，使用無水硫酸鎂干燥，旋蒸除去溶劑，得到粗產物；
[00"] 4)富勒稀苯丙氨酸甲酯衍生物使用C18高效液相色譜柱(250 X 10mm,Discovery)進行分離，得富勒烯4-氨基丁酸甲酯衍生物，流速為4mL/min，柱溫為室溫，流動相使用乙腈/乙酸乙酯/環己烷(60 %乙腈+25 %乙酸乙酯+15 %環己烷)體系，檢測波長為400nm;
[0100]5)將步驟4)中得到的富勒烯苯丙氨酸甲酯衍生物以0.02mmol/L的濃度溶解在乙腈中，即可制備得到未載藥的富勒烯苯丙氨酸甲酯衍生物自組裝囊泡；
[0101]6)將9.90mg的富勒烯苯丙氨酸甲酯衍生物以及1mg的環磷酰胺溶解在1mL乙腈和水的混合溶劑中(80 %乙腈+20 %水)，超聲2h后熟化兩天，轉入透析袋(I OOODa)中，使用乙腈和水的混合溶劑(80%乙腈+20%水)進行透析，除去多余未被載入的環磷酰胺，即得負載環磷酰胺的富勒烯苯丙氨酸甲酯自組裝載藥囊泡。
[0102]實施例9
[0103]I)將500mg富勒烯C6Q溶解在150mL氯苯中，室溫下磁力攪拌4h，使其全部溶解，加入3.5g ICl，室溫下反應4h，使用油栗抽濾除去過量的ICl和氯苯溶劑，得到橙黃色固體。使用正己烷洗滌3次，靜置，除去上清液，保留固體，干燥得到產物；
[0104]2)將在甲醇250mL中通入HCl氣體至形成飽和鹽酸甲醇溶液，加入10.31g的苯丙氨酸甲酯，此時苯丙氨酸甲酯形成苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽溶于甲醇中，加熱至65°C回流20min，產物使用旋轉蒸發儀旋干除去溶劑和多余的HCl，干燥后，得到苯丙氨酸甲酯二甲酯鹽酸鹽；
[0?05] 3)將5.39g的苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽加入250mL乙酸乙酯中，加入1g無水碳酸鈉，室溫攪拌1h，使苯丙氨酸甲酯充分游離，再加入含有0.47g C60Cl6的250mL甲苯溶液，再加入1g無水碳酸鈉，加熱至50°C反應24h，冷卻至室溫，過濾得到橙紅色溶液，使用蒸餾水洗滌三次，保留有機層，使用無水硫酸鎂干燥，旋蒸除去溶劑，得到粗產物；
[Ο?Ο?] 4)富勒稀苯丙氨酸甲酯衍生物使用C18高效液相色譜柱(250 X 10mm,Discovery)進行分離，得富勒烯4-氨基丁酸甲酯衍生物，流速為4mL/min，柱溫為室溫，流動相使用乙腈/乙酸乙酯/環己烷(60 %乙腈+25 %乙酸乙酯+15 %環己烷)體系，檢測波長為400nm;
[0107]5)將步驟4)中得到的富勒烯苯丙氨酸甲酯衍生物以0.02mmol/L的濃度溶解在乙腈中，即可制備得到未載藥的富勒烯苯丙氨酸甲酯衍生物自組裝囊泡；
[0108]6)將9.90mg的富勒烯苯丙氨酸甲酯衍生物以及2mg的順鉑溶解在1mL乙腈和水的混合溶劑中(80%乙腈+20%水)，超聲2h后熟化兩天，轉入透析袋(100Da)中，使用乙腈和水的混合溶劑(80%乙腈+20%水)進行透析，除去多余未被載入的順鉑，即得負載順鉑的富勒烯苯丙氨酸甲酯自組裝載藥囊泡。
[0109]所述富勒烯氨基酸酯衍生物的紅外光譜(FTIR)圖參見圖1。
[0110]所述富勒烯氨基酸酯衍生物大氣壓化學電離質譜(APC1-MS)圖參見圖2。
[0111]所述富勒烯4-氨基丁酸甲酯衍生物的1H NMR(400M，⑶Cl3)參見圖3。
[0112]所述富勒烯4-氨基丁酸甲酯衍生物的13CNMR圖參見圖4。
[0113]所述富勒烯谷氨酸二甲酯衍生物的1HNMR圖參見圖參見圖5。
[0114]所述富勒烯谷氨酸二甲酯衍生物的13CNMR圖參見圖6。
[0115]所述富勒烯苯丙氨酸甲酯衍生物的1HNMR圖參見圖7。
[0116]所述富勒烯苯丙氨酸甲酯衍生物的13CNMR圖參見圖8。
[0117]所述富勒烯氨基酸酯衍生物動態光散射半徑分布圖參見圖9。
[0118]所述富勒烯氨基酸酯衍生物所形成的未載藥囊泡掃描電鏡(SEM)圖參見圖10。
[0119]所述富勒烯4-氨基丁酸甲酯衍生物所形成的未載藥囊泡透射電鏡(TEM)圖參見圖1lo
[0120]所述富勒烯氨基酸甲酯衍生物自組裝載藥囊泡的結構組成面掃表征圖參見圖12。
[0121]所述富勒烯氨基酸甲酯衍生物自組裝載藥囊泡的結構組成線掃表征圖參見圖13。
[0122]所述富勒烯氨基酸甲酯衍生物負載5-氟尿嘧啶的囊泡的釋放曲線圖參見圖14。
[0123]粗產物在安捷倫半制備型高效液相色譜上，對粗樣進行半制備型分離，三輪分離均采用半制備型Discovery C18柱分離，流速為4mL/min,柱溫為室溫，流動相使用乙腈/乙酸乙酯/環己烷(60%乙腈+25%乙酸乙酯+15%環己烷)體系，檢測波長為400nm。
[0124]富勒烯衍生物經紅外表征，確證其基團結構。
[0125]富勒烯衍生物經大氣壓化學電離質譜(APC1-MS)分別檢測得到三種富勒烯氨基酸酯衍生物的 APC1-MS:1335.4、1626.2、1546.6(M)。
[0126]富勒烯衍生物經核磁表征，進一步驗證其結構。
[0127]自組裝囊泡的動態光散射表明其可形成囊泡，其囊泡直徑分別為135、105和79nm。
[0128]自組裝囊泡的掃描電子顯微鏡進一步印證囊泡半徑。
[0129]自組裝囊泡的透射電子顯微鏡表明其空心結構及壁厚。
[0130]載藥自組裝囊泡的高角環形暗場-掃描透射電子像圖和相應的面掃元素分布圖表明其成功負載了相關藥物。
[0131]載藥自組裝囊泡的釋放曲線經安捷倫半制備型高效液相色譜表征，采用半制備型Discovery C18柱分離，流速為4mL/min，柱溫為室溫，流動相使用乙腈/水(80%乙腈+20%水)體系，檢測波長為265nm。
【主權項】
1.一類富勒烯氨基酸酯自組裝載藥緩釋囊泡材料，其特征在于以富勒烯分子上通過親核取代連接有氨基酸酯分子，富勒烯為C6O富勒烯，囊泡的分子通式為C6qR5CI,氨基酸酯R =4-氨基丁酸甲酯或谷氨酸二甲酯或苯丙氨酸甲酯，分子量通式為720+5 X (M-1) +5 X η X 14+35.5，Μ為氨基酸分子量，η為相應氨基酸含有的羧基的數量，囊泡半徑為40?160nm，緩釋時間為直接釋放的2?1倍。2.如權利要求1所述一類富勒烯氨基酸酯自組裝載藥緩釋囊泡材料的制備方法，其特征在于包括以下步驟: 1)以C6q富勒烯和ICl為原料，以氯苯為溶劑，合成C6qCI6; 2)在鹽酸甲醇飽和溶液中，加入氨基酸，加熱回流后得氨基酸酯； 3)用乙酸乙酯和甲苯的混合溶劑，將步驟I)得到的C6qCI6和步驟2)得到的氨基酸酯加熱回流，即得富勒烯氨基酸酯粗產物； 4)將步驟3)中得到的富勒烯氨基酸酯粗產物，進行色譜分離，得富勒烯氨基酸酯衍生物，所述富勒烯氨基酸酯衍生物即為一類富勒烯氨基酸酯自組裝載藥緩釋囊泡材料。3.如權利要求2所述一類富勒烯氨基酸酯自組裝載藥緩釋囊泡材料的制備方法，其特征在于在步驟I)中，所述C6q富勒烯、Icl和氯苯的配比為500mg:3.5g:150mL，其中，C6q富勒稀、I c I以質量計算，氯苯以體積計算。4.如權利要求2所述一類富勒烯氨基酸酯自組裝載藥緩釋囊泡材料的制備方法，其特征在于在步驟2)中，所述鹽酸甲醇飽和溶液與氨基酸的配比為250mL:0.05?0.2mol，其中，鹽酸甲醇飽和溶液以體積計算，氨基酸以摩爾計算;所述加熱回流的溫度可為650C，加熱回流的時間可為10?60min。5.如權利要求2所述一類富勒烯氨基酸酯自組裝載藥緩釋囊泡材料的制備方法，其特征在于在步驟3)中，所述乙酸乙酯和甲苯的混合溶劑中乙酸乙酯和甲苯的體積比為1:1;所述混合溶劑、CboCIb、氨基酸的配比為500mL: 0.47g: 25mmoI，其中，混合溶劑以體積計算，C60Cl6以質量計算，氨基酸以摩爾計算;所述加熱回流的溫度可為40?70°C，加熱回流的時間可為10?48min。6.如權利要求1所述一類富勒烯氨基酸酯自組裝載藥緩釋囊泡材料在制備一類富勒烯氨基酸酯未載藥的自組裝載藥緩釋囊泡中應用。7.如權利要求6所述應用，其特征在于所述一類富勒烯氨基酸酯未載藥的自組裝載藥緩釋囊泡采用以下方法制備: 將一類富勒烯氨基酸酯自組裝載藥緩釋囊泡材料溶解在乙腈中，即得一類富勒烯氨基酸酯未載藥的自組裝載藥緩釋囊泡。8.如權利要求1所述一類富勒烯氨基酸酯自組裝載藥緩釋囊泡材料在制備一類富勒烯氨基酸酯衍生物自組裝載藥囊泡中應用。9.如權利要求8所述應用，其特征在于所述一類富勒烯氨基酸酯衍生物自組裝載藥囊泡采用以下方法制備: 將一類富勒烯氨基酸酯自組裝載藥緩釋囊泡材料以及藥物溶解在乙腈和水混合溶劑中，超聲后熟化，轉入透析袋中透析，除去多余未被載入的藥物，即得富勒烯氨基酸酯衍生物自組裝載藥囊泡； 所述藥物可采用環磷酰胺、5-氟尿嘧啶或順鉑;所述超聲的時間可為2h，熟化的時間可為2d。10.如權利要求8所述應用，其特征在于所述富勒烯氨基酸酯衍生物自組裝載藥囊泡在制備用于包裹親水性或疏水性藥物的藥物載體中應用。
【文檔編號】C07C227/16GK106083626SQ201610390802
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月3日 公開號201610390802.7, CN 106083626 A, CN 106083626A, CN 201610390802, CN-A-106083626, CN106083626 A, CN106083626A, CN201610390802, CN201610390802.7
【發明人】謝素原, 林民松, 朱常鋒, 陳睿婷, 劉雅玲, 陳淑芬, 余楠儀, 崔存浩, 張美林, 黃榮彬, 鄭蘭蓀
【申請人】廈門大學, 廈門福納新材料科技有限公司