補骨脂酚衍生物及其制備方法和應用
【專利摘要】本發明以補骨脂酚為原料，半合成了三種補骨脂酚衍生物，分別具有如式(I)、式(II)和式(III)所示的結構式：式(I)、式(II)和式(III)所示的補骨脂酚衍生物具有較強的抑制四種腫瘤細胞增殖的作用，且式(III)所示的補骨脂酚衍生物不僅可以有效抑制四種腫瘤細胞的增殖，且呈現濃度依賴性，還可以抑制人肝癌SMMC7721細胞的侵襲轉移，具有良好的臨床應用前景；式(III)所示的補骨脂酚衍生物毒性低，而目前臨床所以的抗腫瘤藥物大多數對人體有較大的毒性，本發明的式(I)、式(II)和式(III)所示的補骨脂酚衍生物能夠作為活性成分制備抑制腫瘤細胞增殖、侵襲與轉移的藥物，具有很好的臨床抗腫瘤藥的應用前景。
【專利說明】
補骨脂齡衍生物及其制備方法和應用
技術領域
[0001] 本發明屬于藥物化學技術領域，具體是補骨脂酪衍生物及其制備方法，W及W補 骨脂酪衍生物為活性成分的藥物組合物在治療癌癥中的應用。
【背景技術】
[0002] 補骨脂酪(bakucMol)是中藥補骨脂中的主要活性成分之一，結構上屬于異戊二 締基酪祗類，其含量為1%~7%。現代藥理學研究表明，補骨脂酪具有抗腫瘤、抗菌、抗氧 化、肝保護、降低血糖等生物活性，機具開發應用價值，補骨脂酪的結構式如下：
[0003]
〇：
[0004] 中藥或天然產物在化合物類型、結構上表現出多樣性和復雜性，是一個天然形成 的"組合化學樣品庫"，已成為新藥研發中發現先導化合物的重要來源。我國擁有豐富的中 草藥資源，從中提取分離得到先導化合物，并對其進行結構修飾，增強藥理活性、降低毒副 作用，改善藥代動力學性質，是實現中藥現代化和創制新藥的有效途徑。
[0005] 有關補骨脂酪的半合成已經有一些報道，其主要的結構修飾部位為苯環、酪徑基、 側鏈。2008年，中國科學院上海藥物研究所的Chen H.等(Bioorg Med Chem，2008,16,2403- 2411)采用半合成的方法合成了一系列補骨脂酪衍生物，測定了其抑制Τ細胞和B細胞增殖 的作用，并探討了其構效關系。2010年，Reddy M.V.等化ur J Med化em，2010,45,3125- 3134)采用赫克偶聯反應合成了 17個補骨脂酪衍生物，并通過抗菌實驗篩選，獲得了若干個 較強抗菌活性的化合物。2012年，Majeed R.等巧ur J Med Chem，2012,49,55-67)采用本合 成的方法制備了 28個補骨脂酪衍生物，測定了其對8個腫瘤細胞株的細胞毒性，探討和闡明 了構效關系及其作用機制，為補骨脂酪衍生物的研究指出了一個新的方向。
[0006] 補骨脂酪具有多種生物活性，其中抗腫瘤作用比較受到關注。2008年，Wu等報道了 補骨脂酪及其衍生物抑制缺氧誘導因子-Ια化IF-la)的作用，為補骨脂酪抗腫瘤研究提供 了基礎。HIF-la作為介導細胞缺氧反應的重要的轉錄因子之一，與腫瘤細胞增殖、血管形 成、糖代謝、轉移等密切相關。研究表明，缺氧可W強烈地刺激新血管形成，主要是通過增加 血管生成促進因子（VEGF)的表達所致。同時，缺氧狀態下HIF-la啟動基質金屬蛋白酶2 (MMP2)的表達和酶的活性，抑制E-cadW及其他粘附分子的表達，從而促進了腫瘤細胞的侵 潤和轉移。顯然在腫瘤的研究領域中，HIF-la已成為了腫瘤治療的一個特異性祀點，如缺氧 特異性細胞毒藥物等均展現出良好的應用前景。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的在于提供一系列補骨脂酪衍生物及其制備方法和應用，通過半合成 制備了 Ξ種補骨脂酪衍生物，并闡明其生物活性，證明其具有顯著的抑制腫瘤細胞增殖、侵 襲和轉移的作用，在制備治療癌癥藥物中具有廣闊前景。
[0008] 為實現上述目的，本發明提供了Ξ種補骨脂酪衍生物，分別具有如式（I)、式（II) 和式(III)所示的結構式：
[0009] - ? ·-----,
0
[0010] 其中，式（I)所示的補骨脂酪衍生物的制備方法為：W二氯甲燒為溶劑，1摩爾份補 骨脂酪與10摩爾份苯甲酸在室溫下進行醋化反應，待補骨脂酪不再被消耗時，加水終止反 應;反應液用二氯甲燒萃取，萃取液水洗后，干燥，減壓濃縮得到油狀混合物;利用硅膠柱色 譜分離混合物得到如式(I)所示的補骨脂酪衍生物。
[0011] 式(II)所示的補骨脂酪衍生物的制備方法為：W丙酬為溶劑，1摩爾份補骨脂酪與 1.5摩爾份硝酸儀在室溫下進行單硝化反應，獲得中間體2-硝基補骨脂酪;將1摩爾份2-硝 基補骨脂酪溶于二氯甲燒中，加入4摩爾份丙酸酢，室溫下進行丙酷化反應;反應結束后，用 二氯甲燒萃取，水洗萃取液并干燥，減壓濃縮得到油狀混合物；利用硅膠柱色譜分離混合 物，得到如式(II)所示的補骨脂酪衍生物。
[0012] 式（III)所示的補骨脂酪衍生物的制備方法為取補骨脂酪Immol，溶解于甲醇中， 在冰水浴攬拌條件下緩慢加入稀硫酸，升溫至室溫，TLC監控反應;待原料消耗完畢，減壓濃 縮去除甲醇，反應液用二氯甲燒萃取，萃取液水洗后干燥;減壓濃縮得到油狀混合物;利用 硅膠柱色譜分離混合，得到如式(III)所示的補骨脂酪衍生物。
[0013] 上述Ξ種補骨脂酪衍生物都W補骨脂酪為原料，采用半合成法制備了 Ξ種補骨脂 酪衍生物，制備方法簡單，能夠快速大量地制備補骨脂酪衍生物，操作簡單可行，無污染，成 本低廉，收率穩定，且重復性好。制備的Ξ種補骨脂酪衍生物具有顯著的抑制腫瘤細胞增殖 的作用，式(III)所示的補骨脂酪衍生物還具有較強的抑制腫瘤細胞侵襲轉移的能力，能夠 用于抗腫瘤藥物的制備。
[0014] 本發明還提供了式(I)、式(II)和式(III)所示的補骨脂酪衍生物作為活性成分在 制備抑制腫瘤細胞增殖、侵襲與轉移藥物中的應用。
[0015] 所述的腫瘤細胞為104-18-231、511(：7721、!1邱62或5胖480。
[0016] 本發明提供的Ξ種補骨脂酪衍生物具有較強的抑制四種腫瘤細胞(MDA-MB-231、 SMMC7721、胎pG2和SW480)增殖的作用，且式（III)所示的補骨脂酪衍生物不僅可W有效抑 制四種腫瘤細胞(]\?^-]\?-231、5]\?^7721、胎962和5胖480)的增殖，且呈現濃度依賴性，還可 W抑制人肝癌SMMC7721細胞的侵襲轉移，具有良好的臨床應用前景;式(III)所示的補骨脂 酪衍生物毒性低，而目前臨床所W的抗腫瘤藥物大多數對人體有較大的毒性，具有很好的 臨床抗腫瘤藥的應用前景。
[0017] 所述的補骨脂酪衍生物被配制為用于口服或注射給藥，劑型可W為液體制劑、片 劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、膠囊、緩釋劑、滴丸劑或注射劑。
【附圖說明】
[0018] 圖1是氯化鉆對人肝癌細胞(SMMC7721)增殖的影響。
[0019] 圖2是Western blotting法檢測氯化鉆誘導人肝癌細胞（SMMC7721)缺氧模型中 HIF-化蛋白的表達。
[0020] 圖3是式(III)所示的補骨脂酪衍生物對人肝癌細胞(SMMC7721)侵襲的影響。
[0021] 圖4是式(III)所示的補骨脂酪衍生物對人肝癌細胞(SMMC7721)遷移的影響。
[0022] 圖5是Western blotting法檢測式（III)所示的補骨脂酪衍生物對人肝癌細胞 (SMMC7721)中 HIF-la、MMP-2、MMP-9 蛋白表達的影響。
【具體實施方式】
[0023] W下結合實施例進一步說明發明。
[0024] 實施例1.式(I)所示的補骨脂酪衍生物的制備：
[0025] 取苯甲酸lOmmol，置于4mL二氯甲燒冰浴中，攬拌條件下緩慢滴加亞硫酷氯5ml，并 攬拌lOmin。溫度逐步升到室溫，持續2小時后，減壓濃縮除去氯化亞諷，迅速滴加含有Immol 補骨脂酪的二氯甲燒溶液，回流，再加入催化量的4-二甲氨基化晚，待補骨脂酪不再被消耗 時，加水終止反應。
[0026] 反應液放入二氯甲燒和水各250mL分液漏斗中分層，充分震蕩，二氯甲燒萃取2次， 每次200mL，合并二氯甲燒層后水洗2次，每次lOOmL，二氯甲燒層加無水硫酸鋼干燥過夜，減 壓濃縮得到油狀混合物。
[0027] 利用硅膠柱色譜分離混合物，硅膠300~400目，洗脫液為正己燒：乙酸乙醋（50: 1)，得到式(I)所示的補骨脂酪衍生物。
[002引
[0029] 用高分辨質譜化R-ESI-MS)、核磁共振(iH-NMR、UC-NMR)鑒別制備的產物，波譜數 據如下：皿斗51-]?8:111八[]\?1] + = 361.2165;分子式確定為〔2出28〇2;4-醒1?(6001化，〔0(：13)5 8.24(2H，dd J = 8.4，1.3Hz)，7.68(lH，t J = 7.4Hz)，7.55(2H，t J = 7.細z)，7.45(2H，dJ = 8.4Hz)，7.19(2H，d J = 8.細z),6.38(lH，dJ= 16.3Hz) ,6.23(lH，dJ= 16.3Hz),5.94 (lH，dd，J=17.5，10.7Hz)，5.10(lH，m)，5.07(lH，m)，2.01(2H，m)，1.72(3H，s)，1.63(3H， s)，1.56(2H，m)，1.26(3H，s);i3c-Mffi(150MHz，CDCl3)Sl65.21，149.85，145.68，138.25， 138.25,135.74,133.55,131.39,130.17,128.55,127.04,126.33,124.71,121.68,112.13, 42.68,41.25,25.7,23.32,23.24,17.66 〇
[0030] 實施例2.式(II)所示的補骨脂酪衍生物的制備：
[0031] 取補骨脂酪Immol溶于5mL丙酬中，室溫攬拌條件下加入硝酸儀1.5mmol和催化量 的對甲苯橫酸(P-TSA)，回流，薄層層析色譜(TLC)監控反應。待反應完畢原料消耗完，蒸干 丙酬，反應液放入二氯甲燒和水各250mL分液漏斗中分層，充分震蕩，二氯甲燒萃取2次，每 次200mL，合并二氯甲燒層后水洗2次，每次lOOmL，二氯甲燒層加無水硫酸鋼干燥過夜，減壓 濃縮得到油狀混合物，利用硅膠柱色譜分離混合產物，硅膠300~400目，洗脫液為正己燒： 乙酸乙醋(50:1)，得到中間化合物2-硝基補骨脂酪。
[0032] 再W中間化合物2-硝基補骨脂酪為原料，對其進行酷化反應，TLC監控反應，再同 上述步驟萃取、干燥，硅膠柱層析提純，得到式(II)所示的淡黃色油狀補骨脂酪衍生物。
[0033]
[0034] 用高分辨質譜化R-ESI-MS)、核磁共振(iH-NMR、UC-NMR)鑒別制備的產品，波譜數 據如下：HR-ESI-MS:m/z[M+扣+ = 358.2013，分子式確定為〔21出7側4;1護醒1?(6001化，〔0(：13)8 8.03(lH，d，J = 2.1Hz)，7.58(lH，dd，J = 8.4,2.1Hz)，7.13(lH，d，J = 8.4Hz)，6.31(lH，d，J = 16.3Hz)，6.27(lH，d J= 16.3Hz) ,5.86(lH，ddJ= 17.5,10.7Hz) ,5.08(lH，m) ,5.02( 1H, dd J=17.5,10.7Hz),2.66(2H,m),1.97(2H,m),1.66(3H,s),1.57(3H,s),1.53(2H,m), 1.27(3H，s)，1.20(3H，s);i3c-^R(150MHz，CDCl3)Sl72.22，144.91，142.62，141.79, 141.53,137.05,131.77,131.63,125.21,124.48,124.45,122.81,112.75,42.92,41.05, 27.53,26.35,23.20,23.13,17.67,8.73 0
[0035] 實施例3.式(III)所示的補骨脂酪衍生物的制備：
[0036] 取補骨脂酪Immol溶解于甲醇中，在冰水浴攬拌條件下緩慢加入稀硫酸，升溫至室 溫，TLC監控反應，待原料消耗完畢，減壓濃縮去除甲醇。反應液倒入分頁漏斗中，加二氯甲 燒和水各250mL充分震蕩，二氯甲燒萃取2次，每次200mL，合并二氯甲燒層后水洗2次，每次 1 OOmL。二氯甲燒層加無水硫酸鋼干燥過夜，減壓濃縮得到減壓濃縮得到油狀混合物。
[0037]硅膠柱層析法提純:硅膠300~400目；洗脫液:二氯甲燒：甲醇=80:1; TLC合并相 同組分，得到式(III)所示的無色油狀補骨脂酪衍生物。
[00；3 引
[0039] 用高分辨質譜化R-ESI-MS)、核磁共振(iH-NMR、UC-NMR)鑒別制備的產品，波譜數 據如下：皿-ESI-MS:m/z[M+H] + = 289.2139;分子式確定為Cl姐28〇2; 1h-NMR(600MHz，CDCl3)5 7.28(2H，d J = 8.5Hz)，6.80(2H，dJ = 8.6Hz ),6.28( lH，d，J= 16.2Hz), 6.09(lH，dJ = 16.2Hz)，5.91(lH，dd J= 17.5,10.7Hz),5.08(lH，m) ,5.02(3.20(3H，s), 1.54-1.45 (m) ,1.38-1.32(m)，1.22(3H，s)，1.17(6H，s);i3c-醒R(150MHz，CDC13)S155.0,146.11， 135.19,130.61,127.37,125.55,115.10,111.85,75.01,49.05,42.56,41.97,40.53， 37.12,25.02,23.61,18.78。
[0040] 實施例4.MTT法檢測實施例1~3制備的式（I)、式（II)和式（III)所示的補骨脂酪 衍生物對四種腫瘤細胞(MDA-MB-231、SMMC7721、胎pG2和SW480)增殖的影響：
[0041] (1)實驗材料；
[0042] 細胞株：人肝癌（SMMC7721、HepG2)細胞、人乳腺癌(MDA-MB-231)細胞、人結腸癌 (SW480)細胞來源于美國American Type Qilture Collection(ATCC)公司。
[0043] 試劑:阿霉素(ADM)、PX-478化IF-化特異性抑制劑）、MTT購自美國Sigma公司;DMEM 或RPMI1640培養液、DMS0、0.25 %膜蛋白酶、青霉素和鏈霉素購自Hyclone; 96孔培養板購自 Corning公司;胎牛血清購自中國杭州四季青生物技術公司。
[0044] 儀器：SP-DJ系列垂直凈化工作臺（上海普通物理光學儀器廠），二氧化碳培養箱 (美國甜化L LAB公司），多功能酶標儀(美國BIOT邸），倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。
[0045] (2)方法：
[0046] 細胞培養:將上述四種腫瘤細胞(MDA-MB-231、SMMC7721、HepG2和SW480)分別接種 于DMEM或RPMI1640(含10%滅活胎牛血清aOOIU/1青霉素，lOOyg/血鏈霉素），置5%C02,37 °C，飽和濕度環境下培養并傳代。
[0047] MTT法:取對數生長期的腫瘤細胞，用0.25 %膜蛋白酶消化制成單細胞懸液，接種 于96孔板中，每孔1(Κ)化培養液中含有5000個細胞，于5%C02飽和濕度37°C培養箱中培養。 培養24小時后，按不同濃度處理式（I)、式（II)和式（III)所示的補骨脂酪衍生物W及陽性 對照藥阿霉素(ADM)和PX-478,每個處理3個復孔，繼續培養48小時后每孔加入10化濃度為 5g · [1的MTT溶液繼續解育4小時，棄去培養液，每孔加入DMS0150yL，37°C解育30分鐘，微量 振蕩器振蕩10分鐘使結晶物充分溶解，用酶標儀在570nm波長下檢測每孔的吸光度(A)值， 計算細胞存活率:細胞存活率/ % =實驗組A570nm/對照組A570nm X 100 %，繪制劑量效應曲線， W上實驗重復3次。
[0048] (3)實驗結果:見表1，從結果可看出，式（I)、式（II)和式（III)所示的補骨脂酪衍 生物在體外可抑制四種腫瘤細胞的增殖，其細胞毒性與藥物濃度成正比。
[0049] 表1:補骨脂酪衍生物對腫瘤細胞增殖的影響（IC5〇，ymol/L)
[(K)加 ]
[0051 ] 實施例5 .MTT法檢測氯化鉆對人肝癌細胞(SMM 口 721)增殖的影響：
[0052] 該實驗部分通過氯化鉆對人肝癌細胞(SMMC7721)的殺傷作用進行效果評價。
[0053] (1)實驗材料：
[0054]細胞株：人肝癌細胞（SMMC7721)來源于美國American Type Qilture Collection (ATCC)公司。
[0055] 試劑：氯化鉆購自美國S i gma公司；MTT購自美國S i gma公司；DMEM培養液、DMSO、 0.25 %膜蛋白酶、青霉素和鏈霉素購自Hyclone; 96孔培養板購自Corning公司；胎牛血清購 自中國杭州四季青生物技術公司。
[0化6]儀器：SP-DJ系列垂直凈化工作臺（上海普通物理光學儀器廠），二氧化碳培養箱 (美國甜化L LAB公司），多功能酶標儀(美國BIOT邸），倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。
[0057] (2)方法：
[005引細胞培養：將人肝癌細胞（S歷C7721)分別接種于DMEM(含10 %滅活胎牛血清， 100IU/1青霉素，lOOyg/mL鏈霉素），置5%C02,37°C，飽和濕度環境下培養，待細胞貼壁后， 培養液更換為含有不同濃度的氯化鉆(50、100、150、200、300皿01/1)的0161培養液誘導缺 氧模型，并繼續培養細胞。
[0化9] MTT法：同實施例4。
[0060] (3)實驗結果如圖1所示，從圖1可看出，氯化鉆在150皿01 /L、作用24小時對人肝癌 細胞(SMMC7721)的生長、增殖幾乎沒有影響。
[0061 ] 實施例6.Western blotting法檢測氯化鉆誘導人肝癌細胞(SMMC7721)缺氧模型 中HIF-化蛋白的表達：
[0062] (1)實驗材料：
[0063] 細胞株：人肝癌細胞（SMMC7721)來源于美國American Type Qilture Collection (ATCC)公司。
[0064] 試劑:氯化鉆購自美國Sigma公司；DMEM培養液、DMSO、0.25%膜蛋白酶、青霉素和 鏈霉素、購自Hyclone;6孔板購自Corning公司；胎牛血清購自中國杭州四季青生物技術公 司；兔抗人HIF-：La抗體(Abeam公司）。
[00化]儀器：SP-DJ系列垂直凈化工作臺（上海普通物理光學儀器廠），二氧化碳培養箱 (美國S肥化LAB公司），凝膠成像系統（美國BIO-RAD公司）；電泳儀(美國BIO-RAD公司）；倒 置巧光顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；超速離屯、機(美國BECKMAN)。
[0066] (2)方法：
[0067] Western blotting:調細胞濃度為2X105接種于6孔板，2mL/孔，24小時后加入150 ymol/L氯化鉆，作用24小時。收集培養細胞，用冰PBS清洗后，濾紙吸干液體后加入細胞裂解 液，200化/孔，置冰上30分鐘，細胞刮下，轉移至EP管內80°C凍存，經3次反復凍融后BCA法定 量。取蛋白提取物40yg，加入5 X SDS上樣緩沖液，100°C煮沸10分鐘，做SDS-PAGE電泳，積層 膠恒壓50V，分離膠恒壓100V，電泳至漠酪藍燃料到達凝膠最前沿，停止電泳。
[0068] 轉膜：電泳結束后掲膠，并將凝膠浸于適量的化ansfer buffer中。同時取適當大 小的PVDF膜和4張3M濾紙，將PVDF先在無水甲醇中浸濕，然后同濾紙一起浸于Transfer buffer中，膜放陽極、膠放陰極，兩面各墊2張3M濾紙，恒壓60V，4°C層析柜中轉膜2小時。
[0069] 封膜:將轉有蛋白的膜浸于含10%脫脂奶粉的TBST中封閉1小時。雜交:取出已封 閉的膜，然后浸于1:400稀釋的兔抗人HIF-化一抗(含5%脫脂奶粉的TBST，pH7.4配制），在4 °C過夜。TBST漂洗5次（每次5分鐘），再浸于1:2000稀釋的二抗（含5%脫脂奶粉的TBST， pH7.4配制）中，在室溫1小時，TBST漂洗4次(每次5分鐘）。配制顯色液化化A0.5ml，E化B 0.5ml)，放置凝膠成像系統中顯色分析。
[0070] (3)實驗結果如圖2所示，氯化鉆在150μπιο 1/L( 24小時)條件下，顯著地誘導對人肝 癌細胞(SMMC7721)中HIF-化蛋白的表達。
[0071] 實施例7. Transwell小室法檢測式（III)所示的補骨脂酪衍生物對人肝癌細胞 (SMMC7721)侵襲能力的影響：
[0072] 腫瘤轉移是個多步驟的復雜過程，而腫瘤細胞侵襲基膜是其中的首要環節。該實 驗部分通過化answe 11小室，加入Matr i ge 1 (基膜的類似物)模擬體內的侵襲過程，觀察化合 物抑制人乳腺癌MDA-MB-231細胞侵襲能力。
[0073] (1)實驗材料：
[0074] 細胞株：人肝癌細胞（SMMC7721)來源于美國American Type Qilture Collection (ATCC)公司。
[007引試劑:PX-478化IF-Ια特異性抑制劑）、氯化鉆購自美國Sigma公司；多聚甲醒購自 美國Sigma公司；DMEM培養液、DMS0、0.25%膜蛋白酶、青霉素和鏈霉素、Matrigel基質蛋白 購自Hyclone; Transwel 1購自Costar公司；胎牛血清購自中國杭州四季青生物技術公司。
[0076] 儀器:二氧化碳培養箱(美國甜化L LAB公司），倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。
[0077] (2)方法：
[0078] 誘導人肝癌細胞(SMMC7721)缺氧模型：同實施例5中的細胞培養部分。
[00巧]Transwell小室法:將預冷的Ma化igel膠與無血清的DME：M培養基按1:6稀釋，用預 冷的20化L槍頭W每孔50化均勻鋪于化answell小室底部膜內，置培養箱30min使之成膠。取 對數生長期SMMC7721細胞，消化離屯、，用含式（III)所示的補骨脂酪衍生物W及陽性對照藥 PX-478無血清培養基稀釋細胞至5 X lOVmL，每個TYanswel 1小室中加入lOOyL，下室每孔加 入含5 %胎牛血清的DMEM高糖培養基60化L，培養36小時后取出小室，用棉簽擦去小室上層 未侵襲的細胞，4%多聚甲醒室溫固定15分鐘，0.1%結晶紫染色15分鐘，各取5個400X視野 顯微鏡下觀察拍照。侵襲抑制率/% = (1 -實驗組侵襲細胞數/對照組侵襲細胞數）X 100%。
[0080] (3)實驗結果如圖3所示，從結果可看出，不同濃度的式(III)所示的補骨脂酪衍生 物處理人肝癌細胞(SMMC7721)36小時后，可觀察到式（III)所示的補骨脂酪衍生物具有顯 著的抑制S匪C7721細胞侵襲能力，且抑制SMMC7721細胞侵襲能力呈現濃度依賴性。此結果 說明式（III)所示的補骨脂酪衍生物具有顯著的抗腫瘤細胞侵襲作用，并與藥物濃度呈正 比。
[0081] 實施例8. Transwell小室法檢測式（III)所示的補骨脂酪衍生物對人肝癌細胞 (SMMC7721)遷移能力的影響：
[0082] 該實驗部分通過化answell小室法檢測化合物抑制人肝癌細胞(SMM 口 721)的遷移 能力。
[0083] (1)實驗材料：
[0084] 細胞株：人肝癌細胞（SMMC7721)來源于美國American Type Qilture Collection (ATCC)公司。
[0085] 試劑:PX-478化IF-Ια特異性抑制劑）、氯化鉆購自美國Sigma公司；多聚甲醒購自 美國Sigma公司；DMEM培養液、DMS0、0.25 %膜蛋白酶、青霉素和鏈霉素購自Hyc 1 one ; Transwel 1購自Costar公司；胎牛血清購自中國杭州四季青生物技術公司。
[0086] 儀器:二氧化碳培養箱(美國甜化L LAB公司），倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。
[0087] (2)方法：
[0088] 誘導SMMC7721細胞缺氧模型：同實施例5中的細胞培養部分。
[0089] Transwell小室法:取對數生長期SMMC7721細胞，消化離屯、，用含式（III)所示的補 骨脂酪衍生物的無血清培養基稀釋細胞至5 X 105/mL，每個化answell小室中加入10化L，下 室每孔加入含5%胎牛血清的DMEM高糖培養基60化L，培養24小時后取出小室，用棉簽擦去 小室上層未遷移的細胞，4%多聚甲醒室溫固定15分鐘，0.1%結晶紫染色15分鐘，各取5個 400X視野顯微鏡下觀察拍照。遷移抑制率/% = (1 -實驗組遷移細胞數/對照組遷移細胞 數）X100%。
[0090] (3)實驗結果如圖4所示，從結果可看出，不同濃度式（III)所示的補骨脂酪衍生物 處理人肝癌細胞（SMMC7721)24小時后，可觀察到式（III)所示的補骨脂酪衍生物具有顯著 的抑制SMMC7721細胞遷移能力，并呈現濃度依賴性。此結果說明式(III)所示的補骨脂酪衍 生物具有顯著的抗腫瘤細胞侵襲作用，并與藥物濃度呈正比。
[0091] 實施例9.Western blotting法檢測式（III)所示的補骨脂酪衍生物對人肝癌細胞 (SMMC7721)中 HIF-la、MMP-2、MMP-9 蛋白表達的影響：
[0092] (1)實驗材料：
[0093] 細胞株：人肝癌細胞（SMMC7721)來源于美國American Type Qilture Collection (ATCC)公司。
[0094] 試劑：PX-478化IF-Ια特異性抑制劑）、氯化鉆購自美國Sigma公司；DMEM培養液、 DMS0、0.25%膜蛋白酶、青霉素和鏈霉素、購自Hyclone; 6孔板購自Corning公司；胎牛血清 購自中國杭州四季青生物技術公司；兔抗人HIF-化抗體購自Abeam公司;匪P-2、MMP-9購自 S曰nt曰cruz公司。
[00M]儀器：SP-DJ系列垂直凈化工作臺（上海普通物理光學儀器廠），二氧化碳培養箱 (美國S肥化LAB公司），凝膠成像系統（美國BIO-RAD公司）；電泳儀(美國BIO-RAD公司）；倒 置巧光顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；超速離屯、機(美國BECKMAN)。
[0096] (2)方法：
[0097] Western blotting:調細胞濃度為2 X 105接種于6孔板，2mL/孔，24小時后加入不 同濃度的式(III)所示的補骨脂酪衍生物W及陽性對照藥PX-478,作用24小時。收集培養細 胞，用冰PBS清洗后，濾紙吸干液體后加入細胞裂解液，200化/孔，置冰上30分鐘，細胞刮下， 轉移至EP管內80°C凍存，經3次反復凍融后BCA法定量。取蛋白提取物40yg，加入5 X SDS上樣 緩沖液，100 °C煮沸10分鐘，做SDS-PAGE電泳，積層膠恒壓50V，分離膠恒壓100V，電泳至漠酪 藍燃料到達凝膠最前沿，停止電泳。
[0098] 轉膜：電泳結束后掲膠，并將凝膠浸于適量的化ansfer buffer中。同時取適當大 小的PVDF膜和4張3M濾紙，將PVDF先在無水甲醇中浸濕，然后同濾紙一起浸于Transfer buffer中，膜放陽極、膠放陰極，兩面各墊2張3M濾紙，恒壓60V，4°C層析柜中轉膜2小時。
[0099] 封膜:將轉有蛋白的膜浸于含10%脫脂奶粉的TBST中封閉1小時。雜交:取出已封 閉的膜，然后浸于一定比例稀釋的HIF-化、MMP-2、MMP-9-抗(含5 %脫脂奶粉的TBST，pH7.4 配制），在4°C過夜。TBST漂洗5次(每次5分鐘），再浸于1:2000稀釋的二抗(含5%脫脂奶粉的 TBST，pH7.4配制）中，在室溫1小時，TBST漂洗4次（每次5分鐘）。配制顯色液化化A0.5ml， E化B 0.5ml)，放置凝膠成像系統中顯色分析。
[0100] (3)實驗結果如圖5所示，式(III)所示的補骨脂酪衍生物在2.5、5、10、25ymol/L濃 度條件下，可劑量依賴性地抑制SMMC7721細胞中HIF-la、MMP-2、MMP-9蛋白的表達。
[0101] 總之，實施例7~9的實驗結果充分說明式（III)所示的補骨脂酪衍生物可通過抑 制腫瘤細胞侵襲轉移而發揮抗腫瘤作用。
【主權項】
1. 一種補骨脂酪衍生物，其特征在于，具有如式(I)所示的結構式：2. -種如權利要求1所述的補骨脂酪衍生物的制備方法，其特征在于，包括W下步驟： (1) W二氯甲燒為溶劑，1摩爾份補骨脂酪與10摩爾份苯甲酸在室溫下進行醋化反應， 待補骨脂酪不再被消耗時，加水終止反應； (2) 反應液用二氯甲燒萃取，萃取液水洗后，干燥，減壓濃縮得到油狀混合物； (3) 利用硅膠柱色譜分離混合物得到如式(I)所示的補骨脂酪衍生物。3. -種補骨脂酪衍生物，其特征在于，具有如式(II)所示的結構式：4. 一種如權利要求3所述的補骨脂酪衍生物的制備方法，其特征在于，包括W下步驟： (1) W丙酬為溶劑，1摩爾份補骨脂酪與1.5摩爾份硝酸儀在室溫下進行單硝化反應，獲 得中間化合物2-硝基補骨脂酪； (2) 將1摩爾份中間化合物2-硝基補骨脂酪溶于二氯甲燒中，加入4摩爾份丙酸酢，室溫 下進行丙酷化反應； (3) 反應結束后，用二氯甲燒萃取，水洗萃取液并干燥，減壓濃縮得到油狀混合物； (4) 利用硅膠柱色譜分離混合物，得到如式(II)所示的補骨脂酪衍生物。5. -種補骨脂酪衍生物，其特征在于，具有如式(III)所示的結構式：6. -種如權利要求5所述的補骨脂酪衍生物的制備方法，其特征在于，包括W下步驟： (1) 取補骨脂酪Immol，溶解于甲醇中，在冰水浴攬拌條件下緩慢加入稀硫酸，升溫至室 溫，TLC監控反應； (2) 待原料消耗完畢，減壓濃縮去除甲醇，反應液用二氯甲燒萃取，萃取液水洗后干燥； 減壓濃縮得到油狀混合物； (3)利用硅膠柱色譜分離混合，得到如式(III)所示的補骨脂酪衍生物。7. 權利要求1或3或5所述的補骨脂酪衍生物作為活性成分在制備抑制腫瘤細胞增殖、 侵襲與轉移藥物中的應用。8. 根據權利要求7所述補骨脂酪衍生物作為活性成分在制備抑制腫瘤細胞增殖、侵襲 與轉移藥物中的應用，其特征在于:所述的補骨脂酪衍生物被配制為用于口服或注射給藥。9. 根據權利要求7所述的補骨脂酪衍生物作為活性成分在制備抑制腫瘤細胞增殖、侵 襲與轉移藥物中的應用，其特征在于：所述的腫瘤細胞為MDA-MB-23USMMC7721、胎pG2或 SW480。10. 權利要求9所述的補骨脂酪衍生物作為活性成分在制備抑制腫瘤細胞增殖、侵襲與 轉移藥物中的應用，其特征在于:所述的補骨脂酪衍生物被配制為液體制劑、片劑、顆粒劑、 沖劑、丸劑、膠囊、緩釋劑、滴丸劑或注射劑的劑型。
【文檔編號】A61P35/04GK106083592SQ201610534329
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月7日
【發明人】吳成柱, 霍強, 馬濤, 劉大川, 李紅梅, 郭星
【申請人】蚌埠醫學院