磷酸肌酸鈉的藥物組合物及其在生物醫藥中的應用
【專利摘要】本發明公開了磷酸肌酸鈉的藥物組合物及其在生物醫藥中的應用，本發明提供的磷酸肌酸鈉的藥物組合物中含有磷酸肌酸鈉和一種結構新穎的天然產物化合物(Ⅰ)，磷酸肌酸鈉、化合物(Ⅰ)單獨作用時，對肺癌具有抑制作用；磷酸肌酸鈉和化合物(Ⅰ)聯合作用時，對肺癌的抑制效果進一步提高，可以開發成治療肺癌的藥物，與現有技術相比具有突出的實質性特點和顯著的進步。
【專利說明】
磯酸肌酸納的藥物組合物及其在生物醫藥中的應用
技術領域
[0001] 本發明屬于生物醫藥領域，設及憐酸肌酸鋼的新用途，具體設及憐酸肌酸鋼的藥 物組合物及其在生物醫藥中的應用。
【背景技術】
[0002] 憐酸肌酸鋼是臨床常用的屯、肌保護劑、運動員運補劑。憐酸肌酸廣泛地分布于身 體各組織，90%在肌肉組織中，憐酸肌酸是用來維持ATP水平的。憐酸肌酸通過開放合成通 路和減少分解作用，保護肌纖維膜免受缺血損害并維持細胞的核著酸儲油。臨床用于屯、麻 搏癥的屯、臟保護及屯、肌代謝窘迫的其他狀況。適用于屯、肌缺血、肥厚、屯、梗及屯、衰的治療 (輔助治療）。亦可用作各種屯、臟手術。
[0003] 迄今為止，尚未見憐酸肌酸鋼及其藥物組合物與肺癌的相關性報道。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種憐酸肌酸鋼的藥物組合物，該藥物組合物中含有憐酸 肌酸鋼和一種結構新穎的天然產物，憐酸肌酸鋼和該天然產物可W協同治療肺癌。
[0005] 本發明的上述目的是通過下面的技術方案得W實現的：
[0006] -種具有下述結構式的化合物(I)，
[0007]
[000引一種憐酸肌酸鋼的藥物組合物，包括憐酸肌酸鋼、如權利要求1所述的化合物（I) 和藥學上可W接受的載體，制備成需要的劑型。
[0009] 進一步地，藥學上可W接受的載體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、 崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體或潤滑劑。
[0010] 進一步地，所述劑型包括片劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、 膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。
[0011] 上述化合物（I)的制備方法，包含W下操作步驟：（a)將杜仲葉粉碎，用65~85%乙 醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油酸、乙酸乙醋和水飽和的正下醇萃 取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取物；（b)步驟(a)中正下醇萃取物 用大孔樹脂除雜，先用6%乙醇洗脫8個柱體積，再用70%乙醇洗脫8個柱體積，收集70%洗 脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（C)步驟(b)中70%乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分 離，依次用體積比為50:1、25:1、15:1和5:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到4個組分；（d)步 驟山）中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為10:1、5:1和2:1的二氯甲燒-甲醇梯 度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百 分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化 合物(I)。
[0012] 進一步地，化合物(I)的制備方法中，所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。
[0013] 上述化合物(I)在制備治療肺癌的藥物中的應用。
[0014] 上述憐酸肌酸鋼的藥物組合物在制備治療肺癌的藥物中的應用。
[001引本發明的優點：
[0016] 本發明提供的憐酸肌酸鋼的藥物組合物中含有憐酸肌酸鋼和一種結構新穎的天 然產物，憐酸肌酸鋼和該天然產物單獨作用時，對肺癌具有治療作用；二者聯合作用時，對 肺癌的治療效果進一步提高，可W開發成治療肺癌的藥物。
【具體實施方式】
[0017] 下面結合實施例進一步說明本發明的實質性內容，但并不W此限定本發明保護范 圍。
[0018] 實施例1:化合物(I)分離制備及結構確證
[0019] 分離方法：（a)將杜仲葉（3kg)粉碎，用75%乙醇熱回流提取(2化X3次），合并提取 液，濃縮至無醇味（化），依次用石油酸(化X3次）、乙酸乙醋（化X3次）和水飽和的正下醇 (化X3次）萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取物；（b)步驟(a)中 正下醇萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，先用6%乙醇洗脫8個柱體積，再用70%乙醇洗脫8個 柱體積，收集70 %洗脫液，減壓濃縮得70 %乙醇洗脫濃縮物；（C)步驟(b)中70 %乙醇洗脫濃 縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為50:1(8個柱體積）、25:1(8個柱體積）、15:1(8個柱體 積)和5:1(10個柱體積）的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到4個組分；（d)步驟(C)中組分4用正 相硅膠進一步分離，依次用體積比為10:1(8個柱體積）、5:1(10個柱體積)和2:1(5個柱體 積)的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反 相硅膠分離，用體積百分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個柱體積洗脫液， 洗脫液減壓濃縮得到化合物(IKHPLC歸一化純度大于98% )。
[0020] 結構確證:皿斗51-15顯示[1+化]+為111八455.2045，結合核磁特征可得分子式為 C2姐32〇7，不飽和度為9。核磁共振氨譜數據SH(ppm，CDCb，500MHz): H-la(1.27，m)，H-lb (1.51，m)，H-2a(1.81，m)，H-2b(1.93，m)，H-3(5.91，br，s)，H-5(3.02，d，J=1.3Hz)，H-6 (6.83，d，J=1.3Hz)，H-9(2.36，m，2H)，H-12a(6.29，d，J = 9.6Hz)，H-12b(6.56，d，J = 9.6Hz)，H-13(1.88，s)，H-14(0.99，s)，H-15(1.56，s)，H-3，（5.14，q，J=6.3Hz)，H-4' (1.32，d J = 6.3Hz)，H-5a'（6.33，dj= 12.3Hz)，H-化'（6.62，dj = 12.3Hz)，4-AcO( 1.96， s)，3'-Ac0(l. 99，s);核磁共振碳譜數據 Sc(ppm，CDCl3,125MHz) :31.8(C 出，1-C)，22.8(C 出， 2-C)，73.6(CH，3-C)，83.0(C，4-C)，47.9(CH，5-C)，153.2(CH，6-C)，133.2(C，7-C),194.6 (C，8-C)，46.4(Ol2,9-C)，39.4(C，10-C)，142.3(C，ll-C)，116.6(ai2，12-C)，22.7(ai3，13- C)，18.3(Ol3，14-C)，18.9(ai3，15-C)，167.8(C，r-C)，138.6(C，2'-C)，65.1(CH，3'-C)， 19.3(CH3,4'-C)，127.2(CH2,5'-C)，169.9(C，4-Ac0)，21.5(Ol3,4-Ac0)，170.4(C，3'-Ac0)， 22.4(C出，3'-Ac0)。紅外波譜中的1757cm-i與1648cm-i吸收帶表明結構中存在幾基與雙鍵片 段。"C-NIR、DEPT和HSQ幻普中顯示有24個碳信號，包括六個甲基(兩個乙酷甲基），五個亞甲 基(兩個締控碳），四個次甲基(兩個連氧碳和一個締控碳），W及九個季碳（四個幾基碳，Ξ 個締控碳和一個連氧季碳上功能結構再結合不飽和數表明該化合物為雙環結構。iH- 醒R譜結合HSQC譜顯示四個甲基質子信號δκ 1.88(3H，s)、0.99(3H，s)、1.56(3H，s)、1.32 (3H，d，J = 6.3Hz)，兩個乙酷基甲基質子信號δHl.96(3H，s)與1.99(3H，s)，兩對端締控質 子信號δκ 6.33(lH，d，J=12.3Hz)與6.62(lH，d，J=12.3Hz)、6.29(lH，d，J = 9.細z)與6.56 αH，d，J = 9.6Hz)，兩個連氧次甲基質子信號δH5.91(lH，br，s)與5.14αH，q，J = 6.3Hz)， 一個締屬次甲基質子信號Sh 6.83αH，d，J=1.3化）；W上NMR數據可W確認該化合物為闊 巷菊酬衍生物。HMBC譜中H-12/C-11、H-13/C-11、H-14/C-10、H-15/C-4的相關信號可W歸屬 為闊巷菊酬上的片段，C-3位質子信號移向低場說明C-3^基被醋化，而通過HMB村普中的H- 3/C-r 相關信號得到進一步確認。HMBC譜中H-3 VAcO-3 7C-2 7C-4 '、H-4 7C-3 ' W 及H-5 7 C-27C-1'的相關信號可W確認結構中存在3'-乙酷基-2'-締-下酷氧基邊鏈結構。歷B村普 中，4-AcO/C-4的相關性表明C-4位連有另一個乙酷氧基。NOESY譜中He-1/H-14，He-1/H-3，H- 3/H-15W及H-14/H-15相關信號表明H-3、H-14和H-15在闊巷菊酬骨架的同偵U，此外Ηα-1/Η- 5相關信號暗示H-5在H-3、H-14和H-15的異側。該化合物的相對構型進一步通過X-單晶衍射 確認，C-3位的絕對構型通過酸解反應與Mosher法可W確認為R構型。綜合氨譜、碳譜、HMBC 譜和N0ESY譜，W及文獻關于相關類型核磁數據，可基本確定該化合物如下所示，立體構型 進一步通過ECD試驗確定，理論值與實驗值基本一致。
[0021 ]該化合物化學式及碳原子編號如下：
[0022]
[0023] 實施例2:藥理作用
[0024] 本實施例使用右蔽皮下接種肺癌瘤株細胞建立lewis肺癌小鼠模型，測定各組的 抑瘤率和Bcl-2及Bax表達水平，觀察藥物上調Bax、下調Bd-2的表達、誘導腫瘤細胞調亡來 抑制腫瘤生長的抗腫瘤作用。
[002引1、材料與方法
[0026] 1.1 動物
[0027] C57化/6純系小鼠，雄性6~8周，（20±2)g，北京維通利華公司動物實驗中屯、。
[002引1.2試劑與樣品
[0029] 憐酸肌酸鋼購自中國藥品生物制品檢定所。化合物（I)自制，制備方法見實施例1。 兔抗鼠 Bax單克隆抗體、兔抗鼠 Bd-2單克隆抗體(SANTACRUZ公司）、二步法免疫組化檢測試 劑盒，DAB顯示劑(北京中杉金橋公司）。瘤株Lewis肺癌，Lewis肺癌荷瘤鼠由中科院腫瘤研 究所提供并傳代保種;Lewis肺癌維持在巧7BL/6小鼠體內，每2周傳代1次。
[0030] 1.3小鼠分組及模型制備
[0031 ] C57化/6小鼠隨機分組，每組12只，分別為模型對照組(NS組）、憐酸肌酸鋼組、化合 物（I)組、憐酸肌酸鋼與化合物（I)組合物組。每只小鼠右蔽皮下接種肺癌瘤株細胞，建立 lewis肺癌小鼠模型，從接種腫瘤次日開始，分別腹腔注射給藥。生理鹽水(NS)組:0.9%生 理鹽水0.2mL，連續lOd;憐酸肌酸鋼組:40mg/(kg · d)，連續給藥lOd;化合物（I)組:40mg/ (kg · d)，連續給藥lOd;憐酸肌酸鋼與化合物（I)組合物組：40mg/(kg · d)憐酸肌酸鋼+ 40mg/化g · d)化合物（I)，連續給藥lOd。末次給藥后2地，小鼠稱重，處死。
[0032] 1.5瘤重測定實驗
[0033] 末次給藥后24h將小鼠稱重，斷頸處死，剝取瘤塊稱重。
[0034] 抑瘤率（％ )=(模型組平均瘤重-治療組平均瘤重)/模型組平均瘤重X 100%。
[0(X3日]1.化ewis肺癌Bd-2、Bax表達變化的測定實驗
[0036] 免疫組化法測定Bcl-2、Bax表達。瘤塊W石蠟包埋制成4μπι厚的切片，脫蠟、水化 后，3 %Η202滅活內源性過氧化物酶，高壓抗原修復，后續步驟按照二步法免疫組化檢測試 劑盒說明書操作。陰性對照^0.01111〇1/1?85(抑=7.4)代替一抗。在光學顯微鏡下觀察鹽水 對照組和各給藥實驗組樣本的免疫組化切片。
[0037] 結果判定:每張切片在5~10個高倍視野下進行細胞計數，每個視野計數100~200 個細胞，共1000個細胞，計算每張切片陽性細胞數所占比例。Bcl-2在胞漿出現棟黃色染色 為陽性染色。Bax在胞漿和(或)胞膜出現棟黃色染色為陽性染色。
[003引1.7統計學方法
[0039] 數據均Wx±s表示，采用SPSS13.0軟件進行數據處理，單因素方差分析。
[0040] 2、實驗結果
[0041 ] 2.1對Lewis肺癌模型小鼠實體瘤的影響
[0042] 與模型對照組比較，憐酸肌酸鋼與化合物（I)組合物組瘤重明顯減小(P<0.01)， 抑瘤率明顯增加(P<〇.01);與模型對照組比較，憐酸肌酸鋼組、化合物（I)組瘤重減小(P< 0.05)，抑瘤率增加(P<0.05)。結果見表1。
[0043] 2.2對Lewis肺癌模型小鼠 Bd-2及Bax表達的影響
[0044] 與模型對照組比較，憐酸肌酸鋼與化合物（I)組合物組Be 1 -2表達明顯降低（P < 0.01 )，Bax表達明顯升高(P < 0.01);與模型對照組比較，憐酸肌酸鋼組、化合物（I)組Be 1 -2 表達降低(P<〇.〇5)，Bax表達升高(P<0.05)。結果見表1。
[0045] 表1對小鼠體內Lewis肺癌生長及Bd-2、Bax表達水平的影響(x±s，n = 10)
[0046]
[0047] 肺癌的發生是一個設及多因素多階段的復雜過程，近年來研究表明，肺癌的發生 可能是由于細胞調亡與增殖失衡造成的。細胞調亡是細胞自身的一種主動的、生理性死亡 機制，細胞調亡過程受促調亡因子和調亡抑制因子的共同調節。其中Bcl-2和Bax屬于Bcl-2 同一家族，與人類多種腫瘤的發生有密切關系的基因。Bcl-2是從人類濾泡型非霍奇金B細 胞淋己瘤克隆到的原癌基因，其通過穩定線粒體膜的功能，阻止線粒體釋放化spase、調亡 誘導因子和細胞色素 C等作用抑制細胞調亡。Bcl-2通過抑制細胞調亡而參與腫瘤的發生。 Bax基因具有括抗Bcl-2的作用，是促調亡基因。當Bax蛋白大量表達，并與Bd-2蛋白形成異 源二聚體時加速細胞死亡，Bcl-2和Bax的表達程度對決定細胞接受調亡信號后存活與否起 關鍵作用。目前，多數研究表明，Bcl-2與Bax的表達之間呈負相關，Bcl-2過量表達，細胞存 活;Bax蛋白過量表達，細胞死亡。
[0048] 結果表明，憐酸肌酸鋼、化合物（I)單獨作用時，對肺癌具有抑制作用;憐酸肌酸鋼 和化合物(I)聯合作用時，對肺癌的抑制效果進一步提高，可W開發成治療肺癌的藥物。
[0049] 上述實施例的作用在于說明本發明的實質性內容，但并不W此限定本發明的保護 范圍。本領域的普通技術人員應當理解，可W對本發明的技術方案進行修改或者等同替換， 而不脫離本發明技術方案的實質和保護范圍。
【主權項】
1. 一種具有下述結構式的化合物（I)，2. -種憐酸肌酸鋼的藥物組合物，其特征在于:包括憐酸肌酸鋼、如權利要求1所述的 化合物(I)和藥學上可W接受的載體，制備成需要的劑型。3. 根據權利要求2所述的憐酸肌酸鋼的藥物組合物，其特征在于:藥學上可W接受的載 體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載 體或潤滑劑。4. 根據權利要求2所述的憐酸肌酸鋼的藥物組合物，其特征在于:所述劑型包括片劑、 膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射 劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。5. 權利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于，包含W下操作步驟：（a)將杜 仲葉粉碎，用65~85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油酸、乙酸乙 醋和水飽和的正下醇萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取物；（b) 步驟(a)中正下醇萃取物用大孔樹脂除雜，先用6%乙醇洗脫8個柱體積，再用70%乙醇洗脫 8個柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（C)步驟(b)中70 %乙醇洗 脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為50:1、25:1、15:1和5:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗 脫得到4個組分；（d)步驟(C)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為10:1、5:1和 2:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反 相硅膠分離，用體積百分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個柱體積洗脫液， 洗脫液減壓濃縮得到化合物(I)。6. 根據權利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為AB-8型 大孔吸附樹脂。7. 權利要求1所述的化合物（I)在制備治療肺癌的藥物中的應用。8. 權利要求2~4任一所述的憐酸肌酸鋼的藥物組合物在制備治療肺癌的藥物中的應 用。
【文檔編號】C07C69/73GK106083590SQ201610378383
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年5月31日
【發明人】黃芳
【申請人】黃芳