溶瘤性hsv載體的制作方法

溶瘤性hsv載體的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種重組溶瘤性單純皰疹病毒(oHSV)，其包含特異性針對在細胞(例如癌細胞)表面上存在的分子(蛋白、脂質或碳水化合物抗原決定簇)的非HSV配體，和插入到一個或多個HSV基因(優選地為HSV在正常(即，非癌性)細胞中復制所需的一個或多個HSV基因)座中的一個或多個拷貝的一種或多種microRNA靶序列。本發明進一步提供了包含創新的oHSV的原液和藥物組合物，以及使用所述創新的oHSV殺滅腫瘤細胞的方法。
【專利說明】溶瘤性HSV載體
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本專利申請要求于2013年10月28日提交的美國臨時專利申請61/896,497的優先 權，其全部內容在此通過引用并入。
[0003] 關于聯邦政府資助的研究與開發的聲明
[0004] 本發明是在由美國國立衛生研究院授予的基金號CA119298、CA163205、CA175052、 NS040923和DK044935下借助政府支持而進行的。政府在本發明中具有某些權利。
[0005] 發明背景
[0006] 即便應用現有的聯合療法，多形性膠質母細胞瘤(GBM)仍是一種致命性疾病。臨床 前研究表明具有復制能力的病毒載體(包括溶瘤性HSV( "oHSV"）載體)有望成為替代性的治 療方法，但其在患者的臨床試驗中治療效果有限。實現載體安全性依賴于減毒載體突變，而 該突變還可能會危害在腫瘤細胞中的裂解復制。
[0007] 發明概述
[0008] 本發明提供了一種具有腫瘤選擇性擴增能力但未減毒的oHSV，其可通過結合再靶 向腫瘤相關細胞表面受體的載體和由細胞microRNA( "miR"）導致的載體的復制抑制來實 現，其中所述細胞mi croRNA在正常腦中高度表達而在腫瘤細胞中幾乎是不存在的。miR反應 性元件在裸鼠腦中阻礙載體的發病過程，而不妨礙在體外或異種腦腫瘤模型中的原代腫瘤 細胞中的胞溶性載體復制。該新載體設計將提供一種更安全且更有效的載體平臺，并可進 一步開發以應用于患者腫瘤。
[0009] 附圖若干視圖的簡要說明
[0010] 圖1呈現了來自T124元件的有效性和特異性的實驗結果的數據。將在3'UTR中包含 T124(pfLuc-T124)或對照序列(pfLuc-Ctrl)的螢火蟲熒光素酶(fLuc)表達質粒與海腎熒 光素酶(prLuc)內參質粒共轉染入在24小時前已經轉染了合成的pre-miR-124或pre-miR-21的HEK293AD細胞中。48小時后測定熒光素酶活性。結果表示為根據rLuc活性進行標準化 的fLuc活性的三次測定值的均值土標準偏差。具有統計學上顯著性差異的數據對由相應P 值(未配對t檢驗)下的方括號表示。
[0011] 圖2呈現了來自膠質瘤細胞中病毒復制實驗結果的數據。（A)載體圖。親本K0S-37BAC在病毒UL37和UL38基因之間包含ΙοχΡ側接的BAC序列、氯霉素抗性序列和lacZ序列 ("BAC"）（Gierasch等人，2006)。如下闡明了用于生成KGBAC和KG4: T124BAC的修飾：gB:NT， gB基因中的增強病毒進入的雙重突變;gC-eGFP，經由2A肽序列將完整gC 0RF融合至GFP; Δ Joint，刪除完整的內部重復區，包括1個拷貝的所述ICP4基因；ICP4:T124,將T124插入剩余 的ICP4基因的3'UTR中。UL，病毒基因組的單一長片段;US，單一短片段。（B)T124對于培養中 的來源于患者的膠質瘤細胞中病毒復制的作用。以0.01的Μ0Ι采用KG或KG4:T124病毒感染 G1 i68和GBM30細胞，并且一式三份進行平行實驗。在感染后的指定時間點，收集細胞裂解物 和上清液并在U20S細胞上測定滴度。值為均值土標準偏差。（C)LV124感染的Gli68細胞中的 MiR-124表達。在5cfu/細胞感染細胞，之后三天在含嘌呤霉素培養基中進行篩選，并收獲總 RNA提取物。對照RNA來自未感染的Gli68和U20S細胞。通過qRT-PCR三重測定miR-124水平并 根據RNU43的水平進行數據標準化。所顯示的數據是相對于U20S細胞增加的倍數±標準偏 差。所有數據對間的P〈〇.〇5(未配對t檢驗）。0)在miR-124轉導和對照GBM30和Gli68細胞中 的KG和KG4:T124病毒復制。用LV124或LV137R以5cfu/細胞感染細胞，采用嘌呤霉素篩選3 天，并用KG或KG4: T124以0.01的MOI重復感染。在U20S細胞上測定在感染后72小時和96小時 收集的細胞裂解物和上清液中合并的感染性HSV的滴度。結果為來自三個HSV感染的平行實 驗的均值±標準偏差。方括號指示具有顯著差異的數據對，同時示出了相應P值(未配對t檢 驗)。
[0012]圖3呈現了來自裸鼠腦中KG4:T124病毒復制和毒性實驗結果的數據。將4.8xl09基 因組拷貝的KG或KG4: T124顱內注射入各4只BALB/c裸鼠 （η = 4/組）。（A)載體注射后的經時 動物重量。左，注射KG的動物;X，動物死亡。右，注射KG4: T124的小鼠；實心圓，動物處死。（B) 載體注射后鼠腦中的經時總病毒基因組拷貝。收集來自載體注射組的在第5、14、21和33天 處死的單只KG4:T124注射小鼠和來自KG注射組的在第5天安樂死的具有嚴重疾病癥狀的最 后存活動物的腦，分離DNA，通過qPCR測定每個腦中的病毒載體基因組總數。（C)本實驗中動 物的Kaplan-Meier存活曲線。箭頭指示來自KG4 : T124注射組的單只動物的處死日。P = 0.0058,對數秩檢驗。
[0013]圖4呈現了來自人惡性膠質瘤裸鼠模型的EGFR再靶向miR-124敏感性HSV載體治療 的實驗結果的數據。顏內移植磨碎的GBM30細胞并在5天后在相同坐標注射PBS或1.8xl08gc 的 KGE 或 KGE-4:T124 病毒。（A)Kaplan-Meier 存活曲線。對數秩統計：KGE 對 PBS，P = 0.0188; KGE-4: T124 對 PBS，P = 0.0009; KGE 對 KGE-4:1124，？ = 0.8327。（8)腫瘤細胞移植后的經時動 物重量。X，動物死亡或安樂死。
[0014] 圖5呈現的數據證明KMMP9介導酶活性MMP9的過表達。（A)KMMP9和KGw的結構。（B) 感染KMMP9、KGw或KG(M0I = 0.1)的Vero細胞的細胞裂解物的蛋白印跡分析。β-微管蛋白和 HSV糖蛋白Β分別可視化作細胞和病毒加載對照。采用KGw或ΚΜΜΡ9在MOI = 1下感染原代GBM 細胞系(C)或Vero細胞(D)。感染24小時后收集細胞裂解物和上清液并組合(C)或單獨加載 (D)在10%聚丙烯酰胺/0.1%明膠凝膠上。電泳后37°C下過夜培養所述凝膠，用0.05%考馬 斯藍染色并脫染，并記錄圖像。縮寫1，冗麗?9;6，1??;1?，對照病毒;1111.，未感染$8，糖蛋白 B;Sup.，上清液。
[0015] 圖6呈現的數據證明KMMP9和KGw顯示出可比的細胞進入和生長模式。(A)在圖上列 出的多種gc/細胞下采用病毒感染圖左所列細胞。6小時后固定細胞并免疫染色ICP4JB)分 離GBM30和(C)GBM169細胞并采用KMMP9或KGw在200gc/細胞下進行感染。在1、2、4和6dpi下 收集細胞裂解物并通過qPCR測定病毒基因組拷貝滴度。在任一宿主細胞系中均未觀測到兩 種病毒間的顯著性差異(GBM30:P = 0.20;GBM169:P = 0.11)。
[0016]圖7呈現的數據證明KMMP9在與KGw的比較中顯示出相似或更高的體外腫瘤細胞殺 滅。10或100gc/細胞下感染U87、SNB19或GBM30細胞3或7天。通過MTT試驗測定相對于未感染 細胞的細胞存活百分數(n = 3;星號:P〈0.05，未配對學生t檢驗）。
[0017] 圖8呈現的數據證明MMP9改善oHSV在球狀體中的感染性。在懸浮液中生長GBM30細 胞并用lxl〇3pfu的KMMP9或KGw對其進行感染。2-6dpi下在整體球狀體中每日可視化兩種載 體中來自gC-T2a-eGFP盒的綠色熒光。(A)3和5dpi下的代表性圖像。（B)每種載體6個球狀體 中eGFP信號的平均量化證實了 KMMP9比KGw感染性增加約2倍斤=0.006)。（(^)在4xl07基 因組拷貝/球狀體下用KMMP9或KGw感染兩組GBM30球狀體。固定球狀體、用DAPI染色，并以5μ m間隔記錄Ζ面共焦圖像。圖（C)顯示了自Ομπι至150μπι 3D重建后的分別來自ΚΜΜΡ9和KGw組的 2個代表性球狀體。藍色，DAPI;綠色，eGFP。圖（D)顯示了來自各組的2個球狀體在Z = 1 ΟΟμπι 下的Ζ面。（Ε)根據Ζ軸深度將各球狀體分為5段（自下而上:0-20μm、25-50μm、55-80μm、85-100 μm、105-120μm和125-140μm)。通過用平均eGFP信號除以DAPI信號計算球狀體各段中的 相對信號強度。η = 7;星號:Ρ〈0.05.
[0018] 圖9呈現了關于GBM裸鼠模型的ΚΜΜΡ9治療的數據。顱內移植GBM30細胞并在5天后 在相同坐標(0 · 5mm前、2mm側（右）、3mm深)注射ΚΜΜΡ9、KGw或roS。每日監控動物并當顯示發 病跡象時將其處死。數據呈現為Kaplan-Meier存活曲線。采用KMMP9或KGw治療的動物相比 于采用PBS治療的那些動物顯著存活更長時間（P〈0.01)。在KMMP9和KGw之間未發現顯著差 異(n = 4;P = 0.61，對數秩檢驗）。
[0019] 圖10描述了每個病毒或模擬(PBS)治療GBM30動物治療組中的一個動物的T2加權 腦MRI圖像。（A)在GBM30移植10天后進行治療并在治療前1天(-1天)和治療后第3、6、9和13 天收集圖像。(B)相同天數計算的腫瘤體積。
[0020] 發明詳述
[0021] 本發明提供了一種重組oHSV，其包含特異性針對在細胞(例如癌細胞)表面上存在 的分子(蛋白、脂質或碳水化合物抗原決定簇）的非HSV配體，和插入到一個或多個HSV基因 (優選地為HSV在正常（即，非癌性)細胞中復制所需的一個或多個HSV基因）座中的一個或多 個拷貝的一種或多種mi croRNA祀序列。本發明進一步提供了包含所述創新的oHSV的原液和 藥物組合物，以及使用所述創新的〇HSV殺滅腫瘤細胞的方法。
[0022]所述創新的oHSV的非HSV配體被并入暴露在所述HSV表面上的糖蛋白（例如gD或 gC)中以使用所述配體促進靶向目標細胞。例如，所述配體可被并入至gD的殘基1和25之間。 用于靶向GBM和其它癌細胞的優選配體包括靶向EGFR和EGFRvIII、CD133、CXCR4、癌胚抗原 (CEA)、ClC-3/膜聯蛋白-2/MMP-2、人轉鐵蛋白受體和EpCAM的那些，且所述配體可靶向此受 體或細胞表面分子，即，所述配體能夠特異性結合此受體或細胞表面分子。文獻中已描述了 EGFR和EGFRvIII特異性配體，例如抗體，scFv(單鏈抗體）和VHH(單域抗體）（Kuan等人， Int .J · Cancer，88，962-69 (2000); Wicks trand 等人，Cancer Res.，55(14): 3140-8( 1995); Omidfar 等人，Tumor Biology，25:296-305(2004);還參見 Uchi da 等人.Molecular Therapy ,21:561-9(2013);還參見Braidwood等人，Gene Ther.，15,1579-92(2008))。
[0023]所述oHSV通過結合配體也可以或可替代地是靶向與癌癥非必要相關的其它細胞 表面分子或受體。例如，配體可包含自天然配體結合域(例如，生長因子(例如EGF，其可靶向 EGFR，NGF，其可靶向trkA等））、肽或非肽激素、選擇結合靶分子的肽(例如，預設計錨蛋白重 復蛋白（DARPins))等。所述創新的oHSV還可包含gB和/或gH的突變形式，所述gB和/或gH的 突變形式促進載體通過非經典受體進入(且優選地在所述oHSV的基因組內這些基因的一種 或兩種中也具有此突變）。
[0024]包含在所述創新的載體中的優選microRNA靶序列（優選為其串聯多拷貝）是miR-124,其對于神經應用具有特殊應用（例如，當使用所述創新的oHSV用于治療神經系統腫瘤 (例如GBM)時保護非癌性神經元）。可替代使用其它microRNA靶序列保護其它類型的組織， 且選擇適當microRNA靶序列以保護期望的組織或細胞類型是在本領域的普通技術范圍內。 例如，miR-122和miR-199在正常肝細胞中表達而不在原發性肝癌中表達;因此，miR-122和/ 或miR-199microRNA祀序列中的一種或組合可用在應用所述創新的〇HSV來治療肝癌的實施 方式中。類似地，miR-128和/或miR-137microRNA靶序列可用在用于保護正常腦部的oHSV 中。一種示例性microRNA革E1序列可為microRNA的反向互補序列。
[0025] 所述microRNA靶序列優選包含在HSV基因的3'非翻譯區（"UTR"）中，以在所述 microRNA存在時沉默該基因。優選地，串聯插入多拷貝（例如兩拷貝、三拷貝、四拷貝、五拷 貝、六拷貝、或更多)所述microRNA革E1序列。優選地，所述多拷貝的所述microRNA革E1序列通過 四個或更多個核苷酸(更優選地八個或更多個核苷酸）的間隔序列相分離。不希望受限于理 論，但據信更大的間隔(例如，大于約8個核苷酸)提供增加的穩定性。
[0026]更優選地，為幫助保護非癌細胞免受HSV感染的溶解效應，所述多拷貝的microRNA 靶序列插入非癌細胞復制所必需的HSV基因的3'UTR中，其為普通技術人員所知的。優選地， 所述位點為HSV基因組內正常（或天然)基因座中mi croRNA靶基因的3 ' UTR。本發明的優選 oHSV包含插入ICP4基因 3 'UTR中的多拷貝的所述microRNA靶序列，例如在具有兩個天然拷 貝的所述ICP4基因的載體中的一個或兩個拷貝的所述ICP4基因。
[0027]所述創新的HSV載體的基因組可另外包含一個或多個外源性表達盒（即，包含與啟 動子、增強子和其它適當調控元件可操作連接的編碼序列），例如編碼報告蛋白（例如綠色 熒光蛋白）、溶瘤因子或增強腫瘤殺滅活性的試劑(例如腫瘤壞死因子（"TNF"）或TNF-相關 性凋亡誘導配體（"TRAIL"）、或其它在治療上重要的基因產物(例如，肽、藥物活化酶、抗體、 治療性RNA等）。優選的外源性表達盒編碼基質金屬蛋白酶，例如基質金屬蛋白酶9 ("MMP9"），其降解膠原IV型（細胞外基質(ECM)和惡性膠質瘤基底膜的主要成分）（Mammato 等人，Am.J.Pathol.，183(4) : 1293-1305(2013)，doi: 10. 1016/ j .ajpath. 2013.06.026 .Epub 2013年8月5日），因此由于橫向擴張增強所述創新的載體的 腫瘤細胞感染并增強腫瘤殺滅活性。還優選編碼增強所述創新的HSV的橫向擴張的其它基 因的表達盒。
[0028]其它優選的外源性表達盒編碼誘導針對所述創新的HSV用于治療的癌癥或腫瘤的 患者免疫反應的蛋白或多肽。例如，此表達盒可包含編碼因子（如細胞因子（例如，IL-2和 IFN B))、針對細胞毒性T-淋巴細胞相關蛋白4( "CTLA-4"）的抗體（Hodi等人， N. Engl.J. Med.，363(8):711-23(2010))、針對程序性細胞死亡蛋白1 ( "PD Γ )配體或受體自 身的抗體（Topalian等人，N.Engl.J.Med.，366(26) :2443-54(2012))以及上皮細胞黏附分 子（"EpCAM"）（Patriarca等人，Cancer Treatment Rev.，38:68_75(2012))的一個或多個核 酸。如上所述，EpCAM還可用作被所述創新的載體所識別的靶向標記。而且，在待治療癌癥不 是CNS癌癥時，且更具體地不是膠質瘤或惡性膠質瘤的情況下，另一轉基因可編碼粒細胞巨 噬細胞集落刺激因子（"GM-CSF")。
[0029]其它優選的表達盒編碼催化前藥轉化為活性劑的蛋白或多肽。例如，此表達盒可 編碼酶，例如胞嘧啶脫氨酶，其可在感染所述創新的載體的腫瘤或癌細胞中局部轉化5-氟 胞嘧啶（"5-FC"）為5-氟尿嘧啶（"5-FU"）（參見例如，Akimoto等人，J.Ophthalmol ·，86(5): 581-86(2002))，以便允許5-FU在此細胞或腫瘤內局部起效而最小化5-FU的系統暴露。類似 地，此表達盒可編碼胸苷激酶(tk)(例如，可操作地連接至HSV即刻早期啟動子或強組成型 啟動子），其可活化更昔洛韋，或嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)，其可阻斷或減弱核糖核苷酸還原 酶的活性。在某些實施方式中，所述創新的載體還可包含功能性天然HSV tk基因。
[0030] 在所述創新的載體內，所述外源性表達盒內的編碼序列可以可操作地與任何期望 的基因調節序列連接，例如組成型啟動子或可誘導的或組織特異型啟動子，其許多實例是 現有技術中已知的。例如，一種通常使用的組成型啟動子是人巨細胞病毒(hCMV)啟動子，并 且還可使用其它啟動子，例如，CMV早期增強子/雞β-肌動蛋白（CAG)啟動子和HSV即刻早期 啟動子(例如，ICP4啟動子)等。
[0031] 并且，在某些實施方式中，所述創新的載體的基因組包含內源重復(接合）區連同 所述ICP47基因的啟動子的刪除，所述重復(接合）區包含一個拷貝的各種二倍體基因 ICP0、 ICP34.5、LAT和ICP4。在其它實施方式中，替代刪除所述接合，可通過刪除這些基因或另外 限制它們的突變形成而沉默所述接合區中基因（特別是ICP0和/或ICP47)的表達。
[0032]所述創新的載體可通過HSV病毒學領域普通技術人員已知的標準方法制備。然而， 為便于操作所述HSV基因組并制造所述創新的載體，本發明還提供了編碼所述創新的載體 的核酸。一種優選的核酸是編碼所述創新的載體的細菌人工染色體（"BAC"），其便于操作細 菌系統中的所述HSV。
[0033] 應當意識到所述創新的oHSV可用于靶向并殺滅癌細胞，無論在體內或在體外。一 種優選的應用是在治療上使用所述創新的載體，特別是在人類患者中和/或針對人類腫瘤/ 細胞(其可為各種哺乳動物中的異種移植物）。然而，所述方法還可用于動物中，例如伴侶動 物(例如，貓和狗），或農業上重要的動物(例如牛、羊、馬等)或動物學上重要的動物。所述創 新的載體可用于治療的示例性腫瘤/癌細胞涉及中樞神經系統癌癥，且特別是多形性惡性 膠質瘤。
[0034]通常，當足量病毒可被遞送至細胞群體以確保所述細胞接觸適當量的病毒時，所 述創新的〇HSV載體最為有用。因此，本發明提供了一種原液，優選均質原液，其包含所述創 新的〇HSV載體。HSV原液的制備和分析是本領域中公知的。例如，可在包含采用oHSV載體轉 導的細胞的滾瓶中制造病毒原液。然后可在連續Nycodenze梯度上純化所述病毒原液，并等 分和貯存至需要使用時。病毒原液在滴度上相差很大，主要取決于病毒基因型以及用于制 備它們的方案和細胞系。優選地，此原液具有至少約1〇 5空斑形成單位(pfu)的病毒滴度，例 如至少約106pfu或甚至更優選至少約10 7pfu。在又一更優選實施方式中，所述滴度可為至少 約108pfu，或至少約109pfu，且至少約10 1()pfu或至少約10npfu的高滴度原液最為優選。例如 可使用表達所述載體靶向的受體的細胞建立此滴度。
[0035]本發明另外提供了包含所述創新的oHSV載體和運載體(優選生理學上可接受的運 載體)的組合物。所述組合物的運載體可為用于所述oHSV載體的任何適宜運載體。所述運載 體典型地為液體，但也可為固體，或者液體和固體組分的組合。所述運載體理想地是藥學上 可接受的（例如，生理學上或藥理學上可接受的）運載體(例如，賦形劑或稀釋劑）。藥學上可 接受的運載體是公知的并易于獲得。運載體的選擇將取決于(至少部分)用于給藥所述組合 物的特定載體以及特定方法。所述組合物可進一步包含任何其它適當組分，尤其用于增強 組合物的穩定性和/或其最終用途。因此，具有多種本發明組合物的適當制劑。以下制劑和 方法僅為示例性的且絕非限制。
[0036]適用于腸胃外給藥的制劑包括水性和非水性、等滲無菌注射溶液，其可包含抗氧 化劑、緩沖劑、抑菌劑以及使所述制劑與意圖接受者的血液等滲的溶質，以及可包含懸浮 劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑和防腐劑的水性和非水性無菌懸浮液。所述制劑可呈現在單位 劑量或多劑量密閉容器中，例如安瓿和小瓶，并可貯存在僅需在即用前加入無菌液體賦形 劑(例如注射用水)的冷凍干燥(凍干)條件中。即用注射溶液和懸浮液可制自前述類型的無 菌粉末、顆粒和片劑。
[0037] 此外，所述組合物可包含附加的治療劑或生物活性劑。例如，可存在用于治療特定 適應癥的治療因子。控制炎癥的因子(例如布洛芬或類固醇)可做為所述組合物的部分以減 少與體內給藥所述載體相關的腫脹和炎癥以及生理痛苦。可連同組合物方法給藥免疫系統 抑制劑以減少針對所述載體自身的任何免疫反應或相關紊亂。或者，所述組合物中可包含 免疫增強劑以上調機體對疾病，特別是對所述創新的載體用于針對的癌癥或腫瘤的自然防 御。可存在抗生素（即殺菌劑和殺真菌劑）以降低與轉基因程序相關的感染和其它紊亂的風 險。
[0038] 實施例1
[0039]目的：多形性膠質母細胞瘤(GBM)是一種沒有有效療法的侵襲性腦瘤。已將oHSV載 體設計用于在動物中治療人GBM模型，但在患者試驗中證明其功效令人失望。我們試圖開發 一種實現高選擇性腫瘤裂解而無載體減毒的新型〇HSV設計。
[0040] 實驗設計:我們報道了在腫瘤細胞中選擇性感染和復制的工程化oHSV，所述選擇 性是通過憑借EGFR的完全再靶向感染以及通過憑借將多拷貝的神經元特異性miR-124的識 別序列引入必需的ICP4即刻早期HSV基因的3'UTR以在正常神經元中阻斷載體復制。選擇 miR-124是因為其在神經元中高度表達但在GBM中幾乎檢測不到。在異種腦瘤治療實驗中測 試載體功效。
[0041] 結果:采用miR-124敏感性病毒高劑量顱內接種裸鼠未產生發病或病毒復制跡象， 這與通過miR-124與ICP4mRNA的相互作用在正常腦中阻塞病毒復制相符。采用EGFR再靶向、 miR124敏感性HSV在裸鼠中治療原代人GBM的原位模型證明了與采用親本EGFR再靶向病毒 治療相當的長期存活率(彡50%)，因此表明miR-124識別元件未導致降低的療效。
[0042]結論:我們總結認為通過組合載體感染的腫瘤靶向與通過在腫瘤中不存在而在正 常組織中高度表達的細胞microRNA實現的脫靶載體復制的消除可最大化未減毒oHSV的特 異性。
[0043] 介紹
[0044] GBM是有效療法依舊難以捉摸的最為惡性的癌癥形式之一。標準醫學實踐(例如外 科手術以及放療和化療）已顯示出有限的長期臨床收益。許多實驗室中正在開發包括來源 于單純皰疹病毒1型(oHSV-ι)的那些在內的溶瘤性載體作為潛在的替代治療策略(i) wHSV 載體已顯示出治療原代GBM動物模型的前景，但除了提供良好安全性以外，來自早期臨床試 驗的結果未證實有效的腫瘤殺滅或患者存活的一致改善(2) (3)。
[0045] 實現HSV減毒的最常見方法是功能性刪除規避宿主針對感染的先天免疫反應的非 必需基因，提供用于在非分裂細胞（如神經元)復制的核苷酸池，以及預防細胞凋亡（2)。癌 細胞中病毒復制受到某些先天免疫反應喪失(4)以及快速細胞分裂和失活的凋亡途徑(2) 的促進。然而，這些特性對于當前oHSV在多種腫瘤中的大量復制并非都是足夠的。
[0046] 作為改善載體功效的第一步，我們之前開發了用于完全再靶向HSV的方法以將感 染從經典HSV進入受體重定向至高表達的腫瘤細胞表面受體(例如EGFR和EGFRvIII) (5)。再 靶向的〇HSV顯示出強大的溶瘤活性以及對人GBM細胞的高度特異性，導致原位小鼠模型中 高水平的人類腫瘤破壞。此外，該治療載體產生了大多數受治療動物的長期存活且無載體 相關性毒性。然而，大多數高度表達的腫瘤相關性細胞表面標記均以一定程度存在于正常 細胞類型中，因此，我們尋求通過獨立機制在正常腦中阻斷病毒復制而不減少在腫瘤中的 復制，以增加腫瘤靶向性非減毒載體的安全性。
[0047]近期研究已運用正常和癌細胞間micr〇RNA(miRNA)表達模式的差異作為腫瘤靶向 的替代途徑(6)。已確定有至少30種miRNA在惡性膠質瘤、神經元和神經前體細胞(NPCs)中 差異表達(7)(8)，提示這些差異可用于限制正常腦細胞中病毒復制而允許腫瘤細胞中的無 阻復制。在此我們證實將miR-124識別元件并入基本上野生型病毒的必需ICP4基因阻止了 高度表達miR-124的正常腦組織中HSV的復制。此外，我們顯示所述miR-124反應元件未降低 EGFR再靶向載體的溶瘤活性。重要的是，因為腫瘤表型取決于miR-124的持續缺失，所以潛 在上調miR-124作為從裂解病毒復制的細胞逃逸機制將限制細胞不受控制的增殖能力并因 此不會危害載體功效。在缺乏miR-124的細胞中進行載體的生成，因此在原液制備期間沒有 產生miR-124抗性病毒突變體的選擇壓力。總而言之，這些特征賦予了載體安全性和腫瘤選 擇性，并提示了適用于多種腫瘤類型的溶瘤性載體設計的總體策略。
[0048] 結果
[0049] miR-124反應元件的驗證。在神經元內表達水平高于GBM細胞內表達水平的多種 miRNA中，miR-124是最為豐富的在GBM中具有最小表達的一種(6)。我們設計了由不同的8個 核苷酸(nt)間隔序列相分離的成熟miR-124反向互補序列的4個串聯拷貝組成的miR-124反 應元件(T124)。為評估此序列的功能性，我們將其插入螢火蟲熒光素酶(fLuc)表達質粒的 3'UTR并在經報道很少表達或不表達miR-124的U20S骨肉瘤細胞中用特異性(pre-miR-124) 或非特異性(pre-miR-21)前體miRNA同其進行共轉染實驗(9);包含海腎熒光素酶(rLuc)表 達質粒用于標準化。結果(pfLuc-T124,圖1)顯示在24小時時在采用pre-miR-124共轉染的 細胞中fLuc活性相比于模擬共轉染細胞或采用pre-miR-21共轉染的細胞嚴重降低。相反， 在采用包含4個拷貝的反向miR-21序列的對照fLuc質粒進行轉染的細胞(pfLuc-Ctrl，模 擬)和采用pre-miR-21或pre-miR-124的pfLuc-Ctrl共轉染之間僅觀測到很小的fLuc表達 差異（圖1)。這些結果證實了 T124元件作為miR-124-介導的基因表達限制的有效和特異靶 點的功能性。
[0050] 針對miR-124表達的T124修飾HSV的復制敏感性。我們在大腸桿菌中使用雙Red重 組（10)將一系列修飾引入K0S-37BAC，所述K0S-37BAC為細菌人工染色體(BAC)上的HSV-1K0S菌株的全長基因克隆（11)。刪除產物KG BAe(圖2A)的包含一個拷貝的各種二倍體基因 1〇?0、10?34.5、1^1'和10?4的內源重復(接合）區以及所述10?47基因的啟動子。該刪除有助 于對4個刪除基因的剩余拷貝的操作、提供了用于增強病毒溶瘤活性的轉基因的潛在并入 的充裕空間、并通過降低神經毒性因子ICP34.5的表達增加了腫瘤特異性（12);消除ICP47 表達有益于病毒特異性T細胞對經感染癌細胞的免疫識別（4)。隊^還包含經由2A肽序列 (13)(14)融合至糖蛋白C(gC)0RF的GFP開放閱讀框(0RF)以允許監控后期（復制后）病毒基 因的表達。最后，我們顯示在gB基因中包含一對突變的KG bag增強HSV通過非經典受體的進入 (15) (16)。我們將所述T124序列重組入KGbag的剩余ICP4基因的3 'UTR中以產生KG4: T124bac (圖2A)。通過轉染U20S-Cre細胞，兩種BAC構建體均轉化為病毒顆粒，伴隨同時除去位于 loxP位點間的BAC序列。斑塊純化后，制備KG和KG4: T124病毒原液并在U20S細胞上測定滴 度。
[0051 ]我們首先測定ICP4 3'UTR中4個串聯miR-124靶向位點的引入是否會在培養中影 響人GBM細胞中的病毒復制。結果（圖2B)顯示在兩種原代惡性膠質瘤細胞系Gli68和GBM30 的球狀體中KG4:T124以與KG相似的動力學進行復制，且所述2種病毒的產率在任何時間點 均無實質差異。我們接著測定復制和病毒產率是否對用人miR-124表達慢病毒(LV124)轉導 這些細胞系敏感。圖2C顯示了 U20S、Gli68和Gli68-LV124細胞中的miR-124相對水平，其測 定是通過在逆轉錄小RNA上進行實時qPCR并標準化至內源性RNU43水平。KG在采用表達人 miR-137(LV137R)的反向互補序列(LV137R)的慢病毒構建體轉導的Gli68-LV124和Gli68細 胞中同樣良好地生長并具有相似滴度（圖2D)。相反，KG4:T124在前者中相比于在后者中生 長不良，且采用LV124-相較于LV137R-轉導GBM30細胞也獲得了相似結果（圖2D)。結合來說， 這些觀測強烈表明（i) ICP4基因中的T124元件作為以miR-124依賴性方式限制HSV復制的手 段是有效的，和（ii)2種GBM細胞系中內源性miR-124的水平足夠低以最小化該作用。此外， qRT-PCR數據證實了 KG4: T124與KG相比，U20S細胞更適用于KG4: T124的未受損生長和滴度 測定。
[0052] KG4:T124未在鼠腦中復制或導致疾病。已經顯示在培養中的原代膠質瘤細胞中外 源性miR-124表達在阻止KG4:T124載體生長方面高度有效的情況下，我們接著測試鼠腦中 miR-124的內源性水平是否足以預防載體復制以及與野生型病毒相關的典型神經發病;我 們注意到成熟人和小鼠 miR-124在序列上相同（17)。我們這些實驗中使用裸鼠以限制宿主 抗病毒反應效應并因而便于鑒定將T124插入病毒中的直接效應。選擇BALB/c nu/nu小鼠，因為 這些動物對于HSV復制和發病高度敏感（18) (19) (20)且已在之前用于針對人腫瘤細胞的腫 瘤治療功效實驗（21) (12，22) (5)。我們比較KG對照載體和miR-124敏感性測試載體KG4: T124的以下兩種能力：在裸鼠腦中復制以及在將相等基因組拷貝（gc)數目（4.8xl09gc)顱 內接種入右半球后導致致死感染。結果顯示注射對照載體導致動物在5天內快速死亡（圖 3A，C)，經感染的腦內存在的總gc數增加2倍（圖3B)。相反，如其直至處死的正常增重所例證 的，KG4: T124注射小鼠在33天觀測期間不具有可觀測的健康改變（圖3A)，且病毒gc含量在 此時間期間穩定下降至約輸入量的0.4% (圖3B)。采用對照或測試載體接種的動物之間的 存活差異（圖3C)是高度顯著的(P = 0.0058,對數秩檢驗），表明插入ICP4基因3'UTR中的4個 拷貝的miR-124識別序列能夠在高度HSV敏感性裸鼠的腦中阻斷致死載體復制。因此，單獨 的這些序列足以預防腦中的載體毒性。
[0053]為證實來自這些結果的啟示（即，在病毒原液制備期間miR-124靶向位點的喪失或 突變滅活是極其稀少的），從KG4:T124病毒原液分離DNA并將其置于覆蓋ICP4 3'UTR中T124 插入位點的PCR。通過凝膠電泳的產物分析和DNA測序顯示沒有異常的PCR產品尺寸或核苷 酸變異性證據（數據未示出）。同樣地，采用KG4:T124病毒顱內接種正常BALB/c小鼠 (1.5xl0 1()gC)3小時或21天后分離的全腦DNA的PCR和序列分析顯示整個T124區沒有異常(數 據未示出）。這些結果減輕了對于在KG4:T124病毒生長期間或在體內的miR-124不敏感性變 體潛在的選擇的顧慮。
[0054] miR-124反應元件未損害EGFR靶向的溶瘤性HSV的活性。我們接著尋求確定保護性 miR-124識別元件是否會不利地影響人GBM的裸鼠模型中的病毒性腫瘤殺滅活性。因為當接 種入這些動物的腦中時，KG是高度有毒的（圖3C)，使用該病毒作為荷瘤小鼠存活實驗中的 治療對照可能會導致動物因所述病毒而非腫瘤死亡，因此其不具吸引力。取而代之，基于我 們發表的完全EGFR再靶向的野生型HSV-1K0S對裸鼠腦部無毒性但在裸鼠中原位人GBM的治 療中有效的發現(5)，我們將4拷貝的miR-124結合位點引入KG的完全EGFR再靶向衍生物。因 此，KG的EGFR再靶向版本和KG4: T124(分別稱作KGE和KGE-4: T124)的比較應能確定miR-124 位點對病毒溶瘤活性的任何限制效應。我們使用患者來源的成球GBM30細胞在裸鼠中建立 侵襲性顱內腫瘤(5)。每日觀測動物并當其顯示發病跡象時將其安樂死。和我們發表的結果 相似，腫瘤細胞接種5天后在相同立體定位坐標注射PBS的小鼠在腫瘤細胞移植數周內死亡 (中位數21.5;圖4A，B)。相反，使用EGFR再靶向對照病毒KGE或包含T124的再靶向載體KGE-4:T124的腫瘤治療在實驗持續期間（90天)保護了半數的動物且這兩組的中位生存期是可 比的（分別為79.5和85.5天;Ρ = 0.83，對數秩檢驗）。這些結果表明KGE-4: T124ICP4基因中 的miR-124位點未損害GBM30腫瘤治療功效。
[0055] 討論
[0056] 我們的目標是構建一種溶瘤性HSV載體，其表達完全補足的病毒功能，但可僅感染 表達GBM相關受體的細胞并僅在腫瘤而非正常腦細胞中進行高效復制。腫瘤選擇性感染和 裂解性病毒生長依賴于完全病毒進入再革E向（complete viral entry retargeting) (5)和 在正常腦組織中細胞miRNA介導的病毒復制限制的組合。此轉錄和翻譯后腫瘤靶向的組合 有望提供非常安全和有效的〇HSV，因為裂解性感染需要對于維持腫瘤表型而言重要的靶細 胞的兩個單獨特性:革G向受體和腫瘤特異性miRNA表達模式。使用適合不同癌癥的革E1向和 miRNA反應元件，該總體策略是廣泛可適用的;通過考慮相同類型的個體腫瘤間特異性抗原 和miRNA表達的差異可將其應用優化以用于個體化治療。
[0057] 在GBM中，改變的基因表達包括多種miRNA相比于正常腦組織的實質性下調（23-25)，表明若干可能的miRNA可用于在正常腦中優先減毒工程化病毒的復制。因為miR-124被 認為是神經元分化的潛在誘導物(26)且在GBM中最為高度下調(6)，我們將此miRNA聚焦為 在正常腦組織中阻斷〇HSV復制的手段。將miR-124的重復識別位點（T124)引入病毒ICP4基 因的3'UTR中，其中ICP4基因的產物是啟動HSV裂解周期所絕對需要的。我們發現在膠質瘤 細胞中，T124+病毒可與缺乏T124的對照病毒一樣強力地進行實質復制而miR-124的慢病毒 表達選擇性地阻斷其復制。此外，T124元件足以完全保護裸鼠免受非常高的顱內載體劑量 (4.8xl0 9顆粒)的影響而對照載體在5天內殺滅所有動物。這些動物腦中總病毒基因組拷貝 數的測定未顯示出T124+載體復制的證據而是病毒基因組含量的經時逐漸減少。如通過在 來自病毒原液和感染動物的純化DNA中擴增的ICP43 ' UTR的尺寸和序列分析所評估的，所述 T124序列是穩定的，這與在無腫瘤動物中或在來自我們腫瘤治療實驗的長期幸存者中缺乏 明顯的神經發病學相符。最后，我們使用一種不能感染小鼠細胞的再靶向病毒以證實T124 元件未降低此病毒在人GBM裸鼠模型中的溶瘤功效。
[0058]病毒靶向腫瘤受體和miRNA介導的正常細胞中病毒復制的阻斷的組合通過阻斷可 與腫瘤共享靶向受體(例如，EGFR)的正常細胞的生產性感染而增強裂解病毒的靶向特異 性。雖然我們的結果顯示將四拷貝的miR-124靶序列插入ICP4基因3'UTR中完全阻斷了裸鼠 中非常高劑量的病毒的神經發病，但并非所有腦細胞都表達miR-124。例如，預期位于海馬 體和室下區（SVZ)中的神經元前體細胞(NPC)不被所述miR-124靶序列保護，因為這些細胞 具有與GBM細胞相似的miRNA表達模式，包括miR-124的最小表達（27)。然而，若干miRNA在 NPC中以比在膠質瘤中高至100倍的水平表達(27) (28) (29) (30)，提示將附加的miRNA的靶 向位點構建入相同病毒的相同或其它必需基因處以在更廣范圍的腦細胞內阻斷復制而不 損害腫瘤特異性病毒復制的可能性。
[0059]雖然我們的研究提示病毒靶向腫瘤抗原和miRNA限制正常組織中復制的組合是一 種有效且高特異性腫瘤病毒療法的有吸引力的策略，但很有可能個體腫瘤對于治療的反應 將由于腫瘤抗原水平以及可能的miRNA含量的可變性而不同。例如，在歸類為GBM的腫瘤間 存在顯著差異，且甚至是在分子定義的GBM亞型內，基因表達模式的異質性保留（31)。因此， 單一再靶向病毒將不能有效針對所有GBM或相同亞型的所有GBM。此外，可預期由于腫瘤內 預先存在或治療誘導的細胞-細胞(cell-to-cell)變異性而在大量oHSV敏感性腫瘤中可出 現抗性細胞群體。過去若干年的發展提示在許多不同腫瘤類型中認定的小群體的自我更 新、化療和放療抗性癌癥干細胞(CSC)是治療的最相關靶點（32)。雖然比較給定腫瘤和個體 CSC是有問題的，但很有可能其在腫瘤內的變異性相對于完全腫瘤細胞群體是受限的。文獻 中報道描述了不同的膠質瘤干細胞(GSC)標記(33)且再靶向溶瘤性病毒可用于區分這些中 的每種對于在裸鼠中建立和維持人GBM的意義。我們預期再靶向不同GSC候選標記的載體的 組合能夠更為有效地治療對個體再靶向載體顯示出部分反應的腫瘤。因為每種這些載體還 可靶向某些正常細胞，類似于我們的EGFR再靶向病毒，因此在這些正常細胞中miRNA介導的 病毒復制阻斷將越發重要。此外，如由Kambara和同事在oHSV領域中所倡導的（34)，可使用 細胞類型或發育階段特異性啟動子獲得進一步的特異性以控制關鍵病毒復制功能的表達。 雖然這些特征可提供高活性和特異性的溶瘤性載體混合物，但值得注意的是載體（例如 KGE-4:T124)具有充足空間以容納可增強治療功效的轉基因，例如基因編碼免疫調節劑、月中 瘤細胞迀移抑制劑或降解腫瘤細胞外基質并因而促進瘤內病毒擴張的蛋白水解酶。
[0060]總而言之，本實施例中所述KGE-4:T124載體代表了一種新型OHSV，其包含病毒復 制功能的完全補足，但由再靶向腫瘤相關受體的病毒包膜和對在正常組織而非腫瘤中表達 的miRNA的復制敏感性的組合獲得了腫瘤特異性。此控制系統的組合可應用于其它腫瘤類 型，但之前尚未在溶瘤性載體中進行描述。我們的策略的關鍵優勢是（i)所述載體不包含任 何缺陷基因，可在腫瘤中最大化病毒復制以提供優化的溶瘤病毒療法，以及（ii)載體復制 同時需要重要腫瘤相關細胞表面標記的表達以及實質上不同于正常組織的腫瘤特異性的 miRNA表達模式。我們策略的最引人注目的論據在于經選擇的在正常腦中控制載體復制的 miRNA不能在不損害腫瘤表型的情況下在惡性膠質瘤中上調(7,25,35);損失靶向受體，例 如被我們的載體所識別的腫瘤特異性EGFRvIII變體，可具有相似效果。因此，雖然在大多數 癌癥療法中腫瘤發展了逃逸治療的能力，但采用腫瘤抗原靶向性、miRNA調節病毒不大可能 發生此結果。總而言之，這些論據支持以下預期:我們的方法將提供用于治療GBM和其它癌 癥的高度選擇性、安全和有效的溶瘤性HSV載體系統。
[0061 ]材料和方法
[0062]細胞培養。U20S、HEK293T 和 HEK293AD 細胞來自 ATCC(Manassas，VA)并在 37°C 下5% C〇2培養器中在添加了5-10% (v/v)胎牛血清(FBS; Sigma，St. Louis，M0)的ATCC推薦培養基 中生長。通過逆轉錄病毒轉導生成穩定表達Cre重組酶(U20S-Cre)的U20S細胞系（Y. Μ.和 J. C. G.，未發表結果）ΑΒΜ30和Gli68患者來源的原代膠質瘤球狀體細胞系由E. A. Chiocca (哈佛醫學院，ΜΑ)慷慨提供，并生長在添加了 2%(V/v)B27w/〇維生素 A、2mg/mL兩性霉素 B (Lonza，Walkersville，MD)、100yg/mL慶大霉素（Lonza)、2mM L-谷氛醜胺（Cellgro， Manassas，VA)、加 10ng/mL重組人表皮生長因子(rhEGF)和10ng/mL重組人堿性成纖維細胞 生長因子（bFGF)(均來自 Shenandoah Biotechnology，Warwick，PA)的Neurobasal培養基 (Gibco/Invitrogen/Life Technologies，Carlsbad，CA)中。
[0063] 質粒。pfLuc-T124包含通過8個核苷酸相分離的hsa-miR-124序列的反向互補序列 的四個串聯重復序列，而pfLuc-ctrl包含通過8個核苷酸相分離的hsa-miR-21反向序列的 四個串聯重復序列。兩種質粒的構建均是通過將退火的互補寡核苷酸插入PMIR-REP0RT? (miRNA Expression Reporter載體系統;Ambion，Austin，TX)中焚光素酶基因的3 ' UTR。寡 核苷酸為T124-F、T124-R、TconF和TconR(表1)。退火的寡核苷酸采用Spel和SacI消化，并連 接到 Spe I-Sac I 消化的 pMIR-REPORT?。
[0064] HSV基因組工程化。在細菌人工基因組(BAC)上包含完整菌株KOS HSV-1基因組的 K0S-37BAC(11)由David Leib(達特茅斯醫學院，NH)友善提供。該BAC中的HSV短獨特(Us)區 相對于 HSV-lK0S(36)(GenBank 登記號 JQ673480)公開序列（132、275-145、608位）（36)為反 方向。以下進一步詳述的修飾是通過雙Red重組引入，其基本如Tischer等人（10)所述。質粒 pEPkan-S和pBAD-I-scel(lO)是由Nikolaus 0sterrieder(柏林自由大學，德國）慷慨提供。 通過PCR分析、限制性內切酶消化的FIGE分析和局部DNA測序核實改變。
[0065] 如下所示，按順序得到本研究中使用的載體。KGBAe來源于K0S-37BAC，其通過刪除 完全HSV內部重復區或"接合"（IRL，IRs)獲得，經由Thosea asigna病毒2A(T2A)翻譯終止/再 起始序列（13)(37)將綠色熒光蛋白（GFP)開放閱讀框(0RF)融合至糖蛋白C(gC)0RF，以及在 gB編碼序列（gB: N/T; (15)中引入兩個錯義突變。KG4: T124BAe是從KGBAe通過將來自pfLuc-T124的T124元件插入ICP4基因的3'UTR創建得到的。再靶向載體KGE bag來源于KGbag，其通過 在gD 1位和25位之間包含人EGFR特異性單鏈抗體序列的gD-scEGFR的相應區域替換gD基因 的氨基末端區以及密碼子38處的錯義突變(5)獲得。KGE-4:T124 bag結合了來自KG4:T124bac 和KGEbag的修飾。
[0066] 病毒生長和純化。通過使用Lipof ectamine?LTX試劑（Invitrogen)轉染U20S_Cre 細胞將BAC DNA轉為感染性病毒;這些細胞中表達的Cre重組酶可除去病毒生長抑制性BAC 元件以及鄰近的位于K0S-37BAC中的lacZ基因和ΙοχΡ重組信號之間的衍生物（11)。通過有 限稀釋分離單一斑塊并通過X-gal染色測試lacZ基因的消除（38)。使無色斑塊經受兩個附 加循環的有限稀釋并通過純化病毒體DNA的局部DNA測序證實BAC/lacZ區的準確移除。在 U20S細胞上確立病毒原液的生物滴度(PFU/mL);如下所述，通過針對病毒gD基因的定量實 時PCR (qPCR)測定基因組拷貝的物理滴度(gc) /mL。
[0067] 焚光素酶試驗。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)將海腎焚光素酶表達質粒 prLuc連同不同的螢火蟲焚光素酶表達質粒和口代-11111?1'%11?財前體(41]113；[011)的組合轉染 HEK293AD細胞。第二天，裂解細胞并使用Berthold LB_953AutoLumat光度計（Berthold Technologies USA，0ak Ridge，TN)測定螢火蟲-海腎熒光素酶表達比率。
[0068] miRNA的慢病毒表達。將來自U-87人惡性膠質瘤細胞的基因組DNA用作模板來使用 PCR擴增來自hsa-miR-124-3基因的人pri-miR-124序列，所述擴增使用高保真Accuprime富 GC DNA聚合酶（Invitrogen)和表1中所列的miR-124引物對。用BamHI和Nhel消化320-bp產 物，在miRNASelect pEP-miR載體(Cell Biolabs，San Diego，CA)內含子中的相應位點間克 隆，并確認序列。隨后通過替換固有EF1啟動子將所述啟動子-內含子-pri-miR-124區轉入 pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro(System Biosciences，Mountain View，CA)以產生慢病毒表達質 粒pCDH-miR-124。使用相同程序構建包含反方向pri-miR-137序列的對照慢病毒質粒 (pCDH-miR-137R);用于pri-miR-137克隆的PCR引物在表1中列出。通過采用包裝質粒pLPl、 pLP2、pLP-VSVG(Invitrogen)將 pCDH-miR-124 或 pCDH-miR-137R 分別共轉染入 HEK293T 細胞 產生慢病毒LV124和LV137RJ2小時后收獲上清液，通過0·45μπι濾器（Millipore， Billerica，MA)并在4°C和6,800x g下離心濃縮16小時。將球丸再懸在DMEM中并將其滴度表 示為對HEK293T細胞每ml的嘌呤霉素抗性集落形成單位(cfu)。
[0069] 在存在8yg/mL聚凝胺的情況下在具有5cfu/細胞的LV124或LV137R的懸浮液中感 染2xl05磨碎的Gli68或GBM30細胞90min并點板。次日用包含30yg/mL嘌呤霉素的新鮮培養 基喂養細胞并在72小時后用KG或KG4: T124病毒以0.0 lpfu/細胞的Μ0Ι重復感染。HSV感染后 72和96小時時從細胞和上清液收集感染性病毒顆粒并在U20S細胞上計算滴度。如下所述， 72小時嘌呤霉素選擇后從LV124感染的Gli68細胞的平行培養液分離RNA用于通過qRT-PCR 測定miR-124水平。
[0070] RNA分離和逆轉錄(RT)-qPCR。根據制造商的說明使用TRIzol試劑（Invitrogen)從 U20S、Gli68和LV124Gli68感染細胞提取總RNA。采用DNA酶I(Invitrogen)處理RNA樣本、使 用NanoDrop 2000c分光光度計（Thermo-Fisher，Pittsburgh，PA)定量并在MOPS-甲酸凝膠 上可視化用于質量保證。根據TaqMan Small RNA試驗方案（Applied Biosystems/Life Technologies，Carlsbad，CA)相對于 RNU43測定成熟 hsa-miR-124 水平。TaqMan 引物和探針 來自Applied Biosystems。所有TaqMan PCR反應重復進行三次。
[0071 ]動物。3-4周齡BALB/c無胸腺nu/nu小鼠購自Charles River實驗室(Wilmington， Μ)并飼養在BSL2設施中。根據如匹茲堡大學機構動物管理及使用委員會(IACUC)批準的實 驗動物護理及使用指南(實驗動物資源研究所，1985)中的要求和建議進行所有動物程序。 [00 72]盧頁內毒性。如同所述(5)進行盧頁內病毒接種。小鼠接受4.811098(：1(6或1(64:1'124病 毒(n = 4/組）。每日監控動物的發病跡象并隔日稱重。KG組的所有小鼠死于第5天且其它組 的一只小鼠在相同天數處死。KG4: T124組的剩余動物在第14、21和33天處死。從安樂死小鼠 收集全腦用于如下所述的總DNA提取和病毒基因組qPCR。
[0073] 病毒基因組qPCR。根據制造商程序使用DNeasy Blood&Tissue試劑盒（Qiagen， Valencia，CA)從鼠腦或病毒原液提取DNA。使用Applied Biosystems Step One?和 StepOnePlus?實時PCR系統手冊中描述的方案在來自包含完全HSV-1 (菌株K0S)gD編碼序列 (pE-gD18)的pENTRlA(Invitrogen)質粒的DNA上產生qPCR標準曲線。引物和探針序列在表1 中列出。
[0074] 表 1
[0076]
[0077]
[0078] 腫瘤模型和治療。根據描述(5)將人GBM30細胞顱內移植入裸鼠。在第5天時，也如 所述(5)在相同坐標處接種病毒（1 · 8xl08gc KGE或KGE-4: T124，η = 8/組)或PBS (η = 2)。如 上所述在"顏內毒性"項下監控動物健康狀況。當顯示發病跡象時將動物安樂死。
[0079] 統計分析。使用用于Windows的GraphPad Prism 6.01版（GraphPad Software，La Jol la，CA; www.graphpad.com)進行具有Welch修正的未配對t檢驗。將動物存活數據繪制為 Kap lan-Me i er曲線并使用相同軟件通過Mant e 1 -Cox對數秩檢驗進行比較。
[0080] 實施例1的參考文獻
[0081] 1.Parker JN,Bauer DF,Cody JJ,Markert JM.Oncolytic viral therapy of malignant glioma.Neurotherapeutics.2009；6:558-69.
[0082] 2.Grandi P，Peruzzi P，Reinhart B，Cohen JB，Chiocca EA，Glorioso JC. Design and application of oncolytic HSV vectors for glioblastoma therapy.Expert Rev Neurother.2009;9:505-17.
[0083] 3.Markert JM，Medlock MD，Rabkin SD，Gillespie GY，Todo T，Hunter TO等人， Conditionally replicating herpes simplex virus mutant?G207for the treatment of malignant glioma:results of a phase I trial.Gene therapy.2000；7:867-74.
[0084] 4.Todo T.Oncolytic virus therapy using genetically engineered herpes simplex viruses.Frontiers in bioscience : a journal and virtual library.2008； 13:2060-4.
[0085] 5.Uchida H，Marzulli M，Nakano K，Goins WF，Chan J，Hong CS等人，Effective treatment of an orthotopic xenograft model of human glioblastoma using an EGFR-retargeted oncolytic herpes simplex virus.Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy.2013；21:561-9.
[0086] 6 · Gaur A，Jewe 11 DA，L i ang Y，Ri dzon D，Moor e JH，Chen C等人， Characterization of microRNA expression levels and their biological correlates in human cancer cell lines.Cancer research.2007；67:2456-68.
[0087] 7.Karsy M，Arslan E，Moy F.Current Progress on Understanding MicroRNAs in Glioblastoma Multiforme.Genes&cancer.2012;3:3-15.
[0088] 8.Riddick G?Fine HA.Integration and analysis of genome-scale data from gliomas.Nature reviews Neurology.2011；7:439-50.
[0089] 9·Kumar MS，Lu J，Mercer KL，Golub TR，Jacks T·Impaired microRNA processing enhances cellular transformation and tumorigenesi s. Nature genetics.2007;39:673-7.
[0090] lO.Tischer BK?von Einem J?Kaufer B?Osterrieder N.Two-step red-mediated recombination for versatile high-efficiency markerless DNA manipulation in Escherichia coli.Biotechniques.2006；40:191-7.
[0091] ll.Gierasch ffff?Zimmerman DL，Ward SL?Vanheyningen TK，Romine JD，Leib DA. Construction and characterization of bacterial artificial chromosomes containing HSV-lstrains 17and K0S.J Virol Methods.2006；135:197-206.
[0092] 12.Bennett JJ，Delman KA，Burt BM，Mariotti A，Malhotra S，Zager J等人， Comparison of safety,delivery,and efficacy of two oncolytic herpes viruses (G207and NV1020)for peritoneal cancer.Cancer gene therapy.2002;9:935-45.
[0093] 13·Szymczak AL，Vignali DA.Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors.Expert Opin Biol Ther.2005；5:627-38.
[0094] 14.Doronina VA?ffu C?de Felipe P?Sachs MS?Ryan MD?Brown JD.Site-specific release of nascent chains from ribosomes at a sense codon.Mol Cell Biol.2008；28:4227-39.
[0095] 15.Uchida H，Chan J，Goins WF，Grandi P，Kumagai I，Cohen JB等人，A double mutation in glycoprotein gB compensates for ineffective gD-dependent initiation of herpes simplex virus type 1 infection.Journal of virology.2010； 84:12200-9.
[0096] 16.Uchida H，Chan J，Shrivastava I，Reinhart B，Grandi P，Glorioso JC等人， Novel Mutations in gB and gH Circumvent the Requirement for Known gD Receptors in Herpes Simplex Virus lEntry and Cell-to-Cell Spread.Journal of virology.2013;87:1430-42.
[0097] 17.Cao X，Pfaff SL，Gage FH.A functional study of miR_124in the developing neural tube.Genes&development.2007；21:531-6.
[0098] 1 8 · Fu j i oka N，Akazawa R，Ohash i K，Fu j i i Μ，I keda M，Kur imo t o M.Interleukin-18protects mice against acute herpes simplex virus type 1 infection.Journal of virology.1999；73:2401-9.
[0099] 19.Manickan E，Rouse RJ，Yu Z，Wire WS，Rouse BT.Genetic immunization against herpes simplex virus . Protection is mediated by CD4 + T lymphocytes.Journal of immunology.1995；155:259-65.
[0100] 20.Sethi KK?0mata Y?Schneweis KE.Protection of mice from fatal herpes simplex virus type linfection by adoptive transfer of cloned virus-specific and H-2-restricted cytotoxic T lymphocytes .The Journal of general virology.1983；64(Pt 2):443-7.
[0101] 21.Currier MA，Gillespie RA，Sawtell NM，Mahller YY，Stroup G，Collins MH 等人，Efficacy and safety of the oncolytic herpes simplex virus rRp450alone and combined with cyclophosphamide.Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy.2008；16:879-85.
[0102] 22.Hong CS，Fellows W，Niranjan A，Alber S，Watkins S，Cohen JB等人， Ectopic matrix metalloproteinase-9expression in human brain tumor cells enhances oncolytic HSV vector infection.Gene therapy.2010；17:1200-5.
[0103] 23.Zhang Y，Chao T，Li R，Liu W，Chen Y，Yan X等人，MicroRNA_128inhibits glioma cells proliferation by targeting transcription factor E2F3a.J Mol Med.2009；87:43-51.
[0104] 24.Shi L，Cheng Z，Zhang J，Li R，Zhao P，Fu Z等人，hsa-mir_181a and hsa-mir_181b function as tumor suppressors in human glioma cells.Brain Res.2008； 1236:185-93.
[0105] 25 · Silber J，Lim DA，Petritsch C，Persson AI，Maunakea AK，Yu M等人，miR-124and miR_137inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells.BMC Med.2008；6:14.
[0106] 26.Maiorano NA，Mallamaci A.The pro-differentiating role of miR-124: indicating the road to become a neuron.RNA Biol.7:528-33.
[0107] 27 .Lavon I，Zrihan D，Granit A，Einstein 0，Fainstein N，Cohen MA等人， Gliomas display a microRNA expression profile reminiscent of neural precursor cells.Neuro Oncol.12:422-33.
[0108] 28.Karpowicz P，Willaime_Morawek S，Balenci L，DeVeale B，Inoue T，van der Kooy D.E-Cadherin regulates neural stem cell self-renewal.J Neurosci.2009；29: 3885-96.
[0109] 29.Katoh Y?Katoh M.Hedgehog signaling ? epithelial-t〇-mesenchymal transition and miRNA(review).Int J Mol Med.2008;22:271-5.
[0110] 30.0cana 0H?Nieto MA. A new regulatory loop in cancer-cell invasion.ΕΜΒ0 Rep.2008;9:521-2.
[0111] 31 · Verhaak RG，Hoadley KA，Purdom E，Wang V，Qi Y，Wilkerson MD 等人， Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA，IDH1，EGFR，and NF1.Cancer cell.17:98-110.
[0112] 32.Nduom EK?Hadjipanayis CG?Van Meir EG.Glioblastoma cancer stem-like cells: implications for pathogenesis and treatment. Cancer journal.2012；18:100-6.
[0113] 33. He J，Liu Y，Lubman DM. Targeting glioblastoma stem cells : cell surface markers. Current medicinal chemistry.2012；19:6050-5.
[0114] 34.Kambara H，0kano H，Chiocca EA，Saeki Y.An oncolytic HSV-lmutant expressing ICP34.5under control of a nestin promoter increases survival of animals even when symptomatic from a brain tumor. Cancer research.2005；65 : 2832-9.
[0115] 35.Xia H，Cheung WK，Ng SS，Jiang X，Jiang S，Sze J等人，Loss of brain- enriched miR_124microRNA enhances stem-like traits and invasiveness of glioma cells.The Journal of biological chemistry.2012；287:9962-71.
[0116] 36.Macdonald SJ,Mostafa HH,Morrison LA,Davido DJ.Genome sequence of herpes simplex virus lstrain KOS.Journal of virology.2012；86:6371-2.
[0117] 37.Kaji K,Norrby K,Paca A,Mileikovsky M,Mohseni P,ffoltjen K.Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature.2009；458:771-5.
[0118] 38.Krisky DM,Marconi PC,01igino T,Rouse RJ,Fink DJ,Glorioso JC.Rapid method for construction of recombinant HSV gene transfer vectors.Gene therapy.1997；4:1120-5.
[0119] 實施例2
[0120] 本實施例描述了裝載基質金屬蛋白酶9的腫瘤靶向I型oHSV以用于增強載體分布 和殺滅活性。
[0121] 材料和方法
[0122] 細胞系。通過標準方法培養人惡性膠質瘤SNB19、U251、U87(由匹茲堡大學H Okada 博士友善提供）、J/A、J/C、J/EGFR[9]、非洲綠猴腎臟Vero細胞和7b[ 15]。
[0123] 在補充了10%胎牛血清（Sigma.St.Louis，M0)的達爾伯克改良伊格爾培養基 (Life technologies，Grand Island，NY)中培養細胞。在補充了Glutamax、B27、人β-FGF、 EGF、肝素和青霉素-鏈霉素的Neurobasal培養基中，以球狀體形式培養原代惡性膠質瘤細 胞系GBM169、0G2(由俄亥俄州立大學Balveen Kaur博士友善提供）、GBM30。
[0124] 質粒。通過在KGE-4: T124BAC中插入采用如下引物擴增自pcDNA3 · 1GW的Gateway盒 以產生KGw BAC: 5 ' -TGCCCGTCGCGCGTGTTTGATGTTAATAAATAACACATAAATTTGGCTGGCCACTAGTCC AGTGTGGTGG-3 '（SEQ ID NO:12)和5 '-CTGAAATGCCCCCCCCCCCTTGCGGGCGGTCCATTAAAGACAACA AACAAATCCCCAGCATGCCTGCTATTGT-3 '·（SEQ ID NO:13)。
[0125] 通過將來自質粒pCAGH[10]的CAG啟動子克隆入pEntr-MMP9制備pEnCiLpEntr-MMP9的制備是通過將來自之前報道的質粒pCMV6-XL4-MMP9的mmp9cDNA克隆入pEntrlA質粒 [13]。
[0126] HSV基因組工程化。K0S-37BAC包含在細菌人工基因組(BAC)上完整菌株KOS HSV-1 基因組[14]，其由David Leib(達特茅斯醫學院，NH)友情提供。使用大腸桿菌內雙Red重組 [24]將一系列修飾引入K0S-37BAC，所述K0S-37BAC為細菌人工染色體(BAC)上的HSV-1K0S 菌株的全長基因克隆[14]。刪除產物KGBAC(圖5)的內源重復(接合）區連同所述ICP47基因 的啟動子，所述重復(接合)區包含一個拷貝的各種二倍體基因 ICP0、ICP34.5、LAI^PICP4。
[0127] KGwG4:T124BAC(稱作KGw)創建自KGE-4:T124BAC(在實施例1中討論過），上述創建 是通過經由Red/ET重組技術（Gene Bridges GmbH，Heidelberg)將Gateway盒（來自 pcDNA3. 1GW)和牛生長激素聚腺苷酸化序列插入UL3-UL4基因間隔區。MMP9表達載體 KMMP9G4: T124BAC(稱作KMMP9)來源于KGwG4: T124BAC，其產生是通過Clonase反應采用來自 pEnCM的CAG啟動子-MMP9盒替換GW盒。為產生所述病毒，用KGwG4:T124BAC或KMMP9G4: T124BAC轉染Vero 7b細胞。利用通過相關修飾區的FIGE繪圖、PCR和DNA測序確證所有重組 載體。
[0128] 病毒生長和純化。通過使用Lipofectamine?LTX試劑（Invitrogen)轉染Vero 7b細 胞將BAC DNA轉化為感染性病毒。在Vero細胞上確立病毒原液的生物滴度(PFU/mL);如下所 述，通過針對病毒gD基因的定量實時PCR( qPCR)測定基因組拷貝的物理滴度(gc) /mL。
[0129] 病毒基因組qPCR。根據制造商程序使用DNeasy Blood&Tissue試劑盒（Qiagen， Valencia，CA)從病毒原液提取DNA。使用Applied Biosystems StepOne?和StepOnePlus? 實時PCR系統手冊中描述的方案在來自包含完全HSV-1 (菌株KOS) gD編碼序列(pE-gDl 8)的 pENTRlA(Invitrogen)質粒的DNA上產生qPCR標準曲線。引物和探針序列列出如下:gD正向： 5'-CCCCGCTGGAACTACTATGACA-3'（SEQ ID N0:14) ;gD反向：5'-GCATCAGGAACCCCAGGTT-3' (SEQIDN0:15);探針 ：5'-FAM-TTCAGCGCCGTCAGCGAGGA-TAMRA-3'（SEQIDN0:16)。
[0130] 免疫印跡。在1 % NP40緩沖液中溶解細胞，溶解產物通過10 % SDS-聚丙烯酰胺凝膠 電泳，并使蛋白印跡與多克隆抗MMP-9抗體（1:1000稀釋）（Abeam，Cambridge，MA)或與抗gD 抗體（1:2000) (Santa Cruz，CA)以及HRP偶聯的抗兔第二抗體（Sigma，St .Louis，M0)反應。 用化學發光底物(Amersham Pharmacia，Piscataway，NJ)顯色印跡。使各印跡的下部與多克 隆抗β微管蛋白抗體（1: 3000) (Sigma，St .Louis，M0)反應以檢測裝載差異。用SuperSignal West Dura化學發光底物（Thermo Scientific，Rockford，IL)顯色印跡。
[0131] 明膠酶譜。在包含0.2%明膠的10%SDS_聚丙烯酰胺凝膠上進行分離前，即不對樣 本進行還原劑處理也不對其進行加熱處理。在酶譜洗滌緩沖液（10mM Tris pH 7.5,2.5% Triton X-100)中洗滌所述凝膠，在孵育緩沖液（50mM Tris pH 7.5,5mM CaC12，lyM ZnCl2)中37 °C下培養16小時，用1 %考馬斯亮藍R-250染色并用脫染緩沖液(4 %甲醇，8 %醋 酸)脫染[13]。
[0132] 進入試驗。用 KMMP9、KGw 或 KG(表達 gD:wt)以 10,000、1，000或10(^(：/細胞感染1^、 J/C和J/EGFR細胞6小時并用單克隆鼠抗ICP4(1:300;Santa Cruz Biotechnology)和Cy3偶 聯羊抗鼠 IgG( 1:400; Sigma)免疫染色[9]。
[0133] MTT試驗。將細胞點種在48孔板中并以100gc/細胞(Μ0Ι 0.2)感染3或6天。然后在 37°C下用0.5mg/ml MTT(Sigma)溶液處理細胞3小時。除去MTT溶液后，加入100%DMS0并通 過Wallac酶標儀(Perkin Elmer，Waltham，MA)記錄0D570。將細胞存活百分數計算為100% X0D(感染)/0D(未感染）。
[0134] 球狀體培養和共焦成像。分離球狀體并計數。在懸浮液中單獨生長3,000細胞2天 直至球狀體形成。在微量分析板中用l〇〇〇pfu或4X10 7gc的KMMP9或KGw分別感染各球狀體。 用熒光顯微鏡每日獲得eGFP圖像。對于共焦成像，感染時將球狀體轉移至玻璃底培養皿 (Willco wells，Amsterdam，荷蘭）。5dpi下在4%多聚甲酸中固定球狀體，用具有DAPI (Vector Laboratories，Bur 1 ingame，CA)的封片劑處理并用FV1000共焦成像系統 (Olympus，Miami，FL)獲得Z面圖像。
[0135] 腫瘤模型和治療。3-4周齡BALB/c無胸腺nu/nu小鼠購自Charles River實驗室 (Wilmington，ΜΑ)并飼養在BSL2設施中。根據如匹茲堡大學機構動物管理及使用委員會 (IACUC)批準的實驗動物護理及使用指南(實驗動物資源研究所，1985)中的要求和建議進 行所有動物程序。
[0136] 根據描述[9]將人GBM30細胞顱內移植入裸鼠。在5或10dpi下，也如所述[9]在注射 腫瘤細胞的相同坐標處（前〇.5mm前2mm側（右）3mm深）接種5·65χ109基因組拷貝的KMMP9、 KGw或PBS(n = 3-4/組）。監控動物健康狀況并當顯示發病跡象時將動物安樂死。
[0137] MRI成像。從各治療組(KMMP9、KGw、PBS)隨機選擇若干小鼠。在治療前1天(GBM30移 植后9天）和治療后第3、6、9和13天對動物進行成像。使用Bruker BioSpec 94/30磁體 (Bruker BioSpin，Karlsruhe，德國）、2 · 0cm直徑僅接受(receive-only)鼠腦線圈和70mm直 徑線性卷線圈進行成像。向麻醉小鼠腹膜內注射0 · lmmol/kg Magnevist(Bayer Health Care Pharmaceuticals，Wayne，NJ)并在運行Paravision 4.0的400MHz Bruker水平孔磁體 (Bruker Biospin，Bill erica，MA)上呈冠狀穿過感興趣區域獲得T2加權圖像(重復時間= 3，500ms，回聲時間=12ms，rare因數=8，navgs = 4)。
[0138] 統計分析。使用用于Windows的GraphPad Prism 6.01版（GraphPad Software，La Jol la，CA; www.graphpad.com)進行具有Welch修正的未配對t檢驗。將動物存活數據繪制為 Kap lan-Me i er曲線并使用相同軟件通過Mant e 1 -Cox對數秩檢驗進行比較。
[0139] 結果
[0140] 表達MMP9的再靶向miR控制載體的構建和表征
[0141] 圖5A中圖解了用于本研究的載體工程化和設計，且其包括意圖避免改變任何病毒 裂解功能并因此最大化腫瘤細胞中的復制和裂解活性而避免正常腦中的病毒生長的多處 修飾。
[0142] 將Gateway盒(Gw)和牛生長激素聚腺苷酸化序列插入KGE_4:T124(實施例1中所 述）的UL3和UL4基因座之間以創建KGwG4: T124BAC(在此稱作KGw，對照載體）；通過使用在 CAG(CMV雞β肌動蛋白）啟動子驅動下的MMP9基因替換所述Gateway盒獲得表達MMP9的溶瘤 性載體(KMMP9G4: T124BAC在此稱作KMMP9)。
[0143] 對感染KMMP9的Vero細胞的免疫印跡分析證實了麗P9的正確表達（圖5B)。明膠酶 譜顯示出感染KMMP9的三個原代GBM細胞系GBM30、GBM169和0G2中相比于感染對照載體的細 胞具有更高的明膠酶活性（圖5C)，并且KMMP9感染Vero細胞的上清液相比于對照感染的 Vero細胞的上清液具有更高的明膠酶活性(圖?)。
[0144] 我們然后測定MMP9表達是否影響病毒通過識別表皮生長因子受體(EGFR)的進入。 測試了如下細胞系的病毒進入，由于不存在gD受體而抵抗wt HSV的EGFR轉導的J1.1-2細胞 (J/EGFR)(Nakano等人，Virol. ,413:12-18(2011 ))、表達人HVEM的J/A細胞（Uchida等人， J. Virol .83 :2951-2961(2009))以及表達人粘連蛋白-1的J/C細胞（Frampton等人， J. Virol.，81:10879-889(2007)) ;HVEM和粘連蛋白-1是wt gD的天然受體。感染6小時后通 過針對即刻早期HSV蛋白ICP4的免疫染色檢測病毒進入。如圖6A中所示，EGFR再靶向病毒 KMMP9和KGw進入J/EGFR細胞和表達gD: wt的親本HSV-1載體進入J/A或J/C細胞一樣高效。即 便是在高病毒輸入（l〇,〇〇〇gc/細胞)下也沒有一種再靶向病毒可檢測地進入J/A或J/C細 胞，證實所述MMP9表達未影響再祀向載體感染的功效或特異性。
[0145] 我們還評估了MMP9表達是否可能影響培養中的人GBM細胞中的病毒復制。結果（圖 6B和6C)顯示在兩種原代惡性膠質瘤細胞系GBM169和GBM30的球狀體中KMMP9以與KGw相似 地動力學進行復制，且所述2種病毒的產率(通過qPCR測定)在任何時間點均無實質差異。
[0146] 為評估KMMP9的溶瘤活性，采用0.005M0I (100gc/細胞)感染已知表達EGFR的HSV可 進入的人膠質瘤細胞系（包括U87MG、SNB19和GBM30)并在感染后第3天（圖7A)和第7天（圖 7B)通過溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑(MTT)試驗測定細胞活力。在晚 一些的時間點，KMMP9相比于KGw顯示出顯著更高的2種所述細胞系的殺滅，提示MMP9可增加 載體介導的溶瘤作用。
[0147] MMP-9在球狀體中培養中增加 HSV感染性。
[0148] 為評估增加的麗P-9的細胞表達對HSV在腫瘤細胞球狀體中擴張的影響，將GBM30 和GBM169細胞培養為單一球狀體并用KMMP9或KGw病毒感染（圖8A)。在5dpi下，KMMP9相比于 KGw顯示出增強的載體表達的eGFP的分布。對各球狀體中eGFP陽性細胞的定量證實了在 6dpi下KMMP9感染球狀體相對于KGw感染球狀體有約1.5倍的增加（圖8B; P = 0.006)。
[0149] 為進一步量化麗P9對原發腫瘤來源球狀體的HSV感染性的影響，用KMMP9或KGw感 染GBM30細胞，并通過共聚焦顯微鏡成像由所述載體表達的eGFP表達作為評估病毒滲透和 感染性的手段。來自5μπι Z截面堆疊的3D重建顯示出KMMP9相比于KGw在球狀體內增強的相 對感染性（圖8C)。我們還檢查了各球狀體根據Z軸深度的5段（自下而上0-20μπι、25-50μπι、 55-80μm、85-100μm、105-120μm和125-140μm)的感染性差異（圖8D和8E)。雖然在最外層段 (0-20μπι)未發現差異（圖8D和8Ε)，但深入球狀體內，ΚΜΜΡ9顯示出相比于KGw顯著更高的感 染性(25-50和50-85μπι，P〈0.05)，提示MMP9增強載體擴張貫穿所述球狀體。當在球狀體之間 比較所有段時也發現了顯著性差異(配對t檢驗，P = 0.013)。
[0150] MMP9溶瘤性載體在小鼠 GBM治療中高度有效。
[0151]我們之前顯示GBM30在裸鼠中能穩定地建立致死腫瘤，其導致動物在腫瘤細胞接 種后20天內死亡[9]。我們使用患者來源的成球GBM30細胞在裸鼠中建立侵襲性顱內腫瘤
[9]。每日觀測動物并當顯示發病跡象時將其安樂死。和我們發表的結果相似，腫瘤細胞接 種5天后在相同立體定位坐標注射roS的小鼠在腫瘤細胞移植數周內死亡（中位數18天；圖 9)。相反，使用MMP9表達病毒KMMP9或對照病毒KGw的腫瘤治療保護半數動物至少35天且這 兩組的中位生存期是可比的（分別為29和31.5天;P = 0.61，對數秩檢驗）。這些結果顯示 50%的MMP9治療動物存活直至35天，相比而言無治療動物則為18天（圖9)。
[0152]在平行獨立實驗中，通過在腫瘤接種10天后在原位GBM30異種移植模型中注射載 體以將KMMP9和KGw的抗腫瘤功效與模擬(PBS)治療進行比較。在治療前1天并再在治療后第 3、6、9和13天通過磁共振成像(MRI)對小鼠成像以觀測腫瘤大小變化。圖10A顯示了來自各 組的一個實例的T2加權圖像。對在治療起始時具有可比腫瘤體積的來自各組的單個動物進 行比較，顯而易見MMP9相比于KGw載體具有更強的溶瘤作用（圖10B)。
[0153]實施例2的參考文獻
[0154] 1 · Grossman，S.A.等人，Survival of patients with newly diagnosed glioblastoma treated with radiation and temozolomide in research studies in the United States.Clin Cancer Res，2010.16(8):p.2443-9.
[0155] 2 · Assi，H.等人，Gene therapy for brain tumors :basic developments and clinical implementation.Neurosci Lett?2012.527(2):p.71-7.
[0156] 3 · Friedman，G · K ·等人，Herpes simplex virus oncolytic therapy for pediatric malignancies.Mol Ther?2009.17(7):p.1125-35.
[0157] 4.Mohyeldin，A.和E.A.Chiocca，Gene and viral therapy for glioblastoma:a review of clinical trials and future directions.Cancer J?2012.18(1):p.82-8.
[0158] 5.Campadelli_Fiume，G·等人，Rethinking herpes simplex virus:the way to oncolytic agents.Rev Med Virol?2011.21(4):p.213-26.
[0159] 6.Broberg，E.K.和V.Hukkanen，Immune response to herpes simplex virus and gammal34.5deleted HSV vectors.Curr Gene Ther?2005.5(5):p.523-30.
[0160] 7 .Aghi，M.等人，Oncolytic herpes virus with defective ICP6specif ically replicates in quiescent cells with homozygous genetic mutations in pl6·Oncogene，2008·27(30):p·4249-54·
[0161] 8.Navaratnarajah，C.K.等人，Targeted entry of enveloped viruses:measles and herpes simplex virus I.Curr Opin Virol?2012.2(1):p.43-9.
[0162] 9.Uchida，H.等人，Effective treatment of an orthotopic xenograft model of human glioblastoma using an EGFR-retargeted oncolytic herpes simplex virus.Mol Ther?2013.21(3):p.561-9.
[0163] 10.Uchida，H.等人，A double mutation in glycoprotein gB compensates for ineffective gD-dependent initiation of herpes simplex virus type linfection.J Virol,2010.84(23):p.12200-9.
[0164] 11·Payne，L.S.和P·Η·Huang，The pathobiology of collagens in glioma.Mol Cancer Res，2013.11(10):p.1129-40.
[0165] 12.Mok，W.，Y.Boucher和R.K.Jain，Matrix metalloproteinases-land-8improve the distribution and efficacy of an oncolytic virus.Cancer Res?2007.67(22): p.10664-8.
[0166] 13 · Hong，C · S ·等人，Ectopic matrix metalloproteinase-9expression in human brain tumor cells enhances oncolytic HSV vector infection.Gene Ther， 2010.17(10):p.1200-5.
[0167] 14.Gierasch，W.W.等人，Construction and characterization of bacterial artificial chromosomes containing HSV-lstrains 17and K0S.J Virol Methods， 2006.135(2):p.197-206.
[0168] 15.Krisky，D.M.等人，Deletion of multiple immediate-early genes from herpes simplex virus reduces cytotoxicity and permits long-term gene expression in neurons.Gene Ther?1998.5(12):p.1593-603.
[0169] 16·Szymczak，A·L·和D·A·Vignali，Development of 2A pept ide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opin Biol Ther， 2005.5(5):p.627-38.
[0170] 17 .Miao，H ·等人，EphA2promotes infiltrative invasion of glioma stem cells in vivo through cross-talk with Akt and regulates stem cell properties. Oncogene ? 2014.
[0171] 18.Yin，A.A.等人，The treatment of glioblastomas:a systematic update on clinical Phase III trials.Crit Rev Oncol Hematol?2013.87(3):p.265-82.
[0172] 19.Wong，J.等人，Targeted oncolytic herpes simp lex viruses for aggressive cancers.Curr Pharm Biotechnol?2012.13(9):p.1786-94.
[0173] 20.Wakimoto，H.等人，Effects of innate immunity on herpes simplex virus and its ability to kill tumor cells.Gene Ther?2003.10(11):p.983-90.
[0174] 21 · McKee，T · D ·等人，Degradation of fibrillar collagen in a human melanoma xenograft improves the efficacy of an oncolytic herpes simplex virus vector.Cancer Res，2006.66(5):p.2509-13.
[0175] 22.Yun?C.0.^Overcoming the extracellular matrix barrier to improve intratumoral spread and therapeutic potential of oncolytic virotherapy.Curr Opin Mol Ther?2008.10(4):p.356-61.
[0176] 23 · Dmitrieva，N ·等人，Chondroitinase ABC I-mediated enhancement of oncolytic virus spread and antitumor efficacy.Clin Cancer Res，2011·17(6): p.1362-72.
[0177] 24.Tischer，B.K.等人，Two-step red-mediated recombination for versatile high-efficiency markerless DNA manipulation in Escherichia coli.Biotechniques，2006·40(2):ρ·191_7·
[0178] 25. Ishida，D.等人，Enhanced cytotoxicity with a novel system combining the paclitaxel-2'-ethylcarbonate prodrug and an HSV amplicon with an attenuated replication-competent virus ?HF10as a helper virus. Cancer Lett， 2010.288(l):p.17-27.
[0179] 本文中所引用的所有參考文獻，包括公開、專利申請和專利都在此通過引用并入本 文，就如同每個參考文獻個別并特定地指示通過引用并入本文中并且整體記載于本文中。已 公開為US 2013/0096186和W0 2011/130749且要求美國臨時專利申請61/325,137的優先權的 美國專利申請13/641，649(PCT/US2011/032923的國家階段）的內容也在此以其整體并入， 且特別關注US 2013/0096186的[0039]、[0040]和[0041]段。還通過參照以其整體并入的是 Mazzacurati等人，Mol · Ther · 2014Sep 9 · doi : 10 · 1038/mt · 2014.177[Epub在印刷之前]。
[0180] 除非本文中另外指示或上下文明顯相矛盾，否則在描述本發明的上下文中（特別 是在以下權利要求書的上下文中）術語"一(a)"和"一(an)"和"所述(the)"以及類似指示物 的使用視為既涵蓋單數也覆蓋復數。除非另作說明，否則術語"包含(comprising)"、"具有 (having)"、"包括（including)"以及"含有(containing)"應理解為開放術語（即，意指"包 括，但不限于"）。除非本文中另外指示，否則本文中數值范圍的敘述僅意圖充當個別提及在 所述范圍內的每一各別值的速記方法，并且每一各別值并入本說明書中就如同在本文中分 別記載了這些值。除非本文中另外指示或另外上下文明顯相矛盾，否則本文所述的所有方 法可按任何適當次序進行。本文所提供的任何和所有實例或示例性措辭(比如"例如"）的使 用僅意圖更好地說明本發明，并且除非另外要求，否則不會對本發明的范圍構成限制。本說 明書中的任何措辭都不應理解為指示任何未要求的要素對本發明的實施而言是不可或缺。 [0181]本文中描述了本發明的優選實施方式，包括本發明人已知用于進行本發明的最佳 模式。通過閱讀以上描述，本領域普通技術人員能夠顯而易見獲得那些優選實施方式的變 體。發明人預期技術人員能夠適當地使用所述變體，并且發明人也要求以除本文中特定描 述以外的方式實施本發明。因此，如適用法律允許，本發明包括隨附權利要求書中敘述的主 題的所有修飾和同等物。此外，除非本文中另外指示或另外上下文明顯相矛盾，否則其所有 可能變體中的上述要素的任何組合都涵蓋在本發明中。
【主權項】
1. 一種重組溶瘤性單純皰疹病毒(oHSV)，其包含： (a) 呈現在所述oHSV衣殼表面上的非HSV配體，其對癌細胞表面上存在的分子具有特異 性;和 (b) 插入HSV在正常(非癌性)細胞中復制所需的HSV基因的基因座中的多個拷貝的一種 或多種microRNA革E序列。2. 權利要求1所述oHSV，其中所述配體并入暴露在所述HSV表面上的糖蛋白中。3. 權利要求1或2所述oHSV，其中所述病毒包膜蛋白是gD或gC。4. 權利要求1-3任一項所述oHSV，其中所述配體并入gD的殘基1和25之間。5. 權利要求1-4任一項所述oHSV，其中所述配體能夠特異性結合EGFR或EGFRvII I。6. 權利要求1-5任一項所述oHSV，其中所述配體是結合細胞受體的單鏈抗體(scFv)或 者肽或非肽激素或者生長因子。7. 權利要求1_6任一項所述oHSV，其中所述microRNA革E1序列是microRNA的反向互補序 列。8. 權利要求1-7任一項所述oHSV，其包含插入所述HSV基因的基因座中的兩個或多個 (串聯的2個、3個、4個、5個或6個)所述mi croRNA靶序列。9. 權利要求8所述oHSV，其包含插入所述HSV基因的基因座中的4個串聯拷貝的所述 mi croRNA革E1序列。10. 權利要求8或9所述oHSV，其中所述多拷貝的所述microRNA靶序列通過所述oHSV基 因組內的四個或更多個核苷酸的間隔序列相分離。11. 權利要求1-10任一項所述〇HSV，其中插入所述microRNA靶序列的所述HSV基因是 ICP4〇12. 權利要求1-11任一項所述oHSV，其中所述microRNA靶序列插入所述HSV基因的3 '非 翻譯區（3'UTR)。13. 權利要求1-12任一項所述oHSV，其中所述microRNA是miR-124。14. 權利要求 1-12 任一項所述 oHSV，其中所述 microRNA 是 miR-122、miR-124、miR-128、 miR-137和/或miR-199,或其兩種或多種的組合。15. -種重組oHSV，其包含 (a) 針對癌細胞表面上存在的蛋白具有特異性的非HSV配體，其為特異性結合EGFR或 EGFRvIII的scFv，且其插入所述oHSV gD糖蛋白的殘基1和25之間，和 (b) 插入所述oHSV基因組的ICP4的3'UTR中的4個拷貝的microRNA miR-124的反向互補 序列，每個所述拷貝通過8個核苷酸的間隔序列相分離。16. 權利要求1-15任一項所述oHSV，其包含內源重復(接合)區連同所述ICP47基因的啟 動子的刪除，所述重復（接合）區包含一個拷貝的各種二倍體基因 ICP0、ICP34.5、LAI^P ICP4〇17. 權利要求1-16任一項所述oHSV，其進一步包含促進載體通過非經典受體的進入的 gB或gH基因突變。18. 權利要求1-17任一項所述oHSV，其進一步包含轉基因。19. 權利要求18所述oHSV，其中所述轉基因編碼溶瘤因子。20. 權利要求18所述oHSV，其中所述轉基因編碼增強所述oHSV的橫向擴張的蛋白或多 肽。21.權利要求20所述oHSV，其中所述轉基因編碼金屬蛋白酶9( "MMP9"）。21. 權利要求18所述oHSV，其中所述轉基因編碼誘導患者抗癌免疫反應的蛋白或多肽。22. 權利要求18所述oHSV，其中所述轉基因編碼催化前藥轉化的蛋白或多肽。23. 權利要求22所述oHSV，其中所述轉基因編碼胞嘧啶脫氨酶或胸苷激酶。24. 權利要求18所述oHSV，其中所述轉基因編碼嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)。25. 權利要求1所述oHSV，其為KGE-4: T124。26. 編碼權利要求1-25任一項所述oHSV的核酸。27. 權利要求26所述核酸，其為細菌人工染色體(BAC)。28. -種病毒原液，其包含權利要求1-25任一項所述oHSV載體。29. -種組合物，其包含權利要求1-25任一項所述oHSV和藥學上可接受的載體。30. -種組合物，其包含權利要求28所述病毒原液和藥學上可接受的載體。31. -種殺滅癌細胞的方法，其包括在足以使所述oHSV感染所述癌細胞的條件下將所 述細胞暴露至權利要求1-25任一項所述oHSV、權利要求28所述原液或者權利要求29或30所 述組合物，從而在所述癌細胞內所述oHSV的復制導致細胞死亡。32. 權利要求31所述方法，其中所述細胞是在體內。33. 權利要求31或32所述方法，其中所述細胞是在腫瘤內。34. 權利要求33所述方法，其中所述腫瘤是多形性成膠質細胞瘤。35. 權利要求31-34任一項所述方法，其中所述細胞是人細胞。36. 權利要求33或34所述方法，其中所述腫瘤是在動物腦內。37. 權利要求36所述方法，其中通過顱內注射所述oHSV、原液或組合物至所述動物將所 述oHSV暴露至所述細胞。38. 權利要求37所述方法，其中所述動物是人。
【文檔編號】C12N7/00GK106068326SQ201480071446
【公開日】2016年11月2日
【申請日】2014年10月28日 公開號201480071446.1, CN 106068326 A, CN 106068326A, CN 201480071446, CN-A-106068326, CN106068326 A, CN106068326A, CN201480071446, CN201480071446.1, PCT/2014/62676, PCT/US/14/062676, PCT/US/14/62676, PCT/US/2014/062676, PCT/US/2014/62676, PCT/US14/062676, PCT/US14/62676, PCT/US14062676, PCT/US1462676, PCT/US2014/062676, PCT/US2014/62676, PCT/US2014062676, PCT/US201462676
【發明人】內田宏昭, J·科恩, J·C·格洛廖索三世, P·格蘭迪
【申請人】聯邦高等教育系統-匹茲堡大學