一種檢測牛hcd攜帶者的特異性pcr引物、試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發明涉及檢測引物與試劑盒，具體公開了檢測牛HCD攜帶者的特異性PCR引物及試劑盒。所述引物包括如SEQ ID NO.1～3所示的核苷酸序列，以待測樣本總DNA為模板，利用所述引物進行PCR擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，當PCR擴增產物中僅出現171bp的電泳條帶時，表示待測樣本不攜帶HCD；當PCR擴增產物中同時出現171bp和366bp電泳條帶時，表示待測樣本攜帶HCD的雜合子；當PCR擴增產物中僅出現366bp電泳條帶時，表示待測樣本為HCD純合子。
【專利說明】
-種檢測牛HCD攜帶者的特異性PCR引物、試劑盒及檢測方法
技術領域
[0001]本發明涉及檢測引物與試劑盒，具體地說，涉及檢測牛HCD攜帶者的特異性PCR引 物及試劑盒。
【背景技術】
[0002] 在奶牛育種中，由于后裔測定、基因組選擇等現代育種技術的應用，在極大地提高 了選擇準確性的同時，也潛在地提高了選擇強度。由于人工授精(AI)等繁殖生物技術的應 用，使個別優秀種公牛得到廣泛使用，增加了群體的近交系數，降低了有效群體含量，隱性 基因純合的概率加大，使不良基因在奶牛群體中不斷出現，隨著基因組學研究的不斷深入 和高通量測序技術的迅猛發展，加快了奶牛隱性遺傳缺陷的挖據、鑒定與應用。
[0003] 單倍型，在遺傳學上是指在同一染色體上進行共同遺傳的多個基因座上等位基因 的組合。有害單倍型是新近幾年在牛群中出現的隱性遺傳缺陷的新形式，在荷斯坦牛群中 已經發現20多種單倍型，成功進行區間定位的單倍型有15種。當這些單倍型隱性純合時，就 會表現出不同類型的臨床癥狀、胚胎早期死亡等，是影響奶牛群繁殖健康的隱性殺手，嚴重 影響著奶牛養殖者的經濟效益。
[0004] 膽固醇缺乏單倍型（HCD，Hap 1 〇 t yp e as so c i at ed w i th Cho 1 e s t er ο 1 Deficiency)是在荷斯坦牛群中新發現的一種隱性遺傳缺陷。其遺傳方式是當一頭犢牛從 其父母處都遺傳了 HCD基因時，稱為感染者(純合子）。感染牛的血液中膽固醇含量極低，可 阻止奶牛正常的體脂沉積，其臨床表現為慢性腹瀉、生長緩慢、體重降低，通常6月齡的犢牛 易早期死亡。目前已知該遺傳缺陷基因最早的來源是加拿大種公牛Maughlin Storm (H0CANM5457798)。
[0005] HCD的分子遺傳基礎是在牛11號染色體(BTA11)上APOB(Apolipoprotein B)基因 編碼區有1299bp轉錄調控元件ERV2-1的插入突變，導致ΑΡ0Β基因轉錄終止、剪接異常，使原 4567個氨基酸肽鏈被135個氨基酸殘肽所取代，丟失了97 %的蛋白質(Menzi等，2016)。
[0006] 2015年加拿大使用的荷斯坦種公牛約10%是已知或可能的HCD攜帶者。在LPI前 100名的驗證公牛中，有5頭是HCD攜帶者；在基因組測定前100名的青年公牛中，有2頭是攜 帶者;Kipp等(2015)預測，德國每年大約有3400個HCD純合子出生，攜帶率約8.7%。
[0007] 牛冷凍精液和人工授精技術的普及和廣泛應用，導致優秀種公牛的影響和使用范 圍是世界性的。一頭優秀種公牛一生可以生產幾十萬劑甚至上百萬劑冷凍精液，其遺傳影 響可想而知。由于優秀種公牛冷凍精液在全世界范圍內的流通和廣泛使用，荷斯坦牛群中 發現的有害單倍型帶來的都是世界性的問題。這導致近年來奶牛育種工作者在重視優秀種 公牛生產性能表現的同時，更加重視優秀種公牛是否攜帶一些不良隱性基因的影響。因此， 建立一種有效的檢測膽固醇缺乏單倍型的分子生物學方法，制定合理選種選配方案，是降 低HCD純合子的最好方法。
[0008] 目前，我國尚未開展相關的研究和檢測工作，HCD單倍型在我國荷斯坦牛群中的攜 帶情況尚不清楚。
【發明內容】
[0009] 為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供一種檢測牛HCD攜帶者的 特異性PCR引物、試劑盒及檢測方法。
[0010] 為了實現本發明目的，本發明的技術方案如下：
[0011] 第一方面，本發明經嚴格篩選后提供一種檢測牛HCD攜帶者的特異性PCR引物，其 特征在于，所述引物包括：
[0012] 上游引物F: 5' -TGCAAAGCCACCTAGCCTAT-3' ；
[0013] 下游引物R1:5' -AGATGATGCCCCTCTTGATG-3' ；
[0014] 下游引物R2:5 ' -CACTCCTAATTGCCCAGGAA-3 '。
[0015] 進一步地，本發明提供了前述引物在制備檢測牛HCD攜帶者的試劑盒方面的應用， 并提供了含有前述引物的試劑或試劑盒。
[0016] 所述試劑盒包括:本發明所述特異性PCR引物、Taq DNA聚合酶、dNTP、10 X Buffer、 ddH20〇
[0017] 所述試劑盒的工作程序為：94°C預變性5min;94°C變性30s，58±8°C退火30s，72°C 延伸30s，35個循環；72°C延伸7min。
[0018] 經過對PCR反應程序試劑盒的優化發現，當退火溫度為62°C時，PCR擴增特異性最 好，條帶單一，且最亮。能夠有效保證擴增的有效性和準確性。
[0019] 第二方面，本發明還提供了一種非疾病的診斷和治療目的的檢測牛HCD攜帶者的 方法，該方法可用于牛HCD單倍型的篩選和鑒定工作。所述方法具體為：以待測樣本總DNA為 模板，利用本發明所述引物進行PCR擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，當PCR擴增產物中僅出 現17lbp的電泳條帶時，表示待測樣本不攜帶HCD;當PCR擴增產物中出現366bp電泳條帶時， 表示待測樣本攜帶HCD。且進一步地，當PCR擴增產物中同時出現171bp和366bp電泳條帶時， 表示待測樣本為攜帶HCD的雜合子;當PCR擴增產物中僅出現366bp電泳條帶時，表示待測樣 本為HCD純合子。
[0020] 進一步地，本發明PCR反應體系總體積25yL:
[0023] 更進一步地，PCR工作程序為：94°C預變性5min; 94°C變性30s，58 ± 8 °C退火30s，72。(:延伸30s，35個循環;72°C延伸7min。優選退火溫度為62°C。
[0021]
[0022]
[0024]本發明的有益效果在于：
[0025]本發明提供了檢測牛HCD攜帶者的特異性PCR引物及試劑盒，并提供了利用所述特 異性PCR引物進行多重PCR法檢測牛膽固醇缺乏單倍型的方法，具體為利用SEQ ID NO. 1~3 所示的核苷酸序列為引物，對牛的總DNA進行PCR擴增，得到SEQ ID NO.4和或SEQ ID NO. 5 所示的DNA序列，通過瓊脂糖電泳檢測，得到如附圖1所示的基因型，從而可以直接判定HCD 攜帶者的基因型。
[0026] 本發明還優化了上述PCR的反應程序，開發了一套檢測HCD單倍型的的PCR檢測方 法，為荷斯坦牛的選種、選配提供了技術支撐。
[0027] 本發明建立了一種快速、準確、高效的膽固醇缺乏單倍型(H⑶)分子檢測方法，為 奶牛Η⑶單倍型因的分子篩查提供一種技術手段，為在今后的育種工作中有計劃地降低HCD 單倍型頻率提供了技術支撐，為奶牛場進行科學的選種選配提供了依據。
【附圖說明】
[0028]圖1為檢測牛膽固醇缺乏單倍型(HCD)攜帶者的PCR電泳圖；其中，泳道1、3、4:不攜 帶HCD單倍型;泳道2:HCD單倍型攜帶者;泳道5:陽性對照;M:100bp DNA ladder Marker。
[0029] 圖2為正常個體和HCD攜帶者的測序峰圖。
【具體實施方式】
[0030] 下面將結合實施例對本發明的優選實施方式進行詳細說明。需要理解的是以下實 施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發明的范圍進行限制。本領域的技 術人員在不背離本發明的宗旨和精神的情況下，可以對本發明進行各種修改和替換。
[0031 ]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0032]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0033]實施例1引物設計
[0034] 依據 GenBank 上牛 ΑΡ0Β 基因序列（ID:494004)，并參考 Schiitz 等（2016)針對 ΑΡ0Β 基 因設計的檢測HCD單倍型的引物序列，利用在線引物設計軟件(http://bioinfo.ut.ee/ primer3-0.4.0/)進行檢測HCD的特異性引物設計，獲得引物對:上游引物AP0B-Pr imer-F: 5 ' -TGCAAAGCCACCTAGCCTAT-3 ' ；下游引物AP0B-Primer-Rl: 5 ' -AGATGATGCCCCTCTTGATG-3 '， 該引物對橫跨ΑΡ0Β基因1299bp的插入序列，從理論上講，正常個體可以擴增處171bp的長度 片段;Η⑶攜帶者個體能擴增出171/1470bp長度的片段，Η⑶純合子能擴增出1470bp的長度 片段。經過第一輪引物的篩選和優化，當對HCD攜帶者進行擴增時，該引物對僅能擴增出 171bp的片段，1470bp的長度片段不能正常的擴增出來，可能是由于171bp的短片段擴增會 抑制長片段的擴增，而且，長片段本身就容易擴增。又重新設計了兩對特異性PCR引物，通過 PCR條件的篩選和優化，仍然不能擴增出長片段的擴增片段。目前，還沒有資料顯示，1299bp 片段的插入突變能夠直接用PCR擴增出來。所以，采用簡單PCR引物進行直接擴增的方案是 不可行的。
[0035] 鑒于以上的經驗，本發明通過巧妙構思，設計多條引物，采用復合式PCR來檢測部 分插入序列的方法來對HCD攜帶者進行鑒定。于是，本發明補充設計了第三條引物ΑΡ0Β-Primer-R2：
[0036] 5 ' -ACTCCTAATTGCCCAGGAA-3 '，該引物序列是1299bp插入序列的一部分，是用來檢 測HCD單倍型的特異性引物。該方法具有快速、準確的特定。
[0037]所設計的引物一覽表：
[0038]
[0039] 經試驗，最后確定了如下檢測HCD攜帶者的特異性PCR引物APOB-Primers:
[0040]上游引物APOB-Primer-F: 5 ' -TGCAAAGCCACCTAGCCTAT-3 ' ；
[0041 ]下游引物APOB-Primer-Rl: 5 ' -AGATGATGCCCCTCTTGATG-3 ' ；
[0042]下游引物AP0B-Primer-R2:5 ' -ACTCCTAATTGCCCAGGAA-3 '。
[0043] F/R1引物對擴增片段長度：171bp;
[0044] F/R2引物對擴增片段長度:366bp。
[0045] 上述引物相對其他設計得到的大量引物來說，具有專一性高、特異性強、目的條帶 容易識別等特點，能夠更好的實現HCD基因的快速、準確檢測。
[0046] 實施例2 PCR反應程序的優化
[0047] 本發明基于設計得到的特異性PCR引物，進一步對PCR的反應程序進行了優化。
[0048] 最終確定了鑒定HCD攜帶者的PCR反應程序與反應體系。
[0049] 所述反應程序為：
[0050] 94°C 預變性 5min;94°C 變性 3〇8,62°(：退火3〇8,72°(：延伸3〇8，進行35個循環；721€ 延伸7min，然后4°C保存。其中，最佳退火溫度為62 °C
[0051 ] 所述PCR反應體系：總體積25yL
[0052]
[0053] 實施例3
[0054] 1、牛總DNA的提取
[0055] 選擇北京市種公牛站的荷斯坦公牛為實驗材料，提取總DNA，總DNA可以從血液(例 如，新鮮或冷凍的）、精液(例如，新鮮或冷凍的）、組織樣品（如耳組織等)或含有毛囊的牛毛 樣品中提取、分離和純化。
[0056] 2、PCR擴增和基因型判定
[0057] 根據實施例1篩選得到的特異性引物對，和實施例2優化得到的PCR反應條件及反 應體系進行多重PCR擴增。
[0058]取4yL PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR擴增結果如附圖1所示。
[0059] 基因型判定：
[0060]健康奶牛:基因型為AA型，僅出現171bp電泳條帶；
[0061 ] HCD隱性攜帶者:基因型為AB型，即出現171 bp電泳條帶和366bp電泳條帶；
[0062] Η⑶純合子:基因型為BB型，僅出現366bp電泳條帶。Η⑶單倍型在胚胎早期多數致 死或出生后死亡，在牛群中很少出現，我們篩查隱性有害單倍型HCD的目的就是要找出HCD 隱性攜帶者。
[0063] 利用上述建立的分子檢測方法，對北京地區的138頭荷斯坦公牛和90頭母牛進行 了檢測分析，結果分別檢測到了7頭和1頭HCD攜帶者，攜帶率分別為5.07%、1.11%。
[0064] 3、測序驗證
[0065]對全部HCD攜帶者個體進行測序驗證。
[0066] 為了進一步驗證基因分型結果，將具有不同基因型的個體進行測序，用DNAMAN軟 件與GenBank上的基因序列進行同源性比對發現，ΑΑ基因型的ΑΡ0Β基因擴增序列與GenBank 上的基因序列（ID:494004)相同，該基因型屬正常牛只，在國際上統一采用"Η⑶0"標識；而 ΑΒ基因型的ΑΡ0Β基因的第24位堿基和25位堿基之間插入了 LTR(末端重復序列)轉錄調控元 件序列(http://www.ncbi .nlm.nih.gov/dbvar)(登錄號:NSTD119)，該基因型的牛只是ΗΟ) 攜帶者，在國際上統一采用"HCD1"標識。測序結果見附圖2。研究結果表明附圖1中的基因分 型結果是正確的，而且準確率達100%，說明建立的檢測HCD有害單倍型的方法是可靠的。 [0067] 4、系譜驗證
[0068] 通過系譜追蹤發現，7頭HCD攜帶者公牛的共同祖先是Maugh 1 in Storm (H0CA匪5457798,1991)，與國際上報道的可追溯到的共同祖先相一致，更加證實了所建立 方法的準確性和可靠性。本發明對我國荷斯坦牛進行了 HCD單倍型的分子診斷，并證實HCD 單倍型在我國荷斯坦牛群中存在一定比例，有必要對我國荷斯坦牛群進行大規模的篩查， 標識或淘汰HCD單倍型攜帶者，降低HCD帶來的潛在危害。
[0069]雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在 本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
【主權項】
1. 一種檢測牛HCD攜帶者的特異性PCR引物，其特征在于，所述引物包括： 上游引物F: 5 ' -TGCAAAGCCACCTAGCCTAT-3 ' ； 下游引物R1:5 '-AGATGATGCCCCTCTTGATG-3 ' ； 下游引物R2:5 ' -CACTCCTAATTGCCCAGGAA-3 '。2. 權利要求1所述的引物在制備檢測牛HCD攜帶者的試劑盒方面的應用。3. 含有權利要求1所述的引物的試劑或試劑盒。4. 一種檢測牛HCD攜帶者的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括:權利要求1所述的特 異性PCR引物、Taq DNA聚合酶、dNTP、10 X Buffer、ddH20及陽性對照。5. 根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的反應程序為:94°C預變性 5min;94°C 變性 30s，62°C 退火 30s，72°C 延伸 3〇8,35個循環；72°(：延伸711^11。6. 根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，退火溫度為62 °C。7. -種非疾病的診斷和治療目的的檢測牛HCD攜帶者的方法，其特征在于，以待測樣本 總DNA為模板，利用權利要求1所述引物進行PCR擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，當PCR擴增 產物中僅出現17lbp的電泳條帶時，表示待測樣本不攜帶HCD;當PCR擴增產物中同時出現 171bp和366bp電泳條帶時，表示待測樣本為攜帶HCD的雜合子；當PCR擴增產物中僅出現 366bp泳條帶時，表示待測樣本為HCD純合子。8. 根據權利要求7所述的方法，其特征在于，PCR反應體系總體積25yL: dNTP 混合物，（4><2.5mmol/L) 2.0tuL; lOxBuffer (含 Mg2+ ) 2.5μΙ.; 上游引物 F (: 20pmol/L ) 0.5μΙ; 下游引物 R ]. ( 20pmoL/L ) 0.5μL; 下游引物 R1 ( 20pmoL/L ) 0.5μL； Taq DNA 聚合酶（3U/pL) 0.5μΙ; 模板 DNA ( 50ng/:uL ) 0.5μΙ; ddH20 18.0μLο9. 根據權利要求7或8所述的方法，其特征在于，PCR工作程序為:94°C預變性5min; 94°C 變性 30s，58 ±8 °C 退火 30s，72 °C 延伸 30s，35 個循環；72 °C 延伸 7min。10. 根據權利要求9所述的方法，其特征在于，退火溫度為62 °C。
【文檔編號】C12Q1/68GK106065416SQ201610659243
【公開日】2016年11月2日
【申請日】2016年8月11日
【發明人】李艷華, 麻柱, 劉林, 趙鳳, 呂小青, 韓廣文, 朱玉林, 孫東曉
【申請人】北京奶牛中心