一種油*梅下毛癭螨pcr檢測引物及其檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種油?梅下毛癭螨PCR檢測引物及其檢測方法，屬于果樹蟲害檢測、鑒定及防治技術領域，設計了一種油?梅下毛癭螨的PCR檢測引物，序列如Seq ID NO.1?2所示，PCR反應后，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，可觀察到目的電泳條帶。本發明的PCR檢測引物及其檢測方法可用于油?花芽中梅下毛癭螨的檢測，同時可用于田間油?梅下毛癭螨的早期診斷、監測與鑒定，為梅下毛癭螨引起的油?蟲害的防治提供可靠的技術和理論依據。該方法與傳統鑒定方法相比，具簡便快速，省時省力，對非分類專業人士來說易于掌握，是一種快速鑒定梅下毛癭螨的分子生物學方法。
【專利說明】
一種油捺梅下毛癭螨PCR檢測引物及其檢測方法
技術領域
[0001]本發明涉及一種油捺梅下毛癭螨PCR檢測引物及其檢測方法，專用于油捺梅下毛癭螨高靈敏度快速分子檢測，同時可用于田間油捺梅下毛癭螨的早期診斷、監測與鑒定，屬于果樹蟲害檢測、鑒定及防治技術領域。
【背景技術】
[0002]油棒(JpTtwussalicina Lindli var cordata J.Y.Zhang et al)，又稱棒李，屬薔薇科(Wosaceae)李亞科(Prunoideae)李屬(JpTtmusL)植物，是福建特產佳果，也是我國李產業中最具特色的分支產業，除了福建，廣東、廣西、湖南、江西等省區都有引種，是南方水果產區的重要栽培樹種，對促進農村經濟發展和幫助果農增收致富具有重要意義。近年來，隨著油捺種植面積的擴大和農業生態環境的改變，新害蟲梅下毛癭螨發生蔓延快速，日趨嚴重，嚴重影響果品產量和品質，已成為阻礙油捺發展的一個因素。
[0003]梅下毛癭螨phloeocoptes Nalepa)屬于蜱螨亞綱(Acari)，前氣門亞目(Prostigmata)，癭螨總科(Er1phyoidea)，癭螨亞科(Er1phyinae)，下毛癭螨屬Ucalitus)，是世界廣布種，在全世界各地都有分布，主要發生在歐洲中部和南部、地中海地區、美國北部和南部以及東亞地區，主要危害薔科李屬植物的油捺、杏、櫻桃李、扁桃、梅和洋李等。該螨主要為害寄主的芽苞(包括葉芽和花芽)，受到危害的芽不能正常萌發，影響開花和枝條的形成，造成減產，經調查，危害嚴重的油捺果園，株受害率甚至高達100%，嚴重者整株枯死，當年減產可達70%，導致樹勢衰弱，給生產造成嚴重影響，在我省古田、建陽、屏南和蒲城等油柰產區均有發現其為害，已成為果園急待解決的問題。
[0004]由于梅下毛癭螨個體微小，危害初期肉眼難以發現直到癥狀明顯時才被注意，并且該螨大部分時間營非自由生活，都在芽鱗片之間群集為害，芽的外側有多層鱗片包裹，噴藥不易接觸蟲體，給防治帶來困難，這就要求我們抓住梅下毛癭螨的轉芽活動期進行防治，因此，建立一種快速、靈敏、準確的分子生物學檢測方法是十分必要和緊迫的，對其進行生物學特性研究和防治監測都有重要的意義。近年來，利用PCR擴增生物體基因某一特異分子片段進行有害生物的檢測、鑒定及病蟲害診斷的方法為國際上廣泛使用。由于這種方法快速、準確和簡便的特點，越來越受到各國植物保護學家的重視。但迄今為止，關于梅下毛癭螨的分子鑒定技術國內外尚未見報道。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于克服現有檢測技術中油捺梅下毛癭螨鏡檢靈敏度低、檢測人員專業素質要求高的問題，提供油捺梅下毛癭螨特異性PCR檢測引物以及檢測結果可靠、靈敏度高、特異性強且易于操作的油捺梅下毛癭螨PCR檢測方法。
[0006]為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案:
1、油捺梅下毛癭螨的PCR檢測引物設計
從GenBank中下載梅下毛癭螨的⑶I序列，采用primer5軟件設-H種PCR檢測引物，弓丨物序列分別為:
YM-F3:57- GAAGTATTCAAATTTCGATCTGT -37 ；
YM-B3:57- TTTTTTCCCTGCACATAGG -37 ；
對油捺梅下毛癭螨特異性擴增出214bp的PCR產物。
[0007]2、油捺梅下毛癭螨的PCR檢測體系建立:
(I)從被油捺梅下毛癭螨危害的花芽組織中提取總DNA 按CTAB法提取總DNA，具體步驟如下:
①取0.5g被危害的花芽組織，置于研缽內，用液氮磨成細粉;②加900yL2%CTAB，ΙΟμ?β-巰基乙醇，90yL10%SDS，2yL蛋白酶K ；③65°C，水浴Ih，冷卻至室溫，12000rpm離心1min ；④取上清，加入等體積氛/氯仿/異戊醇(25:24:1)，輕輕顛倒，靜置5min，12000rpm離心1min ；⑤取上清，加入等體積氯仿/異戊醇(24:1)，輕輕顛倒，靜置5min，12000rpm離心1min;⑥取上清，加入等體積異丙醇(或2.5倍體積無水乙醇)，置于-20 0C冰箱2h(或過夜);⑦12000rpm離心1min，棄上清，用75%乙醇洗滌沉淀2次，再將沉淀風干；⑧將沉淀溶于30yL TE(含RnaseA 50yg/mL)，取IyL作為模板進行PCR擴增。
[0008](2)以步驟(I)提取的總DNA為模板，利用權利引物YM-F3/YM-B3進行PCR擴增，擴增條件如下:
PCR反應體系25 yL:包括 12.5yL PCR Mix，ΙΟμΜ YM-F3和ΙΟμΜ ΥΜ-Β3各lyL，50ng 總DNA模板，用滅菌雙蒸水補足至25 yL。擴增程序為94°C預變性4min，94°C變形30s，58°C退火30s，72°C延伸308，32個循環，最后72°(:延伸711^11。
[0009](3)取7yL擴增產物，用1%瓊脂糖凝膠電泳，經溴化乙錠染色后用凝膠成像儀觀察擴增產物大小來判定結果。如果能特異性的擴增到214bp的產物，即可判定所取組織中存在油捺梅下毛癭螨;否則，所取組織中不存在油捺梅下毛癭螨。
[0010]有益效果:本發明方法適用于油捺花芽中梅下毛癭螨的可靠性和高靈敏度快速分子檢測和鑒定，對梅下毛癭螨引起的蟲害防治具有重要的實用價值。本發明與現有技術相比，具有以下技術優勢:
1、特異性強:本發明所采用的PCR引物是針對油捺梅下毛癭螨COI基因序列設計的特性擴增引物；已對福建寧德、南平、龍巖等地區的油捺梅下毛癭螨進行了測試驗證，因此充分保證檢測結果的可靠性；
2、靈敏度高:利用設計的PCR引物對油捺梅下毛癭螨的檢測靈敏度在DNA水平上可達到。
[0011]4、實用性好:本發明所設計出的PCR引物，可用于梅下毛癭螨危害的油捺花芽進行的高靈敏度快速檢測和鑒定，具有很強的實用性；
5、操作簡單:應用本發明方法，可在數小時內完成對油捺梅下毛癭螨的檢測，檢測結果準確可靠。同時，PCR檢測技術已經非常成熟，操作步驟簡單。
【附圖說明】
[0012]圖1為本發明油捺梅下毛癭螨危害PCR特異性檢測結果圖。其中:MSl00bpDNAmarker，I為陰性對照，2為陽性對照，3和4為油棒梅下毛癭螨，5_10為其他近緣螨。
[0013]圖2為本發明油捺梅下毛癭螨危害PCR靈敏度檢測結果圖。其中:MSl00bpDNAmarker, 1_7分別為50ng, 5ng, 500 pg, 50 pg, 5pg, 500 fg和50 fgD
[0014]圖3為本發明油捺梅下毛癭螨危害PCR檢測結果圖。其中:M為10bp DNA marker ,1為陰性對照，2為陽性對照，3-5為被危害花芽，6-10為健康花芽。
【具體實施方式】
[0015]以下結合具體實施例對本發明做進一步說明，但本發明并不止限于此。
[0016]實施例1:PCR引物對油捺梅下毛癭螨的特異性擴增 1、模板DNA的提取
為獲得油捺梅下毛癭螨的特異性引物，以福建寧德、南平和龍巖等市的21個油捺梅下毛癭螨和多個近緣螨為供試材料，采用CTAB法提取花芽總DNA，具體步驟如下:取0.5g被危害的花芽組織，置于研缽內，用液氮磨成細粉;加900yL2%CTAB，ΙΟμ?β-巰基乙醇，90yL10%SDS，2yL蛋白酶K; 65 °C，水浴Ih，冷卻至室溫，12000rpm離心1min ；取上清，加入等體積氛/氯仿/異戊醇(25:24:1),輕輕顛倒，靜置5min，12000rpm離心1min ；取上清，加入等體積氯仿/異戊醇(24:1)，輕輕顛倒，靜置5min，12000rpm離心1min ；取上清，加入等體積異丙醇(或2.5倍體積無水乙醇)，置于-20 0C冰箱2h(或過夜)；12000rpm離心1min，棄上清，用75%乙醇洗滌沉淀2次，再將沉淀風干;將沉淀溶于30yL TE(含RnaseA 50yg/mL)，用超微量分光光度計(NanoDrop)測定DNA濃度并稀釋至50ngAiL，取IyL稀釋后的DNA作為模板進行PCR擴增。
[0017]2、特異性引物設計
從GenBank中下載梅下毛癭螨的COI序列，應用ClustalX軟件進行序列比對，同時結合primer5軟件設-H種PCR檢測引物，引物序列分別為:
YM-F3:57- GAAGTATTCAAATTTCGATCTGT -37 ；
YM-B3:57- TTTTTTCCCTGCACATAGG -37 ；
對油捺梅下毛癭螨特異性擴增出214bp的PCR產物。
[0018]3、PCR 擴增
利用引物YM-F3/YM-B3對供試材料進行PCR擴增。PCR的具體反應條件如下:
PCR反應體系25 41^包括12.541^0? Mix,ΙΟμΜ YM-F3和ΙΟμΜ ΥΜ-Β3各lyL，50ng 總DNA模板，用滅菌雙蒸水補足至25yL。擴增程序為94°C預變性4min，94°C變形30s，58°C退火30s，72°C延伸308，32個循環，最后72°(:延伸711^11。
[0019]4、檢測結果
PCR特異性檢測結果見圖1。除來自福建寧德、南平和龍巖等地的21個梅下毛癭螨危害組織總DNA擴增出214bp的產物外，其他供試近緣螨均沒有出現擴增條帶，說明此引物具有很強的特異性。
[0020]實施例2:PCR引物對油捺梅下毛癭螨的靈敏性檢測
1、模板總DNA濃度稀釋
利用超微量分光光度計(NanoDrop )測定DNA濃度，采用1倍濃度系列稀釋法將提取的總DNA稀釋成50ng, 5ng, 500 pg, 50 pg,5 pg, 500 fg和50 fg共7個不同濃度梯度。
[0021]2、靈敏度檢測
取IyL總DNA為模板進行PCR檢測WCR反應條件如下: PCR反應體系25 “1^包括12.541^0? Mix,ΙΟμΜ YM-F3和ΙΟμΜ ΥΜ-Β3各lyL，50ng 總DNA模板，用滅菌雙蒸水補足至25 yL。擴增程序為94°C預變性4min，94°C變形30s，58°C退火30s，72°C延伸308，32個循環，最后72°(:延伸711^11。
[0022]3、檢測結果
PCR靈敏度檢測結果見圖2。在25yL反應體系中，當模板濃度為500 pg/yL時仍可擴增出一條214bp的條帶，而隨著濃度繼續降低，卻沒有檢測到特異性條帶，表明其檢測靈敏度為500 pg/yLo
[0023]實施例3:梅下毛癭螨危害油捺花芽的田間實測。
[0024]1、樣品采集:樣品采自福建寧德、南平和龍巖等油捺生產基地。
[0025]2、DNA提取及檢測
被危害的油捺花芽采用CTAB法提取總DNA。
[0026]按下述方法進行PCR檢測:
①PCR反應體系25 “1^包括12.541^0? Mix,ΙΟμΜ YM-F3和ΙΟμΜ ΥΜ-Β3各lyL，50ng 總DNA模板，用滅菌雙蒸水補足至25 yLo
[0027]?擴增程序為94°(:預變性41^11，94°(:變形308，58°(:退火308，72°(:延伸308，32個循環，最后72°C延伸7min。
[0028]3、檢測結果
樣品實測結果見圖3。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳后出現一條214bp的特異性條帶，則判斷供試花芽被梅下毛癭螨危害。圖中第3、4、5的花芽組織中檢測出梅下毛癭螨。
【主權項】
1.一種油捺梅下毛癭螨PCR檢測引物，其特征在于:引物序列為: YM-F3:57- GAAGTATTCAAATTTCGATCTGT -37 ； YM-B3:57- TTTTTTCCCTGCACATAGG -37 ； 對油捺梅下毛癭螨特異性擴增出214bp的PCR產物。2.—種利用權利要求1引物的油捺梅下毛癭螨檢測方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)從被油捺梅下毛癭螨危害的花芽組織中提取總DNA; (2 )以步驟(1)提取的總DNA為模板，利用權利要求1的引物YM-F3/YM-B3進行PCR擴增； (3)取步驟(2)的PCR擴增產物，經瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色，用凝膠成像儀觀察PCR結果，如果能特異擴增出214bp的PCR產物，即可診斷為所取得花芽組織存在油捺梅下毛癭螨。3.根據權利要求2所述的油捺梅下毛癭螨檢測方法，其特征在于:所述的步驟(2)PCR擴增條件為:PCR反應體系為25μL:包括 12.5yL PCR MIX,10μM YM-F3和10μM ΥΜ-Β3各1μL，.50ng總DNA模板，用滅菌雙蒸水補足至25 yL;擴增程序為94°C預變性4min，94°C變形30s，.58°C退火30s，72°C延伸308，32個循環，最后72°(:延伸711^11。4.如權利要求1所述的引物在檢測油捺梅下毛癭中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK106065415SQ201610587046
【公開日】2016年11月2日
【申請日】2016年7月25日
【發明人】胡菡青, 范國成, 林雄杰, 王賢達, 羅水鑫, 陳瑾
【申請人】福建省農業科學院果樹研究所