雞包涵體肝炎的卵黃抗體及其制備方法

雞包涵體肝炎的卵黃抗體及其制備方法
【專利摘要】本發明提出了雞包涵體肝炎的卵黃抗體及其制備方法，卵黃抗體為含有雞包涵體肝炎病毒株，所述病毒為禽腺病毒I群血清4型病毒，命名為SDJ15?8，其保藏號為CCTCC NO:V201636，保藏于武漢大學中國典型培養物保藏中心。制備方法包括以下步驟：1)用雞包涵體肝炎病毒株SDJ15?8制成滅活疫苗；2)步驟1)制備的滅活疫苗注射免疫產蛋雞，制備高免蛋；3)由高免蛋收集卵黃用酸化水?辛酸的方法萃提、滅活后制備成雞包涵體肝炎的卵黃抗體。該卵黃抗體能夠有效預防與治療雞包涵體肝炎，治愈率達到82％以上。CCTCC NO:V20163620160616
【專利說明】
雞包涵體肝炎的卵黃抗體及其制備方法
技術領域
[0001] 本發明屬于獸用生物制品技術領域，具體涉及一種雞包涵體肝炎的卵黃抗體及其 制備方法。
【背景技術】
[0002] 雞包涵體肝炎特征為病雞死亡突然增多，嚴重貧血、黃疸，肝腫大，有出血和壞死 灶，心包積液。本病多發于4-10周齡的雞，5周齡雞最易感，產蛋雞則很少發病，肉雞多發。該 病的致病原屬于禽腺病毒I群，有12個血清型，1951年美國首次報道該病，隨著我國雞養殖 業的快速發展，近年來該病在我國肉雞養殖區呈局部流行趨勢，通過對萬方和維普數據庫 搜索，近2年該病以血清4型流行為主。該病目前無疫苗預防，肉雞臨床發生包涵體肝炎時常 見的抗病毒和抗菌治療效果不佳，治愈率低于40%，耐過雞發育受阻，與正常肉雞比較，料 肉比高7-13%，出欄時間延長7-12天，發育不整齊，嚴重影響經濟效益。
[0003] 卵黃抗體是指從免疫禽蛋中提取出的針對特定抗原的抗體，由于卵黃中僅有IgG 類抗體，故稱其為卵黃免疫球蛋白IgG(egg yolkimmunoglobulins)，簡稱為IgY。卵黃抗體 的研究始于19世紀末，1893年，Klemperer發現了卵黃中富含抗體；1934年Jukes的實驗證明 母雞血清中的抗體可以轉移到卵黃中，從而為雛雞提供被動免疫保護。Pat ter s等的試驗證 實，相對別的血漿蛋白，IgG被選擇性的轉運到卵泡中。1969年，Lesl ie和Clem將這種抗體命 名為IgY。
[0004] 卵黃抗體在多種環境中有較高的穩定性，在低于75°C條件下，卵黃抗體具有良好 的熱穩定性，90°C處理15min后，大部分卵黃抗體喪失結合活性，在pH<4時，僅有少量卵黃 抗體失去活性。在PH4-12范圍內，卵黃抗體的活性幾乎不受影響，在pH> 12時，卵黃抗體迅 速失去結合活性。實驗表明，卵黃抗體具有耐受反復凍融的特性，即使經過5次凍融，其抗原 結合活性幾乎不受影響。
[0005] 對于雞包涵體肝炎的預防和治療，目前除了加強消毒和疫苗免疫外，抗體免疫也 在控制該病的流行中發揮著重要作用。

【發明內容】

[0006] 為解決現有雞包涵體肝炎沒有有效抗體的問題，本發明提出一種雞包涵體肝炎的 卵黃抗體，該卵黃抗體能夠有效預防與治療雞包涵體肝炎，治愈率達到82%以上。
[0007] 本發明的技術方案是這樣實現的：
[0008] -種雞包涵體肝炎的卵黃抗體，其特征在于，所述卵黃抗體為含有雞包涵體肝炎 病毒株，所述病毒為禽腺病毒I群血清4型病毒，命名為SDJ15-8,其保藏號為CCTCC N0: V201636,保藏于武漢大學中國典型培養物保藏中心。
[0009] 本發明的另一個目的是提供一種雞包涵體肝炎的卵黃抗體的制備方法，包括以下 步驟：
[0010] 1)用雞包涵體肝炎病毒株SDJ15-8制成滅活疫苗；
[0011] 2)步驟1)制備的滅活疫苗注射免疫產蛋雞，制備高免蛋；
[0012] 3)由高免蛋收集卵黃用酸化水-辛酸的方法萃提、滅活后制備成雞包涵體肝炎的 卵黃抗體。
[0013] 進一步，所述步驟1)雞包涵體肝炎病毒株SDJ15-8是被甲醛滅活的。
[0014] 進一步，所述步驟1)滅活疫苗制備包括以下步驟：
[0015] a、接種:將雞包涵體肝炎病毒株SDJ15-8用滅菌生理鹽水稀釋后經卵黃囊接種于 SPF雞胚，37 °C進行靜置孵化，收集48~120小時內死亡的雞胚，收獲尿囊液；
[0016] b、向步驟a中的尿囊液中加入終濃度為0. lwt %甲醛溶液，滅活后，離心去沉淀物， 將上清液濃縮制得雞包涵體肝炎病毒株SDJ15-8抗原；
[0017] c、按常規法制備成油佐劑滅活疫苗。
[00?8]進一步，所述步驟b的濃縮倍數為15倍。
[0019] 本發明制備的雞包涵體肝炎病毒血清4型精制卵黃抗體，用于預防:在雞高發該病 的日齡，保護率96%以上。用于治療：1次用藥，治愈率達到82.0%以上，配合抗生素，治愈率 大于87.5%，病雞愈后發育良好，不影響養殖經濟效益。
【附圖說明】
[0020] 為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以 根據這些附圖獲得其他的附圖。
[0021 ]圖1為PCR產物凝膠電泳圖；
[0022]圖2為雞包涵體肝炎卵黃中和抗體效價變化趨勢。
【具體實施方式】 [0023] 實施例1 [0024]病毒株的分離與鑒定 [0025] 1.1病毒分離
[0026] 2014年3月，從山東濟南市章丘市辛寨鎮大高村肉雞養殖場采集臨床診斷為雞包 涵體肝炎的死亡雞肝臟，按質量體積比1:5(W/V)用生理鹽水勻漿，于-20°C和4°C反復凍融2 次，在4°C條件下12000rpm離心30分鐘，收集上清液，過濾除菌，分裝，-40°C保存。同時取樣， 按現行《中華人民共和國獸藥典》方法進行無菌檢驗合格。
[0027] 1.2PCR 鑒定
[0028] 1.2.1引物設計
[0029] 根據Genbank上雞包涵體肝炎I群基因序列，設計一對引物，目標片段約1300bp，弓丨 物序列如下：
[0030] FAdvFl :5'_atgctccgagcccctaaaagaagacattcc_3'（見SEQ ID NO: 1 所不）；
[0031 ] FAdvRl: 5'-ttacgggagggagcccgctggacagctgtagagc-3'（見SEQ ID NO: 2所不）〇
[0032] 1.2.2PCR
[0033] 1.2.2.1模板制備
[0034]取1.1中病料上清液，參照DNA提取試劑盒方法，提取DNA作為模板。
[0035] 1.2.2.2PCR反應體系及條件
[0036] 反應體系：ddH20 13μ1,模板2μ1，上下游引物各 1μ1，25πιΜ MgC122.5yl，dNTP Mixture 2·5μ1，γ Taq酶0·5μ1〇
[0037] 反應條件：941€511^11，941€4〇8,541€5〇8,72 1€5〇8,30循環，72。(：1〇11^11。
[0038] 反應結束后，取PCR產物進行凝膠電泳，在凝膠成像系統下觀察，擴增出約1300bp 的目的條帶（圖1)，其中Μ為DNA Marker DL2000，1和2泳道為PCR產物，3泳道為陰性對照。
[0039] 1.2.2.3測序
[0040] 剩余pCR產物送哈爾濱博仕生物科技有限公司進行測序，結果如下： atcatggttccgctgttgtttggattaaaaatgctcgcgttcgtgcactgcagactatagcatagaagggtgtatcg ctctccggaggccgaaaccggcacggggaggacgcggatccctatgtttcccgggttccaggcacctgttaccaccg ggctgaacacttggaattccccgatggatggttcatagtatccattggccgagtacgtccatgggctggtcacgctc ctattggccatgggttcaaagtccgtgagggtggcggtggaggggctgaccgttcccgcttgaatcccggaggggtt gcattgctggagataggcggacacccaaaaggtgaaccatttggcattggcggagttgaggtccccagggcgattcc ccatggtggcgctgtccaatttcaagtagagggaggtaacaaggagcccctgtatgttccactgttgaaggtagtag gcgcaagagaaggcgttcgcgctggaattgacggtcgtggcattgtaggtgttgaggctgggacttcccgagacaaa agtagcgatgggtgtggagacgctcccccctccgaccacggttaaagcgcccgcggtcaccgctagggtattagtgt cgtacttcagccctaggccattggcggagaccgtaagcggtccgctgggatccggtttcacttccagagtgttgttg acaatctgtaggctttcatccacggaaacgcccactcccgaactgtcggcttggatgcctccctgcgcttttaggtt gagttccagcactccgcttccggtcgaggtgttgaccgtgaacatgttaggattgatctcgaggtcgataccactgc tatcggcagtgatgggtccttgttggttgaggtgtacgcccagttctccctgatccacgagcaaggtgtcgtccacg ctgacccccagtccacccgcggtggaatccaatccgccggacgggtcgacttttacggccagttcccagtcatcgtt gaccattacggtcactccgtcgaccttgacgtccagtccatcgggggtgatgtccagggccccttcggggtcaacgg ccaccgccagttgaccttgggcgttgacatcgagactggggtcgtgggccaagtccaccgatctgttcttgatgatg atgggatcggtgacgttgagcgtaagctgtccgccctggtccactaggggtcctgagcctcccaaaaaaggcgggtt gagccctccgacggggtcggccacgtaatcgaaaggataaaccaggtcaagctgggatgctctcaccatgcgtttgg cgcgcttgattggagccggggaaggtcccgctcgg
[0041 ] 1.2.2.4序列比對
[0042] 核酸序列與Genbank上禽腺病毒I群血清4型同源性為99%，證明分離到的病毒為 禽腺病毒I群血清4型。
[0043] 1.3命名
[0044] 根據基因測序時間，將分離到的病毒命名為雞包涵體肝炎病毒SDJ15-8株，該毒株 部分基因序列在Genbank注冊號為KU589231，其保藏號為CCTCCN0:V201636,保藏于武漢大 學中國典型培養物保藏中心。
[0045] 實施例2
[0046] 病毒的傳代培養及鑒定
[0047] 2.1傳代培養
[0048] 雞包涵體肝炎病毒SDJ15-8株病料上清液用生理鹽水10倍稀釋，經卵黃囊接種7日 齡SPF雞胚，0.1ml/胚，收集接種24-120小時死亡雞胚尿囊液，標記為雞包涵體肝炎病毒 SDJ15-8株El，無菌檢驗合格后再連續傳代培養，病毒傳代培養過程中，根據各代病毒接種 后雞胚死亡時間段，適當調整病毒得稀釋倍數，直至在接種后60%以上雞胚死亡時間段集 中在60-92小時止。病毒傳代至第7代時，70%以上雞胚死亡時間段集中在60-92小時，收集 尿囊液，標記為雞包涵體肝炎病毒SDJ15-8株E7，無菌檢驗合格，于-40°C保存。
[0049] 2.2雞包涵體肝炎病毒SDJ15-8株E7鑒定 [0050] 2.2.1血凝性
[0051 ] 按照現行《中華人民共和國獸藥典》中方法制備1 %雞紅細胞懸液，以新城疫病毒 (Losta株，HA為1:210)為陽性對照，參照現行《中華人民共和國獸藥典》中96孔微量板法進 行檢測，室溫放置20~40分鐘，當陰性對照孔中紅細胞呈紐扣狀時判定結果。陽性對照和陰 性對照成立，結果為E7無血凝性。
[0052] 2.2.2病毒含量
[0053] E7用生理鹽水10倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-6和10-7 4個稀釋度接種7日齡SPF 雞胚，每個稀釋度各接種5枚，0.1ml/胚，用蠟封孔，于37.5°C靜置孵化，24小時以前死亡的 雞胚棄去不計，收集24~168小時死亡雞胚，按Reed-Muench法計算病毒含量為10_ 5.75ELD50/0.1ml。
[0054] 2.2.3純凈性
[0055] E7按照現行《中華人民共和國獸藥典》進行細菌、支原體和外源病毒檢驗合格。
[0056] 2.2.4特異性
[0057] E7用生理鹽水稀釋至200ELD50/0.1ml，與等量抗雞包涵體肝炎特異性血清混合， 37°C水浴中和1小時，尿囊腔接種7日齡SPF雞胚10枚，0. lml/胚;同時設病毒對照10枚，接種 同條件處理的病毒與生理鹽水混合液0.1ml/枚，上述雞胚用蠟封孔，于37°C靜置孵育，觀察 至168小時。中和組雞胚全部健活，對照組雞胚全部死亡。說明病毒能被抗雞包涵體肝炎抗 體中和。
[0058] 2.2.5免疫原性
[0059] 2.2.5.1雞包涵體肝炎油乳劑滅活疫苗制備
[0060] 2.2.5.1.1油相制備取注射白油94.0ml，加入硬脂酸鋁2.0g，邊加邊攪拌，而后加 熱直至完全透明，再加入6.0ml司本-80，充分混勻，高壓滅菌備用。
[0061 ] 2.2.5.1.2水相制備E7含毒尿囊液96.0ml，加入終濃度為0.2 %的甲醛，37 °C滅活 24小時，期間振搖4~6次，而后加入4.0ml滅菌吐溫-80,充分振搖后使吐溫-80完全溶解。 [0062] 2.2.5.1.3乳化將油相導入膠體磨乳化1分鐘后緩慢加入水相，水相全部加入后 再乳化3~5分鐘。
[0063] 2.2.5.1.4分裝定量分裝，加蓋密封，2-8 °C保存。
[0064] 2.2.5.2檢驗
[0065] 2.2.5.2.1外觀為乳白色均勻乳劑。
[0066] 2.2.5.2.2劑型油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴于清潔冷水表面，除第 一滴外，應呈油滴狀，不擴散。
[0067] 2.2.5.2.3穩定性吸取疫苗加入離心管中，3000轉/分鐘離心15分鐘，應不出現分 層。
[0068] 2.2.5.2.4黏度按現行《中華人民共和國獸藥典》檢驗，應符合規定。
[0069] 2.2.5.2.5無菌檢驗按現行《中華人民共和國獸藥典》檢驗，應無菌生長。
[0070] 2.2.5.2.6安全檢驗疫苗皮下或肌肉注射4~5周齡SPF雞10只，2.0ml/每只。飼養 觀察14日，應不出現由疫苗引起的任何局部和全身不良反應。
[0071] 2.2.5.3免疫接種
[0072] 疫苗按如下免疫程序接種90~120日齡SPF雞10只，同時設5只對照，不做任何處 理，免疫程序如下：
[0073] 基礎免疫每只雞腿部肌肉注射油乳劑滅活疫苗0.5ml。
[0074] 加強免疫在基礎免疫后21日進行第2次接種，每只雞胸部肌肉注射油乳劑滅活疫 苗1.5ml〇
[0075] 強化免疫在加強免疫后10日進行第3次接種，每只雞頸背部皮下注射油乳劑滅活 疫苗2.0ml。
[0076] 2.2.5.4抗體效價檢測
[0077] 強化免疫后14日宰殺試驗組和對照組的雞，分別分離血清，按組混合，按現行《中 華人民共和國獸藥典》的中和試驗法檢測血清中雞包涵體肝炎特異性抗體效價。結果為:試 驗組中和抗體效價為1:320,對照組中和抗體效價<1:4。結果說明雞包涵體肝炎病毒 SDJ15-8株免疫原性良好。
[0078] 實施例3
[0079] 雞包涵體肝炎病毒血清4型精制卵黃抗體制備
[0080] 3.0^原制備
[0081 ] 3.1.1接種將雞包涵體肝炎病毒SDJ15-8株E7用滅菌生理鹽水作15000倍稀釋，經 卵黃囊接種7日齡SPF雞胚，每胚0. lml，用蠟封孔，于37°C靜置孵化。
[0082] 3.1.2孵育和觀察棄去48小時前死亡的雞胚，以后每隔6小時照蛋1次，收集48~ 120小時內死亡的雞胚，于2~8 °C冷藏12~24小時。
[0083] 3.1.3收獲雞胚用碘酊消毒蛋殼表面氣室部，無菌操作除去氣室部蛋殼，收獲尿 囊液，分組置于無菌容器內，標記為雞包涵體肝炎病毒SDJ15-8株E8，置-20°C及以下溫度保 存。
[0084] 3.2抗原檢驗
[0085] 3.2.1無菌檢驗將E8以瓶為單位，按現行《中華人民共和國獸藥典》附錄檢驗，應 無細菌生長。
[0086] 3.2.2病毒含量為10-5.5%0)50/0.11111。
[0087] 3.3抗原滅活與濃縮將檢驗合格的E8加入終濃度為0.1 %甲醛溶液(含36~40% 甲醛），密閉后置37°C滅活24小時(其間4~6小時振搖1次，每次3分鐘）后，經4000轉/分鐘離 心20分鐘，棄去沉淀物，分成2份。將2份上清液用截留分子量為10KD的中空纖維超濾器分別 濃縮10倍和15倍，即為制備疫苗用抗原，分別標記為雞包涵體肝炎病毒SDJ15-8株抗原1和 抗原2。
[0088] 3.4抗原滅活檢驗
[0089] 3.4.1無菌檢驗
[0090] 雞包涵體肝炎病毒SDJ15-8株抗原1和抗原2按現行《中華人民共和國獸藥典》檢 驗，應無細菌生長。
[0091] 3.4.2滅活檢驗
[0092] 雞包涵體肝炎病毒SDJ15-8株抗原1和2分別經卵黃囊接種7日齡SPF雞胚5枚，每胚 0. lml，用蠟封孔，37 °C靜置孵化，觀察至168小時，SPF雞胚應全部健活，胚體無雞包涵體肝 炎感染導致的典型病變。
[0093] 3.5油乳劑滅活疫苗的制備及檢驗
[0094]取雞包涵體肝炎病毒SDJ15-8株抗原1和2，按2.2.4.1制備油乳劑滅活疫苗，分別 標記為雞包涵體肝炎病毒油乳劑滅活疫苗1和2，按2.2.4.2檢驗合格。
[0095] 3.6雞包涵體肝炎病毒血清4型油乳劑滅活疫苗1和2免疫后抗體效價監測
[0096] 120日齡商品蛋雞（按雞群0.5%抽樣采血檢測，應無禽白血病和禽網狀內皮增生 癥，雞白痢和雞支原體陽性率應<〇. 1 % ) 100只，分為2組，每組50只，分別用雞包涵體肝炎 病毒油乳劑滅活疫苗1和2按2.2.4.3免疫。3次免疫后1周收集高免雞蛋，分離卵黃，按卵黃 與注射用水(V/V) 1:3稀釋，充分攪拌，加入終濃度20 %的氯仿，劇烈震蕩20分鐘，4000轉/分 鐘離心20分鐘，收集上清，過濾除菌，按現行《中華人民共和國獸藥典》的中和試驗法檢測上 清中雞包涵體肝炎特異性抗體效價。結果:雞包涵體肝炎病毒油乳劑滅活疫苗1和2免疫雞 所收集高免雞蛋的雞包涵體肝炎卵黃中和抗體效價分別為1:320和1:640。隨后每隔1周收 集高免雞蛋1次，檢測雞包涵體肝炎卵黃中和抗體效價直至第8周，具體的中和抗體效價變 化趨勢見圖2。分析圖2結果，雞包涵體肝炎病毒油乳劑滅活疫苗2比疫苗1免疫后產生的雞 包涵體肝炎卵黃中和抗體效價高且持續時間長。
[0097] 3.7雞包涵體肝炎血清4型精制卵黃抗體制造及檢驗
[0098] 3.7.1高免雞蛋的生產
[0099] 3.7.1.1產蛋雞應具有商品蛋雞的生產性能。
[0100] 3.7.1.1.1按雞群0.5%抽樣采血，分別按ELISA和AGP法檢測抗體，應全部為陰性.
[0101] 3.7.1.1.2雞白痢和雞支原體按NY/T 536-2002《雞傷寒和雞白痢診斷技術》和 NY/T553-2002《禽支原體病診斷技術》進行檢測，雞白痢和雞支原體感染陽性率應<0.1 %。
[0102] 3.7.1.1.3產蛋雞的飼養管理雞場建設必須符合獸醫衛生防疫規范要求。雞場應 離交通要道500米以上，進、出口道路應分開。場內料、糞道路分開。雞場進出口應設有消毒 池。育雛舍與成雞舍應設隔離帶。此外，雞場應具備糞污處理設施，實施全進全出制，雞場飲 水應達到衛生標準，飼養人員應衛生健康。
[0103] 3.7.1.1.4雞的疫病防治根據當地疫病發生的實際情況，按科學免疫程序適時接 種相關疫苗，根據情況需要，適時、適量投喂抗生素和抗球蟲藥品等。
[0104] 3.7.1.1.5雞的日齡 100 ~120日齡。
[0105] 3.7.1.2 疫苗免疫
[0106] 3.7.1.2.1疫苗制備
[0107]按3.1-3.5，制備雞包涵體肝炎病毒血清4型油乳劑滅活疫苗2并檢測合格。
[0108] 3.7.1.2.2免疫程序
[0109] 按2.2.5.3執行。維持免疫：當卵黃中雞包涵體肝炎中和抗體效價臨界1:640時，維 持接種1次，每只雞頸背部皮下注射疫苗2 2.0ml。
[0110] 3.7.1.3收蛋強化免疫后7日，抽樣取蛋，分離卵黃，按3.6檢測雞包涵體肝炎中和 抗體效價應多1:640為合格，收集高免雞蛋，8~12 °C貯存，應不超過10日。
[0111] 3.7.2抗體制造
[0112] 3.7.2.1 消毒
[0113] 高免雞蛋擺入塑料蛋盤，浸入40°C、0.1 %新潔爾滅水溶液中消毒15~20分鐘。而 后將高免雞蛋用福爾馬林密閉熏蒸消毒30分鐘。
[0114] 3.7.2.2 分離卵黃
[0115] 手工或機械打蛋，除去蛋清（白）、胚盤和系帶，收集卵黃。
[0116] 3.7.2.3 抗體萃取
[0117] 充分攪拌使卵黃呈均勻膏狀，裝入500L攪拌罐中，按體積比1:1加入25°C左右的滅 菌注射用水(用〇. 2M鹽酸調節pH4.3)，200轉/分鐘，攪拌30分鐘，將卵黃液轉入不銹鋼桶中， 加入終濃度為4%正辛酸，用轉頭裝有槳葉的電轉攪拌30分鐘，室溫放置12~24小時，用40 目濾網撇去漂浮在上層的蛋黃，用80目濾布過濾，收集濾液，濾出液和下層液體合并，用板 框過濾器加濾板和0.4微米濾膜過濾，即為抗體半成品，將抗體半成品轉入用0.2 %甲醛溶 液消毒的500L冰柜中，4°C冷藏5小時，使殘留的辛酸結晶凝結析出，用80目濾網撇去浮在上 層的辛酸結晶，用〇. 2M氫氧化鈉溶液調pH7.0,再后用磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液調節 pH6.9 〇
[0118] 3.7.2.4 過濾
[0119] pH6 · 9抗體半成品用過濾精度0 · 45μπι的筒式濾芯精濾，而后用過濾精度0 · 2μπι的筒 式濾芯過濾除菌，無菌操作分裝，裝量為250ml/瓶，即為雞包涵體肝炎病毒血清4型精制卵 黃抗體。
[0120] 3.7.3抗體檢驗
[0121] 3.7.3.1純凈性
[0122] 按照現行《中華人民共和國獸藥典》進行檢測，無細菌、支原體和外源病毒污染。
[0123] 3.7.3.2效價檢測
[0124] 按照現行《中華人民共和國獸藥典》進行檢測，雞包涵體肝炎病毒血清4型中和抗 體效價應彡1:320。
[0125] 3.7.3.3安全性檢驗
[0126] 5日齡健康肉雞雛10只，每只皮下注射1.0ml，觀察14日，應全部健活。
[0127] 3.7.3.4辛酸和甲醛殘留
[0128] 按照現行《中華人民共和國獸藥典》進行檢測，應符合規定。
[0129] 實施例4
[0130] 雞包涵體肝炎病毒血清4型精制卵黃抗體臨床使用劑量、方法研究
[0131] 4.1用于預防
[0132] 4.1.1 按日齡
[0133] 4.1.1.1 5日齡雛雞試驗
[0134] 5日齡肉雞雛70只，分為7組，每組10只，1-3組分別經肌肉注射雞包涵體肝炎精制 卵黃抗體0. lml/只、0.3ml/只、0.5ml/只；4-6組分別經皮下注射雞包涵體肝炎精制卵黃抗 體0 . lml/只、0.3ml/只、0.5ml/只；7為對照組，不做任何處理。在接種抗體后24小時，對1-7 組所有雞雛肌肉注射接種雞包涵體肝炎SDJ15-8株100LD50/只，接種病毒后觀察10天，統計 各組雞雛發病及死亡情況。結果顯示:7組發病率100 %，死亡率90 % ; 1組和4組雛雞發病率 分別為70%和60%，未死亡；其它組雞雛均健活，未出現包涵體肝炎臨床發病癥狀（臨診癥 狀及病理變化參照《獸醫傳染病學》第五版，P369)，說明抗體接種途徑不影響預防保護率。
[0135] 4.1.1.2 10日齡雛雞試驗
[0136] 10日齡肉雞雛40只，分為4組，每組10只，1-3組分別經肌肉注射雞包涵體肝炎精制 卵黃抗體0.2ml/只、0.3ml/只、0.5ml/只；4組為對照組，不做任何處理。在接種抗體后24小 時，對1-4組所有雞雛肌肉注射接種雞包涵體肝炎SDJ15-8株100LD50/只，接種病毒后觀察 10天，統計各組雞雛發病及死亡情況。結果顯示:4組發病率100%，死亡率70% ;1組雛雞發 病率為40%，未死亡;其它組雞雛均健活，未出現包涵體肝炎臨床發病癥狀。
[0137] 4.1.1.3 15日齡雛雞試驗
[0138] 15日齡肉雞雛40只，分為4組，每組10只，1-3組分別經肌肉注射雞包涵體肝炎精制 卵黃抗體0.3ml/只、0.5ml/只、0.8ml/只；4為對照組，不做任何處理。在接種抗體后24小時， 對1-4組所有雞雛肌肉注射接種雞包涵體肝炎SDJ15-8株100LD50/只，接種病毒后觀察10 天，統計各組雞雛發病及死亡情況。結果顯示:4組發病率100%，死亡率60%; 1組雛雞發病 率為50%，未死亡;其它組雞雛均健活，未出現包涵體肝炎臨床發病癥狀。
[0139] 4.1.2按體重(對于15日齡以上雛雞）
[0140] 25日齡肉雛雞40只，隨機分為4組，1組按0.5ml抗體/kg體重、2組按0.8ml抗體/kg 體重、3組按1.0ml抗體/kg體重皮下注射雞包涵體肝炎精制卵黃抗體，接種抗體后24小時， 對1-4組所有雞雛肌肉注射接種雞包涵體肝炎SDJ15-8株100LD50/只，接種病毒后觀察10 天，統計各組雞雛發病及死亡情況。結果顯示:4組發病率100%，死亡率50% ; 1組雛雞有1只 表現出精神沉郁，發病率為10%，未死亡;其它組雞雛均健活，未出現包涵體肝炎臨床發病 癥狀。
[0141] 4.1.3結論
[0142] 雞包涵體肝炎精制卵黃抗體經肌肉或皮下注射接種，兩種途徑均可，不影響預防 保護率。用于預防：15日齡及以下肉雛雞，每只接種劑量為0.3-0.5ml; 15日齡以上肉雛雞， 接種劑量為〇.8ml/kg體重。
[0143] 4.2用于治療
[0144] 4.2.1 按日齡
[0145] 4.2.1.1 5日齡雛雞試驗
[0146] 5日齡肉雞雛40只，分為4組，每組10只，1-4組雞雛分別肌肉注射接種雞包涵體肝 炎SDJ15-8株100LD50/只。1-3組為治療組，待每組有2只雛雞出現包涵體肝炎臨床發病癥狀 時開始全組治療，分別皮下注射雞包涵體肝炎精制卵黃抗體〇.8ml/只、1.0ml/只、1.5ml/ 只；4組為對照組，不做任何處理。接種抗體后觀察10天，統計各組雞雛發病及死亡情況。結 果顯示:4組死亡率80 % ; 1-3組死亡率分別為20 %、0和0，治愈率（以觀察期結束無包涵體肝 炎臨床癥狀為治愈)60%、80%和90%。
[0147] 4.2.1.2 10日齡雛雞試驗
[0148] 10日齡肉雞雛40只，分為4組，每組10只，1-4組雞雛分別肌肉注射接種雞包涵體肝 炎SDJ15-8株100LD50/只。1-3組為治療組，待每組有2只雛雞出現包涵體肝炎臨床發病癥狀 時開始全組治療，分別皮下注射雞包涵體肝炎精制卵黃抗體1.0ml/只、1.5ml/只、2.0ml/ 只；4組為對照組，不做任何處理。接種抗體后觀察10天，統計各組雞雛發病及死亡情況。結 果顯示:4組死亡率80 % ; 1-3組死亡率分別為10 %、0和Ο，治愈率（以觀察期結束無包涵體肝 炎臨床癥狀為治愈)70%、80%和80%。
[0149] 4.2.2按體重(對于15日齡以上雛雞）
[0150] 20日齡肉雞40只，隨機分為4組，1-4組雞分別肌肉注射接種雞包涵體肝炎SDJ15-8 株100LD50/只。1-3組為治療組，待每組有2只雞出現包涵體肝炎臨床發病癥狀時開始全組 治療，分別按1.5ml、1.8ml和2 . Oml/kg體重皮下注射雞包涵體肝炎精制卵黃抗體，觀察10 天，統計各組雞死亡情況。結果顯示:第4組死亡率80 % ;第1-3組死亡率均為0，治愈率80 %、 80 % 和 90 %。
[0151] 4.2.3結論
[0152] 用于治療：以彡80 %治愈率為標準，10日齡及以下肉雞雛，1.0-1.5ml抗體/只；大 于10日齡肉雞，1.5-2. Oml抗體/kg體重。
[0153] 實施例5
[0154] 雞包涵體肝炎血清4型精制卵黃抗體保存期
[0155] 5.1 方法
[0156] 取于2-8 °C保存6、12、15個月的雞包涵體肝炎病毒血清4型精制卵黃抗體，分別肌 肉注射10只5日齡AA肉雞雛0.3ml/只，同時設相同日齡和數量的雞雛作為對照，在接種抗體 后24小時對上述2組雞雛肌肉注射雞包涵體肝炎SDJ15-8株100LD50/只，觀察10日，統計各 組雞雛發病及死亡情況。
[0157] 5.2 結果
[0158] 攻毒對照組雞雛100 %發病，死亡率>70 %。接種保存6個月和12個月抗體的雞雛 均健活，接種保存15個月抗體的雞雛有2只發病，未死亡，其余健活。說明抗體的有效期為12 個月。
[0159] 實施例6
[0160] 雞包涵體肝炎血清4型精制卵黃抗體質量標準
[0161] 本品系用雞包涵體肝炎SDJ15-8株接種SPF雞胚培養，收獲接種后48~120小時死 亡雞胚的尿囊液，濃縮、滅活，制成油乳劑滅活疫苗，接種健康產蛋雞，從高免卵黃中提取抗 體制成。用于雞包涵體肝炎的預防和早期治療。
[0162] 【性狀】本品為無色至微黃色澄明液體，久置瓶底有微量沉淀。
[0163] 【無菌檢驗】按現行《中華人民共和國獸藥典》檢測，應無細菌生長。
[0164] 【支原體檢驗】按現行《中華人民共和國獸藥典》檢測，應無支原體生長。
[0165] 【外源病毒檢驗】按現行《中華人民共和國獸藥典》檢測，應無外源病毒污染。
[0166] 【安全檢驗】用5日齡易感健康雛雞10只，每只皮下注射本品1.0ml，連續觀察14日， 雛雞應全部健活。
[0167] 【效力檢驗】按現行《中華人民共和國獸藥典》檢測，雞包涵體肝炎病毒血清4型中 和抗體效價應多1:320。
[0168] 【甲醛殘留】按現行《中華人民共和國獸藥典》檢測，應符合規定。
[0169] 【辛酸殘留】按現行《中華人民共和國獸藥典》檢測，應符合規定。
[0170] 【規格】250ml/瓶
[0171] 【貯藏與有效期】2~8°C貯存，有效期為12個月。
[0172] 雞包涵體肝炎精制卵黃抗體使用說明
[0173] 【作用與用途】用于雞包涵體肝炎病毒血清4型的預防和早期治療。
[0174] 【用法與用量】皮下或肌肉注射。用于預防：15日齡及以下雛雞，每只接種劑量為 0.3-0.5ml; 15日齡以上雛雞，接種劑量為0.8ml/kg體重。用于治療：10日齡及以下雞雛， 1.0-1.5ml抗體/只；10日齡以上雞，1.5-2.0ml抗體/kg體重。
[0175] 【注意事項】
[0176] 1本品□服無效，預防保護期為6日。
[0177] 【規格】250ml/瓶。
[0178] 【貯藏與有效期】8~12°C貯存，有效期為12個月。
[0179] 以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精 神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種雞包涵體肝炎的卵黃抗體，其特征在于，所述卵黃抗體為含有雞包涵體肝炎病 毒株，所述病毒為禽腺病毒I群血清4型病毒，命名為SDJ15-8,其保藏號為CCTCC NO: V201636,保藏于武漢大學中國典型培養物保藏中心。2. 如權利要求1所述的雞包涵體肝炎的卵黃抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步 驟： 1) 用雞包涵體肝炎病毒株SDJ15-8制成滅活疫苗； 2) 步驟1)制備的滅活疫苗注射免疫產蛋雞，制備高免蛋； 3) 由高免蛋收集卵黃用酸化水-辛酸的方法萃提、滅活后制備成雞包涵體肝炎的卵黃 抗體。3. 根據權利要求2所述的雞包涵體肝炎的卵黃抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟 1)雞包涵體肝炎病毒株SDJ15-8是被甲醛滅活的。4. 根據權利要求3所述的雞包涵體肝炎的卵黃抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟 1)滅活疫苗制備包括以下步驟： a、 接種:將雞包涵體肝炎病毒株SDJ15-8用滅菌生理鹽水稀釋后經卵黃囊接種于SPF雞 胚，37°C進行靜置孵化，收集48~120小時內死亡的雞胚，收獲尿囊液； b、 向步驟a中的尿囊液中加入終濃度為O.lwt%甲醛溶液，滅活后，離心去沉淀物，將上 清液濃縮制得雞包涵體肝炎病毒株SDJ15-8抗原； c、 按常規法制備成油佐劑滅活疫苗。5. 根據權利要求4所述的雞包涵體肝炎的卵黃抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟 b的濃縮倍數為15倍。
【文檔編號】C07K16/08GK106065030SQ201610624695
【公開日】2016年11月2日
【申請日】2016年8月2日
【發明人】魏思遠
【申請人】重慶三杰眾鑫生物工程有限公司