腎細胞癌的預后判定方法

腎細胞癌的預后判定方法
【專利摘要】本發明提供一種迅速、簡便且高精度的癌預后判定方法。一種腎細胞癌患者的預后判定方法，包括以下工序：(1)將由受檢者的腎臟組織制備的基因組DNA用亞硫酸氫鹽進行處理的工序；(2)將該被亞硫酸氫鹽處理了的DNA通過PCR進行擴增的工序；(3)將得到的PCR擴增產物供給離子交換色譜的工序；(4)獲得在該色譜中得到的檢測信號的保留時間的工序；(5)工序(4)的結果比成為基準的保留時間早的情況下，將受檢者的腎細胞癌判定為預后不良的工序。
【專利說明】
腎細胞癌的預后判定方法
技術領域
[0001] 本發明設及利用了甲基化DNA的檢測的腎細胞癌的預后判定方法。
【背景技術】
[0002] 近年來，人們清楚地意識到DNA的異常甲基化深度參與癌癥化而受到關注。作為癌 細胞的特征性的表觀遺傳異常，已知有部分基因啟動子區域中的CpG島的異常的DNA甲基 化。CpG島是介由憐酸二醋鍵(P)的胞喀晚(C)-鳥嚷嶺(G)的二堿基序列高頻出現的區域，大 多存在于基因上游的啟動子區域。CpG島的異常DNA甲基化通過抑癌基因的失活等來參與癌 變。在大腸癌、胃癌等中，已經報道了與臨床病理學因素相關的CpG島的DNA甲基化亢進(非 專利文獻1~4)，運種類型的癌被稱為CpG島甲基化表型(CIMP)陽性癌。
[0003] 作為已經確立的甲基化DNA的解析方法，有利用了亞硫酸氨鹽（重亞硫酸鹽、酸式 亞硫酸鹽、bisulfite)反應的方法。該方法是在甲基化DNA的解析中最通用的方法。當用亞 硫酸氨鹽對單鏈DNA進行處理時，胞喀晚經經過橫化、水解脫氨化、脫橫化而被變換為尿喀 晚。另一方面，被甲基化的胞喀晚由于最初發生的橫化的反應速度極為緩慢，因此，在實際 進行的亞硫酸氨鹽處理的反應時間中，仍保持為甲基化胞喀晚。因此，如果使用亞硫酸氨鹽 處理了的DNA進行PCR^olymerase化ain Reaction),則甲基化胞喀晚仍為胞喀晚，但未甲 基化胞喀晚從尿喀晚被置換為胸腺喀晚而被擴增。利用該PCR擴增產物的序列中產生的胞 喀晚與胸腺喀晚的堿基的差異，對甲基化狀態進行解析。將其作為基本原理通用的方法是 專利文獻1、非專利文獻5中記載的Meth5dation-Specific PCR(MSP)法、W及非專利文獻6、 7中記載的Combined Bisulfite Restriction Analysis(COBRA)法。
[0004] MSP法是如下方法，即，在DNA的亞硫酸氨鹽處理后，依次進行使用了甲基化序列特 異性引物和未甲基化序列特異性引物的PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳，通過兩個引物所致的擴 增產物的有無來判定對象區域的DNA甲基化狀態。COBRA法是如下方法，即，在DNA的亞硫酸 氨鹽處理后，依次進行使用了甲基化DNA和未甲基化DNA所共同的引物的PCR擴增、使用了識 別甲基化DNA和未甲基化DNA中序列不同的位置的限制性內切酶的處理、瓊脂糖凝膠電泳， 通過限制性內切酶處理片段的有無來判定對象區域的DNA甲基化狀態。兩種方法從在無需 特殊裝置下能夠進行甲基化DNA的定量解析的方面來看均是目前廣泛使用的甲基化DNA解 析方法，但是存在對于解析中利用電泳法運點需要花費勞動和時間的課題。
[0005] 另一方面，在生物化學、醫學等領域的核酸、蛋白質、多糖類等生物體高分子的分 離分析中，作為能夠簡便且短時間精度良好地檢測的方法，通用的是離子交換色譜。使用離 子交換色譜對核酸的PCR擴增產物進行分離的情況下，一般而言，使用利用核酸分子中所含 的憐酸的負電荷進行分離的陰離子交換色譜。填充有具有陽離子性官能團作為離子交換基 團的色譜柱填充劑的陰離子交換色譜用色譜柱已經上市銷售，并在各種研究領域中使用。
[0006] 此外，已經報道了通過使用了填充有具有強陽離子性基團和弱陽離子性基團二者 作為陽離子性官能團的色譜柱填充劑的色譜柱的離子交換色譜，能夠對20mer的未甲基化 合成寡核巧酸間的單個堿基的差異進行分離分析(專利文獻2)。
[0007] 腎細胞癌(Renal Cell化;rcinoma:RCC)常發生于屬于勞動人口的壯年期，大部分 是利用腎摘除術得到根治的病例人群，相反地，也明顯存在迅速遠距離轉移的病例人群，兩 者的臨床過程有很大差異。此外，已知即使轉移也有免疫療法?分子祀向治療藥等成功的 病例。復發可能性高的病例如果經過密切觀察早期診斷復發，并追加后續療法則有能夠改 善預后的可能性。但是，接觸過雖然屬于病理組織學上為低非典型度且作為最常見組織類 型的透明細胞型RCC但迅速遠距離轉移的病例，基于現有的臨床病理學因素等的預后預測 是困難的。
[000引通過基于MSP法、COBRA法W及細菌人工染色體(BAC)陣列的甲基化CpG島擴增法 (BAMCA法)進行解析，顯示出從RCC患者得到的非癌腎皮質組織已經處于與DNA甲基化狀態 的變化相關的前癌階段(專利文獻3和非專利文獻8~11)。進而，通過基于BAMCA法的全基因 組的解析，也可明確處于前癌階段的非癌腎皮質組織的DNA甲基化的變化來自于同一患者 的相應的RCC，成功開發出預測RCC病例的預后的方法(專利文獻3和非專利文獻10)。
[0009] 最近，可判明惡性度高的RCC顯示CIMP陽性表型，W及FAM150A、GRM6、ZW540、 ZFP42、ZNF154、RIMS4、PCDHAC1、K皿RBS2、ASCL2、KCNQ1、PRAC、WNT3A、T畑、FAM78A、ZNF6 71、 SLC13A5和NKX6-2的17種基因的CpG位點的甲基化為RCC的CIMP的特征(專利文獻4)。專利文 獻4中，提出了如下方法，即，利用微珠陣列法，質量分析(MassARRAY法）、焦憐酸測序、甲基 化敏感性高分辨率烙解曲線分析、定量PCR、亞硫酸氨鹽處理物的直接測序、COBRA法等，對 上述17種基因的CpG位點的甲基化水平進行檢測，由此來檢測RCC的預后不良風險。用W往 使用的MassARRAY法、焦憐酸測序等方法得到的DNA甲基化率的值可得到作為供于測定的試 樣全體的平均值的DNA甲基化率。因此，在試樣中DNA甲基化率低的細胞量多的情況下，即使 混合存在具有高度甲基化DNA的細胞，得到的DNA甲基化率的值也變低。作為結果，存在W下 問題:無法判定有無具有高度甲基化DNA的細胞，進而不能避免過低估計DNA甲基化率的風 險。
[0010] 現有技術文獻
[0011] 專利文獻
[0012] 專利文獻1:美國專利第5786146號公報
[0013] 專利文獻2:國際公開公報第2012/108516號
[0014] 專利文獻3:日本特開2010-63413號公報 [0015] 專利文獻4:國際公開公報第2013/062650號
[0016] 非專利文獻
[0017] 非專利文獻 1: Nat. Rev. Cancer，4，988-993( 2004)
[001 引 非專利文獻2: Proc. Natl. Acad. Sci . USA，96，8681-8686( 1999)
[0019] 非專利文獻 3 :Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104,18654-18659(2007)
[0020] 非專利文獻4:Cancer Res. ,59,5438-5442(1999)
[0021] 非專利文獻 5 :Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93,9821-9826( 1996)
[0022] 非專利文獻6:Nucleic Acids Res. ,24,5058-5059(1996)
[0023] 非專利文獻7:Nucleic Acids Res. ,25,2532-2534(1997)
[0024] 非專利文獻8:Clin.Cancer Res. ,14,5531-5539(2008)
[00巧]非專利文獻9: Int. J. Cancer，119，288-296(2006)
[0026] 非專利文獻 10: Carcinogenesis，30，214-221 (2009)
[0027] 非專利文獻 ll:Pathobiology，78，l-9(2011)

【發明內容】

[0028] 為了防止癌癥的復發，優選通過獲得基因組DNA的甲基化狀態的信息，從而特異性 高地判定復發風險來開始治療。如果能夠預測并早期發現癌的轉移?復發，則對其可期待 免疫療法或分子祀向治療藥等的奏效，所W，正在尋求一種能夠進行更準確的癌預后診斷 的方法。進而，尋求一種用于準確的癌預后診斷的迅速且簡便的方法。
[0029] 本發明人等發現通過用PCR對經亞硫酸氨鹽處理的DNA進行擴增，將由此得到的 PCR擴增產物利用離子交換色譜進行分離，從而能夠迅速且簡便地檢測甲基化DNA。進而，本 發明人等發現，利用離子交換色譜得到的信號的圖案在由CIMP陽性癌得到的DNA和由CIMP 陰性癌得到的DNA之間是不同的，并且通過對該圖案的不同進行解析，能夠判定預后不良的 癌，從而完成本發明。
[0030] 本發明提供W下內容。
[0031] 〔1)一種含有腎細胞癌的組織的判定方法，包括W下工序：
[0032] (1)將由受檢者的腎臟組織制備的基因組DNA用亞硫酸氨鹽進行處理的工序；
[0033] (2)將該用亞硫酸氨鹽處理了的DNA通過PCR進行擴增的的工序；
[0034] (3)將得到的PCR擴增產物供給離子交換色譜的工序；
[0035] (4)獲得在該色譜中得到的檢測信號的保留時間的工序；
[0036] (5)在工序(4)的結果早于成為基準的保留時間的情況下，判定該組織為從預后不 良的腎細胞癌患者得到的含有腎細胞癌的組織的工序。
[0037] 〔2)-種用于判定含有腎細胞癌的組織的數據的獲得方法，包括W下工序：
[0038] (1)將由受檢者的腎臟組織制備的基因組DNA用亞硫酸氨鹽進行處理的工序；
[0039] (2)將該用亞硫酸氨鹽處理了的DNA通過PCR進行擴增的的工序；
[0040] (3)將得到的PCR擴增產物供給離子交換色譜的工序；
[0041] (4)獲得在該色譜中得到的檢測信號的保留時間的工序；
[0042] (5)取得W下數據的工序，即，將工序(4)的結果是否早于成為基準的保留時間作 為用于判定該組織是否為從預后不良的腎細胞癌患者得到的含有腎細胞癌的組織的數據。
[0043] 〔3)-種腎細胞癌患者的預后判定方法，包括W下工序：
[0044] (1)將由受檢者的腎臟組織制備的基因組DNA用亞硫酸氨鹽進行處理的工序；
[0045] (2)將該用亞硫酸氨鹽處理了的DNA通過PCR進行擴增的的工序；
[0046] (3)將得到的PCR擴增產物供給離子交換色譜的工序；
[0047] (4)獲得在該色譜中得到的檢測信號的保留時間的工序；
[0048] (5)在工序(4)的結果早于成為基準的保留時間的情況下，將該受檢者的腎細胞癌 判定為預后不良的工序。
[0049] 〔 4)根據〔1)~〔3)中任一項記載的方法，上述工序(2)中，被PCR擴增的DNA含有選 自FAM150A、GRM6、ZNF540、ZFP42、ZNF154、RIMS4、PCDHAC1、KHDRBS2、ASCL2、KCNQ1、PRAC、 WNT3A、T畑、FAM78A、ZNF671、化Cl 3A5 W 及 NKX6-2 中的至少一個基因的 CpG 島。
[0050] 〔5)根據〔1)~〔3)中任一項記載的方法，上述工序（2)中，被PCR擴增的DNA含有 FAMl 50A基因啟動子區域。
[0051] 〔6)根據〔1)~〔3)中任一項記載的方法，上述工序(2)的PCR中，使用由序列號51和 52表示的PCR引物。
[0化2] 〔7)根據〔1)~〔6)中任一項記載的方法，在上述工序(4)之間，進一步包括W下工 序：
[0053] (r)將與由上述受檢者的腎臟組織制備的基因組DNA的PCR擴增區域相當的未甲 基化的DNA用亞硫酸氨鹽進行處理的工序；
[0054] (2'）將工序（1'）中得到的被亞硫酸氨鹽處理過的DNA通過PCR進行擴增的工序；
[0055] (3'）將工序(2'）中得到的PCR擴增產物供給離子交換色譜的工序；
[0056] (3a)從工序(3)的色譜所得到的檢測信號減去工序(3'）的色譜所得到的檢測信號 而得到差值數據的工序。
[0057] 本發明提供一種迅速、簡便且高精度的癌預后判定方法。根據本發明，能夠更迅 速、簡便且高精度判定癌患者的復發風險，因此，能夠對必須進行治療的癌患者重新進行早 期治療。因此，本發明對癌患者的生存率的提高有貢獻。
【附圖說明】
[0化引圖1是DNA甲基化率所致的色譜洗脫時間的變動。A: DNA甲基化率的不同DNA(0 %、 25%、50%、75%、100% )的色譜圖，B:DNA甲基化位置不同的50%甲基化DNA(隨機、5'端附 近、3'端附近、中央)的色譜圖。
[0059] 圖2是DNA甲基化率與色譜保留時間的相關性。
[0060] 圖3是CIMP陽性和陰性試樣的色譜。A、B: CIMP陽性試樣，C、D: CIMP陰性試樣。
[0061 ]圖4是CIMP陽性和陰性試樣的色譜保留時間。
[0062] 圖5-1是MassARRAY法和本發明所得到的DNA甲基化率的比較。
[0063] 圖5-2是MassARRAY法和本發明所得到的DNA甲基化率的比較。
【具體實施方式】
[0064] 本說明書中，"腎細胞癌"是指腎臟的腎小管上皮細胞被癌化的癌，是根據其病理 學的特征被分類為透明細胞型、顆粒細胞型、嫌色細胞型、紡鍵型、囊腫相關型、囊腫派生 型、囊腫性型、乳頭狀型的癌。另外，本說明書中，作為"受檢者"，例如，可舉出患有腎細胞癌 的患者或者疑似患病的患者、通過外科手術等實施了腎細胞癌的治療的患者。
[0065] 本說明書中，癌的"預后不良"是指例如可舉出受檢者的預后（治療后）的生存率 低，更具體而言，可舉出術后經過500天后的無復發生存率(無癌生存率)為50% W下，或者， 可舉出術后經過1500天后的總生存率(全體的生存率)為70% W下。
[0066] 本說明書中，"DNA甲基化"是指在DNA中，胞喀晚的5位的碳被甲基化的狀態。另外， 本說明書中，DNA的"甲基化的檢測"是指測定該DNA中有無存在甲基化DNA或存在量、存在量 之比、或者該DNA的甲基化率。本說明書中，"DNA甲基化率"是指在作為檢測對象的特定DNA 中CpG島的胞喀晚被甲基化的比例，例如W作為檢測對象的特定DNA的CpG島中的、甲基化胞 喀晚數相對于胞喀晚總數（甲基化胞喀晚和未甲基化胞喀晚）的比率表示。
[0067] 本說明書中，"CpG位點"是指，在DNA中胞喀晚(C)與鳥嚷嶺(G)之間進行憐酸二醋 鍵合(P)的部位。另外，本說明書中，CpG島是指介由憐酸二醋鍵(p)的胞喀晚(C)-鳥嚷嶺(G) 的二堿基序列高頻出現的區域。CpG島大多存在于基因上游的啟動子區域。本說明書中， "(某一)基因的CpG位點或CpG島"是指存在于接近該基因的編碼區域的位置的CpG島、或者 該CpG島所含的CpG位點，優選是指存在于該基因的啟動子區域的CpG位點或者CpG島。特定 的基因的CpG位點或者CpG島可W基于MassARRAY法、焦憐酸測序等方法進行確定。
[006引本說明書中，"成為基準的保留時間"（W下，也稱為基準保留時間）表示，能夠區分 CIMP陽性組和CIMP陰性組的HPLC保留時間，或者表示針對來自由腎細胞癌制備的基因組 DNA的檢測信號而言能夠區分來自高度甲基化的DNA的信號組和來自甲基化程度低的DNA的 信號組的HPLC保留時間。即，由于在比成為基準的保留時間（基準保留時間）早的保留時間 能夠檢測出來自高度甲基化的DNA的信號，所W在比基準保留時間早的保留時間具有檢測 信號的樣本能夠判定為預后不良。上述基準保留時間根據HPLC的分析條件、基因組DNA的區 域、或者基因標志物的種類等而色譜發生變化，因此，根據運些條件等設定適當的基準保留 時間即可。另外，優選還考慮必要的臨床靈敏度來設定基準保留時間。
[0069] 在一個實施方式中，本發明提供一種包括W下工序的含有腎細胞癌的組織的判定 方法。
[0070] (1)將由受檢者的腎臟組織制備的基因組DNA用亞硫酸氨鹽進行處理的工序；
[0071] (2)將該用亞硫酸氨鹽處理了的DNA通過PCR進行擴增的工序；
[0072] (3)將得到的PCR擴增產物供給離子交換色譜的工序；
[0073] (4)獲得在該色譜中得到的檢測信號的保留時間的工序；
[0074] (5)在工序(4)的結果早于成為基準的保留時間的情況下，判定該組織為從預后不 良的腎細胞癌患者得到的含有腎細胞癌的組織的工序。
[0075] 在另一實施方式中，本發明提供一種包含W下工序的獲得用于判定含有腎細胞癌 的組織的數據的方法。
[0076] (1)將由受檢者的腎臟組織制備的基因組DNA用亞硫酸氨鹽進行處理的工序；
[0077] (2)將該用亞硫酸氨鹽處理了的DNA通過PCR進行擴增的工序；
[007引（3)將得到的PCR擴增產物供給離子交換色譜的工序；
[0079] (4)獲得在該色譜中得到的檢測信號的保留時間的工序；
[0080] (5)取得W下數據的工序，即，將工序(4)的結果是否早于成為基準的保留時間作 為用于判定該組織是否為從預后不良的腎細胞癌患者得到的含有腎細胞癌的組織的數據。
[0081] 在另一實施方式中，本發明提供包含W下工序的腎細胞癌患者的預后判定方法。
[0082] (1)將由受檢者的腎臟組織制備的基因組DNA用亞硫酸氨鹽進行處理的工序；
[0083] (2)將該用亞硫酸氨鹽處理了的DNA通過PCR進行擴增的工序；
[0084] (3)將得到的PCR擴增產物供給離子交換色譜的工序；
[0085] (4)獲得在該色譜中得到的檢測信號的保留時間的工序；
[0086] (5)在工序(4)的結果早于成為基準的保留時間的情況下，將受檢者的腎細胞癌判 定為預后不良的工序。
[0087] 在另一實施方式中，本發明提供在上述工序(4)前進一步進行W下工序的含有腎 細胞癌的組織或者腎細胞癌患者的判定方法。
[00則 （r)將與由上述受檢者的腎臟組織制備的基因組DNA的PCR擴增區域相當的未甲 基化的DM用亞硫酸氨鹽進行處理的工序；
[0089] (2'）將在工序（1'）中得到的用亞硫酸氨鹽處理了的DNA通過PCR進行擴增的工序；
[0090] (3'）將工序(2'）中得到的PCR擴增產物供給離子交換色譜的工序；
[0091] (3a)用工序(3)的色譜所得到的檢測信號減去工序(3'）的色譜所得到的檢測信號 而得到差值數據的工序。
[0092] 作為受檢者的腎臟組織，只要是含有DNA的腎臟組織或者其細胞即可，例如，可舉 出在活檢、外科手術等中采集的組織、及其冷凍物或固定化標本。從抑制基因組DNA的分解 等、更高效地進行DNA甲基化檢測的觀點考慮，優選使用冷凍的腎臟組織。
[0093] 作為從上述腎臟組織或細胞制備樣品DNA的方法，沒有特別限制，可適當地選擇使 用公知的方法。作為制備DNA的公知方法，可舉出酪氯仿法或者使用市售的DNA提取試劑盒、 例如后述的QIAamp DNA Mini kit(Qiagen公司制）、Clean Columns(NexTec公司制）、 Aqua化re(Bi〇-Rad公司制）、ZR Plant/Seed DNA Kit(Zymo Research公司制）、prepGEM (ZyGEM公司制）、Buccal如ick(T;rimGen公司制）的DNA提取方法等。
[0094] 接著，用亞硫酸氨鹽對提取的樣品DNA進行處理。作為DNA的亞硫酸氨鹽處理的方 法，沒有特別限制，可適當選擇使用公知的方法。作為用于亞硫酸氨鹽處理的公知方法，例 如，可舉出使用后述的化 iTect Bisulfite Kit(48) (Qiagen 公司制）、Methy 化 asy(Human Genetic Signatures Pty公司制）、Cells-t〇-CpG Bisulfite Conversion Kit(Applied Biosystems公司制）、CpGenome Turbo Bisulfite Modification Kit(MERCK MILLIPORE公 司制)等市售試劑盒的方法。
[0095] 接著，將用亞硫酸氨鹽處理了的樣品DNA通過PCR進行擴增。作為PCR擴增的方法， 沒有特別限制，可根據擴增對象的DNA的序列、長度、量等適當選擇使用公知的方法。
[0096] 關于腎細胞癌，已報到了 17種基因（FAM150A、GRM6、ZNF540、ZFP42、ZNF154、RIMS4、 PC畑AC1、KHDRBS2、AS化2、KCNQ1、PRAC、WNT3A、T畑、FAM78A、ZNF671、化C13A5 U 及NKX6-2)中 的DNA甲基化與腎細胞癌的預后不良（CIMP陽性)相關（專利文獻4)。因此，在本發明的方法 中，被PCR擴增的祀DNA優選W能夠檢測選自上述17種基因中的至少一個基因的CpG島的DNA 甲基化而進行選擇，更優選W能夠檢測上述17種基因的CpG位點的甲基化來進行選擇。例 如，祀DNA是編碼上述17種基因中任一種基因的編碼區域和/或啟動子區域的一部分或全部 的DNA。優選是編碼上述17種基因中任一種基因的啟動子區域的一部分或全部的DNA。更優 選是編碼上述17種基因中任一種基因的CpG島的一部分或者全部的DNA。
[0097] FAM150A是對由RefSeq ID:NP_997296標識的蛋白質進行編碼的基因，GRM6是對 由Ref Seq ID:NP_000834標識的蛋白質進行編碼的基因，ZNF540是對由Ref Seq ID:NP_ 689819標識的蛋白質進行編碼的基因，ZFP42是對由RefSeq ID:NP_777560標識的蛋白質 進行編碼的基因，ZNF154是對由RefSeq ID:NP_001078853標識的蛋白質進行編碼的基因， RIMS4是對由RefSeq ID:NP_892015標識的蛋白質進行編碼的基因，PCDHAC1是對由Ref Seq ID:NP_061721標識的蛋白質進行編碼的基因，K皿RBS2是對由RefSeq ID:NP_689901標識 的蛋白質進行編碼的基因，ASCL2是對由Ref Seq ID: NP_005161標識的蛋白質進行編碼的 基因，KCNQ1是對由RefSeq ID :NP_000209標識的蛋白質進行編碼的基因，PRAC是對由 RefSeq ID: NP_115767標識的蛋白質進行編碼的基因，WNT3A是對由Ref Seq ID: NP_ 149122標識的蛋白質進行編碼的基因，T畑是對由Ref Seq ID: NP_009048標識的蛋白質進 行編碼的基因，FAM78A是對由RefSeq ID:NP_203745標識的蛋白質進行編碼的基因， ZNF671是對由RefSeq ID:NP_079109標識的蛋白質進行編碼的基因，SLC13A5是對由 RefSeq ID:NP_808218標識的蛋白質進行編碼的基因，NKX6-2是對由RefSeq ID:NP_ 796374標識的蛋白質進行編碼的基因。
[0098] 上述17種基因的CpG位點，W基準人類基因組序列即NCBI數據庫Genome Build 37 上的位置為基準，位于表1~4中記載的染色體上的位置。
[0099] 表 1
[0100]
[0101]表 2
[0102]
[0103]表3
[0106]
[0107] 在專利文獻4中記載的CIMP判定中，作為DNA甲基化的檢測對象所優選的CpG位點， 是基準人類基因組序列即NCBI數據庫Genome Build 37上的位置為選自第8染色體53、478、 454位，第5染色體178、422、244位，第19染色體38、042、472位，第4染色體188、916、867位，第 19染色體58、220、662位，第20染色體43、438、865位，第5染色體140、306、458位，第6染色體 62、995、963位，第 11 染色體 2、292、004位，第 11 染色體 2、466、409位，第 17 染色體 46、799、640 位，第19染色體58、220、494位，第1染色體228、194、448位，第3染色體129、693、613位，第9染 色體134、152、531位，第19染色體58、238、928位，第17染色體6、617、030位^及第10染色體 134、599、860位中的至少1個的CpG位點。
[0108] PCR擴增產物的鏈長可W在考慮PCR的擴增時間的縮短W及離子交換色譜中的分 析時間的縮短、分離性能的維持等要素的基礎上進行適當選擇。例如，使用CpG島多的樣品 DNA時的PCR擴增產物的鏈長優選為lOOObpW下，更優選為70化pW下，進一步優選為500bp W下。另一方面，使用CpG島少的樣品DM時的PCR擴增產物的鏈長，下限為使用避免PCR中的 非特異性雜交的15mer附近的引物時的PCR擴增產物的鏈長即30~40bp。另一方面，優選W CpG島的含有率變得豐富的方式設計引物。例如，CpG位點的胞喀晚相對于PCR擴增產物的鏈 長，優選含有2 % W上，更優選含有5 % W上。
[0109] 接著，將得到的PCR擴增產物供給離子交換色譜。本發明中進行的離子交換色譜優 選為陰離子交換色譜。作為在本發明中進行的離子交換色譜所使用的色譜柱的填充劑，只 要是在表面具有強陽離子性基團的基材粒子，就沒有特別限定，但優選專利文獻2中示出的 在填充劑表面具有強陽離子性基團和弱陽離子性基團運兩種基團的基材粒子。
[0110] 本說明書中，上述強陽離子性基團是指在pH為1~14的寬范圍內解離的陽離子性 基團。即，上述強陽離子性基團不受水溶液的抑的影響而保持解離（陽離子化)狀態。
[0111] 作為上述強陽離子性基團，可舉出季錠基團。具體而言，例如，可舉出S甲基錠基、 =乙基錠基、二甲基乙基錠基等=烷基錠基等。另外，作為上述強陽離子性基團的反離子， 例如，可舉出氯化物離子、漠化物離子、艦化物離子等面化物離子。
[0112] 導入至上述基材粒子表面的上述強陽離子性基團量，沒有特別限定，相對于填充 劑的干燥重量的優選下限為化eq/g，優選上限為50化eq/g。上述強陽離子性基團量如果小 于化eq/g，則保持力弱且分離性能變差。上述強陽離子性基團量如果超過50化eq/g，會產生 保持力變得過強而不容易將PCR擴增產物洗脫，分析時間變得過長等問題。
[0113] 本說明書中，上述弱陽離子性基團是指pfoi為8W上的陽離子性基團。即，上述弱陽 離子性基團受到水溶液的抑的影響，解離狀態發生變化。即，如果抑變得比8高，則上述弱陽 離子性基團的質子解離，不具有正電荷的比例增加。相反，如果抑變得比8低，上則述弱陽離 子性基團質子化，具有正電荷的比例增加。
[0114] 作為上述弱陽離子性基團，例如，可舉出叔氨基、仲氨基、伯氨基等。其中，優選為 叔氨基。
[0115] 導入至上述基材粒子表面的上述弱陽離子性基團量，沒有特別限定，相對于填充 劑的干燥重量的優選下限優選為0.扣eq/g，優選上限為50化eq/g。上述弱陽離子性基團量 如果小于0.扣eq/g，則過少有時分離性能沒有提高。上述弱陽離子性基團量如果超過50化 eq/g，則與強陽離子性基團同樣產生保持力過強，不容易將PCR擴增產物洗脫，分析時間變 得過長等問題。
[0116] 上述基材粒子表面的強陽離子性基團或弱陽離子性基團量，通過將氨基所含的氮 原子定量進行測定。作為對氮進行定量的方法，例如可舉出凱氏定氮法。在本發明（實施例） 記載的填充劑的情況下，首先，將聚合后強陽離子性基團所含的氮定量，接著，通過將導入 弱陽離子性基團后的強陽離子性基團和弱陽離子性基團中含有的氮定量，能夠算出之后導 入的弱陽離子性基團量。通過運樣進行定量，制備填充劑時，能夠將強陽離子性基團量和弱 陽離子性基團量調整在上述范圍內。
[0117] 作為上述基材粒子，例如，可使用利用聚合性單體等得到的合成高分子微粒、二氧 化娃系等無機微粒等，但優選由合成有機高分子構成的疏水性交聯聚合物粒子。
[0118] 上述疏水性交聯聚合物，可W是將至少巧巾疏水性交聯單體與至少巧巾具有反應性 官能團的單體共聚而得的疏水性交聯聚合物、將至少1種疏水性交聯單體和至少1種具有反 應性官能團的單體W及至少1種疏水性交聯單體共聚而得的疏水性交聯聚合物中的任一 個。
[0119] 作為上述疏水性交聯性單體，只要是在1分子單體中具有2個W上乙締基的單體， 就沒有特別限定，例如，可舉出乙二醇二（甲基）丙締酸醋、聚乙二醇二（甲基）丙締酸醋、丙 二醇二（甲基）丙締酸醋、聚丙二醇二（甲基）丙締酸醋等二（甲基）丙締酸醋、S徑甲基甲燒 立（甲基)丙締酸醋、四徑甲基甲燒立（甲基)丙締酸醋等立（甲基)丙締酸醋或四（甲基)丙締 酸醋、或者二乙締基苯、二乙締基甲苯、二乙締基二甲苯、二乙締基糞等芳香族系化合物。應 予說明，本說明書中，上述（甲基)丙締酸醋是指丙締酸醋或甲基丙締酸醋，（甲基)丙締酷基 是指丙締酷基或甲基丙締酷基。
[0120] 作為上述具有反應性官能團的單體，可舉出縮水甘油基（甲基）丙締酸醋、異氯酸 醋乙基（甲基)丙締酸醋等。
[0121] 作為上述疏水性非交聯性單體，只要是具有疏水性的性質的非交聯性的聚合性有 機單體，就沒有特別限定，例如，可舉出（甲基)丙締酸甲醋、（甲基)丙締酸乙醋、（甲基)丙締 酸下醋、（甲基)丙締酸叔下醋等（甲基)丙締酸醋、苯乙締、甲基苯乙締等苯乙締系單體。
[0122] 當上述疏水性交聯聚合物是將上述疏水性交聯性單體和上述具有反應性官能團 的單體共聚而得到的聚合物的情況下，上述疏水性交聯聚合物中的來自于上述疏水性交聯 性單體的片段的含有比例的優選下限為10重量％，更優選下限為20重量％。
[0123] 本發明的離子交換色譜用填充劑優選是在上述基材粒子的表面具有聚合物層的 填充劑，該聚合物層具有上述強陽離子性基團和上述弱陽離子性基團。另外，在具有上述強 陽離子性基團和上述弱陽離子性基團的聚合物中，上述強陽離子性基團和上述弱陽離子性 基團優選分別來自于獨立的單體。具體而言，本發明的離子交換色譜用填充劑，優選是在由 上述疏水性交聯聚合物粒子和共聚于上述疏水性交聯聚合物粒子表面的具有強陽離子性 基團的親水性聚合物的層構成的被覆聚合物粒子的表面導入弱陽離子性基團而成的填充 劑。
[0124] 上述具有強陽離子性基團的親水性聚合物是由具有強陽離子性基團的親水性單 體構成的聚合物，含有來自于1種W上具有強陽離子性基團的親水性單體的片段即可。即， 作為制造上述具有強陽離子性基團的親水性聚合物的方法，可舉出將具有強陽離子性基團 的親水性單體均聚的方法、使巧巾W上的具有強陽離子性基團的親水性單體共聚的方法、使 具有強陽離子性基團的親水性單體和不具有強陽離子性基團的親水性單體共聚的方法等。
[0125] 作為上述具有強陽離子性基團的親水性單體，優選為具有季錠基團的單體。具體 而言，例如，可舉出甲基丙締酷氧乙基=乙基氯化錠、甲基丙締酷氧乙基二甲基乙基氯化 錠、甲基丙締酷氧乙基二甲基芐基氯化錠、丙締酷氧乙基二甲基芐基氯化錠、丙締酷氧乙基 =乙基氯化錠、丙締酷氧乙基二甲基乙基氯化錠、丙締酷胺乙基=甲基氯化錠、丙締酷胺乙 基=乙基氯化錠、丙締酷胺乙基二甲基乙基氯化錠等。
[0126] 作為在上述被覆聚合物粒子的表面導入上述弱陽離子性基團的方法，可使用公知 的方法。具體而言，例如作為將叔氨基作為上述弱陽離子性基團進行導入的方法，可舉出如 下方法，即，將上述具有強陽離子性基團的親水性單體在由含有來自于具有縮水甘油基的 單體的片段的疏水性交聯聚合物構成的疏水性交聯聚合物粒子的表面進行共聚，接著，使 具有叔氨基的試劑與縮水甘油基反應的方法;將上述具有強陽離子性基團的親水性單體在 由具備來自于具有異氯酸醋基的單體的片段的疏水性交聯聚合物構成的疏水性交聯聚合 物粒子的表面進行共聚，接著，使具有叔氨基的試劑與異氯酸醋基反應的方法;使上述具有 強陽離子性基團的親水性單體和具有叔氨基的單體在上述疏水性交聯聚合物粒子的表面 共聚的方法;使用具有叔氨基的硅烷偶聯劑，在具備上述具有強陽離子性基團的親水性聚 合物的層的被覆聚合物粒子的表面導入叔氨基的方法;將上述具有強陽離子性基團的親水 性單體在由具備來自于具有簇基的單體的片段的疏水性交聯聚合物構成的疏水性交聯聚 合物粒子的表面進行共聚，接著，使用碳二亞胺使簇基和具有叔氨基的試劑縮合的方法;將 上述具有強陽離子性基團的親水性單體在由含有來自于具有醋鍵的單體的片段的疏水性 交聯聚合物構成的疏水性交聯聚合物粒子的表面進行共聚，將醋鍵部分水解后，接著，使用 碳二亞胺使通過水解生成的簇基和具有叔氨基的試劑縮合的方法等。其中，優選如下方法， 即，將上述具有強陽離子性基團的親水性單體在由含有來自于具有縮水甘油基的單體的片 段的疏水性交聯聚合物構成的疏水性交聯聚合物粒子的表面進行共聚，接著，使具有叔氨 基的試劑與縮水甘油基反應的方法;將上述具有強陽離子性基團的親水性單體在由含有來 自于具有異氯酸醋基的單體的片段的疏水性交聯聚合物構成的疏水性交聯聚合物粒子的 表面進行共聚，接著，使具有叔氨基的試劑與異氯酸醋基反應的方法。
[0127] 作為與縮水甘油基或異氯酸醋基等反應性官能團反應的上述具有叔氨基的試劑， 只要是具有叔氨基和能夠與反應性官能團反應的官能團的試劑，就沒有特別限定。作為上 述叔氨基和能夠與反應性官能團反應的官能團，例如，可舉出伯氨基、徑基等。其中，優選在 末端具有伯氨基的基團。作為具有該官能團的具體試劑，可舉出N，N-二甲基氨基甲胺、N，N- 二甲基氨基乙胺、N，N-二甲基氨基丙胺、N，N-二甲基氨基下胺、N，N-二乙基氨基乙胺、N，N- 二乙基氨基丙基乙胺、N，N-二乙基氨基下胺、N，N-二乙基氨基戊胺、N，N-二乙基氨基己胺、 N,N-二丙基氨基下胺、N,N-二下基氨基丙胺等。
[0128] 上述強陽離子性基團優選為季錠鹽與上述弱陽離子性基團優選為叔氨基的相對 位置關系，優選為上述強陽離子性基團位于與上述弱陽離子性基團相比距離基材粒子的表 面遠的位置，即位于外側。例如，優選上述弱陽離子性基團位于距離基材粒子表面3CL4W 內，上述強陽離子性基團位于距離基材粒子表面30化4 W內且與弱陽離子性基團相比位于 外側。
[0129] 本發明的離子交換色譜用填充劑所使用的上述基材粒子的平均粒徑沒有特別限 定，優選下限為O.lwn，優選上限為20WI1。如果上述平均粒徑小于O.Uim，則色譜柱內變為過 度高壓，有時引起分離不良。如果上述平均粒徑超過20WI1，則色譜柱內的無效體積變得過 大，有時引起分離不良。應予說明，本說明書中，上述平均粒徑表示體積平均粒徑，可使用粒 度分布測定裝置(Ac州Sizer780/化；rticle Sizing Systems公司制等)進行測定。
[0130] 作為本發明中進行的離子交換色譜所使用的洗脫液的組成，可使用公知的條件。
[0131] 作為上述洗脫液所使用的緩沖液，優選使用公知的含有鹽化合物的緩沖液類、有 機溶劑類，具體而言，例如，可舉出Tris鹽酸緩沖液，由Tris和抓TA構成的TE緩沖液，由 Tris、棚酸W及邸TA構成的TBA緩沖液等。
[0132] 上述洗脫液的抑沒有特別限定，但優選下限為5,優選上限為10。認為通過設定在 該范圍，上述弱陽離子性基團作為離子交換基團（陰離子交換基團）也能夠有效地發揮作 用。上述洗脫液的抑的更優選下限為6，更優選上限為9。
[0133] 作為上述洗脫液所含有的鹽，例如，可使用氯化鋼、氯化鐘、漠化鋼、漠化鐘等由面 化物和堿金屬構成的鹽;氯化巧、漠化巧、氯化儀、漠化儀等由面化物和堿±類金屬構成的 鹽;高氯酸鋼、高氯酸鐘、硫酸鋼、硫酸鐘、硫酸錠、硝酸鋼、硝酸鐘等無機酸鹽等。另外，還可 使用乙酸鋼、乙酸鐘、班巧酸鋼、班巧酸鐘等有機酸鹽。上述鹽可W任一個可單獨使用或組 合使用。
[0134] 作為上述洗脫液的鹽濃度，根據分析條件適當地調整即可，優選下限為lOmmol/L， 優選上限為2000mmol/L，更優選下限為lOOmmol/L，更優選上限為1500mmol/L。
[0135] 進而，為了進一步提高分離性能，在本發明的離子交換色譜所使用的洗脫液中可 含有反離液離子。反離液離子具有與離液離子相反的性質，具有使水合結構穩定化的作用。 因此，具有增強填充劑與核酸分子之間的疏水性相互作用的效果。本發明的離子交換色譜 的主要相互作用是靜電相互作用，除此之外，通過也利用疏水性相互作用的作用，分離性能 提局。
[0136] 作為上述洗脫液所含有的反離液離子，可舉出憐酸根離子(P0431、硫酸根離子 (S0421、錠根離子(畑4+)、鐘離子化+)、鋼離子(化+)等。在運些離子的組合中，可優選使用硫 酸根離子和錠根離子。上述反離液離子，可W任一種單獨使用或組合使用。應予說明，上述 反離液離子的一部分含有上述洗脫液所含的鹽、緩沖液的成分。使用運樣的成分時，由于具 備作為洗脫液所含的鹽的性質或緩沖性能、和作為反離液離子的性質運兩者，因此，適于本 發明。
[0137] 本發明的離子交換色譜用洗脫液中的反離液離子的分析時的濃度，根據分析對象 物進行適當地調整即可，但優選W反離液鹽計為2000mmol/LW下。具體而言，可舉出使反離 液鹽的濃度在0~2000mmo 1/L的范圍進行梯度洗脫的方法。因此，分析開始時的反離液鹽的 濃度無需為Ommol/L，并且，分析結束時的反離液鹽的濃度也無需為2000mmol/L。上述梯度 洗脫的方法可W為低壓梯度法，也可W為高壓梯度法，但優選一邊進行利用高壓梯度法的 精密濃度調整，一邊洗脫的方法。
[0138] 上述反離液離子可W僅添加到用于洗脫的洗脫液中的1種中，也可W添加到多種 洗脫液中。另外，上述反離液離子也可W具備如下兩個作用：增強填充劑與PCR擴增產物之 間的疏水性相互作用的效果或緩沖性能，W及使PCR擴增產物從色譜柱中洗脫的效果。
[0139] 本發明中進行的離子交換色譜中，分析PCR擴增產物時的柱溫優選為3(TCW上，更 優選為40°CW上，進一步優選為45°CW上。離子交換色譜的柱溫如果小于30°C，則填充劑與 PCR擴增產物之間的疏水性相互作用減弱，很難得到所希望的分離效果。離子交換色譜的柱 溫小于45°C的情況下，甲基化DNA的亞硫酸氨鹽處理物的PCR擴增產物（甲基化DNA樣品）與 未甲基化DNA的亞硫酸氨鹽處理物的PCR擴增產物(未甲基化DNA樣品）的保留時間之差小。 進而，柱溫如果為60°CW上，則甲基化DNA樣品與未甲基化DNA樣品之間的保留時間之差進 一步擴大，并且各個峰也變得更清晰，所W，能夠更加精度良好地進行DNA的甲基化的檢測。
[0140] 進而，離子交換色譜的柱溫如果增高，則甲基化DNA樣品與未甲基化DNA樣品明顯 被分離，所W，根據樣品DNA中的甲基化DNA與未甲基化DNA的存在比率，兩者的保留時間的 峰面積或峰高度容易產生差異。因此，如果提高柱溫，則基于甲基化DNA樣品與未甲基化DNA 樣品之間的保留時間的峰的面積或高度來測定樣品DNA中的甲基化DNA和未甲基化DNA各自 的存在量或存在比率變得更加容易。
[0141] 另一方面，離子交換色譜的柱溫如果為90°CW上，則由于PCR擴增產物中的核酸分 子的雙鏈解離，因此，在分析上不優選。進而，柱溫如果為i〇〇°cw上，則有時可能發生洗脫 液沸騰，因此，在分析上不優選。因此，用在本發明中進行的離子交換色譜來分析PCR擴增產 物時的柱溫為30°C W上且小于90°C即可，優選為40°C W上且小于90°C，更優選為45°C W上 且小于90°C，進一步優選為55°C W上且小于90°C，更進一步優選為55°C~85°C，進而優選為 60°C~85°C。
[0142] 對上述離子交換色譜色譜柱的試樣注入量沒有特別限定，根據色譜柱的離子交換 容量和試樣濃度適當地調整即可。流速優選為0.1血/min~3. OmL/min，更優選為0.5mL/min ~1.5mL/min。如果流速變慢，則可期待分離的提高，但如果變得過慢，則分析需要長時間， 或者可能導致因峰的展寬化引起的分離性能的降低。相反，如果流速變快，則在分析時間的 縮短方面有優勢，但由于峰被壓縮而導致分離性能降低。由此，雖然是根據色譜柱的性能適 當地調整的參數，但優選設定在上述流速的范圍內。各樣品的保留時間可通過對各樣品進 行預備實驗而預先確定。送液方法可使用線性梯度洗脫法、階梯式洗脫法等公知的送液方 法，但作為本發明中的送液方法，優選為線性梯度洗脫法。對于梯度(gradient)的大小，可 W將洗脫所使用的洗脫液在0%~100%的范圍內根據色譜柱的分離性能和分析對象物(此 處為PCR擴增產物）的特性進行適當調整即可。
[0143] 本發明中，通過將W上述順序亞硫酸氨鹽處理了的DNA的PCR擴增產物供給離子交 換色譜，從而能夠對樣品DNA中的DNA的甲基化進行檢測。
[0144] 對DNA進行亞硫酸氨鹽處理的情況下，該DNA中的未甲基化胞喀晚變換為尿喀晚， 但甲基化胞喀晚仍是胞喀晚。如果對進行了亞硫酸氨鹽處理的DNA進行PCR擴增，則來自于 未甲基化胞喀晚的尿喀晚進一步被置換為胸腺喀晚，因此，在甲基化DNA與未甲基化DNA之 間，胞喀晚與胸腺喀晚的存在比率產生差異。因此，PCR擴增產物中的DNA具有與甲基化率對 應的不同的序列。如果將上述PCR擴增產物供給離子交換色譜，則可根據該擴增產物中含有 的DNA的堿基序列，得到顯示不同信號的色譜。
[0145] 例如，通過將來自樣品DNA的亞硫酸氨鹽處理物的PCR擴增產物的檢測信號與來自 與樣品DNA堿基序列相同但沒有甲基化的DNA的亞硫酸氨鹽處理物的PCR擴增產物m下，稱 為陰性對照）的檢測信號、或來自與樣品DNA的堿基序列相同且甲基化率已知(例如，100%) 的DNA的亞硫酸氨鹽處理物的PCR擴增產物下，稱為陽性對照）的檢測信號進行比較，可 W測定樣品DNA中的甲基化DNA有無存在。
[0146] 或者，通過將來自樣品DNA的亞硫酸氨鹽處理物的PCR擴增產物的檢測信號與來自 陰性和陽性對照的檢測信號進行比較，可W測定樣品DNA中的甲基化DNA的存在量和未甲基 化DNA的存在量之比。再或者，通過將來自與樣品DNA堿基序列相同且甲基化率已知的多個 DNA的亞硫酸氨鹽處理物所產生的多個PCR擴增產物下，稱為標準品）的檢測信號與來自 樣品DNA的亞硫酸氨鹽處理物的PCR擴增產物的檢測信號進行比較，可W測定樣品DNA中的 甲基化DNA的甲基化率、存在量、W及與未甲基化DNA的存在量之比。
[0147] 在本發明的方法中，代替上述陰性對照、陽性對照或標準品，也可W使用由與上述 陰性對照、陽性對照或標準品相同的堿基序列構成的、化學或基因工程合成的DNA。進一步， 在本發明的方法中，在陰性對照、陽性對照或標準品的制備中也可W使用市售品，例如可W 使用化iTect Control DNA and Control DNA Set(Qiagen公司制）。
[0148] 在優選的方式中，在本發明中進行的離子交換色譜中，將含有上述樣品DNA的亞硫 酸氨鹽處理物的PCR擴增產物的試樣和上述陰性對照或陽性對照、或上述標準品的試樣分 別獨立地供于離子交換色譜分析。通過使用多個洗脫液對吸附于色譜柱的試樣進行梯度洗 脫，從而可根據DNA甲基化率W不同保留時間將樣品DNA的亞硫酸氨鹽處理物的PCR擴增產 物和陰性對照或陽性對照或者標準品進行洗脫。
[0149] 來自于陰性對照的檢測信號可W通過代替樣品DNA而使用與樣品DNA堿基序列相 同但沒有甲基化的DNA，按照上述順序進行亞硫酸氨鹽處理和PCR，將得到的PCR擴增產物供 給離子交換色譜而獲得。來自于陽性對照的檢測信號可W通過代替樣品DNA而使用與樣品 DNA堿基序列相同且甲基化率已知（例如，100 % )的DNA按照上述順序進行亞硫酸氨鹽處理 和PCR，將得到的PCR擴增產物供給離子交換色譜而獲得。或者，也可W通過將上述合成DNA、 市售的DNA作為陰性或陽性對照供給離子交換色譜，從而得到來自于陰性或陽性對照的檢 測信號。
[0150] 來自于標準品的檢測信號可W通過代替樣品DNA而使用與樣品DNA堿基序列相同 且甲基化率已知的多個DNA，按照上述順序進行亞硫酸氨鹽處理和PCR，將得到的多個PCR擴 增產物分別供給離子交換色譜而獲得。進而，可W根據得到的各個檢測信號，制作標準曲 線。或者，通過將上述合成DNA、市售的DNA作為標準品供給離子交換色譜，也可W得到來自 于標準品的檢測信號。
[0151] 接著，將在上述色譜中得到的來自于樣品DNA的亞硫酸氨鹽處理物的PCR擴增產物 的檢測信號與來自于陰性或陽性對照、或標準品的檢測信號進行比較。基于兩者的檢測信 號的差異，可W檢測樣品DNA的甲基化。
[0152] 例如，由樣品DNA的亞硫酸氨鹽處理物的PCR擴增產物得到的檢測信號的峰的保留 時間如果偏離陰性對照的峰的保留時間，則可W判定樣品DNA甲基化。進而此時，如果保留 時間的偏離越大，可W推知甲基化率越大。相反，由樣品DNA的亞硫酸氨鹽處理物的PCR擴增 產物得到的檢測信號的峰的保留時間如果越偏離100%甲基化陽性對照的峰的保留時間， 則可W推知樣品DNA的甲基化率越小。或者，基于由甲基化率已知的標準品得到的多個峰的 保留時間制作標準曲線，基于該標準曲線可W確定樣品DNA的甲基化率(參照圖1和2)。
[0153] 根據上述標準曲線，能夠使DNA甲基化率與保留時間相關聯。因此，基于該標準曲 線，可W求得與基準保留時間對應的DNA甲基化率（W下，也稱為基準DNA甲基化率）。如果事 先取得基準DNA甲基化率，則即使在變更HPLC的器材、分析條件的情況下，通過在該變更的 器材、條件下，對新制成的標準曲線擬合該基準DNA甲基化率，也能夠容易地算出新的基準 保留時間。
[0154] 此外例如，通過將由樣品DNA的亞硫酸氨鹽處理物的PCR擴增產物得到的檢測信號 的峰的高度或峰面積，與由甲基化DNA的甲基化率和混合比已知的DNA的亞硫酸氨鹽處理物 的PCR擴增產物得到的檢測信號的峰的高度或峰面積進行比較，可W確定樣品DNA中的甲基 化DNA的存在比率（例如未甲基化DNA的存在比率、W特定的比例甲基化的DNA的存在比率 等)。
[0155] 本發明的方法中，作為判定色譜的檢測信號的峰的有無的方法，可舉出使用已有 的數據處理軟件例如LCsolution(島津制作所）^RAMS/AKlliermo Fisher Scientific公 司）、Igor P;ro(WaveMe化ics公司）等的峰檢測。例示使用了LCsolution的峰的有無的判定 方法時，具體而言，首先指定要檢測出峰的保留時間的區間。接下來，為了除去噪音等不必 要的峰，設定各種參數。例如，可舉出將參數"WIDTH"設置為大于不要的峰的半峰寬，將參數 "化OPE"設置為大于不要的峰的上升斜率，通過改變參數"DRIFT"的設定來選擇垂直分割或 基線分割分離度低的峰等。對于參數值而言，由于分析條件、選擇的基因標志物的種類、樣 本的量等而得到不同色譜圖，因此，根據色譜圖設定適當的值即可。
[0156] 保留時間即峰頂的時間可W用上述的數據處理軟件自動算出。例如，可W將色譜 圖進行一次微分，并將微分系數從正數變化為負數的時間作為峰頂的時間而取得。
[0157] 在本發明的方法中，對利用色譜得到的檢測信號的保留時間進行調查。其結果，在 早于基準保留時間的保留時間得到檢測信號的情況下，可判定該試樣為從預后不良的腎細 胞癌患者得到的試樣。如圖3A、B所示，在高甲基化率DNA的峰和低甲基化率DNA的峰分離良 好且二峰化的情況下，通過峰的分離而能夠除去未甲基化DNA的影響，可精度良好地判定為 由預后不良的腎細胞癌患者得到的試樣。
[015引進而，本發明的方法中，從由樣品DNA的亞硫酸氨鹽處理物的PCR擴增產物得到的 檢測信號減去由陰性對照得到的檢測信號，可W求出差值數據。通過求得差值數據，可W從 作為樣品DNA整體的檢測信號中除去來自未甲基化DNA的信號（噪音），僅提取來自甲基化 DNA的信號。該差值數據相當于樣品DNA中的甲基化DNA所致的檢測信號。將該差值數據的保 留時間與基準保留時間進行比較。其結果，在早于基準保留時間的情況下，可判定該試樣為 從預后不良的腎細胞癌患者得到的試樣。通過使用該差值數據，即使在僅微弱檢測出來自 甲基化DNA的信號成分的樣品中，例如甲基化DNA的存在比率低的樣品DNA、或者含有甲基化 率低的甲基化DNA的樣品DNA中，也能夠進行甲基化DNA的檢巧U、解析。另外，在樣品DNA中含 有各種甲基化率的DNA的情況下，能夠得到有肩峰的、多個峰重疊等各種圖案的色譜圖。在 運種情況下，通過求出差值數據僅提取高甲基化率的樣品DNA的信號，因此，可高精度地進 行癌預后判定。
[0159] 因此，通過使用上述差值數據，關于樣品DNA中的甲基化DNA，能夠更高精度的解 析。應予說明，求出差值數據時，優選樣品DNA與陰性對照中使用的DNA的DNA量事先匹配。 DNA量的確認通過吸光度測定等的測定方法進行確認即可。
[0160] 利用上述差值數據時的本發明的癌預后判定方法的順序，基本上與上述差值前的 數據的情況相同。例如，對利用色譜得到的檢測信號的保留時間進行調查，其結果，在早于 成為基準的保留時間的保留時間得到檢測信號的情況下，可判定該試樣為從預后不良的腎 細胞癌患者得到的試樣。
[0161] 在本發明的預后判定方法中，上述差值數據的利用非常有效。為了臨床檢查而采 取的樣本存在W下的情況，即，含有沒有進行DNA甲基化的非癌上皮細胞、間質細胞等正常 細胞的情況;或者含有大量DNA甲基化沒有特別進行的前癌狀態的細胞的情況;或者W各種 比例存在各種DNA甲基化率的癌細胞的情況。通過使用上述差值數據，能夠除去樣本中的正 常細胞或前癌細胞中的正常DNA、或者來自作為測定對象的基因區域沒有甲基化的癌細胞 的未甲基化DNA的影響，所W能夠進行更高精度的甲基化DNA的檢測，進而利用該檢測結果 時，能夠進行更高精度的癌預后判定。
[0162] 根據本發明的預后判定方法，能夠對試樣中的甲基化DNA和未甲基化DNA進行分離 檢測，因此，即使試樣含有大量正常細胞的情況下，也可高精度地檢測甲基化DNA的存在及 其甲基化率，并進行準確的預后判定。在本發明的方法中，對于W往的檢查中盡管預后不良 但沒有判定為CIMP陽性運樣的受檢者，也能夠進行正確的預后判定。
[0163] 實施例
[0164] W下，通過實施例對本發明作詳細說明，但本發明不受W下實施例的限制。
[01化]〔患者和組織樣品）
[0166] 109癌組織(T)樣品和對應的10巧自癌腎皮質組織(N)樣品是從由患有原發性的透 明細胞型腎細胞癌的110人的患者通過手術摘出的試樣得到的，N樣品中沒有看到顯著的組 織學變化。應予說明，運些患者是沒有接受術前治療的、在國立癌癥研究中屯、醫院接受腎摘 出術的患者。由79名男性和31名女性構成，平均年齡為62.8± 10.3歲（平均±標準偏差，36 ~85歲）。
[0167] 另外，樣品的組織學診斷是根據WHO的分類進行的（參照化le，J.N.等，"腎細胞癌 腫瘤WHO分類病理學W及遺傳學男性生殖器W及泌尿系統的腫瘤"，2004年，IARC出版， Lyon, 10~43頁，圖1)。
[016引進而，全部的腫瘤的組織學異型度根據"Fuhrman，S. A.等，Am. J. Surg.化tho 1.， 1982年，6卷，655~663頁"記載的基準進行評價，了醒分類根據"Sobin，L. H.等，國際抗癌聯 盟化ICC)，?M惡性腫瘤的分類，第6版，2002年，Wil巧-Liss，化W化rk，193~195頁"等進行 分類。
[0169] 另外，作為腎細胞癌的肉眼分類的基準，采用在肝細胞癌化CC)中確立的基準（參 照非專利文獻4~6)。應予說明，類型3(多結節愈合型化CC與類型1(單結節型）和類型2(單 結節周圍增殖型）的HC討目比，組織學的分化度低、肝內轉移的產生率高（參照Kanai，T.等， Cancer ,1987年，60 卷，810~819頁）。
[0170] 有無血管侵襲，通過用顯微鏡觀察實施了蘇木精-曙紅和Elastica van Gieson s化in染色的載玻片進行調查。腎靜脈的主干中的腫瘤血栓的有無通過肉眼觀察來調查。
[0171] 從作為運次研究對象的全部患者獲得書面的知情同意書。另外，本研究受到國立 癌癥研究中屯、的倫理委員會的承認而進行實施。
[0172] 〔參考例1)利用現有方法的CIMP陰性/陽性判定
[017引利用現有方法的CIMP陰性/陽性判定，根據專利文獻帥記載的MassARRAY法(實施 例5)進行。用甲基化DNA檢測方法之一的MaSSARRAY法，檢測17種基因（FAM150A、GRM6、 ZNF540、ZFP42、ZNF154、RIMS4、PCDHAC1、KHDRBS2、ASCL2、KCNQ1、PRAC、WNT3A、T畑、FAM78A、 ZNF671、化C13A5 W及NKX6-2)的CpG位點（表1~4)的DNA甲基化水平。
[0174] MassARRAY法是如下方法，即，將亞硫酸氨鹽處理后的DNA擴增，轉錄為RNA，進而利 用RNAase進行堿基特異性切割后，利用質量分析儀，檢測甲基化DNA片段與未甲基化DNA片 段的分子量之差。
[01巧]首先，對含有上述CpG位點的CpG島，使用6910日31旨〇日^5691]6肋1公司制， MassARRAY用引物設計軟件)進行MassARRAY的引物設計。
[0176] 另外，為了排除PCR中的偏差的影響，每1個引物組，平均進行3種DNA聚合酶和4個 階段左右退火溫度的條件的組合來試行，確定定量性良好的最佳PCR條件。接著，針對PCR祀 序列所包含的作為解析對象的全部CpG部位，確認在采用的PCR條件下定量性良好，在109的 腎細胞癌組織樣品中的腎細胞癌102樣本中，實施MassARRAY解析。
[0177] 首先，通過將從上述患者得到的新鮮冷凍組織樣品用苯酪-氯仿進行處理，接著實 施透析，從而提取高分子量DM(參照Sambrook，J.等，分子克隆：實驗手冊第3版，冷泉港實 驗室出版，NY，6.14~6.15頁）。而且，使用EZ DNA Methylation-Gold?試劑盒（Zymo Research公司制），將DNA50化g供于亞硫酸氨鹽處理。用PCR對亞硫酸氨鹽處理基因組DNA進 行擴增，從而進行體外轉錄反應。接著，將得到的RNA利用RNAase在尿喀晚的部位進行特異 性切割，生成與各樣品的基因組DNA的甲基化的有無對應的長度不同的片段。而且，將得到 的RNA片段供給能夠檢測一個堿基質量的差異的MALDI-T0F MAS(SEQUENOM公司制， MassARRAY Analyzer 4)，進行質量分析。使用解析軟件化piTYP邸，SEQ肥N0M公司制），將得 到的質量分析結果與參比序列進行比對，根據來自于甲基化DNA的RNA片段和來自于未甲基 化DNA的RNA片段的質量比，算出甲基化水平。將本解析所使用的引物的序列和使用該引物 組進行擴增的PCR產物的序列示于表5和6 W及序列表中。
[017引表5
[0181]
[0182] 關于作為MassARRAY的解析對象的全部區域，通過檢測上述CpG位點的DM甲基化 水平，來辨別預后不良的腎細胞癌(CIMP陽性組：14樣本)和預后良好的腎細胞癌(CIMP陰性 組:88樣本）。
[0183] 〔參考例2)陰離子交換色譜柱的制備
[0184] 向帶有攬拌機的反應器中的3重量％聚乙締醇（日本合成化學公司制）水溶液 2000mL中，添加四乙二醇二甲基丙締酸醋(新中村化學工業公司制）200g、S乙二醇二甲基 丙締酸醋(新中村化學工業公司制noog、甲基丙締酸縮水甘油醋（和光純藥工業公司制） lOOgW及過氧化苯甲酯化ISHIDA化學公司制n.Og的混合物。邊攬拌邊加熱，在氮氣氛下W 8(TC聚合1小時。接下來，作為具有強陽離子性基團的親水性單體，將甲基丙締酸乙基S甲 基氯化錠(和光純藥工業公司制noog溶解于離子交換水。將其添加至相同的反應器，按照 相同方式，邊攬拌邊在氮氣氛下W80°c聚合2小時。通過用水和丙酬將得到的聚合組合物清 洗，得到表面具有具備季錠基的親水性聚合物的層的被覆聚合物粒子。對于得到的被覆聚 合物粒子，使用粒度分布測定裝置(Ac州Sizer780/化；rticle Sizing Systems公司制）進行 測定，結果平均粒徑為10皿。
[0185] 使得到的被覆聚合物粒子lOg分散在離子交換水lOOmL中，準備反應前漿料。接著， 邊攬拌該漿料，邊添加 N，N-二甲基氨基丙基胺(和光純藥工業公司制）lOmL，在70°C反應4小 時。反應結束后，使用離屯、分離機（日立制作所公司制，巧imac CR20G")除去上清，用離子交 換水清洗。清洗后，使用離屯、分離機除去上清。進一步重復4次該利用離子交換水的清洗，得 到在基材粒子的表面具有季錠基和叔氨基的離子交換色譜用填充劑。
[0186] 將上述離子交換色譜用填充劑填充于液相色譜系統的不誘鋼制色譜柱(色譜柱尺 寸：內徑4.6mm X長度20mm)。
[0187] 〔參考例3)利用離子交換色譜的甲基化DNA的檢測
[0188] (1)基因組DNA的提取和亞硫酸氨鹽處理
[0189] 將從患者得到的新鮮冷凍組織樣品用苯酪-氯仿進行處理，接著實施透析，從而提 取高分子量DNA(參照Sambrook，J.等，分子克隆：實驗手冊第3版，冷泉港實驗室出版，NY， 6.14~6.15頁）。使用62 0麻16證71日11〇11-6〇1(1了《試劑盒（27111〇1?636日'地公司制），將 DNA50化g供于亞硫酸氨鹽處理。
[0190] (2)PCR
[0191] 對（1)中得到的亞硫酸氨鹽處理基因組DNA進行PCR擴增。PCR用含有模板DNA 10ng、GeneAmp 1XPCR buffeHLife Technologies公司制）、200皿ol/L GeneAmp dNTP MixiXife Technologies公司制）、0.75U Ampinaq Gold DNA聚合酶(Xife Technologies 公司制）、〇.25皿ol/L正義W及反義引物的25化的反應液進行。在PCR中，在95°C進行5分鐘 初始熱變性后，將94°C 30秒^59 °C (使用F3-R3引物時）30秒^72 °C40秒作為1個循環，持續 35個循環，進一步在72°C進行10分的延伸反應。PCR結束后，在預先添加了漠化乙錠的3%瓊 脂糖凝膠中，對反應液扣L混合loading dye solution 1化后上樣而進行電泳，觀察PCR擴 增產物來確認得到目標PCR擴增產物。各引物的序列示于表7。
[0192] 表7
[0193]
[0194] 下劃線是引物結合部位
[0195] (3)HPLC 分析
[0196] 使用參考例2中準備的陰離子交換色譜柱，按W下條件進行離子交換色譜，對(2) 中得到的各PCR擴增產物進行分離檢測。
[0197] 系統:LC-20A系列（島津制作所公司制）
[019引洗脫液:洗脫液A 25mmol/L Tris-鹽酸緩沖液(PH7.5)
[0199] 洗脫液B 25mmol/L Tris-鹽酸緩沖液(pH7.5)+lmol/L硫酸錠分析時間：分析時間 為15分鐘
[0200] 洗脫法:根據W下的梯度條件使洗脫液B的混合比率線性增加。
[0201] 0分鐘(洗脫液B 40%)一 10分鐘(洗脫液B 100%)
[0202] 樣本:（2)中得到的PCR擴增產物
[0203] 流速：1.0mL/min [0204] 檢測波長：260nm [02化]試樣注入量:如L
[0206] 柱溫：70 r
[0207] 〔實施例1)基于DM甲基化率的色譜保留時間的變動
[020引基于FAM150A基因啟動子的具有39個CpG位點的384bp區域的DNA序列，合成從39個 CpG位點全部被甲基化的DNA( 100%甲基化DNA)至完全沒有被甲基化的DNA(0%甲基化DNA) 的甲基化率不同的8個DNA。應予說明，對于50%甲基化DNA，合成甲基化位置在5 '端附近、在 3'端附近、和在中央附近的巧中模式的DNA。將各合成DNA的甲基化率和CpG島的甲基化數示 于表8。
[0209]表 8
[0210]
[0別。將上述8個合成DNA，按照參考例3的順序供給亞硫酸氨鹽處理、PCRW及HPLC。將合 成DNA齡.1(100%甲基化）、齡.2(0%甲基化）、齡.3(25%甲基化）、齡.4(50%甲基化）^及 No.5(75%甲基化）的HPLC的色譜示于圖1。能看到保留時間隨著DNA甲基化率而縮短。進而， 對于8個DNA，將HPLC的保留時間相對于甲基化率繪制的數據示于圖2。顯示HPLC的保留時間 相對于DNA甲基化率有極高的相關性。進而，對于50%甲基化DNA，可確認不依賴于甲基化位 置地顯示基本相同的保留時間。由此顯示出不依賴于DNA中的甲基化位置而取決于甲基化 率來確定保留時間。因此，通過測定HPLC的保留時間能夠測定樣品DNA所含的甲基化率。
[0212] 〔實施例2)腎細胞癌中的DNA甲基化解析和預后判定
[0213] 參考例1中CIMP判定的腎細胞癌中，由來自患者13人的CIMP陽性腎細胞癌和來自5 人的CIMP陰性腎細胞癌制備基因組DNA。按照參考例3 (1)~(3)的順序，將該DNA供給亞硫酸 氨鹽處理、PCR W及HPLC。PCR中，對FAM150A基因啟動子中的384bp區域進行擴增。
[0214] 進而，對于上述PCR擴增區域中的甲基化率為0 % (陰性對照）和100 % (陽性對照） 的DNA，也分別按相同的順序進行HPLC分析。
[0215] 將由CIMP陽性和CIMP陰性試樣得到的HPLC色譜示于圖3。圖3中也示出了未甲基化 DNA(陰性對照)和100%甲基化DNA(陽性對照）的色譜圖。圖3A、B為CIMP陽性試樣的色譜圖， 與未甲基化DNA(陰性對照）的峰保留時間不同的峰清晰地出現，表示甲基化DNA的存在。圖 3C為CIMP陰性試樣的色譜，其峰與未甲基化DNA(陰性對照）的峰在保留時間上基本沒有區 另IJ，表示基本不存在甲基化DNA。圖3D為CIMP陰性試樣的色譜，但與未甲基化DNA(陰性對照） 的峰保留時間不同的峰清晰地出現，表示存在甲基化DNA。即，即使判定為CIMP陰性，也啟示 有可能為預后不良的樣本。
[0216] 圖4是對本實施例中調查的全部18個CIMP陰性/陽性試樣繪制HPLC色譜的峰的保 留時間的圖。由于CIMP陰性試樣和陽性試樣的保留時間的分布明顯不同，所W可明確根據 本發明的方法，用MassARRAY法判定的癌的CIMP也能夠通過本發明的方法準確地判斷。 [0217] 在本實施例中使用的FAM150A基因啟動子384bp區域中，如圖4所示，在保留時間 9.3min附近可區分CIMP陽性組和CIMP陰性組，所W，可W將保留時間9.3min附近設定為成 為基準的保留時間。即，在早于成為基準的保留時間（基準保留時間）的保留時間具有檢測 信號的樣本可判定為預后不良。上述基準保留時間根據HPLC的分析條件、基因組DNA的區 域、或基因標志物的種類等而色譜圖發生變化，所W設定適當的基準保留時間即可。另外， 也優選考慮必要的臨床靈敏度來設定基準保留時間。
[0218] 本實施例中，由于陽性對照(dm甲基化率100%)的保留時間為約9.0分鐘和陰性 對照(DNA甲基化率0 % )的保留時間約為9.35分鐘，所W算出具有基準保留時間的基準DNA 甲基化率約為17%。因此，顯示在本實施例中使用的FAM150A基因啟動子384bp區域中，具有 高于上述基準DNA甲基化率(約17%)的DNA甲基化率的樣本為預后不良。
[0219] 將MassARRAY中得到的DNA甲基化率的平均值與本發明中得到的DNA甲基化率進行 比較。對于本發明中的得到的檢測信號為圖3A、B所示的二峰化的峰，繪制根據保留時間(將 洗脫較快的保留時間設為曰、較慢的保留時間設為b)算出的DNA甲基化率，與用MassARRAY得 到的DNA甲基化率進行比較，將結果示于圖5A。在圖5A中，沒有看到由各個方法得到的DNA甲 基化率有相關性。然而，將由W保留時間a與保留時間b的平均算出的合成峰C(保留時間C) 得到的DNA甲基化率進行繪制，同樣地，與用MassARRAY得到的DNA甲基化率進行比較，將結 果示于圖5B。如圖5B所示，由合成峰C算出的DNA甲基化率與用MassARRAY法得到的DNA甲基 化率的平均值有良好的相關性。
[0220] 根據本發明，例如30%甲基化DNA與70%甲基化DNA等量混合而成的試樣和全部為 50 %甲基化DNA的試樣在色譜圖上可明顯地辨別。與此相對，在上述的例子中，通過 MassARRAY法對于任一試樣也僅能夠得到W平均值計為50%甲基化DNA的信息。根據本發 明，由于與MassARRAY法不同，能夠將試樣中所含的各種DNA甲基化率的信號分離檢測，所W 能夠得到沒有被平均化的DNA甲基化率。
[0221] 由于MassARRAY法、焦憐酸測序等方法中得到的DNA甲基化率的值能夠得到作為供 于測定的試樣整體的平均值的DNA甲基化率，因此，作為結果，存在無法判定有無具有高度 甲基化DNA的細胞運一問題。根據本發明，即使判定為CIMP陰性，由于能夠除去未甲基化DNA 的影響，并能夠檢測是否含有高甲基化DNA，所W能夠避免低估DNA甲基化率的風險。進而可 判定疑似預后不良的樣本。
[0222] 基于專利文獻4中記載的方法的CIMP判定是W多個基因標志物的CpG島為對象對 CpG位點的甲基化進行調查來判定CIMP陽性或CIMP陰性。根據本發明，即使為單獨的基因標 志物，也啟示有可能通過對由HPLC得到的檢測信號進行解析而能夠容易地得到與CIMP判定 同等的腎細胞癌的預后判定。進而，啟示了有可能通過對多個基因標志物解析基于HPLC的 檢測信號從而能夠使預后判定高精度化。
【主權項】
1. 一種含有腎細胞癌的組織的判定方法，包括以下工序： (1) 將由受檢者的腎臟組織制備的基因組DNA用亞硫酸氫鹽進行處理的工序； (2) 將工序（1)中得到的被亞硫酸氫鹽處理過的DNA通過PCR進行擴增的工序； (3) 將工序(2)中得到的PCR擴增產物供給離子交換色譜的工序； (4) 獲得在該色譜中得到的檢測信號的保留時間的工序； (5) 在工序(4)的結果早于成為基準的保留時間的情況下，判定該組織為從預后不良的 腎細胞癌患者得到的含有腎細胞癌的組織的工序。2. 根據權利要求1所述的方法，其中，在所述工序（2)中，被P C R擴增的D N A含有選自 FAM150A、GRM6、ZNF540、ZFP42、ZNF154、RIMS4、PCDHAC1、KHDRBS2、ASCL2、KCNQ1、PRAC、 WNT3A、TRH、FAM78A、ZNF671、SLC13A5 以及 NKX6-2 中的至少一個基因的 CpG 島。3. 根據權利要求1所述的方法，其中，在所述工序(2)中，被PCR擴增的DNA含有FAM150A 基因啟動子區域。4. 根據權利要求1所述的方法，其中，在所述工序(2)的PCR中，使用由序列號51和52表 示的PCR引物。5. 根據權利要求1~4中任一項所述的方法，其中，在所述工序(4)之前，進一步包括以 下工序： 0-)將與由所述受檢者的腎臟組織制備的基因組DNA的PCR擴增區域相當的未甲基化 的DNA用亞硫酸氫鹽進行處理的工序； (2'）將工序0- )中得到的被亞硫酸氫鹽處理過的DNA通過PCR進行擴增的工序； (3'）將工序(2'）中得到的PCR擴增產物供給離子交換色譜的工序； (3a)從工序(3)的色譜所得到的檢測信號減去工序(3'）的色譜所得到的檢測信號而得 到差值數據的工序。6. -種腎細胞癌患者的預后判定方法，包括以下工序： (1) 將由受檢者的腎臟組織制備的基因組DNA用亞硫酸氫鹽進行處理的工序； (2) 將被該亞硫酸氫鹽處理過的DNA通過PCR進行擴增的工序； (3) 將得到的PCR擴增產物供給離子交換色譜的工序； (4) 獲得在該色譜中得到的檢測信號的保留時間的工序； (5) 在工序(4)的結果早于成為基準的保留時間的情況下，將該受檢者的腎細胞癌判定 為預后不良的工序。7. 根據權利要求6所述的方法，其中，在所述工序（2)中，被PCR擴增的DNA含有選自 FAM150A、GRM6、ZNF540、ZFP42、ZNF154、RIMS4、PCDHAC1、KHDRBS2、ASCL2、KCNQ1、PRAC、 WNT3A、TRH、FAM78A、ZNF671、SLC13A5 以及 NKX6-2 中的至少一個基因的 CpG 島。8. 根據權利要求6所述的方法，其中，在所述工序(2)中，被PCR擴增的DNA含有FAM150A 基因啟動子區域。9. 根據權利要求6所述的方法，其中，在所述工序(2)的PCR中，使用由序列號51和52表 示的PCR引物。10. 根據權利要求6~9中任一項所述的方法，其中，在所述工序(4)之前，進一步包括以 下工序： 0-)將與由所述受檢者的腎臟組織制備的基因組DNA的PCR擴增區域相當的未甲基化 的DNA用亞硫酸氫鹽進行處理的工序； (2'）將工序0- )中得到的被亞硫酸氫鹽處理過的DNA通過PCR進行擴增的工序； (3'）將工序(2'）中得到的PCR擴增產物供給離子交換色譜的工序； (3a)從工序(3)的色譜所得到的檢測信號減去工序(3'）的色譜所得到的檢測信號而得 到差值數據的工序。11. 一種用于判定含有腎細胞癌的組織的數據的獲得方法，包括以下工序： (1) 將由受檢者的腎臟組織制備的基因組DNA用亞硫酸氫鹽進行處理的工序； (2) 將被該亞硫酸氫鹽處理過的DNA通過PCR進行擴增的工序； (3) 將得到的PCR擴增產物供給離子交換色譜的工序； (4) 獲得在該色譜中得到的檢測信號的保留時間的工序； (5) 取得以下數據的工序，即，將工序(4)的結果是否早于成為基準的保留時間作為用 于判定該組織是否為從預后不良的腎細胞癌患者得到的含有腎細胞癌的組織的數據。12. 根據權利要求11所述的方法，其中，在所述工序（2)中，被PCR擴增的DNA含有選自 FAM150A、GRM6、ZNF540、ZFP42、ZNF154、RIMS4、PCDHAC1、KHDRBS2、ASCL2、KCNQ1、PRAC、 WNT3A、TRH、FAM78A、ZNF671、SLC13A5 以及 NKX6-2 中的至少一個基因的 CpG 島。13. 根據權利要求11所述的方法，其中，在所述工序（2 )中，被P C R擴增的D N A含有 FAM150A基因啟動子區域。14. 根據權利要求11所述的方法，其中，在所述工序(2)的PCR中，使用由序列號51和52 表示的PCR引物。15. 根據權利要求11~14中任一項所述的方法，其中，在所述工序(4)之前，進一步包括 以下工序： 0-)將與由所述受檢者的腎臟組織制備的基因組DNA的PCR擴增區域相當的未甲基化 的DNA用亞硫酸氫鹽進行處理的工序； (2'）將工序0- )中得到的被亞硫酸氫鹽處理過的DNA通過PCR進行擴增的工序； (3'）將工序(2'）中得到的PCR擴增產物供給離子交換色譜的工序； (3a)從工序(3)的色譜所得到的檢測信號減去工序(3'）的色譜所得到的檢測信號而得 到差值數據的工序。
【文檔編號】G01N30/88GK106062215SQ201580010887
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2015年3月2日
【發明人】金井彌榮, 新井惠吏, 根本有理子, 與谷卓也
【申請人】國立研究開發法人國立癌研究中心, 積水醫療株式會社