與光學超分辨率圖案化相關的方法和組合物的制作方法【專利摘要】本公開提供了用于在基板上生成分子的超分辨率圖案的方法。在一個方面，本文公開了一種方法，其包括使多個瞬時結合的核酸探針與其各自靶標接觸，其中所述靶標被固定在基板上，檢測基板的衍射受限區域內的選擇區域或選擇區域集合中的結合事件，和照射基板的衍射受限區域，其中所述探針包含光交聯劑。在一個實施方案中，所述光交聯劑是3?氰基乙烯基咔唑。【專利說明】與光學超分辨率圖案化相關的方法和組合物[0001]相關申請[0002]本申請要求2013年12月15日提交的美國臨時申請號61/916259(其各自的完整內容通過引用并入本文）的權益。[0003]聯邦資助的研究[0004]本發明是在美國國立衛生研究院授予的撥款號1DP20D007292-01下的政府支持的情況下進行的。政府在本發明中具有某些權利。[0005]背景[0006]現代分子生物學的標志是在分子尺度上操作和觀察生物系統的能力。操作和觀察的精度經常決定可W獲得的知識的清晰度、質量和置信度。打破光的衍射限制的超分辨率成像方法已經允許研究人員"看到先前看不見的東西"，并在深得多的水平獲得桐察力。[0007]概述[000引本發明提供了允許W納米精度光學操作分子的方法。迄今為止，標記(和進一步操作且由此研究）小規定的目標區域(諸如5nmX5nm目標區域）中的祀標諸如祀蛋白質、同時還不無差別標記短距離(例如，l0nm)遠的另一祀標是有挑戰性的。本文提供了用于超分辨率標記的方法，其設及超分辨的光學標記和W納米精度擾動分子祀標。運些方法允許研究人員"獲取先前不可接觸的東西"。該能力具有廣泛范圍的應用，包括但不限于用于捕獲和鑒定細胞中在任意用戶指定的分子位置的蛋白質祀標的納米級單細胞空間蛋白質組學，W及用于W納米精度活化/失活活神經元上的用戶指定的位置的特定離子通道的納米級光遺傳學。[0009]本公開提供了用于就目標分子或功能而言在兩個或=個維度圖案化基板的方法和組合物。本文提供的方法采用了具有化學(其允許與祀標瞬時結合相互作用（例如，參與與探針的序列特異性結合相互作用的表面綴合的核酸））的探針，和光交聯劑和/或光可裂解的接頭。該方法進一步包括檢測結合事件，隨后在特定條件下（例如，僅當單一期望的結合事件發生時）照射基板。該過程在本文被稱為反饋過程(或系統），因為其為決定并控制照射事件的時機的結合事件本身的發生。[0010]在一個方面，本文公開了運樣的方法，其包括使多個瞬時結合的核酸探針與其各自祀標接觸，其中所述祀標被固定在基板上，檢測基板的衍射受限區域內的選擇區域或選擇區域集合中的結合事件，和照射基板的衍射受限區域，其中所述探針包含光交聯劑。在一個實施方案中，所述光交聯劑是3-氯基乙締基巧挫。在一個實施方案中，所述基板的衍射受限區域用366皿至405皿光照射少于1秒或少于0.5秒。所述探針可W是序列和長度足W實現瞬時結合至祀標的探針。本文提供了探針序列基序的實例。[0011]在另一個方面，本文公開了運樣的方法，其包括使多個瞬時結合的核酸探針與其各自祀標接觸，其中所述祀標被固定在基板上，檢測基板的衍射受限區域內的選擇區域中的結合事件，和照射基板的衍射受限區域，其中所述探針具有發夾二級結構，且沿著其長度具有光可裂解的接頭或間隔區(使得所述接頭或間隔區的斷裂將誘導鏈中的共價斷裂）。在一個實施方案中，所述光可裂解的接頭包含1-(2-硝基苯基）乙基。在一些實施方案中，所述基板的衍射受限區域用具有等于或小于405皿的波長的光照射，任選少于1秒或少于0.5秒。所述探針可W包含立足點（即，在結合至祀標前是單鏈且由其結合至祀標的核巧酸序列）。所述立足點可W具有類似于標準"用于納米級形勢中的成像的點積聚（PointsAc州mulationforImaginginNanoscaleTopogra地y,PAINT)"探針的特征的特征，包括特定結合能量(當結合至祀標時），其進而取決于序列和長度。[0012]在前述方面，如果選擇區域中的結合事件是整個衍射受限區域中的唯一結合事件，則發生照射步驟。在運方面，如果結合事件觸發照射步驟(或事件），則其可W在本文被稱為"唯一"結合事件W意指，其為衍射受限區域中的唯一結合事件。如果與選擇區域中的結合事件同時檢測其它結合事件，則不發生照射。W該方式，探針僅附接至衍射受限區域內的選擇區域，而不附接至其它區域。[0013]在一些情況下，所述探針和祀標之間的結合的瞬時性質決定待使用的光交聯劑和光可裂解的接頭的性質。所述光交聯劑和光可裂解的接頭通常可W用短激光脈沖持續時間W~lW/cm2(或更小）至千瓦/cm2范圍內的功率密度進行活化，其進而意味著它們可W在非常短的時間段內用通常用于生物成像應用諸如隨機光學重構顯微鏡(STORM)超分辨率成像的標準且廉價的激光器進行活化。運是重要的，因為所述探針和祀標之間的結合僅發生短時間段，并且可W希望避免所圖案化的基板或先前圖案化的探針或其載荷的照射損傷。如本文所使用，所述光交聯劑和光可裂解的接頭的活化意欲分別形成共價加合物和鍵的裂解。[0014]待圖案化的基板的選擇區域可W比所述衍射受限區域更小。待圖案化的基板的選擇區域可W具有(或可W不具有)運樣的特征或區域，其局部具有比其對應的衍射受限區域的面積(或體積)更小的面積(或體積）。在一些實施方案中，待圖案化的選擇區域不比衍射受限區域更小，并且相反，其可W含有比直接衍射受限區域更小的特征(其可W連接或可W不連接）。基于可W使用超分辨率顯微鏡觀察探針的精度和準確度確定探針是否位于任意二維或=維選擇區域(其可W在本文被稱為模版）。因此，可W使用大小尺度低于衍射限值的具有幾何定義特征的圖案化模板。[0015]應當理解的是，照射步驟在檢測到期望的結合事件之后不久發生。檢測和照射之間的時間可W是毫秒的量級。所述方法可W是自動化的，并且可W采用CCD或EMCCD相機來檢測衍射受限區域內的結合事件。所述方法還可W采用激光點照射器或數字微鏡裝置(DMD)陣列。如果使用DMD陣列，則可W監測且同時或并行圖案化多個衍射受限區域。[0016]在一些實施方案中，所述探針進一步包含巧光團。在一些實施方案中，所述巧光團是ATT0655、Alexa647或其它亮巧光團。如本文所使用，"亮巧光團"是指發射足夠數目的光子、使得CCD或EMCCD相機能夠檢測單一結合事件的巧光團。在一些實施方案中，所述巧光團是釋放至少或約1〇4-1〇6個光子的巧光團。在一些實施方案中，Trolox、b-琉基乙醇(BME)、k半脫氨酸甲醋化-切S-ME)、環辛四締(COT)、沒食子酸正丙醋、1，4-二氮雜雙環[2.2.2]辛燒(DABC0)或琉基乙胺(MEA)和其它試劑可染料的氧化還原永久光漂白率存在于成像緩沖液中（例如，通過清除反應性氧種類(R0S)如單線態氧），因此增加染料光子輸出和定位精度）。通常，所使用的巧光團的激發和發射波長在用于活化光交聯劑或光可裂解的接頭的波長范圍之外。在一些實施方案中，所述探針進一步包含官能團或部分。在一些實施方案中，所述官能團或部分是化學柄(chemicalhandle)。在一些實施方案中，所述官能團或部分是生物素、抗生物素蛋白或納米顆粒。在一些實施方案中，所述官能團或部分是烘控或疊氮化物(例如，用于"點擊化學"）。在一些實施方案中，所述官能團或部分用于將載荷附接至基板。所述載荷可W是通常用于半導體工業中的光刻中的化學化合物。運樣的化學化合物的實例是PDMS或PMMA。[0017]在一些實施方案中，所述基板的選擇區域是所述基板的選擇面積或選擇體積。所述選擇區域可W是最終用戶預定的區域或圖案(例如，最終用戶希望將具體目標載荷沉積于其中或其上的區域）。所述區域可W是面積或體積。所述圖案可W是二維的或=維的。在后一種情況下，所述基板可W是小室(cell)或其它=維部分。[0018]在一些情況下，所述衍射受限區域包含在其整個面積或體積相對均勻結合的多個祀標。W該方式，基板可W制備成包含結合至其表面中的一個或多個和其體積中的一個或多個的祀標，并且可W處理W生成如本文提供的超分辨率圖案。結合至基板的祀標可W是彼此相同的或者它們可W是不同的。如果不同，則可W存在附接至基板的2-1000個祀標群體。任何給定的衍射受限區域可W包含1-1000個祀標群體。在一些情況下，所述祀標可W提供為結合至具有催化特性的膠體金顆粒(例如5nmAu納米顆粒)或氧化鐵納米顆粒的寡核巧酸。[0019]在一些實施方案中，其中去除結合至基板的選擇區域之外的祀標的探針(例如，在與其各自祀標解離之后洗掉）。[0020]上述方法可W用于生成目標部分的圖案，例如通過在結合至祀標之前或之后將目標部分綴合至探針。如本文所述，所述圖案可W具有超分辨率維度（即，小于光學檢測系統的分辨率限值的維度）。例如，所述圖案可W具有維度小于衍射受限分辨率的特征或組分(并且因此位于衍射受限區域內，其可W-維是例如幾百納米）。[0021]本發明的運些和其它方面和實施方案將描述于本文中且被認為是本公開的部分。[0022]附圖簡述[0023]圖1舉例說明本公開的包括使用探針的光交聯和探針的經由光裂解的動力學俘獲的各個方面和實施方案。[0024]圖2舉例說明超分辨率標記(操作-PAINT)。[0025]圖3A-F舉例說明DNA-PAINT概念和高空間分辨率成像。（A-E)修改自Rust等人1。[0026]圖4A-C舉例說明（A)操作-PAINT機制，（B)光交聯基質，和(C)CNVK光交聯批量實驗。[0027]圖5舉例說明使用矩形DNA折權結構為操作-PAINT設基準。[0028]圖6A和B舉例說明（A)操作-PAINT自動獲取、處理和驅動軟件，和(B)通過DMD陣列的活化激光空間控制。[0029]圖7舉例說明光裂解。[0030]圖8舉例說明3DDNA-PAINT超分辨率成像口9'創。[0031]圖9A-E舉例說明細胞中的操作-PAINTd(A，B)細胞祀標的2D(A)和3D(B)DNA-PAINT成像的初步工作n23;(C，D)3D操作-PAINT原位展示。（C)使用3D-操作-PAINT用獨特的DNA分子修飾3D納米結構（固定在細胞表面上）的指定頂點。（D)使用旋轉盤共聚焦系統在整個全細胞體積用3D-操作-PAINT位點特異性修飾微注射的3D納米結構。化）W20nm的間隔標記用DNA偶聯的抗體標記的微管網絡的操作-PAINT。[0032]圖10舉例說明納米級單細胞空間蛋白質組學。[0033]圖11舉例說明單離子通道操作。[OOW詳述[0035]超分辨率成像方法是本領域中已知的，且包括但不限于隨機光學重構顯微術(STORM)U哺用于納米級形勢中的成像的點積聚(PAINT盧'S3。本文提供的超分辨率標記方法部分基于運樣的超分辨率成像方法（圖2A)。簡言之，在DNA-PAINT中，將樣品用短(8-至9-ntr對接鏈"（圖2A中的鏈a)修飾，并且溶液含有巧光團（描述為星號)標記的"成像劑鏈"(a*)。成像劑鏈可W瞬時結合至對接鏈，在全內反射(TIR)成像下使之明亮。成像劑鏈的重復、瞬時結合將對接鏈在亮和暗狀態之間隨機轉換，并且使得能夠通過一次相繼和精確定位一個對接鏈而將運些鏈超分辨率成像。DNA-PAINT可用于W小于10-nm分辨率顯現固定細胞中的蛋白質也已經獲得高密度、超分辨率圖像，其設及DNA納米結構上隔開僅5nm的對接鏈(圖2A，右側）。[0036]為了實現超分辨率標記（圖2B)，例如用光交聯劑和綴合柄（圖2B中的b區段)修飾成像劑鏈。當成像劑鏈存在于DNA-PAINT下的期望位置(即，結合至目標區域中的對接鏈[用框描繪];圖2B中的情況(2))時，將成像劑鏈光交聯至對接鏈，然后用綴合柄修飾目標區域中的對接鏈。然而，當成像劑鏈位于目標區域之外（圖2B中的情況(1))時，不會觸發交聯。該過程在本公開中被稱為"操作-PAINT"。運些方法可W在核納米結構、細胞和組織，包括固定的細胞和組織，和活細胞和細胞膜的背景下實施。[0037]操作-PAINT提供了廣泛實施平臺W實現細胞中的分子祀標的納米級標記和操作。操作-PAINT可W用于納米級單細胞空間蛋白質組學，其中可W在用戶指定的位置特異性捕獲和標記特定蛋白質及其相關的伴侶（圖2C，頂部）。運些蛋白質然后可W使用單一蛋白質指紋分析方法進行鑒定（圖2C，底部），由此變性和拉伸各蛋白質，用DNA對接鏈標記特定氨基酸(例如，賴氨酸），并且超分辨率DNA-PAINT將生成光學幾何信號用于蛋白質鑒定。操作-PAINT也可W用于納米級光遺傳學，其中分子擾動劑(例如，阻斷離子通道的lumitoxin)將遞送至神經元上的用戶指定的離子通道，由此使得能夠W納米精度特異性光學活化/失活離子通道（圖2D)。操作-PAINT也可用于位點特異性祀標標記和純化、擾動和位點特異性祀標上的載荷，等。[0038]本公開提供了整合的超分辨率顯現和標記方法。該方法基于短寡核巧酸的瞬時結合的超分辨率顯現，和運些寡核巧酸的實時位點特異性活化而用于化學修飾。先前已經用超高空間分辨率(<5nm)和超高多路功率（多達10種顏色)表明使用DNA-PAINT3的超分辨率成像本公開通過整合實時顯現和活化而延伸了運樣的方法。活化步驟經由光反應性化學實現，包括使用包含光裂解和光交聯的堿基的短寡核巧酸。[0039]因此，如從上述將理解，在某些超分辨率成像方法中，探針，瞬時、而不是穩定，結合至其祀標。如果基板(或階段)在圖像獲取過程中移動，則可W連續地(例如，使用時間推移技術)或串聯地（用例如隨后的比對和重疊），任選地用漂移校正，獲取圖像。用于漂移校正的方法是本領域中已知的。所得圖像然后可W用于定義探針結合，因此定位位置。[0040]探針結合的瞬時性質允許最終用戶辨別更多祀位置，包括位于給定光學檢測系統的分辨率限值內的特別重要的祀位置。因此，使用常規的穩定結合探針，彼此分開小于所使用的光學檢測系統的分辨率限值的兩個祀位置不會被辨別為兩個分開的位置。然而，如果使用瞬時結合探針，有更大可能性的是，在任何給定時間，兩個祀位置之一將不會被其相應的探針結合。僅當單一祀位置結合至其相應的探針時，然后才可W獲得圖像，并且運些圖像的編譯將使兩個祀位置呈現為分開的位置。[0041]本發明采用超分辨率成像技術，并且在其上構建W便W超分辨率水平圖案化基板。W超分辨率維度圖案化基板的能力具有各種應用，包括光刻。此外，由于可W用多種載荷負載各探針，所W本發明也促進各種載荷的圖案化。[0042]探針[0043]待用于本發明的方法中的探針可W是能夠結合至目標祀標的任何部分。在一些情況下，所述探針可W特異性結合至祀標（即，其對于一種祀標具有較高的親和力或有效唯一親和力）。[0044]所述祀標可W是核酸、蛋白質和其它生物和非生物實體。在一些實施方案中，所述祀標(或對接位點）可W在基板上彼此的200nm內。所述探針可W是核酸(例如，諸如寡核巧酸且包括適配子）、蛋白質(例如，諸如抗體或抗體片段)等。在某些實施方案中，所述祀標和探針是核酸，并且更具體是寡核巧酸。[0045]在重要實施方案中，所述探針是在室溫瞬時結合至其祀標的核酸。在一些實施方案中，所述探針長度為7-12個核巧酸。在一些實施方案中，所述探針長度為約9個核巧酸。在一些實施方案中，所述探針被巧光標記。當使用該長度的寡核巧酸時，所述寡核巧酸及其祀標之間的結合強度降低，因此它們比結合至其祀標的更長寡核巧酸更可能解離。在室溫，長度為約8個或約9個核巧酸的寡核巧酸和祀區域與彼此僅瞬時結合。如本領域中將理解，在較高溫度，寡核巧酸和祀區域的長度將通常增加，W實現相同的結合/解離動力學。運樣的長度可W范圍為，但不限于，約5個核巧酸至30個核巧酸，或約7個核巧酸至約25個核巧酸，或約9個核巧酸至約21個核巧酸。所述探針可W在本文被稱為成像劑鏈，且所述祀標可W是對接鏈或可W綴合至對接鏈，所述對接鏈與成像劑鏈互補。因此，所述祀標可W是對接鏈，或者其可W是已經修飾W包含對接鏈的另一種目標試劑。[0046]所述探針和祀標可W基于它們的相互作用的結合能來設計。因此，在一些情況下，所述探針和祀標之間的結合相互作用可W被定義為在25°C具有約-6.92kcal/mol的AG的結合能。ah(洽）可W是約-58kcal/摩爾，且AS(賭）可W為約-0.171kcalAK?mol)。運些結合能假定包含約50mM至約1M化Cl的結合環境(例如，雜交環境）。如果在較高溫度(例如，體溫)發生結合，則結合能AG(在37°C)為約-4.8化cal/mol。因此，所述探針和祀標可W被設計成實現在運些量或約運些量的結合能。[0047]應當進一步理解的是，所述探針可W包含核酸或由核酸組成，并且所述祀標可W包含核酸或由核酸組成。例如，所述探針可W是核酸和另一部分諸如蛋白質的綴合物。在核酸中促進基板上的相互作用和固定化。或者，如果所述探針是具有化學柄的核酸，則可W在固定化后使用運樣的化學柄，W便在基板上的特定區域附接另一部分，諸如例如蛋白質。[0048]所述探針將如本文所述用例如官能團或部分進一步修飾。所述官能團或部分的性質將取決于具體應用。實例包括結合伴侶諸如生物素和抗生物素蛋白，納米顆粒或微粒，其它形式的載荷，和化學基團諸如烘控或疊氮化物等。[0049]圖案化方法[0050]本公開的各個方面將超分辨率成像方法，諸如隨機光學重構顯微術(STORM)W和用于納米級形勢中的成像的點積聚（PointsAccumulationforImaginginNanoscaleTopogra曲y，PAINT)[2'33轉化為高通量光刻工具，其允許W可W光學分辨它們的相同分辨率圖案化分子。[0051]光交聯方法[0052]在一個方面，本發明提供了用于交聯PAINT探針的方法、產品和裝置。在一些實施方案中，將所述探針光交聯。在一些實施方案中，將運樣的探針交聯，包括光交聯，至結合伴侶諸如互補結合伴侶。[0053]在一些實施方案中，所述探針包含交聯劑諸如光交聯劑。所述交聯劑，包括光交聯劑，可W位于探針的末端(例如，5'末端或3'末端），或者它可W在內部位置。在一些實施方案中，所述交聯劑，包括光交聯劑，可W位于探針的中屯、附近或探針的中屯、(例如，相對于其長度）。所述探針可W包含一種或多種交聯劑。[0054]在一些實施方案中，所述交聯劑是光交聯劑。可W根據本公開使用的光交聯劑的實例是3-氯基乙締基巧挫。其它交聯劑，包括光交聯劑（例如，肉桂酸醋，面化堿諸如5-漠加，補骨脂素），是本領域中已知的，并且可W在其它實施方案中與本公開放在一起。[0055]一個方面組合超分辨率成像技術諸如PAINT[2'33與交聯技術，諸如與3-氯基乙締基巧挫核巧(?Vk)化學物的光化學交聯該組合然后進一步與光源組合，所述光源諸如例如激光點照射器諸如例如在>20化操作的照射器W，或具有例如約103至106個單獨可編程鏡子(用于大規模并行點照射)的數字微鏡顯示器(DMD)陣列通過整合運些要素，生成快速基于激光的反饋系統，其利用CCD相機輸入永久固定(?Vk)-標記的探針諸如PAINT探針，其為二維表面上或S維體積中被隨機相繼吸附/添加（RSA)放置的瞬時占據對接位占[U-13]V林〇[0056]對接位置通常存在于圖案化基板的面積或體積內，其在可用用于巧光團定位的CCD相機觀察的全內反射巧光(TIR巧消散場內。[0化7]。典型"的CCD相機視場(F0V)為約>50皿2(例如，用AndoriXon897EMCCD相機[14]，其具有512X512個像素的陣列），并且可W使用>4兆像素（2048X2048像素陣列）〇1^曰-Flash4.0V2ScientificCMOSCCD[i5]合理地擴大至>150皿2至>200皿2面積。然而，運些F0V可W使用一些現有技術擴大，所述技術包括用于光響應非均勻性（Photo-ResponseNon-Uniformity，PRNU)的校準和校正慣例，其允許使用較低物鏡（即，每衍射受限面積的較少像素及提高CCD相機探測器量子效率和像素密度。運些應當為針對高分辨率單分子定位和圖案化縮放可工作探測器F0V提供了重要的機會。[0058]關于=維體積中的圖案化的事情，沿著可W圖案化的焦平面的Z-軸的程度（即，可及的"場深度"）和對于圖案化可實現的分辨率，取決于各種=維超分辨率方法可W如何好地分辨巧光目標。為此，通過將RafaelPiestun的雙螺旋點擴散函數（Double-HelicalPointSpread化nction，DH-PSF)[n]應用于S維超分辨率成像技術諸如STORM(或STORM的蛋白質變體，光活化的定位顯微術(PALM)W4iMoerner等人能夠沿著X-、廠和Z-軸經>2皿場深度對單一巧光分子表明各向同性>10皿至>200皿分辨率W'W，并且還提取>10度的標準偏差內的(Z，0，(1))染料取向參數。運對于像散性和多平面[23'W方法實現的巧光染料定位分別超過>600nm場深度和皿場深度，并且通常經短或長場深度范圍超過任一方法的3-空間分辨率因此，運些方法可W用于本公開的方法中。[0059]本公開的某些方法使用CCD相機輸入W引導激光反饋系統，W"冷凍"隨機巧光探針結合相互作用，由此允許最終用戶通過附接至巧光團的分子或顆粒的任意復雜圖案的構建而走到賭梯度。使用巧光探針定位的該反饋方案，隨機閃爍激光W原位鎖定探針將引起潛在探針對接位點的集合的統一且隨機的圖案化。[0060](?Vk)[4^73核巧可W并入PAINT[2'33探針序列，優先在給定探針的中屯、附近，W盡可能提高熱力學穩定性。優選地，喀晚堿基(最佳為胸腺喀晚、尿喀晚或甲基胞喀晚乍為探針上的（?k)插入立即上游的核巧酸的Watson-化ick互補物而存在于修飾探針的對接位點上。[0061](?Vk)交聯反應對于側接插入位點的最近核巧酸是敏感的[4'7^。在W下核巧酸背景下，[0062](5'-...X(?Vk)-Y...-3'）[0063](3'-...X'----Z-Y'...-5'）.[0064]X'是與(?k)基團共價交聯的喀晚基團，Z核巧位于(?Vk)雙鏈體插入的相對側，但不直接參與交聯反應，而Y/Y'Watson-化ick堿基對經由與(?k)/Z假-堿基對的堆積相互作用影響交聯反應。如果X'=T或U(運對于喀晚堿基交聯祀標是最佳選擇），則Z和Y的選擇可W具有較少影響[4'7^。甲基化的胞喀晚可W充當類似有效的交聯祀標(即，X'=Cm)W。[0065]對于特定X'=T實例W下雜交的寡核巧酸的配對在使用基于UVL邸燈的光源用>1.5W/cm2的功率密度W>366nm照射<1秒之后得到>50%光交聯得率^'7]:[0066]5'-TGCA?\TCGT-3'[0067]3'-ACGT--GAGCA-5'。[0068]因此，探針可W包含W下序列或由W下序列組成：[0069]5'-TGCA?\TCGT-3'[0070]且對應祀標可W包含W下序列或由W下序列組成：[0071]3'-ACGT-GAGCA-5\[0072]運樣的探針-祀標對的能量近似值如下：[0073]AH(0.01M至1MNaCl)::-49.4kcal/mol,[0074]AS(1MNaCl):：-0.134kcal/(K*mol),[0075]AG(1MNaCl，25°C)::-9.57kcal/mol，且[0076]AG(1MNaCl，37°C)::-7.96kcal/mol。[0077]在一些實施方案中，為了使探針更適合于PAINT，可W通過操作溶液的一價離子濃度而改變AG值。例如，可W降低化C1一價離子的濃度W降低該序列的熱穩定性，或者可替代地，可W增加NaCl濃度W補償由于引入(?Vk)基團導致的不穩定影響。[0078]經由1-(2-硝基苯基)乙基光裂解的動力學俘獲[0079]本公開的其它方面是本文描述的光交聯實施方案的變型。在一個運樣的變型中，將光可裂解間隔區諸如1-(2-硝基苯基）乙基光可裂解間隔區商購自Ambergen)插入PAINT[2'33探針的發夾變體中。運允許使用基于激光的反饋系統W便在所需位置和/或在所需時間原位動力學俘獲隨機PAINT探針結合相互作用。光可裂解間隔基化學物是與3-氯基乙締基巧挫(?Vk)W-叫I多飾核巧的快速且直接光交聯的替代方案。[0080]可W用于該實施方案中的核酸的實例如下：[0081]5'-/5ATT0655N/TAGATGTATGGTCTG/iSpPC/CCGGACTTTTTTTTCAATGTATTTTTTTTGTCCGGCAGACCATACATCTATCTTCATTA-3'(沈QIDNO:1)[0082]其中75ATT0655N/"被定義為寡核巧酸上的共價綴合的ATT0655染料的位置的指示符，且ViSpPC/"被定義為使用例如1-(2-硝基苯基）乙基化學物的光可裂解間隔區的位置的指示符UU。該探針具有74個核巧酸的長度，并且包含長度為9個核巧酸的立足點(粗體序列）。[0083]本公開的方面和實施方案在圖1中舉例說明，其在下面更詳細描述。如圖中所示，本文提供的方法可用于在基板上W預定的（和潛在任意的）圖案放置特定目標化學柄(在圖底部通過5角星表示）。該圖頂部舉例說明其內任意圖案W粗"彎曲矩形"表示的衍射受限區域。圖中舉例說明的過程的最終結果是使用目標部分生成預定圖案，如右上框中所示。[0084]中間小圖舉例說明可W如何使用光交聯來實現圖案。左小圖舉例說明基板上存在祀標。在該情況下，所述祀標是單鏈核酸。作為一個實例，單鏈核酸可W存在于沿著面積相對均勻分布的5nm膠態金顆粒上。所述探針還是具有一端的巧光團且另一端的化學柄的單鏈核酸。應當理解的是，化學柄僅僅代表任何目標官能團或部分。所述探針進一步包含3-氯基乙締基巧挫的形式的光交聯劑。所述光交聯劑作為寡核巧酸探針的修飾核巧的部分存在。當探針結合至其祀標(在核酸祀標和探針的情況下通常通過Watson-Crick雜交），革己標的位置作為從探針上的巧光團發射的結果是顯而易見的。如果祀標位于預定目標區域(在圖中被稱為"模版"）中，且重要地，如果其在當時是唯一檢測的結合事件，則整個區域將被照射，導致僅在目標區域形成祀標和探針之間的共價鍵。在舉例說明的實例中，生成3-氯基乙締基巧挫及其對接位點（胞喀晚堿基的形式)之間的共價光加合物。因此，經由運樣的共價鍵結合固定探針，如同其載荷一樣。照射也用于光漂白巧光團，或者可替代地更接近于巧光團的波長的照射可用于完成運一點，使得該過程可W重復多次W便將額外探針固定于目標區域中，而不受先前固定的探針的干擾。在該具體情況下，可W通過用366-405nm的波長照射少于1秒或少于0.5秒來實現光交聯。應當理解的是，僅當在衍射受限區域中檢測到單一結合事件時才發生照射，并且結合事件存在于目標區域中。如果在目標區域之外檢測到結合事件，則不發生照射。在模板面積(或體積)之外結合至祀標的任何探針僅瞬時結合，因此可W容易地經由一次或多次洗涂去除。[0085]應當理解的是，可W使用其它光交聯劑和其它巧光團，只要可W相對快速地活化光交聯劑(并且因此具有相對少的能量），并且巧光團能夠發射足夠數目的光子，足W在相對短的時間段內被檢測。因此應當理解的是，探針結合的動力學，探針結合的檢測(作為巧光團發射的結果），和光交聯劑活化都是相互關聯的。[0086]探針和祀標也可W被設計為包括特定序列模式，W增強它們的結合和隨后的共價相互作用，如本文所述。[0087]底部小圖舉例說明可W如何使用光裂解來實現模式。再次，與中間小圖類似，左小圖舉例說明基板上存在祀標。如舉例說明，所述祀標具有兩個區域(核巧酸序列）。運些區域之一與探針上化學柄(本文被稱為立足點）附近的特定區域(核巧酸序列)互補。另一區域與發夾探針上的另一特定區域互補。還舉例說明發夾探針在其未結合和結合狀態的結構。所述發夾探針包括在一端的化學柄，在另一端的巧光團，和在內部位置的光可裂解的接頭。當結合至基板上的其祀標(通過通常從立足點與祀標的相互作用進行的過程)時，祀標的位置由從巧光團的巧光發射表示。如果祀標在預定目標區域(模版）中，且如果在衍射受限區域中沒有檢測到其它結合事件，則整個區域將被照射，導致發夾環的裂解和包含巧光團的探針區域的釋放。在該情況下，經由小于或等于405nm的照射，1-(2-硝基苯基）乙基接頭的閃光光裂解，生成熱穩定的18聚體雙鏈體。如舉例說明，探針區域的釋放在所得相對固定的探針上生成單鏈區域。如圖中舉例說明，裂解之后，固定的探針可W具有"無癒痕5'憐酸醋"(例如，如果使用1-(2-硝基苯基）乙基接頭，如圖中舉例說明），意欲可W在連接反應中使用運樣的末端，例如，沒有進一步修飾。[0088]設計立足點序列和長度，使得所述立足點的結合能足夠強，足W開始探針雜交至祀標的過程，但不穩定，足W仍然瞬時結合(從而實現超分辨率成像，因此如本文提供的模式化）。在一些情況下，立足點區域因此可W長度為約9個核巧酸或更少。[0089]應當理解的是，可W使用其它光可裂解的接頭和其它巧光團，只要可W相對快速地活化光可裂解的接頭(并且因此W~IW/cm2至千瓦/cm2的功率密度用短持續時間激光脈沖），并且巧光團能夠發射足夠數目的光子，足W在相對短的時間段內被檢測。因此應當理解的是，探針結合的動力學，探針結合的檢測(作為巧光團發射的結果），和光可裂解的接頭活化都是相互關聯的。[0090]因此，如在本公開的背景下將理解，結合事件的期望性取決于衍射受限區域中的其位置(例如，（X，y)或(x，y，z))及其獨特性。[0091]本文提供的方法允許最終用戶替代選擇區域上的化學柄或標志物。一旦在選擇區域中且僅在選擇區域中檢測到結合事件，則可W照射整個衍射受限區域，由此將探針固定至選擇區域。所述化學柄或標志物可W是或可W用于附接例如納米顆粒(對于拉曼光譜)或珠粒(對于力光譜)或巧光顆粒(對于FACS)。[0092]等待(x，y)或(x，y，z)中的一些期望位置的探針結合事件、檢查探針是否僅在衍射受限區域中、然后是否如此、決定用激光將其共價附接至基板(在其結合位置)的能力，允許最終用戶在低于衍射限制的特定位點標記部分。作為非限制性實例，所述標記可W是可檢測標記，或者它們可W是親和標記。在光刻背景下，可W期望W模擬標準光刻技術(其改變衍射受限區域中的化學組成)的方式將大量標記置于衍射受限區域中。[0093]在一些實施方案中，可W使用超快皮秒至飛秒激光脈沖W非常高功率密度(例如，使用〔〇116'6]11：'31'；[:3日郵11；['6畑日1116160]1叫1：抑11系統）[36]代替1]￥或近1]￥光（例如，405nm光）。運允許使用"紅偏移"光（例如，吸收兩個810nm光子，至第一階近似，類似于W兩倍能量吸收一個405nm光子）。較長波長可W意指較少的對樣品的損傷，或背景巧光，并且還可W在例如組織或3D聚合物網絡中提供較深的穿透。[0094]用于本公開的方法中的蛋白質的實例包括，但不限于，抗體(例如，單克隆單體）、抗原結合抗體片段(例如，化b片段）、受體、膚和膚適配子。[0095]如本文所使用，"抗體"包括全長抗體及其任何抗原結合片段(例如，"抗原結合部分"）或單鏈。術語"抗體"包括，但不限于，包含通過二硫鍵相互連接的至少兩條重化)鏈和兩條輕化)鏈的糖蛋白，或其抗原結合部分。抗體可W是多克隆的或單克隆的；異種的、同種異體的或同基因的;或其修飾形式(例如人源化的、嵌合的）。[0096]如本文所使用，抗體的"抗原結合部分"是指保留特異性地結合至抗原的能力的抗體的一個或多個片段。抗體的抗原結合功能可W由全長抗體的片段進行。術語抗體的"抗原結合部分"內涵蓋的結合片段的實例包括（i)Fab片段，由VH、VL、化和CHI結構域組成的單價片段；（ii)F(ab'）2片段，包含通過二硫鍵在較鏈區連接的兩個化b片段的二價片段；（iii)由VH和CH1結構域組成的Fd片段；（iv)由抗體的單一臂的VH和化結構域組成的Fv片段，（V)dAb片段(Wardetal.，化ture341:544546，1989)，其由￥始吉構域組成；和（￥1)分離的互補性決定區（CDR)或(vii)兩個或更多個分離的CDR的組合，其可W任選地通過合成接頭接合。而且，盡管Fv片段的兩個結構域VH和化由分開的基因編碼，但可W使用重組方法通過合成接頭將它們接合，所述接頭能夠使其成為單一蛋白質鏈，其中VH和化區域配對W形成單價分子（被稱為單鏈Fv(scFv);參見，例如，Bird等人Science242:423426,1988;andHustonetal.Proc.化tl.Acad.Sci.USA85:5879-5883,1988)。運樣的單鏈抗體也意欲涵蓋于術語抗體的"抗原結合部分"中。可W使用本領域技術人員已知的常規技術獲得運些抗體片段，并且篩選片段用于W與完整抗體相同的方式應用。[0097]如本文所使用，"受體"是指結合至配體的源自細胞的分子(例如，蛋白質），諸如，例如，膚或小分子(例如低分子量《900道爾頓)有機或無機化合物）。[009引如本文所使用，"膚適配子"是指可變膚序列插入恒定支架蛋白質的分子(參見，例如，Baines1C,等人.DrugDiscov.Today11:3:34-341,2006))。[0099]如本文所使用，"核酸適配子"是指可W形成能夠特異性結合蛋白質或其它細胞祀標的二級和S級結構的小RNA或DNA分子(參見，例如，NiX，等人.CurrMed化em.l8(27):4206-4214,2011)。[0100]可W用于本文描述的方法中的巧光標記包括咕噸衍生物(例如巧光素、羅丹明、俄勒岡綠、伊紅和德克薩斯紅）、花青衍生物(例如花青、嗎I噪幾花青（indocarbo巧anine)、氧代幾花青（oxacarbocyanine)、硫雜幾花青（thiacarbo巧anine)和部花青）、糞衍生物（例如丹橫酷和普羅丹衍生物）、香豆素衍生物、嗯二挫衍生物(例如化晚基嗯挫、硝基苯嗯二挫和苯并嗯二挫）、巧衍生物（例如級聯藍）、嗯嗦衍生物（例如尼羅紅、尼羅藍、甲酪紫和嗯嗦170)、叮晚衍生物(例如原黃素、叮晚澄和叮晚黃）、芳基次甲基衍生物(例如金胺、結晶紫和孔雀綠）、和四化咯衍生物（例如化吩、獻菁和膽紅素）。在某些實施方案中，所述巧光團是ATT0655或Alexa647或其它亮巧光團（例如，發射至少104-106個光子的巧光團）。[0101]在某些實施方案中，所述巧光團是能夠被可逆或永久光漂白的巧光團。[0102]下面將更詳細地描述各個方面和實施方案及其各種應用。[0103]通過DNA-PAINT的超分辨率成像[0104]遠場巧光顯微鏡近年來已經看到真正復興，因為出現了繞過經典衍射限制的方法，即，超分辨率顯微術ns-W。超分辨率顯微術依賴于運樣的事實，分子在有巧光和無巧光狀態之間'轉換'，W獲得亞衍射圖像分辨率。用于納米級形勢中的成像的點積聚(PAINT)W是用于隨機超分辨率成像的易于實施的方法，其中使用與樣品瞬時相互作用的擴散分子進行成像。一種實施PAINT的方式被稱為DNA-PAINT3,其中短巧光標記的寡核巧酸('成像劑'鏈)與互補'對接'鏈的重復、瞬時結合將分子從暗狀態轉換至亮狀態(圖3A，3B)。當成像劑鏈未被結合時，僅從樣品觀察到背景巧光；在成像劑鏈結合之后，使用全內反射(TIR)或高度傾斜且層疊的光學片化ILO)43^照射檢測其巧光發射。該整合能夠W高度可調節的有巧光和無巧光時間（通過成像劑鏈結合強度和濃度設置)實現特定的模塊化的超分辨率成像。最近，DNA-PAINT的分辨率增加至體外合成DNA結構的~10皿橫向成像分辨率(圖3C-3E)。使用先進的漂移校正算法和仔細優化的成像條件，已經實現了高密度、超分辨率DNA-PAINT圖像，其中對接位點隔開僅~5nm(圖3F)。也已經表明了合成納米結構和固定細胞38的3D成像。[0105]2D中的操作-PAINT[0106]DNA-PAINT與光化學過程偶聯W永久固定瞬時結合的成像劑鏈，W實現具有納米級精度的可編程和位點特異性標記。該方案的一種簡單的實施方式(圖4A)設及首先將綴合柄(例如生物素或另一單鏈DNA結構域)和光交聯劑附接至成像劑鏈，然后當成像劑鏈結合至目標區域中的祀標上的對接鏈時，觸發成像劑和對接鏈之間的快速光交聯反應。該位置中的祀標然后連接至綴合柄，并且可W進一步操作或分析。當對接鏈位于目標區域的外側時，不會觸發交聯。[0107]在合成DNA納米結構平臺上的超分辨率DNA探針捕獲。[010引光反應性核堿基類似物3-氯基乙締基巧挫(?K心'45]可W用作光交聯劑（圖4B)。在含有gnvk的DNA雙鏈體中，UV光(350-405nm)可W誘導和相反鏈上的胸腺喀晚(T)或胞喀晚(C)之間的快速交聯，由此形成兩條鏈之間的共價連接。當照射的強度足夠高時，光交聯可W在一秒內進行完全。如圖4C中所示，在1秒的365nm光暴露內實現10-nt寡核巧酸和含有?^的互補寡核巧酸之間的有效交聯(>90%)。[0109]該系統可W使用矩形的DNA折權納米結構進行基準化，所述矩形的DNA折權納米結構充當先前超分辨率成像方法中的校準標準品。32可W如下所述進行實驗。[0110]矩形的DNA折權納米結構W3X420nm柵格顯示12個對接鏈。為了表明超分辨的標記，含有?Vk的成像劑鏈共價標記至僅在4個角的對接鏈。具體地，所有對接鏈都含有相同的9-nt序列a，而巧光標記的成像劑鏈含有兩個結構域：序列"a*"(基本上與V'互補，但含有?^修飾)和序列"b"。對于初始表征，每個視場僅分析一個DNA折權納米結構。如圖5中所圖示舉例說明，該實驗含有4個階段。（1)在定位階段，使用標準DNA-PAINT監測成像劑鏈與DNA折權納米結構上的對接鏈的結合。成像~10分鐘之后，可W確定并存儲DNA折權納米結構上的所有12個對接鏈的位置。（2)在R0I選擇階段中，用戶指定待在下一步驟中修飾的對接位點（即，在R0I中，目標區域）（表示為圓形）。（3)在標記階段中，無論何時成像劑鏈結合所研究的DNA折權納米結構上的對接鏈，將通過實時軟件程序迅速確定其定位，W決定其是否在角上。如果它是，則該軟件將觸發UV源的打開W誘導成像劑鏈和對接鏈之間的交聯。接下來，將遞送強激光脈沖W漂白交聯的成像劑鏈上的巧光團。將重復該過程，直到所有4個角都被成像劑鏈標記。（4)在分析階段中，洗掉初始成像劑鏈，并且添加具有序列"b*"的二級成像劑鏈。第二成像劑鏈將用于標準DNA-PAINT中W顯現交聯的初始成像劑鏈的位置。DNA折權納米結構的僅4個角被預期'亮起來'。[0111]軟件。該方法將通常使用軟件進行，所述軟件允許成像劑鏈的實時檢測、定位、選擇和交聯。合適的軟件滿足兩個要求。第一個要求是DNA-PAINT超分辨率圖像的實時檢測和處理。瞬時DNA-PAINT結合事件在定位階段過程中進行檢測和定位。作為該處理慣例的部分校正隨著時間的任何階段漂移W確保高分辨率成像和祀向。第二個要求是基于上述信息的實時選擇和反饋。運對于確保成像劑鏈結合至其各自對接鏈的短時間段過程中的成像劑鏈的交聯是必需的。該結合事件的瞬時性質要求順利整合和實時進行整個過程。應當盡可能減少由軟件計算循環引入的延遲W短于平均結合事件的持續時間（0.5-2秒），W確保成功的交聯。[0112]能夠快速且準確檢測和定位且實現最小的定位誤差的算法是已知的hW。運樣的算法提供了與要求高的超分辨率需求相容的理論上最佳的擬合精確度，并且還有效地使用GPU計算W加速處理速度W允許實時成像處理。漂移校正將基于追蹤由金納米顆粒和專口設計的核酸納米顆粒制成的漂移標志物。兩種方法的組合允許快速且精確的漂移校正，使得能夠高要求的超分辨率成像。在其中在光譜分開通道中實時監測新活化的祀標的情況下，也可W實施實時報道。然后可W將處理的定位匯集并擅染成超分辨的圖像，用于最終用戶實時查看和分析并決定祀標選擇用于后一活化步驟。該軟件還包括常規的從擅染圖像選擇目標區域(R0I)。[0113]硬件。為了提供指定結合寡核巧酸的實時位點特異性活化，使用具有快速轉換和照射面積控制的UV激光。激光轉換可W用具有<30ms轉換延遲的聲光可調諧濾光片(A0TF)快口來實施。激光照射可W用不受控制的全平面照射來實現。該方法在W期望圖案產生局部(巧皿)位點特異性標記或擾動中是有效的。作為一個實例，可W使用配備具有小于30ms轉換的A0TF快口的NikonTi顯微鏡系統。先前已經報道了與Nikon顯微鏡系統整合的成功嘗試[8]。[0114]為了實現更高效的大視場位點特異性圖案化，使用數字微鏡裝置(DMD)陣列W便在整場實現UV激光照射的并行轉換，如上所述。運樣的DMD陣列裝置提供了用于分割整個照射場的大像素陣列；定制控制在各像素是可能的，允許各像素進行ON或OFF轉換。運允許獨立控制各微陣列像素，同時在較大面積實現類似有效的操作和擾動。作為一個實例，可W使用AndorMOSAIC數字轉換平臺，因為其提供了在大1M像素陣列的基于像素的定制控制，并得到亞毫秒轉換延遲。[0115]替代固定化學。已經顯示光可裂解的接頭鄰硝基芐基和其許多衍生物與生物系統具有優異的相容性，運是由于來自反應物和產物的毒性最小。運些化合物已經用于各種各樣的生物應用中47'17'^。接頭的一些變體甚至可^用高強度可見光經由二光子效應裂解因此消除潛在誘變的UV照射。已經開發了方案W通過使用光可裂解的接頭、而不是光交聯劑來實現成像劑鏈的光誘導的固定（圖7)。此處，成像劑鏈假定為發夾結構，并在環中含有光可裂解的位點。當莖-環是完整的時，成像劑鏈可W經由短（~8-nt)立足點結合（圖7)、隨后等能鏈置換僅與對接鏈瞬時相互作用。當裂解環中的光可裂解的接頭時，鏈置換可W導致發夾的一個臂的不可逆解離。盡管在最終產品中成像劑鏈沒有共價連接至對接鏈，但其仍然穩定地雜交至對接鏈。[0116]動力學。DNA寡核巧酸結合時間可W在寬范圍（O.l-lOs)內靈活地調諧，具有約0.5-2S的典型值。當前的成像率通常為每帖100ms。基于當前的軟件處理速度的估計顯示可W在100ms內實現有效的擬合和處理，且可W在30ms內實現硬件通信和活化。WlW/cm2UV激光功率，交聯需要少于Is來完成。加在一起，運保證了化學活化將在結合事件發生之后<300ms的延遲內開始；因此，對于具有約2s的結合時間的寡核巧酸，運提供了足夠的時間（〉Is)用于交聯發生。[0117]特異性。通過確保結合事件在時間上彼此分離而保證修飾的特異性，使得因為兩次連續結合而不發生錯誤活化。可W如下實現特異性。DNA-PAINT結合亮時間（ON-時間）和暗時間（OFF-時間）均可W獨立且W寬動態范圍進行調諧。結合0N/0F即寸間比可W被調諧至足夠低，使得在各衍射受限區域中，閃爍的可能性低（<1/1〇)。運保證了活化的>90%正確性。在已經發生錯誤檢測和活化的事件中，我們可W利用光交聯化學的可逆性，并且使用類似的方法用于在312nmUV照射下分離寡核巧酸W。[011引3D中的操作-PAINT[0119]提出了在S維空間中的兩次操作-PAINT實施。一種適合于接近于表面的應用，而另一種適用于更深的3D穿透諸如全細胞或甚至組織應用。對于接近于蓋玻璃表面的操作-PAINT的應用，將使用基于像散性的3D超分辨率成像組合高度傾斜且層疊的光學片化IL0照明。運允許亞衍射檢測和隨后的操作-PAINT修飾用于~1WI1場深度應用。在基于像散性的單分子成像中，當失焦成像時，成像路徑中使用的圓柱形透鏡將分子的球形點擴散函數(PSFr轉化"為楠圓形PSF(圖8A)。[0120]楠圓形PSF的程度和取向取決于來自當前焦點成像平面的點源的位移和方向，并且用于W亞衍射精確度確定其Z位置（圖8B)。基于像散性的3D操作-PAINT的實施如下：由于檢測和驅動（即，使用UV脈沖固定DNA鏈用于交聯)依賴于僅單一探針結合且在衍射受限體素中被檢測(基于單分子的3D超分辨率顯微術的先決條件）的事實，可W使用3DDNA-PAINT技術[32'39]W便W目前在x、y中~5nm精確度和在Z中~lOnm將分子定位于該體素（~200x200x1000皿)中，確定結合是否發生于指定的5x5xlOnm體素中，并且如果結合發生，則W3D中的高精確度固定探針。亞衍射大小的3DDNA多面體結構可W用作對照，其中結構的所有頂點都攜帶相同的DNA-PAINT對接位點（圖8C)。表面固定之后，獲取3DDNA-PAINT圖像。可W定義四面體的頂點用于操作-PAINT修飾。本文描述的軟件可W容易地延伸用于實時3D檢測和驅動。[0121]對于更深的3D成像，TIRF或HILO照射不太適合于3DDNA-PAINT(和因此操作-PAINT),運是由于來自游離擴散成像劑鏈的增加平面外巧光，其惡化了有效定位單分子所必需的高信噪檢測比。為了克服該限制，旋轉盤共聚焦激光顯微術用于深穿透3D操作-PAINT，允許我們在幾十個微米(即，通過全細胞和潛在組織或小生物體)獲得亞衍射位點特異性3D標記。對于遠高于蓋玻璃表面的結構的成像，已經廣泛使用了共焦顯微鏡，因為其光學切片能力得到具有良好信噪比的圖像。近來，當使用自發閃爍巧光分子時，使用旋轉盤系統用于單分子超分辨率成像W。鑒于DNA-PAINT探針自主閃爍(無需光轉換）的事實，旋轉盤共聚焦的3D切片能力應當適用于本文提供的方法。實際地說，可W-次在~1WI1厚的Z-切片中使用旋轉盤共聚焦顯微鏡進行深度穿透3D操作-PAINT成像和標記。將通過如上所述的光學像散性成像獲得亞衍射超分辨率能力。[0122]細胞中的操作-PAINT[0123]進行兩項并發細胞研究。在第一項研究中，將納米級DNA探針附接至DM折權納米結構，所述DNA折權納米結構被錯定至固定細胞的表面或注射入細胞中且存在于細胞質或核中。在第二項研究中，操作-PAINT用于直接標記固定細胞中的蛋白質祀標(例如，W20nm的周期性間隔標記微管網絡）。[0124]DNA-PAINT細胞成像。已經表明使用DNA-PAINT的細胞結構的超分辨率成像[32]。此夕h已經使用DNA綴合的抗體成像固定化La細胞中的細胞骨架微管網絡（圖8a)。此外，光學像散性[22'W用于獲得固定化La細胞內的微管網絡的3D超分辨率圖像(圖9B;其中顏色指示高度）。[0125]附接至細胞表面或顯微注射入細胞的DM結構上的操作-PAINT。為了評估操作-PAINT在細胞環境的背景下的表現，對附接至細胞表面的DNA四面體上的單個指定點進行高精度DNA寡核巧酸修飾。經由使用預組裝的抗體DNA折權綴合物免疫標記過表達的表面受體(諸如EGFR)實現將DNA納米結構錯定至細胞表面（圖9C)。細胞錯定之后，使用超分辨率DNA-PAINT成像解析四面體結構的四個角。此處，類似于先前的體外實驗，使用含有兩個序列結構域的巧光標記的成像劑鏈進行DNA-PAINT成像。第一結構域是與四面體結構上的對接鏈互補的序列，且含有?^修飾。第二結構域是獨特的綴合柄，其在四面體結構的操作-PAINT納米修飾之后可得，其用于通過第二輪的DNA-PAINT表征性能。接下來，如本文所述的軟件和硬件組件，進行3D-操作-PAINTW便將成像劑鏈特異性附接至3D納米結構的單一、指定的頂點。使用第二輪的DNA-PAINT評估細胞表面上的納米結構修飾的性能。該實驗得到關于影響細胞性能的參數的信息。[0126]進行下一實驗W表明修飾固定細胞內的納米結構的能力（圖9D)。將DNA四面體納米顯微注射入固定細胞的核和細胞質中。使用DNA-PAINT顯現納米結構，并且使用操作-PAINT修飾特定的頂點。該實驗促進校準和減輕與獲得自細胞表面的參考結果的偏差(如果有的話）。[0127]標記細胞內蛋白質結構的操作-PAINT。在進一步實驗中，操作-PAINT用于實現固定細胞中的蛋白質的位點特異性標記。在一項實驗中，周期性標記微管網絡。通過使用具有DNA鏈的微管祀向的抗體綴合物將DNA鏈錯定于整個微管網絡上。獲取微管網絡的DNA-PAINT圖像之后，進行操作-PAINT，W便W用戶指定的圖案，例如，W周期性的20nm間隔，永久固定DNA探針（圖9E)。其后，通過DNA-PAINT成像圖案化微管結構W評估蛋白質修飾的性能。運些細胞實驗允許進一步優化參與細胞操作-PAINT的某些參數，包括選擇具有低非特異性結合的成像劑序列，激光功率，和最佳交聯所需的時間。在又另一項實驗中，DNA-PAINT用于W周期性圖案(例如，20nm柵格)標記細胞表面蛋白質簇。[0128]在一些情況下，用納米抗體替代全規模抗體，特別是當期望高密度成像時。在一些情況下，設計成像劑和對接鏈被，使得在^^1(交聯實施中，T或C存在于對接鏈DNA中的-1位置。預期運盡可能減少非特異性交聯。此外，為了消除可W導致含有?^的成像劑鏈與細胞自身的核酸的不期望的交聯的序列相似性，將針對細胞的基因組內容物篩選含有的成像劑鏈序列。[0129]應用[0130]本文提供的方法可W用于在單細胞水平分析蛋白質特異性相互作用。與使用限于遺傳可及的細胞隔室的小分子試劑的工程改造的基因標簽的先前方法(例如，APEX)W^36]相比，具有實時光學反饋的本文提供的方法允許任意標記和擾動圖案，其具有并入基于來自實時超分辨率成像數據的信息的最終用戶的決定的潛能。此外，該新方法可W在單細胞水平上進行，為最終用戶提供細胞特異性蛋白質組學信息和細胞行為的隨機波動的前所未有的知識。[0131]本文提供的方法也可W用于納米級光遺傳學中，包括在空間時間受控的單離子通道操作中。在研究神經元激發和活動水平的離子通道效應的先前方法已經被限制為僅基于批次的轉換，運是由于缺乏可超分辨率精度檢測和擾動離子通道行為的操作工具。使用分子擾動劑諸如lumitoxin[W，本文提供的方法提供了整合的工具集，其允許運些離子通道的超分辨率和分子特異性的顯現和操作。運將促進鑒定和描繪致密簇中各單離子通道的作用，并且使得能夠進一步研究其成簇排列的作用。[0132]下面將更詳細地描述運些應用。[0133]實現納米級單細胞空間蛋白質組學的操作-PAINT[0134]本實施例描述了用于納米級單細胞空間蛋白質組學的第一種方法。該方法特異性地捕獲和鑒定細胞中的用戶指定的位置的特定蛋白質及其相關伴侶。特異性捕獲和鑒定特定蛋白質祀標及其相關伴侶的能力使得能夠W位點特異性的方式詳細理解來自單細胞的蛋白質網絡結構。[0135]已經傳統上使用基于質譜(MS)的蛋白質組學解決描繪細胞中的蛋白質相互作用網絡，其被限制為可高得率和純度分離的細胞隔室。然而，許多細胞蛋白質相互作用難W純化，并且作為結果，某些蛋白質的"相互作用組"無法使用現有技術方法進行探索。更近的技術使得能夠使用工程改造的抗壞血酸過氧化物酶(APEX)作圖活細胞中的特異性蛋白質相互作用組W-W。然而，基于APEX-蛋白質網絡作圖獲得自來自大細胞群體、而不是來自單細胞的平均蛋白質相互作用。進一步，也已經假設某些蛋白質具有完全不同的相互作用蛋白質伴侶，運取決于它們的細胞功能，并且運些相互作用無法使用基于APEX-生物化學表征進行作圖。重要的是，用于基于遺傳標簽(諸如APEX)的位置特異性標記的方法限于遺傳可及的位置，并且無法實現任意用戶指定的位置選擇。相反，操作-PAINT使得用戶能夠在任意用戶指定的位置"抓住"蛋白質。[0136]納米級空間標記和捕獲。圖10A提供了運些方法的設計。在步驟1中，固定細胞，并且用綴合至對接鏈(序列a)的抗體標記祀蛋白質。在步驟2中，W~5nm的分辨率進行DNA-PAINT超分辨率成像（圖3F)。運允許W亞衍射分辨率空間鑒定祀蛋白質的位置。在步驟3中，使用操作-PAINT,將使用攜帶綴合柄(序列b)的成像劑鏈修飾R0I中的對接鏈(框）。在步驟4中，裂解細胞，并且使用與綴合柄b互補的鏈(b*)將內容物捕獲于成像室中，其允許分離目標蛋白質復合物。然后使用如下所述的單一蛋白質光學指紋分析法鑒定復合物中的蛋白質。可WW2D和3D實施進行實驗。[0137]經由超分辨率指紋分析的單一蛋白質鑒定。通過將DNA(用化學標簽修飾）附接至特定氨基酸殘基（例如，用NHS-醋化學附接至賴氨酸)和WDNA-PAINT超分辨率(2nm定位精確度)成像來實現"蛋白質指紋分析"。圖10B提供了運些方法的設計。在步驟1中，使用化學劑諸如SDS變性和拉伸從先前方法(上文)捕獲的蛋白質復合物。用另一種標簽特異性標記膚鏈中的所有賴氨酸殘基，所述另一種標簽包含DNA-PAINT柄，并且在該情況下包含點擊化學反應基團（諸如TC0)。可W使用其它綴合方式代替點擊化學反應基團。在步驟2中，將具有額外的點擊化學錯的拉伸膚鏈固定在用反作用點擊化學基團（諸如TZ)完全修飾的表面上。在步驟3中，用新標記的DNA-PAINT柄的超分辨率DNA-PAINT成像用于顯示所有賴氨酸殘基的位置，具有<2nm定位精確度。拉伸膚鏈中的所有鑒定的賴氨酸殘基的集合提供了膚序列中的賴氨酸分布的條形碼樣代表。特異性標記的殘基的組合多樣性允許獨特鑒定蛋白質(文庫大小〉1〇7)。在步驟4中，將該條形碼信息與來自全基因組測序的所有基因鑒定的蛋白質編碼序列的文庫進行比較和匹配，然后確定目前蛋白質的身份。[0138]用該方法，來自相同蛋白質復合物的蛋白質將是彼此接近的，并且可W與來自不同復合物的那些分開。也可W鑒定大蛋白質復合物內的各單一組分，并且將其與其基因序列直接匹配，而無需蛋白質組分的任何先前知識，并且不使用預先存在的針對各組分的抗體。可W用交換-PAINT進行多輪殘基特異性的條形碼成像便進一步鑒定具有類似條形碼的蛋白質，或研究特定特征，諸如憐酸化和翻譯后修飾圖案。[0139]應用于馬達蛋白質。先前工作已經確定，馬達蛋白質諸如肌球蛋白、驅動蛋白和動力蛋白具有完全不同的蛋白質相互作用網絡，運取決于它們與之相關的細胞載荷及其在細胞環境內的位置(例如，甚至當與相同載荷相關時。對于運些馬達蛋白質的大部分現有蛋白質相互作用作圖研究來自大量生物化學和一些單分子分析數據使用本文所述的技術，獨特的DNA柄可W附接至蛋白質祀標W促進單細胞內的不同細胞位置中存在的單獨馬達蛋白質復合物的拉下和蛋白質概況分析。一種合適的復合物是驅動蛋白-1馬達蛋白質的蛋白質相互作用組，因為使用其它先前系統對其進行廣泛研究，并且可W將結果與先前作為驗證獲得的結果進行比較。[0140]首先，固定哺乳動物細胞，并且經由預組裝的驅動蛋白-1抗體-DNA綴合物將DNA錯寡核巧酸附接至驅動蛋白-1馬達蛋白質。然后進行DNA-PAINT超分辨率成像，W對細胞內的所有驅動蛋白-1馬達蛋白質的細胞定位進行作圖。進一步，該實驗可用于研究驅動蛋白-1相互作用組與不同形式的細胞載荷(例如，mRNA、脂質、線粒體等）的相互作用。運可W通過進行多路DNA-PAINT成像和僅選擇與特定載荷類型共定位的那些驅動蛋白-1蛋白質來實現，并且存在于微管上，后一特征表明在活性細胞轉運的過程中的驅動蛋白-1。然后，如前所述，使用用光交聯或光裂解DNA堿基修飾的DNA，將獨特DNA柄附接至目標特定驅動蛋白-1蛋白質復合物，并且可W通過遵循上述方法來檢查其蛋白質相互作用組。通過理解驅動蛋白-1相互作用組中對于不同細胞位置中的相同載荷或對于相同細胞位置中的不同載荷的變化，將可能理解某些驅動蛋白-1適配子蛋白質諸如JIPl、Miro、Milton、FMRP等的特定生物功能KW。類似技術可W用于驅動蛋白超家族的其它成員或其它分子馬達(諸如肌球蛋白和動力蛋白）。[0141]在拉伸的膚鏈的各賴氨酸殘基上標記DNA-PAINT柄。可W用NHS醋化學實現賴氨酸特異性修飾。在一些情況下，特別是當潛在的擁擠性是問題時，NHS基團和DNA-PAINT柄之間可W包括長接頭。新近數據顯示，長度為約lOnm的接頭不會犧牲定位精確度(數據未顯示）。[0142]可W如下進行由賴氨酸殘基的可變定位編碼的可能文庫大小的估計。假設典型的蛋白質編碼膚鏈具有300個殘基。本文所述的成像能力允許向下定位至化m精確度(數據未顯示），其等于~10個膚鍵。將整個膚鏈分為10個膚鍵部分(300/10)導致產生約30個部分。如果賴氨酸存在，則各部分被指定為1，或者如果不存在賴氨酸，則各部分被指定為0。運樣的0或1指定，得到2^(或109)種不同的可能性。然而，在實踐中，蛋白質編碼序列中的賴氨酸分布為約7%，運意味著蛋白質內將平均存在21個賴氨酸殘基，運得到（30,21)=1.4義107種可能性。人基因組中的基因的目前估計數目低于100,000,運完全低于此處允許的文庫大小。[0143]在兩種蛋白質具有相似或相同的賴氨酸信號的事件中，可W用不同的殘基特異性的化學物，諸如例如半脫氨酸或精氨酸，經由交換-PAINT進行額外的篩選為了成像多輪不同的氨基酸信號，在DNA-PAINT寡核巧酸之前放置光可裂解的接頭，使得成像之后，可W通過UV光照射去除標記寡核巧酸。鑒于在膚鏈上允許的緊密空間，運允許化學修飾第二個氨基酸。[0144]不完全拉伸的膚序列可W潛在提供錯誤信號(諸如在鏈的中間的丟失區段），并且可W導致不正確的蛋白質身份分配。為了解決該問題，可W將氨基酸信號首先局部匹配，然后全局組裝。該方法既是計算更有效的（與整個序列匹配相比），其又提供錯誤拉伸序列的更多誤差耐受性。[0145]可W在整合的微流體裝置中實現整個操作-PAINT和蛋白質條形碼平臺。本發明考慮整合流平臺，其為蛋白質條形碼分析提供足夠的支持。[0146]實現納米級光遺傳學的操作-PAINT[0147]光遺傳學工具已經證明在神經科學中具有很大效用。運些分析技術通過遞送外源離子通道、隨后照射和離子轉運而引起細胞中的電壓變化WW。作為結果，它們不能用于分析內源離子通道對神經計算的影響。同時，越來越理解，內源離子通道的確切身份和分布對于神經計算是重要的。例如，樹突鐘通道可W精確雕刻神經活動傳播入神經元的不同隔室，并且在癒痛中，該興奮性控制可W被破壞，引起過度興奮WU。在神經元的某些子集中，如在軸突小丘，相對少量鋼通道的作用可W控制神經元是否生成和傳播操作電位因此，控制離子通道的小集合的能力在神經元如何整合來自上游神經元的神經輸入W生成尖峰、然后將其傳輸至下游神經元的研究中可具有很大效用。甚至單獨離子通道或單獨離子通道的集合的驅動或阻斷可具有很大效用。事實上，理論研究已經表明，由于單離子通道的閃爍影響導致的離散通道噪音，可對于內嗅皮層的某些星狀神經元中的慢闊值附近振蕩（slowperi-thresholdoscillations)是關鍵的[63]。不考慮單獨離子通道的隨機口控的模型比考慮的模型表現出更貧乏的神經動力學W3。另一個理論研究已經暗示，如果離子通道在特定大小的簇中操作，或者如果離子通道被認為概率性閃爍打開或關閉的離散實體(與僅被認為具有聚集動力學的協調群體相反），則離子通道噪音可W優化神經元將輸入編碼成尖峰的能力WS3。沒有先前的技術允許W時間精度阻斷或驅動單獨離子通道，因此離子通道口控的隨機性質可能如何有助于神經動力學的模型仍然未被探索。實驗性研究已經局限于通道的小子集，諸如巧通道，其中納米域的成像已經變得可能，表明在離子通道功率附近，大濃度的巧可W瞬時發生WW，并且通道成簇可W增強該過程事實上，巧通道可W在突觸連接競爭稀少"槽(slots)"，運意味著特定巧通道的身份可W在個體水平是重要的然而，除了巧通道的該特定情況W外，沒有研究單獨通道或小簇的通用方式已經變得顯而易見。[0148]本公開考慮使用操作-PAINTW首次實現納米級光遺傳學（即，W納米精度在用戶指定的位置精確控制單獨離子通道的活性的能力）。納米光遺傳學將允許W好得多的精度擾動和分析神經元功能，并且將有助于廣泛地實現神經元功能的真正的分子、而不是細胞、的理解。[0149]細胞膜和內部膜中的離子通道和受體經常WlOOnm的平均直徑分布于離散簇中。運些簇隨機分布于整個細胞膜，并且已知運些簇各自含有幾個至幾百個單獨離子通道W3。因此，為了描繪單離子通道的貢獻，需要能夠W納米精度W時間精確和可逆的方式活化或失活單獨離子通道的技術。[0150]近來，開發了新穎的蛋白質結構（lumitoxin),其能夠通過完全遺傳編碼和通過光活化而調節內源離子通道W3"Lumitoxin是包含兩個功能元件膚神經毒素和光受體L0V2-J的融合蛋白質，并且其充當目標蛋白質配體和膜之間的系鏈。在PC12細胞和Kv通道上使用lumitoxin和藍色(455nm)光，顯示大多數離子通道在黑暗狀態下被失活，并且在暴露于藍光幾秒內被活化。全細胞膜片錯記錄用于確定離子通道的活性。與藍光組合的Lumitoxin能夠控制離散離子通道簇，但不能調節單離子通道，因為藍色激光源不能破壞衍射屏障（~200nm)。[0151]在本公開中，lumitoxin用于控制首先體外、然后活哺乳動物細胞中的單獨離子通道的活性。先前的工作已經顯示成功純化和重構脂質體中的活性離子通道（TREK-1和TRPV3)且使用膜片錯記錄測量活性47。將在合成脂質體系統中進行納米級單離子通道操作的實驗（圖11A)。具體地，首先如先前所述連同蛋白質標簽(諸如SNAP)純化運些離子通道，并且將DNA錯寡核巧酸(經由06-芐基鳥嚷嶺）附接至單獨離子通道。作為下一步驟，在脂質小滴中重構純化蛋白質與DNA寡核巧酸，并且DNA-PAINT超分辨率成像用于理解每個蛋白質-脂質體的離子通道的確切位置和拷貝數然后，使用操作-PAINT,將偶聯至lumitoxin的DNA寡核巧酸置于單獨目標離子通道上。選擇性沉默單獨離子通道或測量單獨離子通道的活性(使用技術諸如單分子膜片錯FRET顯微術nu)之前和之后的膜片錯測量用于分析單獨離子通道的活性。[0152]也可W分析活細胞中的簇內的單一離子通道的貢獻。在一個實驗中，可W使用操作-PAINT活化用戶指定的通道W便向其遞送lumitoxin載荷（圖11B)。首先，使用基于DNA-PAINT的超分辨率成像(分辨率~5nm)確定簇內的單一離子通道的精確位置。然后，使用現有的膜片錯記錄或單分子膜片錯FRET顯微術，記錄整個離子通道簇的活性W-W。在此之后，鑒定目標單離子通道，并且使用操作-PAINT將偶聯至lumitoxin的DNA寡核巧酸置于該離子通道附近W失活該通道。下一步驟設及記錄離子通道簇的活性（同時用藍光失活祀向的離子通道)且將運樣的活性與先前的記錄進行比較。[0153]-種補充方法是驅動單一用戶指定的離子通道(圖11C)。首先，使用其中表達具有蛋白質標簽的目標離子通道的細胞，將DNA對接鏈附接至運樣的離子通道（與圖11B中類似）。然后，將DNA-lumitoxin附接至所述柄，使得每一離子通道具有蛋白質標簽對。偶聯至DNA-lumitoxin之后，使得所述通道失活，除非用藍光活化。現在，通過采用如圖11C中所述的方案，可W從單一離子通道選擇性去除lumitoxin，并且測量所述簇的活性W測定單一離子通道的貢獻。具體地，在步驟1中，操作-PAINT用于將（3*-4*)鏈綴合至連接至選擇的待活化的離子通道的鏈。在步驟2中，引入活化劑發夾;運將通過由"立足點"區段4起始的立足點介導的鏈置換反應僅特異性置換來自用步驟1中的鏈修飾的離子通道的DNA-lumitoxin。W該方式，將僅失活該具體離子通道。[0154]本文所述的納米級光遺傳學工具可用于例如研究離子通道的納米級空間調節對于精確信號整合和傳播的作用，W及離散離子通道噪音的微妙作用。[0155]參考文獻[0156][l]Rust,M.J.,Bates,M.,Zhuan邑，X.Stochasticopticalreconstructionmicroscopy(STORM)providessub-diffraction-1imitimageresolution.NatureMethods3(10),pp.793-795(2006).[0157][2]Sharonov,A.,Hochstrasser,R.M.Wide-fieldsubdiffractionimagingbyaccumulatedbindingofdiffusingprobes.PNAS103(50),pp.18911-18916(2006).[015引[3]Jungmann,R.,Steinhauer,C.,Scheible,M.,Kuzyk,A.,Tinnefeld,P.,Simmel,F.C.Single-moleculekineticsandsuper-resolutionmicroscopybyfluorescenceimagingoftransientbindingonDNAorigami.NanoLetters10，pp4756-4761(2010).[01日9][4]Yoshimura，Y.，Fujimoto，K.Ultrafastreversiblephoto-cross-linkingreaction:towardinsituDNAmanipulation.OrganicLetters10，pp.3227-3230(2008).[0160][5]Fujimoto,K.,Konishi-Hiratsuka,K.,Sakamoto,T.,Yoshimura,Y.Site-specificphotochemical民NAediting.ChemicalCommunications46，pp.7545-7547(2010).[0161][6]Shigeno，A.，Sakamoto，T.，Yoshimura，Y.，FujimotoK.Quickregulationofm民NAfunctionsbyafewsecondsofphotoirradiation.Organic&BiomolecularQiemistryl0，pp?7820-7825(20l2)?[0162][7]Fujimo，K.，Konishi"Hiratsuka，K.，Sakamoto，T.Quick,Selectiveandreversiblephotocross1inkingReactionbetween5-methylcytosineand3-cy過novinylc過rb過zoleinDNAdoublestr過nd.Intern過tion過1JournalofMolecularSciences14(3),pp.5765-5774(2013).[0163][8]Levskaya，A.，Weiner，0.D.，Lim，W.A.，Voigt，C.A.Spatiotemporalcontrolofcellsignallingusingalight-switchableproteininteraction.Nature461，pp.997-1001(2009).[0164][10]TexasInstruments(TI)(Posted:Aug.2012,Rev.Sept.2012)?('DLP9500:DLP?0.951080p2xLVDSTypeADMD.，'Retrieved(April20th，2013)from:<http:/7WWW.ti.com/lit/ds/dlps025a/dlps025a.pdf〉.[0165][lljHinrichsen'E.L.，Feder,J.，Ji0SS貧ng，T.Geometryofrandomsequentialadsorption.JournalofStatisticalPhysics44(5|6),pp.793-827(1986).[0166][12]Cadilhe，A.，Araujo，N.A.M.，Privman，V.民andomsequentialadsorption:fromcontinuumtolatticeandpre-patter打edsubstrates.JournalofPhysics:CondensedMatter19,065124(2007).[0167][13]Torquato，S.，Uche，0.U.，Stillinger，F.H.民andomsequentialadditionofhardspheresinhighEuclideandimensions.<arXiv:cond-mat/0608402>[0168][14]AndorTechnology(Andor)/'iXonEMCCDCameraSeriesRetrieved(November23^"^,2013)from:<http://www.andor.com/scientific-cameras/ixon-emccd-camer過-series〉.[0169][15]HamamatsuCorporation?"DigitalCMOScamera-〇RCA-Flash4?0V2Cl1440-22CU?，'Retrieved(November23rd,2013)from:<ht化：//www.hamamatsu.com/化/en/community/life_science_camera/product/search/Cl1440-22CU/index.html>.[0170][16]Pertsinidis，A.，Zhang，Y.，Chu，S.，Subnanometresingle-moleculelocalization,registrationanddistancemeasurements.Nature466，pp.647-651(2010).[0171][17]Piestun,民.，Schechner，Y.Y.，Shamir，J.Propagation-invariantwavefieldswithfiniteenergy.JournaloftheOpticalSocietyofAmericaA17,pp.294-303(2000).[0172][18]Betzig，E.，Patterson，G.H.'Sougrat，R.，Lindwasser，0.W.，01enych，S.，Bonifacino，J.S.，Davidson，M.W.，Lippincott-Schwartz，J.，Hess,H.F.Imagingintracellularfluorescentproteinsatnanometerresolution.Science313，pp.1642-1645(2006)?[0173][19]Pavani，S.R.P.'Thompson，M.A.，Biteen,J.S.'Lord's.J.，Liu，N.，Twieg,民.K.，Piestun,民.，Moerner，W.E.Three-dimensionalsingle-moleculefluorescenceimagingbeyondthediffractionlimitusingadouble-helixpointspreadfunction.PNAS106,pp.2995-2999(2009).[0174][20]Lee，H?D?，Sahl，S.J.，Lew,M.D.，Moerner，W.E.Thedouble-helixmicroscopesuper-resolvesextendedbiologicalstructuresbylocalizingsingleblinkingmoleculesinthreedimensionswithNanoscaleprecision.AppliedPhysicsLetters100(15),153701(2012).[0175][21]Backlund，M.P.，Lew，M.D.，Backer，A.S.，Sahl，S.J.，Grover，G.'Agrawal，A.，Piestun，民.，Moerner，W.E.Simultaneous，accuratemeasurementofthe3Dpositionandorientationofsinglemolecules.PNAS109,pp.19087-19092(2012).[0176][22]Huang，B.，Wang，W.，Bates，M.，Zhuang，X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