細胞培養基的制作方法

細胞培養基的制作方法
【專利摘要】本發明大體上涉及一種培養基，例如血清替代物、培養基補充物、完全培養基或低溫保存培養基，所述培養基包含基礎生理緩沖劑和包含膽固醇、卵磷脂以及脂肪酸的脂質體。預期與不使用本文中所描述的血清替代物培養的細胞相比，培養基提供改良的培養中細胞生長的優點。
【專利說明】
細胞培養基
[0001 ]本申請要求2013年12月20日提交的美國臨時專利申請第61/918,833號的優先權， 所述臨時專利申請W全文引用的方式并入本文中。
技術領域
[0002] 本發明大體上設及一種細胞培養基組合物，例如血清替代物、完全培養基或培養 基補充物，其包含熱力學穩定脂質體和液體基礎混合物W在無血清環境中培養細胞。預期 脂質體包含膽固醇和卵憐脂W及脂肪酸。也預期包含脂質體的低溫保存培養基，其用于在 冷凍期間保存細胞。
【背景技術】
[0003] 用于體外實驗或離體培養W投予人類或動物的細胞(例如哺乳動物細胞或昆蟲細 胞)培養為人類疾病研究和治療的一種重要工具。細胞培養廣泛用于生產各種生物活性產 品，如病毒疫苗、單克隆抗體、多膚生長因子、激素、酶W及腫瘤特異性抗原。然而，用于培養 細胞的許多培養基或方法包含可能對細胞生長和/或未分化細胞培養物的維持具有負面影 響的組分。舉例來說，哺乳動物或昆蟲細胞培養基常常補充有來自血液的血清，如小牛血清 (fetal calf se;rum;FCS)或胎牛血清（fetal bovine se;rum;FBS)，W便提供促進細胞在培 養物中增殖和生長的生長因子、載體蛋白、附著和擴散因子、養分W及微量元素。然而，在 FCS或FBS中發現的因子（如轉型生長因子（transforming growth factor;TGF)0或網膜酸） 可促進特定細胞類型分化化e等人，《美國病理學雜志(Am J Pathol.)》137:833-43，1990) 或引發細胞中可促進培養物中非所需細胞活性的不希望的下游信號傳導(Vel化oen等人， 《自然免疫學(Nat Immunol.)》7( 11 ):1151-6,2006)。
[0004] 血清組合物的非典型性和血清的批間差異使得無血清培養基中血清替代物和培 養物的使用為理想的(Pei等人，《男科學集刊(Arch An化〇1.)》49(5) :331-42,2003)。另外， 由于在向人體投予時潛在的病毒污染和/或動物蛋白的潛在免疫原性效應，因此對于在細 胞培養物中生長的用于治療用途的細胞、重組蛋白或疫苗來說，添加來源于動物的組分為 不希望的。
[0005] 已經研發血清替代物W嘗試最小化FCS對細胞培養的影響，W及最小化用于人類 細胞培養的動物蛋白的量。如KNOCKOUT?血清替代物（11^1付〇旨日11，化^36日(1，〔4)的血清替 代物稱為化學成分確定的培養基，其缺乏血清且含有用于細胞生長的基本養分和其它蛋白 質。由于缺乏附著因子，使得此調配物中細胞附著不充分，因此KNOCKOUT SR?無法用作飼養 細胞平板培養中的FBS的替代物。PC-1?無血清培養基化〇nza，Wa化ersville，MD)為在特殊 改性DMEM/F12培養基基礎中調配的低蛋白無血清培養基且含有具有已知量的膜島素、轉鐵 蛋白、脂肪酸W及專有蛋白質的完全肥PES緩沖系統。
[0006] Cellgro C0MPLETE?(Cellgro,Manassas，VA)為基于DMEM/F12、RPMI 1640W及麥 克柯伊氏(McCoy ' s)5A基礎培養基混合物的無血清低蛋白培養基。CelIgro COMPLETE?不含 膜島素、轉鐵蛋白、膽固醇、生長或附著因子，但包含微量元素和高分子量碳水化合物、附加 維生素、非動物蛋白源w及牛血清白蛋白的混合物。
[0007] 無血清培養基也描述于國際專利公開案第W02009023194號、國際專利公開案第 W02008137641號、國際專利公開案第W02006017370號、國際專利公開案第W02001011011號、 國際專利公開案第W02007071389號、國際專利公開案第W02007016366號、國際專利公開案 第W02006045064號、國際專利公開案第W02003064598號、國際專利公開案第W02001011011 號;美國專利公開案第US20050037492號、美國專利公開案第US20080113433號、美國專利公 開案第11520080299540號;美國專利第4,560,655號、美國專利第5,324,666號、美國專利第 6，162,643號、美國專利第6，103,529號、美國專利第6,048,728號、美國專利第7,709,229號 W及歐洲專利申請第EP2243827號中。
[0008] 美國專利7,220,538描述一種包含親脂性納米粒子和基礎營養培養基的細胞培養 基。

【發明內容】

[0009] 本發明提供一種包含基礎生理緩沖劑液體混合物和包含膽固醇、卵憐脂W及脂肪 酸的脂質體的培養基，其可用作血清替代物、完全培養基或培養基補充物。所述培養基適用 于促進初生細胞或細胞系在細胞培養物中存活、生長和增殖，其中所述培養基包含具有有 助于細胞維持和生長的脂質形態的脂質體。也預期包含脂質體的低溫保存培養基。
[0010] 在各種實施例中，本發明提供一種用于懸浮液或貼壁培養物中的細胞的培養基， 所述培養基包含:基礎生理緩沖劑液體混合物;和(a)包含膽固醇、卵憐脂W及脂肪酸的脂 質體，其中所述脂質體的量使得膽固醇在細胞懸浮液或貼壁培養物中的最終濃度為1毫克/ 升到20毫克/升，且其中卵憐脂在細胞懸浮液或貼壁培養物中的最終濃度為100毫克/升到 1000毫克/升;或(b)果膠;或(a)和(b)。
[0011] 在各種實施例中，脂質體包含脂質、脂肪酸、固醇和/或游離脂肪酸。示例性脂肪酸 包括(但不限于)次亞麻油酸、亞麻油酸、肉豆違酸、油酸肉豆違油酸、棟桐油酸、十六碳締 酸、反油酸、異油酸、反亞油酸、a-次亞麻油酸、二十碳四締酸、二十碳五締酸、芥子酸、二十 二碳六締酸、辛酸、癸酸、月桂酸、棟桐酸、硬脂酸、二十燒酸、二十二燒酸、二十四燒酸W及 蠟酸。在各種實施例中，脂質體包含一或多種由次亞麻油酸、亞麻油酸、肉豆違酸W及油酸 所構成的群組中選出的脂肪酸。
[0012] 在各種實施例中，脂質體進一步包含乙醇胺和聚山梨醇醋。在各種實施例中，脂質 體包含抗氧化劑。
[0013] 在各種實施例中，基礎生理緩沖劑液體混合物包含有機鹽、無機鹽、緩沖劑、鐵源 或鐵轉運體、甘油、氨基酸、維生素、糖W及微量元素中的一或多者。任選地，基礎生理緩沖 劑液體混合物包含抗氧化劑。
[0014] 在各種實施例中，鐵源或鐵轉運體是由W下各者所構成的群組中選出：轉鐵蛋白、 乳鐵蛋白、硫酸亞鐵、巧樣酸亞鐵、巧樣酸鐵、硝酸鐵、硫酸鐵、巧樣酸鐵錠、草酸鐵錠、反下 締二酸鐵錠、蘋果酸鐵錠W及下二酸鐵錠。
[0015] 在各種實施例中，基礎生理緩沖劑液體混合物包含一或多種由W下各者所構成的 群組中選出的氨基酸:甘氨酸丙氨酸精氨酸天冬酷胺、k天冬氨酸、k瓜氨酸、鹽 酸心半脫氨酸、k脫氨酸谷氨酸谷氨酷胺、k組氨酸異亮氨酸、k亮氨酸賴氨 酸、甲硫氨酸、鳥氨酸、苯丙氨酸、IH?氨酸a-絲氨酸、蘇氨酸a-色氨酸、酪氨 酸^及心鄉氨酸。
[0016] 在各種實施例中，基礎生理緩沖劑液體混合物包含一或多種由W下各者所構成的 群組中選出的有機鹽或無機鹽:憐酸鐘、氯化巧(無水）、硫酸銅、硝酸鐵、硫酸鐵、氯化儀(無 水）、硫酸儀(無水）、氯化鐘、氯化鋼、無水憐酸氨二鋼、憐酸二氨鋼、氯化錫、硫酸鋒W及碳 酸氨鋼。
[0017] 在各種實施例中，脂質體或基礎生理緩沖劑液體混合物包含一或多種抗氧化劑。 示例性抗氧化劑包括(但不限于)生育酪、生育S締酪、a-生育酪、0-生育酪、丫-生育酪、S- 生育酪、a-生育S締酪、0-生育S締酪、a-生育釀、水溶性維生素6(6-徑基-2,5,7,8-四甲基 色燒-2-甲酸）、下基化徑基甲氧苯（butylated hydroxyanisole ;BHA)、下基化徑基甲苯 (buty lated hy化owtoluene; BHT)、類黃酬、異黃酬、西紅柿紅素、0-胡蘿h素、砸、泛釀、梅 毒菌素、S-腺巧甲硫氨酸、谷脫甘膚、牛橫酸、N義酷半脫氨酸、巧樣酸、k肉堿、冊T、單硫代 甘油、抗壞血酸、沒食子酸丙醋、甲硫氨酸、半脫氨酸、高半脫氨酸、谷脫甘膚、脫胺和脫硫酸 (cysstathionine) W及甘氨酸-甘氨酸-組氨酸(=膚）。
[0018] 在各種實施例中，基礎生理緩沖劑液體混合物包含一或多種由W下各者所構成的 群組中選出的維生素：生物素、氯化膽堿、D-泛酸巧、葉酸、煙堿酷胺、鹽酸化唉醇、雙黃素 (bibof lavin)、鹽酸硫胺、維生素B12W及異肌醇。
[0019] 在各種實施例中，基礎生理緩沖劑液體混合物包含一或多種由W下各者所構成的 群組中選出的微量元素:砸、鋼酸鹽、銘、鉆、儀、鋒、銅、儘、領、嫁、裡、錫、鐵、漠、艦、饑、錯、 鋼、娃、鐵、氣、銀、鋼、錯、儒W及侶。在各種實施例中，液體混合物包含砸和鋼酸鹽。
[0020] 在各種實施例中，培養基為血清替代物、完全培養基、培養基補充物或低溫保存培 養基。
[0021] 在各種實施例中，用于細胞培養的血清替代物、完全培養基或培養基補充物包含 脂質體和基礎生理緩沖劑液體混合物。任選地，完全培養基或培養基補充物包含果膠。在各 種實施例中，血清替代物、完全培養基或培養基補充物進一步包含基礎生理緩沖劑液體混 合物，其包含一或多種有機鹽或無機鹽、鐵供體，且任選地包含果膠、甘油、氨基酸、維生素、 糖、有機鹽、無機鹽W及微量元素。
[0022] 在各種實施例中，本發明也提供包含脂質體和基礎生理緩沖劑液體混合物的血清 替代物、完全培養基或培養基補充物，其中脂質體包含卵憐脂、乙醇胺、次亞麻油酸、亞麻油 酸、膽固醇W及聚山梨醇醋，且基礎液體混合物包含至少一種有機鹽或無機鹽、至少一種 糖、甘油、至少一種微量元素、至少一種非離子表面活性劑W及至少一種鐵源。在各種實施 例中，脂質體或基礎液體混合物包含至少一種抗氧化劑。
[0023] 在各種實施例中，對于本文中所描述的血清替代物、完全培養基或培養基補充物， 脂質體的量使得膽固醇在細胞懸浮液或貼壁培養物中的最終濃度為1毫克/升到20毫克/ 升，且其中卵憐脂在細胞懸浮液或貼壁培養物中的最終濃度為100毫克/升到1000毫克/升。
[0024] 在各種實施例中，脂質體包含一或多種由次亞麻油酸、亞麻油酸、肉豆違酸W及油 酸所構成的群組中選出的脂肪酸。預期的額外脂肪酸包括(但不限于）肉豆違油酸、棟桐油 酸、十六碳締酸、反油酸、異油酸、反亞油酸、a-次亞麻油酸、二十碳四締酸、二十碳五締酸、 芥子酸、二十二碳六締酸、辛酸、癸酸、月桂酸、棟桐酸、硬脂酸、二十燒酸、二十二燒酸、二十 四燒酸w及蠟酸。
[0025] 在各種實施例中，脂質體進一步包含乙醇胺。在各種實施例中，脂質體進一步包含 聚山梨醇醋。預期聚山梨醇醋可為聚山梨醇醋20、聚山梨醇醋40、聚山梨醇醋60或聚山梨醇 醋80。示例性聚山梨醇醋包括TWEEN? 20和TWEEN愈80。
[0026] 在各種實施例中，一或多種有機鹽或無機鹽是由W下各者所構成的群組中選出： 憐酸鐘、氯化巧(無水）、硫酸銅、硝酸鐵、硫酸鐵、氯化儀(無水）、硫酸儀(無水）、氯化鐘、氯 化鋼、無水憐酸氨二鋼、憐酸二氨鋼、氯化錫、硫酸鋒W及碳酸氨鋼。在各種實施例中，液體 混合物包含氯化鋼、氯化鐘、憐酸鋼W及憐酸鐘。
[0027] 在各種實施例中，培養基進一步包含鐵源或鐵轉運體。在各種實施例中，鐵源或鐵 轉運體是由W下各者所構成的群組中選出:轉鐵蛋白、乳鐵蛋白、硫酸亞鐵、巧樣酸亞鐵、巧 樣酸鐵、硝酸鐵、硫酸鐵、巧樣酸鐵錠、草酸鐵錠、反下締二酸鐵錠、蘋果酸鐵錠W及下二酸 鐵錠。在各種實施例中，鐵源為巧樣酸鐵。在各種實施例中，鐵轉運體為轉鐵蛋白。
[00%]在各種實施例中，血清替代物進一步包含銅源或銅轉運體(例如G皿-Cu)。示例性 銅源包括(但不限于)氯化銅和硫酸銅。
[0029] 在各種實施例中，液體混合物包含一或多種由Pluronic-68(F68pastille)、 Pluronic-128、去水山梨醇、聚山梨醇醋W及嵌段共聚物所構成的群組中選出的非離子表 面活性劑。在各種實施例中，非離子表面活性劑為Pluronic-68(F68pastille)。
[0030] 在各種實施例中，每升培養基提供甘油在細胞培養物(例如細胞懸浮液或貼壁培 養物）中的最終濃度為約2微升/升到0.5毫升/升。
[0031 ]在各種實施例中，培養基提供果膠在細胞培養物(例如細胞懸浮液或貼壁培養物） 中的最終濃度為約0.25克/升到0.5克/升，或25毫克/升到500毫克/升。
[0032] 在各種實施例中，培養基提供砸在細胞培養物(例如細胞懸浮液或貼壁培養物）中 的最終濃度為約0.005毫克/升到0.050毫克/升。
[0033] 在各種實施例中，也預期血清替代物，其中來自脂質體的膽固醇在血清替代物中 的最終濃度為約10毫克/升到200毫克/升，且來自脂質體的卵憐脂在血清替代物中的最終 濃度為約50毫克/升到1克/升，或約1000毫克/升到10克/升。
[0034] 在各種實施例中，本發明提供一種完全培養基，其中來自脂質體的膽固醇在完全 培養基中的濃度為約1毫克/升到20毫克/升，且來自脂質體的卵憐脂在完全培養基中的濃 度為約100毫克/升到1000毫克/升。
[0035] 在各種實施例中，本發明提供一種培養基補充物，其中來自脂質體的膽固醇在培 養基補充物中的濃度為約100毫克/升到2000毫克/升或大于2000毫克/升，且來自脂質體的 卵憐脂在培養基補充物中的濃度為約10克/升到100克/升。
[0036] 在各種實施例中，本發明提供一種低溫保存培養基，其中來自脂質體的膽固醇在 低溫保存培養基中的最終濃度為約10毫克/升到200毫克/升，且來自脂質體的卵憐脂在低 溫保存培養基中的最終濃度為約1000毫克/升到10克/升。
[0037] 在各種實施例中，脂質體為納米粒子。在各種實施例中，納米粒子具有范圍為約50 納米到500納米，約100納米到約300納米或約100納米到200納米的平均直徑。
[0038] 本文提供脂質體為熱力學穩定的。在各種實施例中，脂質體在水溶液中為穩定的 (例如不沉淀）。在各種實施例中，脂質體在水溶液中在37°C、25°C、4°C、0°C或-20°C下穩定 至少7天、10天、14天、21天、30天、2個月、3個月、6個月或1年或大于1年的時間段。示例性水 溶液包括(但不限于）水、緩沖生理鹽水和其它平衡鹽溶液、基礎細胞培養基W及完全細胞 培養基。
[0039] 本文也提供一種細胞低溫保存培養基，其包含脂質體、基礎生理緩沖劑液體混合 物W及任選的果膠。
[0040] 本文也預期一種細胞低溫保存培養基，其包含基礎生理緩沖劑液體混合物和果 膠。
[0041 ]在各種實施例中，在低溫保存培養基中，果膠在細胞懸浮液中的最終濃度為約 0.25克/升到5克/升，或250毫克/升到5000毫克/升或約50毫克/升到5克/升。
[0042] 在各種實施例中，本文中所描述的低溫保存培養基進一步包含甘油。在各種實施 例中，當使用低溫保存培養基時，甘油在細胞懸浮液中的最終濃度為約0.2毫升/升到5毫 升/升。
[0043] 在各種實施例中，低溫保存培養基進一步包含脂質體，其中脂質體包含膽固醇、卵 憐脂W及脂肪酸，其中脂質體的量使得膽固醇在細胞懸浮液中的最終濃度為約10毫克/升 到200毫克/升，且其中卵憐脂在細胞懸浮液中的最終濃度為約1克/升到10克/升。
[0044] 在各種實施例中，低溫保存培養基進一步包含二甲亞諷(dimethyl sulfoxide; DMSO)，其中DMSO在低溫保存培養基中的濃度小于或等于4%。在各種實施例中，DMSO的濃度 為 4%、3%、2%、1%或0.5%。
[0045] 在各種實施例中，低溫保存培養基進一步包含聚賴氨酸。在各種實施例中，聚賴氨 酸為改性聚賴氨酸。在各種實施例中，聚賴氨酸為e-聚-k賴氨酸。在某些實施例中，聚賴氨 酸包含簇化胺基。在各種實施例中，聚賴氨酸的最終濃度為約10%、9%、8%、7%、6%、5%、 4%、3%、2%、1%或0.5%。
[0046] 在各種實施例中，在添加到細胞培養物前，將血清替代物或培養基補充物添加到 基礎培養基。標準基礎培養基在所屬領域中已知且可購得。此類培養基的實例包括(但不限 于）杜爾貝科氏改性伊格爾培養基（Du化ecco's Modified Eagle's Medium;DMEM)、DMEM F12、伊斯寇氏改性達爾伯克培養基（Iscove's Modified Du化ecco's Medium)、漢姆氏養 分混合物F-10(化m's Nutrient mix1:ure F-10)(漢姆氏F-10(化m's F-10))或漢姆氏F- 12、羅斯威爾帕克紀念學會培養基（Roswell Park Memorial Institute Medium;RPMI)、 MCDB 131、克里克氏培養基(Click's medium)、麥克柯伊氏5A培養基、培養基199、威廉姆氏 培養基E(William's Medium E)W及如格雷斯氏培養基（Grace's medium)和TNM-即的昆蟲 培養基。
[0047] 運些培養基中的任一者任選地補充有鹽、氨基酸、維生素、緩沖劑、核巧酸、抗生 素、微量元素W及葡萄糖或等效能量來源。也可包括所屬領域的技術人員已知的適當濃度 的其它任選的補充物。培養基補充物為所屬領域中眾所周知且可購得，且更詳細描述于具 體實施方式中。
[004引在各種實施例中，更預期血清替代物本身包含如上文所描述的基礎培養基和補充 物的要素，例如鹽、氨基酸、維生素、緩沖劑、核巧酸、抗生素、微量元素、抗氧化劑W及葡萄 糖或等效能量來源，W使得血清替代物W無血清完全培養基形式提供。
[0049]在各種實施例中，培養基不含動物組分。
[0050] 在各種實施例中，脂質體負載有本文中所描述的基礎液體混合物。更預期脂質體 負載有在細胞培養中有利的其它組合物。在細胞培養中有利的示例性組合物包括(但不限 于)緩沖劑、鐵轉運體、游離脂肪酸、生長膚(例如膜島素、包含甘氨酸-組氨酸-賴氨酸=聚 體的GHK膚）、氨基酸(必需和非必需）、維生素、微量元素、抗氧化劑和/或鹽。
[0051] 在各種實施例中，本發明提供一種培養細胞的方法，其包含在完全培養基或含有 本文中所描述的血清替代物或培養基補充物的培養基中培養細胞。
[0052] 在各種實施例中，細胞在由哺乳動物細胞和昆蟲細胞所構成的群組中選出。在各 種實施例中，細胞自哺乳動物個體分離。在各種實施例中，細胞為原始培養物或細胞系。在 各種實施例中，細胞是由W下各者所構成的群組中選出：多能性干細胞、胚胎干細胞、骨髓 基質細胞、造血祖細胞、淋己干細胞、骨髓干細胞、T細胞、B細胞、巨隧細胞、肝細胞、膜腺細 胞W及細胞系。
[0053 ] 預期的哺乳動物細胞系包括（但不限于）CH0、CH0K1、DXB-11、DG-44、CH0/-DHFR、 CV1、C0S-7、肥K293、B服、TM4、VER0、肥LA、MDCK、B化 3A、W138、Hep G2、SK-Hep、MMT、TRI、MRC 5、FS4、T細胞系（例如化rkat)、B細胞系（例女日8146、6胖36、〔446、51486^及船116、1?曰占-1、 化malvaW及Daudi)、3T3、RIN、A549、PC12、K562、l：)ER.C6度、SP2/0、NS-0、U20S、HT1080、 L929、融合瘤、癌細胞系W及所屬領域中眾所周知的其它細胞系。預期的昆蟲細胞系包括 (但不限于）Sf9、Sf21、HIGHFIVE?、EXPRESSF+及、S2、l'n5、TN-368、BmN、Schneider2、D2、 C6/36W及KC細胞。
[0054] 在各種實施例中，本發明涵蓋一種低溫保存細胞的方法，其包含使細胞懸浮在本 文中所描述的低溫保存培養基中，所述低溫保存培養基任選地包含果膠或任選地包含脂質 體，且將細胞置于小于8°C的環境中。低于8°C的示例性溫度包括(但不限于)溫度處于或低 于 4 °C、0°C、-20°C、-70°C、-135 °C 或在液氮(-196 °C)中。
[0055] 在各種實施例中，所述方法進一步包含使細胞解凍且將其置于如本文所描述的培 養基中。
[0056] 在各種實施例中，解凍后，當置于本文中所描述的培養基時，無論用作血清替代 物、培養基補充物或完全培養基，至少30 %的冷凍細胞仍然有活力。在各種實施例中，解凍 后細胞的存活率為約40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%或高于80%。
[0057] 在一個實施例中，WlO毫升、50毫升、100毫升、500毫升或1升的體積封裝培養基 (血清替代物、培養基補充物、完全培養基或低溫保存培養基）。在一個相關實施例中，將血 清替代物、培養基補充物或低溫保存培養基封裝于1 X、5X、10X或20X溶液中。
[005引也提供一種制造本文中所描述的脂質體的方法。在各種實施例中，制造脂質體的 方法包含將所需量的膽固醇溶解于非甲醇或非氯仿溶液中。在各種實施例中，將膽固醇溶 解于液體憐脂溶液中。在各種實施例中，在室溫下膽固醇混合在非甲醇或非氯仿溶液中，或 在非甲醇或非氯仿溶液中加熱，直到膽固醇成溶液。溶液可加熱到約35°C、40°C、45°C、50 °C、55°C或60°C，且不超過80°C。一旦成溶液，將W下組合物添加到膽固醇組合物且混合:聚 山梨醇醋、乙醇胺W及脂肪酸。將最終混合物儲存在4°C、0°C或-20°C下。任選地，混合膽固 醇溶液，隨后添加殘余化合物。
[0059]在各種實施例中，預期如本文所描述的某些培養基組合物或脂質體組合物促進改 良的細胞培養，例如相比于包含不同組的組分的培養基或脂質體組合物，細胞生長增加、細 胞存活率增加或重組蛋白質表達增加。預期那些促進改良的細胞培養的培養基或脂質體組 合物用于進一步實驗。
[0060] 應理解本文中所描述的各特征或實施例或組合為本發明方面中任一者的非限制 性、示例性實例，且因此，打算與本文中所描述的任何其它特征或實施例或組合可組合。運 些類型實施例中每一者為特征的一個非限制性實例，所述特征打算與本文中所描述的任何 其它特征或特征組合進行組合而不必列出每個可能的組合。此類特征或特征組合適用于本 發明方面中的任一者。當掲露落在范圍內的數值實例時，預期運些實例中任一者為一個范 圍的可能端點，預期在所述端點之間的任何和所有數值，且預想上端點與下端點的任何和 所有組合。
【附圖說明】
[0061] 圖1展示相比于可商購的美國食品藥物管理局(抑A)認可的無血清培養基，本文中 描述的血清替代物對所刺激脾細胞的影響。
[0062] 圖2A和圖2B展示相比于在包含胎牛血清的培養基中的脾細胞培養，本文中所描述 的血清替代物對所刺激脾細胞生長的影響。
[0063] 圖3A展示與培養基加 FBS相比，血清替代物加生長因子將誘發更大程度的細胞增 殖。圖3B展示相比于FBS，當用血清替代物培養細胞時，增殖中的實驗內差異減小。
[0064] 圖4A展示歷經3天培養，相比于在培養基加 FBS中培養的細胞，血清替代物加生長 因子中的細胞培養減少細胞死亡水平。圖4B展示相比于包含FBS的培養基，當用含血清替代 物的培養基培養細胞時，細胞調亡的實驗內差異減小。
【具體實施方式】
[0065] 本發明提供一種包含基礎生理緩沖劑液體混合物和包含膽固醇、卵憐脂W及脂肪 酸的脂質體的培養基，其中培養基可為血清替代物、完全培養基或培養基補充物組合物，其 用于體外細胞培養W便提供類似在胎牛血清細胞(FBS)中生長的生長而沒有FBS對細胞生 理機能所貢獻的非特定副作用。血清替代物、完全培養基或培養基補充物提供一種包含生 理學相關濃度的膽固醇和卵憐脂與脂肪酸組合的脂質體W使得在血清替代物、完全培養基 或培養基補充物中的脂質體向細胞提供一個類似于血漿膜的環境。任選地，完全培養基、血 清替代物或培養基補充物包含果膠。也提供一種包含脂質體和/或果膠的低溫保存培養基。 本文的培養基(血清替代物、完全培養基、培養基補充物或低溫保存培養基)組合物提供優 于在含FBS培養基中或在無血清培養基中進行細胞培養的優勢。
[0066] 如本說明書和所附權利要求書中所使用，除非上下文明確規定，否則不定冠詞"一 (a)"和"一(an)" W及定冠詞"所述(the)"包括復數W及單數指示物。
[0067] 術語"約(about)"或"大約（approximately)"意指由所屬領域的技術人員確定的 可接受特定值誤差，其在某種程度上視所述值如何測量或測定而定。在某些實施例中，術語 "約"或"大約"意指在1、2、3或4個標準偏差內。在某些實施例中，術語"約"或"大約"意指在 給定值或范圍的 30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、 0.5%或 0.05%內。
[006引如本文中所使用，"培養基(media)"或"細胞培養基（cell culture media)"是指 提供細胞生長、存活或儲存的水溶液類溶液。如本文中預期的培養基可補充有如實施方式 中描述的養分W促進培養基中所培養的細胞的所需細胞活性，如細胞存活率、生長、增殖、 分化。如本文所使用的培養基包括血清替代物、培養基補充物、完全培養基或低溫保存培養 基。
[0069] 如本文所使用，"血清替代物(serum replacement)"或"血清替代物培養基(ser皿 r邱lacement media)"是指可與基礎培養基結合使用或用作完全培養基W便促進培養物中 細胞生長和生存的組合物。在各種實施例中，血清替代物作為典型地添加到體外細胞培養 的培養基中的任何血清的替代物用于基礎或完全培養基中。預期血清替代物包含蛋白質和 用于培養物中細胞生長和生存的其它因子。在各種實施例中，在用于細胞培養前，將血清替 代物添加到基礎培養基。在各種實施例中，更預期血清替代物可包含基礎培養基和基礎養 分，如鹽、氨基酸、維生素、微量元素、抗氧化劑等，W使得血清替代物適用作用于細胞培養 的無血清完全培養基。
[0070] 如本文所使用，"基礎培養基（basal media/base media/base medium)"或"基礎 營養培養基(base nutritive media)"是指基礎鹽養分或鹽和其它要素的水溶液，其向細 胞提供正常細胞代謝所必需的水和某些大量無機離子，且維持細胞內和細胞外滲透平衡。 在各種實施例中，基礎培養基包含至少一種碳水化合物作為能量來源，和/或緩沖系統W維 持培養基在生理pH范圍內。可商購基礎培養基的實例包括（但不限于）憐酸鹽緩沖鹽水 (phosphate buffered saline;PBS)、杜爾貝科氏改性伊格爾培養基(DMEM)、最低必需培養 基（Minimal Essential Medium;MEM)、伊格爾基礎培養基（Basal Medium Eagle ;BME)、 RPMl 1640、漢姆氏F-10、漢姆氏F-12、a-最低必需培養基(aMEM)、格拉斯哥氏最低必需培養 基（Glasgow's Minimal Essential Medium;G-MEM)、伊斯科夫氏改性杜爾貝科氏培養基 (Iscove's Modified Dulbecco's Medium)或經改性用于多能細胞的通用培養基，如X- VIVO(Lonza)或造血干細胞基礎培養基。基礎培養基可補充有如實施方式中更詳細描述的 養分。
[0071] 如本文中所使用，"完全培養基(complete media)"是指進一步包含可促進細胞生 長的額外補充物(如生長因子、激素、蛋白質、血清或血清替代物、微量元素、糖、抗生素抗氧 化劑等）的基礎培養基。舉例來說，可商購完全培養基包含補充物，如乙醇胺、谷脫甘膚(還 原型）、抗壞血酸憐酸醋、膜島素、人類轉鐵蛋白、富含脂質牛血清蛋白、微量鹽、亞砸酸鋼、 偏饑酸錠、硫酸銅W及氯化亞儘(DMEM ADVANCED?培養基，Life Technologies)。
[0072] 如本文中所使用，"培養基補充物(media supplement)"是指在細胞培養前添加到 基礎培養基的試劑或組合物。培養基補充物可為對培養物中細胞生長有利的試劑，如生長 因子、激素、蛋白質、血清或血清替代物、微量元素、糖、抗生素、抗氧化劑等。典型地，培養基 補充物為所需補充物的濃縮溶液，其稀釋成完全或基礎培養基W達到適用于細胞培養的最 終濃度。
[0073] 如本文所使用，"低溫保存培養基(CTyopreservation media)"是指適于在處于或 低于8°C溫度(包括處于或低于4°C、0°C、-20°C、-70°C、-135°C或在液氮(-196°C)中的溫度） 下將細胞懸浮儲存或冷凍的培養基。
[0074] 如本文所使用，"果膠(pectin)"是指來源于植物細胞壁的結構性雜多糖，其分子 量為30,000道爾頓(Da)到250,000道爾頓。果膠主要由a-1-4鍵聯半乳糖醒酸殘基構成。在 某些實施例中，果膠醋化，例如55%、60%、65%、70%、75%或高于75%醋化，且可為高醋果 膠或低醋果膠。在各種實施例中，果膠對巧敏感。巧敏感果膠能夠與巧相互作用形成凝膠， 而非巧敏感果膠不能。預期果膠在pH 4.5-6.9范圍內的酸性溶液內或pH7.5到10范圍內的 堿性溶液內，視所用果膠類型而定。任選地，果膠在抑范圍7.0-7.4的溶液中。使用所屬領域 中的常識和技能，可測定在不同pH水準下使用的果膠，且在所需pH水準下使用的果膠受果 膠的醋化程度或巧敏感性影響。
[0075] 通過商業來源供應果膠，且其可來自具有果膠的任何植物，如梨、蘋果、番石惱、冥 護、李子、醋栗、相橘和其它相枯類水果、樓桃、葡萄W及草替。具有不同醋化（甲基化)度和 巧敏感性的果膠組合物描述于W0 2000008952中，其W引用的方式并入本文中。
[0076] 如本文中所使用，"脂質體(liposomeT是指包含包圍內部水溶液空間的外脂質雙 層或多層膜的封閉結構。脂質體可為多層或單層。預期脂質體的尺寸在直徑5微米到10微米 到納米粒子尺寸范圍內。在某些實施例中，脂質體納米粒子直徑為約50納米到500納米，約 100納米到300納米或約100納米到200納米。
[0077] 如本文所使用，"液體基礎混合物（liquid base mix)"或"基礎生理緩沖劑液體混 合物(base physiological buffer liquid mix)"是指血清替代物或培養基補充物的基礎 液體溶液，其中脂質體懸浮W形成細胞培養基組合物。在各種實施例中，更預期將液體基礎 混合物裝載入脂質體W使得當與細胞培養物中的細胞融合/由細胞吸收時，脂質體向細胞 傳遞一定量的液體基礎混合物。在各種實施例中，本文中預期液體基礎混合物或基礎生理 緩沖劑液體混合物為基礎培養基、完全培養基或生理緩沖溶液，如憐酸鹽緩沖鹽水(PBS)和 其它平衡鹽溶液，其可與脂質體和/或本文中其它組分結合使用來形成血清替代物、完全培 養基、培養基補充物或低溫保存培養基。
[0078] 如本文所使用，"改良的細胞培養"是指相比于使用不包含脂質體的血清替代物或 無血清培養基的細胞培養，當使用本文中所描述的培養基組合物(血清替代物、完全培養基 或培養基補充物)培養時，細胞增殖增加、細胞生長增加、細胞死亡減少或細胞的蛋白質產 生（重組型或內源性）增加。使用所屬領域中眾所周知的方法，包括生長曲線分析、刺激指 數、錐蟲藍微觀評估、氣化胸巧(?)、增殖分析、MTT分析、刃天青類分析W及DNA梯度變化分 析來測量增殖增加、生長增加和細胞死亡變化。使用所屬領域中已知的技術，包括量化總蛋 白質或mRNA，或定量相關特定蛋白質的含量，測量細胞的蛋白質產生(重組型或內源性)增 加。
[0079] 如本文中所使用，"無動物組分"是指其中組分不來源于動物的組合物。預期組分 W重組方式產生或來源于植物或其它來源，而非直接自動物分離。如本文中所使用，無動物 組分允許培養基組分在動物類細胞系中重組產生。
[0080] 培養基組合物
[0081] 先前已描述包含脂質組分和脂質體的細胞培養基用于細胞培養，但成就有限。舉 例來說，Hams等人（《美國國家科學院院刊（Proc化tl Acad USA)》78:5588-92，1981)掲露 在包含不同脂質組分(例如包含膽固醇、卵憐脂或純化卵憐脂、銷憐脂W及維生素E的脂質 體)的培養基中培養人類纖維母細胞。然而，Hams描述脂質體不穩定，因為其需要在使用的 24小時內制備，且展示在完全培養基中僅使用脂質體不促進細胞生長。Spens等人(《生物技 術進展(Biotechnol Prog)》21:87-95,2005)描述在尤其進一步包含膽固醇、環糊精、卵憐 月旨、維生素E、巧樣酸鐵、Pluronic和氨基酸的無蛋白質培養基中培養NSO骨髓瘤細胞。Spens (前述)描述脂質自溶液W高水平沉淀（引用Keen等人，《細胞技術學(切totechnology)》17 (3):203-11,1995)0
[0082] 制造脂質體的方法在所屬領域中已知，包括用于制造多層小泡（具有一系列同屯、 雙層脂質）的液體水合或溶劑小球制備，用W制備單層小泡(具有單層脂質）的衛生設備、法 式壓制、溶劑注入、清潔劑去除、逆相蒸發、巧誘發融合、微流體化或凍融方法。
[0083] 脂質體制備描述于美國專利7，220，538號、美國專利第6，217，899號；美國專利公 開案第20100021531號；Lichtenbe;rg等人,《生物化學分析方法(Methods Biochem Anal.)》 33 : 337-462,1988; W及G .Gregoriadis :《脂質體技術脂質體制備和相關技術化iposome Technology Liposome Preparation and Related Techniques)》，第2片反，第I-III卷，CRC Press。用于醫藥用途的脂質體已掲露于Mozafari M,《脂質體、方法和方案化iposomes. Methods and Protocols)》第1 卷，第2章，V.Wessing編2010,Humana Press。
[0084] 在各種實施例中，本發明提供一種用于懸浮液或貼壁培養物中的細胞的培養基， 所述培養基包含基礎生理緩沖劑液體混合物和(a)包含膽固醇、卵憐脂W及脂肪酸的脂質 體，其中所述脂質體的量使得膽固醇在細胞懸浮液或貼壁培養物中的最終濃度為1毫克/升 到20毫克/升，且其中卵憐脂在細胞懸浮液或貼壁培養物中的最終濃度為5毫克/升到100毫 克/升;或(b)果膠;或(a)和化）。
[0085] 在各種實施例中，培養基為血清替代物、培養基補充物或完全培養基。在各種實施 例中，本發明提供一種包含脂質體和基礎生理緩沖劑液體混合物，任選地包含果膠的細胞 低溫保存培養基，其中脂質體包含膽固醇、卵憐脂W及脂肪酸。在各種實施例中，脂質體的 量使得膽固醇在細胞懸浮液中的最終濃度為1毫克/升到20毫克/升，且其中卵憐脂在細胞 懸浮液中的最終濃度為5毫克/升到100毫克/升。
[0086] 在各種實施例中，本發明提供一種包含基礎生理緩沖劑液體混合物和果膠的低溫 保存培養基。
[0087] 脂質體可為多層或單層。預期脂質體的尺寸在直徑5微米到10微米到納米粒子尺 寸范圍內。在一些實施例中，脂質體為納米粒子。在某些實施例中，納米粒子具有范圍為約 50納米到500納米，約100納米到約300納米，或約100納米到200納米的平均直徑。可使用所 屬領域中已知的方法，包括使用Zetasizer (Malvern Instruments , Uni ted Kingdom)測量 脂質體尺寸，其通過動態光散射方法將粒度測量為整個粒子的平均直徑值。
[0088] 在各種實施例中，脂質體包含脂質、脂肪酸、固醇和/或游離脂肪酸。在各種實施例 中，脂質體包含為細胞生長提供更加生理相關環境的濃度的膽固醇和卵憐脂W及脂肪酸。 血清替代物、完全培養基或培養基補充物組合物中的脂質體組分的示例性最終濃度闡明于 表1中。
[0089] 表1
[00901
[0091] 在各種實施例中，血清替代物脂質體包含最終濃度為約10毫克/升到200毫克/升、 25毫克/升到175毫克/升、50毫克/升到150毫克/升、60毫克/升到120毫克/升、20毫克/升到 100毫克/升、30毫克/升到90毫克/升、40毫克/升到80毫克/升或50毫克/升到70毫克/升的 膽固醇。在各種實施例中，血清替代物脂質體包含最終濃度為約50毫克/升、約55毫克/升、 約60毫克/升、約65毫克/升、約70毫克/升或約75毫克/升的膽固醇。
[0092] 在各種實施例中，血清替代物中脂質體的量使得膽固醇在細胞懸浮液或貼壁培養 物中的最終濃度為1毫克/升到20毫克/升，且其中卵憐脂在細胞懸浮液或貼壁培養物中的 最終濃度為5毫克/升到100毫克/升或100毫克/升到1000毫克/升。
[0093] 在各種實施例中，脂質體包含一或多種脂肪酸。示例性脂肪酸包括(但不限于)次 亞麻油酸、亞麻油酸、肉豆違酸、油酸、肉豆違油酸、棟桐油酸、十六碳締酸、反油酸、異油酸、 反亞油酸、a-次亞麻油酸、二十碳四締酸、二十碳五締酸、芥子酸、二十二碳六締酸、辛酸、癸 酸、月桂酸、棟桐酸、硬脂酸、二十燒酸、二十二燒酸、二十四燒酸W及蠟酸。在各種實施例 中，血清替代物脂質體包含最終濃度為約0.5毫克/升到5毫克/升、0.75毫克/升到4毫克/ 升、1毫克/升到3毫克/升、0.5毫克/升到3毫克/升、0.5毫克/升到2毫克/升或1毫克/升到2 毫克/升的脂肪酸。在各種實施例中，血清替代物脂質體包含最終濃度為約0.5毫克/升到5 毫克/升的亞麻油酸或次亞麻油酸。
[0094] 在各種實施例中，血清替代物脂質體包含最終濃度為約0.5毫克/升到50毫克/升、 1毫克/升到50毫克/升、2.5毫克/升到40毫克/升、5毫克/升到35毫克/升、10毫克/升到30毫 克/升或15毫克/升到25毫克/升的乙醇胺。在各種實施例中，乙醇胺在血清替代物中的最終 濃度為約1毫克/升、2.5毫克/升、5毫克/升、10毫克/升、15毫克/升、20毫克/升、25毫克/升、 30毫克/升、35毫克/升、40毫克/升、45毫克/升或50毫克/升。
[00M]在各種實施例中，脂質體進一步包含聚山梨醇醋。在某些實施例中，聚山梨醇醋為 聚山梨醇醋20、聚山梨醇醋40、聚山梨醇醋60或聚山梨醇醋80。示例性聚山梨醇醋包括 TWEEN海20或TWEEN⑧80。預期聚山梨醇醋在血清替代物中的最終濃度在約100微升/升 與1000微升/升之間，200微升/升到800微升/升，300微升/升到700微升/升或400至化00微 升/升。在各種實施例中，聚山梨醇醋在血清替代物中的最終濃度為約500微升/升。
[0096] 上文所描述的關于血清替代物組合物的最終濃度可用作計算培養基補充物或完 全培養基中的組分濃度的基礎。各別組分在培養基補充物中的最終濃度為用于血清替代物 組合物中的最終濃度的10倍。各別組分在完全培養基中的最終濃度為用于血清替代物中的 最終濃度的1 /10。示例性濃度闡明于表1和表2中。
[0097] 更預期W大于5 X或10 X的稀釋度使用血清替代物。在各種實施例中，Wl:5、l: 10、1:15、1:20、1:25、1:50、1:100、1:200、1:250、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、 1:900、1:1000、1:1500或1:2000的稀釋度使用血清替代物。
[0098] 對于低溫保存培養基，組分的起始濃度與用于血清替代物培養基的濃度相同，即， 為用于完全培養基濃度的10倍濃度。然而，低溫保存培養基無需稀釋或僅在最低稀釋度下 即可使用，使得組分的最終濃度與起始濃度大約相等。舉例來說，在各種實施例中，對于低 溫保存培養基，膽固醇在細胞懸浮液中的最終濃度為10毫克/升到200毫克/升，且卵憐脂在 細胞懸浮液中的最終濃度為50毫克/升到1克/升，或1000毫克/升到10克/升。
[0099] 預期當用于完全細胞培養基溶液中時，盡管高濃度的膽固醇和卵憐脂存在于用于 血清替代物或培養基補充物中的脂質體中且考慮到長期暴露于水溶液，本文中所描述的脂 質體在水溶液中為熱力學穩定的。本發明提供本文中所描述的具有如表1中闡明的組分最 終濃度的脂質體在水溶液中為穩定的（例如不沉淀）。在各種實施例中，脂質體在水溶液中 在37°(：、25°(：、4°(：、0°(：或-20°(：下穩定至少7天、10天、14天、21天、30天、2個月、3個月、6個月 或1年或大于1年的時間段。示例性水溶液包括(但不限于)水、緩沖生理鹽水和其它平衡鹽 溶液、基礎細胞培養基W及完全細胞培養基。本發明脂質體組合物的優勢為其含有生理學 相關含量的固醇和脂肪酸，此提供極佳生長增效而在若干天后不自溶液沉淀，所述優勢已 在包含高含量如膽固醇和卵憐脂的試劑的其它培養基中觀察到（Spens等人、Keen等人，前 述)。
[0100] 預期培養基的液體基礎混合物組分包含果膠、甘油、砸和鐵源中的一或多者。任選 地，液體基礎混合物進一步包含氨基酸、維生素、糖、無機鹽、抗氧化劑W及微量元素。類似 于上文所描述的脂質體復合物，在其中制造脂質體的液體基礎混合物可W用于血清替代 物、培養基補充物或完全培養基的不同濃度制造。示例性最終濃度闡明于表2中。
[0101] 表2 「01021
[0103] 在各種實施例中，甘油在血清替代物中的最終濃度為約0.02毫升/升到5毫升/升 (L)，或0.05毫升/升到4毫升/升、0.1毫升/升到3毫升/升、0.5毫升/升到2.5毫升/升或1暈 升/升到2毫升/升。在各種實施例中，甘油在血清替代物中的最終濃度為約0.02毫升/升、 0.05毫升/升、0.1毫升/升、0.25毫升/升、0.5毫升/升、1.0毫升/升、1.5毫升/升、2毫升/升、 2.5毫升/升、3毫升/升、3.5毫升/升、4毫升/升、4.5毫升/升或5毫升/升D
[0104] 在各種實施例中，果膠在血清替代物中的最終濃度為約0.25克/升到5克/升、0.5 克/升到4克/升、1.5克/升到3克/升或1克/升到2克/升。在各種實施例中，果膠在血清替代 物中的最終濃度為約0.25克/升、0.5克/升、0.75克/升、1克/升、1.5克/升、2克/升、2.5克/ 升、3克/升、3.5克/升、4克/升、4.5克/升或5克/升。
[0105] 示例性無機鹽包括(但不限于)憐酸鐘、氯化巧(無水）、硫酸銅、硝酸鐵、硫酸鐵、氯 化儀(無水）、硫酸儀(無水）、氯化鐘、碳酸氨鋼、氯化鋼、無水憐酸氨二鋼、憐酸二氨鋼、氯化 錫W及硫酸鋒。示例性有機鹽包括(但不限于)碳酸氨鋼或肥PES。
[0106] 示例性糖包括(但不限于)右旋糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖W及運些糖的多聚 體。
[0107] 示例性抗氧化劑包括(但不限于)生育酪、生育立締酪、a-生育酪、0-生育酪、丫 -生 育酪、S-生育酪、a-生育s締酪、(6-生育S締酪、a-生育釀、水溶性維生素6(6-?基-2,5,7, 8-四甲基色燒-2-甲酸）、下基化徑基甲氧苯(BHA)、下基化徑基甲苯(BHT)、類黃酬、異黃酬、 西紅柿紅素、e-胡蘿h素、砸、泛釀、梅毒菌素、S-腺巧甲硫氨酸、谷脫甘膚、牛橫酸、N-乙酷半 脫氨酸、削i酸、k肉堿、BHT、單硫代甘油、抗壞血酸、沒食子酸丙醋、甲硫氨酸、半脫氨酸、 高半脫氨酸、谷脫甘膚、脫胺和脫硫酸W及甘氨酸-甘氨酸-組氨酸(=膚）。
[010引示例性微量元素包括(但不限于)銅、鐵、鋒、儘、娃、鋼酸鹽、鋼、饑、儀、錫、侶、銀、 領、漠、儒、鉆、銘、巧、二價陽離子、氣、錯、艦、鋼、錯或砸。額外微量金屬掲露于W0 2006/ 004728 中。
[0109] 在各種實施例中，培養基或液體基礎混合物包含鐵源或鐵轉運體。示例性鐵源包 括(但不限于)鐵鹽和亞鐵鹽，如硫酸亞鐵、巧樣酸亞鐵、巧樣酸鐵、硝酸鐵、硫酸鐵;鐵錠化 合物，如巧樣酸鐵錠、草酸鐵錠、反下締二酸鐵錠、蘋果酸鐵錠W及下二酸鐵錠。示例性鐵轉 運體包括(但不限于)轉鐵蛋白和乳鐵蛋白。
[0110] 在各種實施例中，培養基或液體基礎混合物或脂質體包含一或多種如上文所描述 的基礎培養基和補充物的要素，例如鹽、氨基酸、維生素、緩沖劑、核巧酸、抗生素、微量元 素、抗氧化劑W及葡萄糖或等效能量來源，W使得培養基能夠用作無血清完全培養基。
[0111] 在各種實施例中，培養基或液體基礎混合物進一步包含銅源或銅轉運體（例如 GHK-化）。示例性銅源包括(但不限于)氯化銅和硫酸銅。
[0112] 在各種實施例中，鐵源或銅源W在約0.05納克/毫升到250納克/毫升、0.05納克/ 毫升到100納克/毫升、約0.05納克/毫升到50納克/毫升、約0.05納克/毫升到10納克/毫升、 約0.1納克/毫升到5納克/毫升、約0.5納克/毫升到2.5納克/毫升或約1納克/毫升到5納克/ 毫升范圍內的最終濃度添加到血清替代物培養基。更預期鐵源或銅源在血清替代物中的最 終濃度為約0.05納克/毫升、0.1納克/毫升、0.25納克/毫升、0.35納克/毫升、0.45納克/毫 升、0.5納克/毫升、0.6納克/毫升、0.7納克/毫升、0.8納克/毫升、1納克/毫升、1.5納克/毫 升、2納克/毫升、2.5納克/毫升、3納克/毫升、4納克/毫升、5納克/毫升、6納克/毫升、7納克/ 毫升、8納克/毫升、9納克/毫升或10納克/毫升。
[0113] 上文所描述的關于血清替代物組合物的培養基或液體混合物中的組分的最終濃 度可用作計算培養基補充物或完全培養基中組分濃度的基礎。各別組分在培養基補充物中 的最終濃度為用于血清替代物組合物中的最終濃度的10倍。各別組分在完全培養基中的最 終濃度為用于血清替代物中的最終濃度的1/10。
[0114] 關于低溫保存培養基，預期用于血清替代物的起始濃度范圍與預期用于低溫保存 培養基的起始濃度范圍相同。然而，低溫保存培養基無需稀釋或僅在最低稀釋度下即可使 用，使得組分的最終濃度與起始濃度大約相等。舉例來說，在低溫保存培養基的各種實施例 中，果膠在細胞懸浮液中的最終濃度為約0.25克/升到5克/升、0.5克/升到4克/升、1.5克/ 升到3克/升或1克/升到2克/升。
[0115] 在各種實施例中，脂質體負載有有利于細胞培養的組分。有利于細胞培養的示例 性組合物包括(但不限于)鐵轉運體、游離脂肪酸、生長膚（例如膜島素、包含甘氨酸-組氨 酸-賴氨酸S聚體的G皿膚）、氨基酸（必需和非必需）、維生素、微量元素、抗氧化劑W及鹽。 在各種實施例中，預期脂質體負載有額外乙醇胺和游離脂肪酸。
[0116] 在各種實施例中，將血清替代物或培養基補充物添加到基礎培養基。標準基礎培 養基為細胞培養領域中已知且可購得。基礎培養基的實例包括(但不限于)杜爾貝科氏改性 伊格爾培養基(DMEMKDMEM F12(l:l)、伊斯寇氏改性達爾伯克培養基、漢姆氏養分混合物 F-10或F-12、羅斯威爾帕克紀念學會培養基(RPMIKMCDB 131、克里克氏培養基、麥克柯伊 氏5A培養基、培養基199、威廉姆氏培養基EW及如格雷斯氏培養基和TNM-FH的昆蟲培養基。
[0117] 也預期本文中所描述的血清替代物和培養基補充物用于可商購無血清培養基。示 例性無血清培養基包括（但不限于）AIM-V化ife Technologies,Carlsbad，CA)、PER-C6 (Life Technologies ,Carlsbad,CA)、Knock-0ut?(Life Technologies)、SlcmPrc):及'(Life Technologies)、CdlGro?(Corning Life Sciences-Mediatech Inc. ,Manassas ,VA) 〇
[0118] 運些培養基中的任一者任選地補充有鹽(如氯化鋼、巧、儀W及憐酸鹽）、氨基酸、 維生素、緩沖劑(如皿PES)、核巧酸（如腺巧和胸巧）、抗生素（如慶大霉素(gentamicin)藥 物）、微量元素(定義為通常W在微摩爾范圍內的最終濃度存在的無機化合物）、抗氧化劑W 及葡萄糖或等效能量來源。也可包括所屬領域的技術人員已知的適當濃度的任何其它必要 的補充物。如溫度、pH值等的培養條件將為所屬領域的技術人員所顯而易見。
[0119] 預期培養基組合物呈單元形式封裝。在一個實施例中，W10毫升、50毫升、100毫 升、500毫升或1升的體積封裝培養基(血清替代物、培養基補充物、完全培養基或低溫保存 培養基）。在一個相關實施例中，將血清替代物、培養基補充物或低溫保存培養基封裝于1 X、5X、10X或20X溶液中。
[0120] 細胞培養
[0121] 預期本文中所描述的培養基，例如血清替代物、培養基補充物、完全培養基或低溫 保存培養基適用于細胞體外培養，較佳適用于體外充分生長典型地需要血清補充物或明確 培養基的細胞。此類細胞包括真核細胞(如哺乳動物細胞)和昆蟲細胞。預期得益于使用血 清替代物、完全培養基或培養基補充物的哺乳動物細胞包括(但不限于)倉鼠、猴、黑猩猩、 狗、貓、母牛/公牛、豬、小鼠、大鼠、家兔、綿羊W及人類細胞。昆蟲細胞包括來源于草地粘蟲 (Spodoptera frugiperda)(毛蟲）、埃和斑蚊（Aedes aegypti)(蚊子）、白蚊伊蚊（Aedes albopictus)(蚊子）、黑腹果蛹（Drosophila melanogaster)(果蛹）W及家蠶（Bombyx mori)的細胞。
[0122] 預期經血清替代物、完全培養基或培養基補充物培養或經低溫保存培養基冷凍的 細胞為不朽化細胞(細胞系)或非不朽化(初級或次生)細胞，且可為在體內發現的多種細胞 類型中的任一者。示例性細胞類型包括(但不限于)纖維母細胞、角質細胞、上皮細胞、卵巢 細胞、內皮細胞、膠質細胞、神經細胞、血液成形成分(例如淋己細胞、骨髓細胞）、軟骨細胞 和其它骨來源細胞、肝細胞、膜腺細胞W及運些體細胞類型的前驅細胞。
[0123] 在各種實施例中，預期用于培養基的細胞自哺乳動物個體分離。自哺乳動物個體 分離的細胞包括(但不限于）多能干細胞、胚胎干細胞、骨髓基質細胞、造血祖細胞、淋己干 細胞、骨髓干細胞、淋己細胞、T細胞、B細胞、巨隧細胞、內皮細胞、膠質細胞、神經細胞、軟骨 細胞和其它骨來源細胞、肝細胞、膜腺細胞、體細胞類型的前驅細胞W及任何癌瘤或腫瘤來 源細胞。
[0124] 在各種實施例中，細胞為細胞系。示例性細胞系包括(但不限于）中國倉鼠卵巢細 胞，包括C冊K1、DXB-11、DG-44 W及C冊/-DHFR;猴腎CV1、C0S-7;人胚腎化EK) 293;幼倉鼠腎 細胞(BHK);小鼠塞特利氏（sertoli)細胞(TM4);非洲綠猴腎臟細胞(VER0);人類子宮頸癌 細胞化ELA);犬類腎臟細胞(MDCK);布法羅(buffalo)大鼠肝臟細胞(B化3A);人類肺細胞 (W138);人類肝癌細胞化ep G2; SK-胎P);小鼠乳房腫瘤(MMT); TRI細胞;MRC 5細胞;FS4細 胞；T細胞系（Jurkat)、B細胞系、小鼠 3T3、RIN、A549、PC12、K562、PE及.C6⑩、SP2/0、NS-0、 U20S、HT 1080、L929、融合瘤、腫瘤細胞W及不朽化初生細胞。
[0125] 示例性昆蟲細胞系包括（但不限于）Sf9、Sf21、HIGHFIVE?、EXP民ES邸+啜、S2、 Tn5、TN-368、BmN、Schne ider 2、D2、C6/36 W 及KC細胞。
[01%]額外細胞類型和細胞系掲露于WO 2006/004728中，其W引用的方式并入本文中。 運些細胞包括（但不限于）CD34+造血細胞和骨髓譜系細胞、293胚胎腎臟細胞、A-549、 Jurkat、化ma 1 wa、皿LA、293BHK細胞、胎La子宮頸上皮細胞、PER-C6視網膜細胞(PER. C6)、 MDBK(NB^I)細胞、911細胞、CRFK細胞、MDCK細胞、BeWo細胞、張氏細胞（Chang ce 11)、 Detroit 562細胞、HeLa 229細胞、HeLa S3細胞、Hep-G2細胞、KB細胞、LS 180細胞、LS 174T 細胞、NCI-H-548細胞、RPMI 2650細胞、SW-13細胞、T24細胞、WI-28VA1 3、2RA細胞、WI甜細 胞、BS-C-I細胞、LLC-MK2細胞、克隆M-3細胞、1-10細胞、RAG細胞、TCMK-I細胞、Y-I細胞、 LLC-PK1細胞、PK(15)細胞、GH1細胞、GH3細胞、L2細胞、LLC-RC 256細胞、MH1C1細胞、XC細 胞、MD0K細胞、VSW細胞、TH-I、B1細胞或其衍生物;來自任何組織或器官(包括(但不限于）屯、 臟、肝臟、腎臟、結腸、腸、食道、胃、神經組織（大腦、脊髓）、肺、血管組織（動脈、靜脈、毛細 管）、淋己組織(淋己腺、腺樣增殖體、扁桃體、骨髓W及血液）、脾、纖維母細胞W及纖維母細 胞類細胞系）的纖維母細胞、TRG-2細胞、IMR-33細胞、Don細胞、G皿-21細胞、瓜氨酸血癥細 胞、登普西細胞（Dempsey cell)、De1:;roi1:55l細胞、Detroit 510細胞、Detroit 525細胞、 Detroit 529細胞、Detroit 532細胞、Detroit539細胞、Detroit 548細胞、Detroit 573細 胞、皿L 299細胞、MR-90細胞、MRC-5細胞、WI-38細胞、WI-26細胞、MiCll細胞、CV-I細胞、 C0S-I 細胞、C0S-3 細胞、C0S-7 細胞、VER0 細胞、DBS-Fr化-2 細胞、BALB/3T3 細胞、F9 細胞、SV- T2 細胞、M-MSV-BALB/3T3 細胞、K-BALB 細胞、BL0-I1 細胞、N0R-I0 細胞、C3H/I0TI/2 細胞、 HSDM1C3細胞、KLN205細胞、麥克柯伊細胞、小鼠L細胞、株系2071 (小鼠L)細胞、L-M株系（小 鼠 U 細胞、L-MTK(小鼠 L)細胞、NCTC 克隆體2472 和 2555、SCC-PSA1 細胞、NS0、NSl、Swiss/3T3 細胞、印度鹿細胞、SIRC細胞、化細胞、延森細胞(Jensen 〇611)、0)5細胞、和592/0細胞、模 擬細胞和/或其衍生物。
[0127] 本文中預期的細胞培養條件可經調整W適于適用于生長細胞的任何培養基質。具 有適合表面的基質包括組織培養孔、培養瓶、滾瓶、可透氣容器、平面或平行板生物反應器 或細胞培養器。也預期其中細胞附著到懸浮保存于攬拌槽容器中的微載體或粒子的培養條 件。
[0128] 細胞培養方法通常描述于《動物細胞的培養:基礎技術手冊(Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique)》，第6版，2010(1?.1.化6311]1巧編，胖;[1巧&50]13);《細 胞培養的一般技術（General Techniques of Cell Culture)》（M.A.化rrison和I.F.Rae, Cambridge Univ.Press) 及《胚胎干細胞：方法和方案（EmbiTonic Stem Cells:Methods and Protocols)》化.Turksen編,Humana Press)。其它參考文獻文本包括《創造高效能培養 物（Creating a High Performance Culture)》（A;roselli,Hu《研究發展進程 (Res .Dev .Pr.)》1996)和《生長限制化imits to Growth)》（D .H. Meadows等人，Uni verse Publ. 1974)。組織培養用品和試劑為技術人員眾所周知且可購得。
[0129] 應了解，將細胞W適合于與血清替代物、完全培養基或培養基補充物一起使用的 特定細胞系或分離細胞類型的密度置于具有培養物中。在某些實施例中，細胞X 103個 細胞/毫升、5 X 103個細胞/毫升、1 X 104個細胞/毫升、5 X 104個細胞/毫升、1 X 105個細胞/ 毫升、5X 105個細胞/毫升、1 X 106個細胞/毫升或5X 106個細胞/毫升培養。
[0130] 在各種實施例中，預期本文中所描述的培養基用作低溫保存培養基。低溫保存是 指細胞或組織儲存在小于8°C的環境中，其允許細胞長期儲存且可處于低于8°C的任何溫度 下，包括處于或低于4°(：、0°(：、-20°(：、-70°(：、-135°(：或在液氮(-196°(：)中的溫度。用含膽堿 鹽和薦糖的培養基低溫保存細胞的方法掲露于美國專利5,985,538中。額外低溫保存組合 物和方法掲露于美國專利7,935,478和美國專利7,112,576中。預期本文中所描述的低溫保 存培養基可進一步包含W下試劑中的一或多者:二甲亞諷(DMS0)、甘油、乙二醇、聚乙二醇、 丙二醇、糖(如薦糖、右旋糖、海藻糖、果膠）、蛋白質、碳水化合物(如徑基乙基淀粉化y化oxy ethyl starch;肥S))、聚葡萄糖和/或聚賴氨酸。在各種實施例中，低溫保存培養基包含脂 質體和/或果膠。
[0131] 在各種實施例中，解凍后，當置于本文中的培養基時，無論用作血清替代物、培養 基補充物或完全培養基，至少30%細胞仍然有活力。在各種實施例中，解凍后細胞的存活率 為 40%、50%、60%、65%、70%、75%、80% 或高于 80%。
[0132] 測量在低溫保存后存活率的額外分析包括(但不限于)干細胞菌落形成單位的測 定、細胞倍增時間和增殖的測定、MTT分析、刃天青分析W及所屬領域用W測量細胞存活率 和生長的其它分析。
[0133] 在各種實施例中，預期如本文所描述的某些培養基組合物或脂質體組合物促進改 良的細胞培養，例如相比于包含不同組的組分的培養基或脂質體組合物，細胞生長增加、細 胞存活率增加或重組蛋白質表達增加。預期那些促進改良的細胞培養的培養基或脂質體組 合物用于進一步實驗。
[0134] 在各種實施例中，已證明包含具有抗氧化劑的脂質體的血清替代物培養基支持細 胞在培養物中生長增加。運個結果與展示抗氧化劑維生素E或a-生育酪抑制培養物中的細 胞生長的先前研究形成對比。
[0135] 試劑盒
[0136] 本發明更提供一種包含如本文所描述的培養基(例如血清替代物、培養基補充物、 完全培養基或低溫保存培養基)和使用說明書的試劑盒。在各種實施例中，培養基為血清替 代物、培養基補充物或低溫保存培養基，且試劑盒提供適用于產生完全培養基的基礎培養 基和/或附加因子。在各種實施例中，培養基封裝在標簽貼附到容器的容器中，或包括于描 述組合物用于體外、體內或離體用途的包裝中。示例性容器包括(但不限于)容器、小瓶、管、 安飯、瓶、燒瓶等。更預期容器經調整W適于封裝液體或冷暖形式的培養基，例如血清替代 物、培養基補充物或低溫保存培養基。預期容器由所屬領域中眾所周知的材料制成，包括 (但不限于)玻璃、聚丙締、聚苯乙締W及其它塑料。在各種方面中，組合物W單位劑型封裝。 試劑盒任選地包括一種適用于組合血清替代物、培養基補充物或低溫保存培養基與基礎培 養基，且或者組合培養基與附加生長因子的裝置。在各種方面中，試劑盒含有描述培養基用 于細胞培養或低溫保存用途的標簽和/或說明書。
[0137] 本發明血清替代物的額外方面和細節將自W下實例顯而易見，所述實例意圖為說 明性而非限制性的。
[013引實例1
[0139] 示例性脂質體血清替代物組合物
[0140] 下文描述本文中預期的制造示例性脂質體和血清替代物培養基的方法。適用于血 清替代物的組分闡明于表3和表4中。在所述表中列出的組分不打算限制，而是證明脂質體 復合物在血清替代物中的功效。表3闡明脂質體組合物的示例性組分。任選地，脂質體復合 物可包含Tw旅n數(例如50微升/升）。
[0141] 表3
[0142]
[0143] 為制成脂質體，將700微升乙醇置入1.5毫升微量離屯、管，且將250微升:PHOSAL? 53添加到乙醇。將50毫克膽固醇添加到PHOSAL見混合物且加熱到50°C直到膽固醇成溶 液。使混合物滿旋（V0RTEXGENIE皮,Scientific Industries Inc. ,Bohemia,NY)10秒，歷 經20秒到30秒增量，直到溶液為透明班巧色(短暫滿旋且將脂質混合物放回，進行加熱且重 復直到其成溶液）。任選地，將50微升Tween某20添加到脂質混合物且滿旋。將乙醇胺添加到 混合物且滿旋。隨后，添加如亞麻油酸和次亞麻油酸的脂肪酸且通過滿旋混合。最終脂質混 合物儲存在暗處4°C下。
[0144] 血清替代物也包含與上文所描述的脂質混合物組合的基礎培養基液體混合物。在 一個實施例中，基礎培養基液體混合物包含W下組分:果膠、氯化鋼(化C1)、右旋糖、氯化鐘 化C1)、憐酸鋼(化出P〇4)、憐酸鐘化也P〇4)、砸、鋼酸鹽、巧樣酸鐵、甘油W及pluronic。基礎 液體混合物的一個示例性實施例描述于表4中。
[0145] 表4 「01461

[0147] ~將右旋糖、果膠W及化Cl混合成粉末且緩慢添加到600毫升再蒸饋水（double distilled water;dd出0)。將氯化鐘、憐酸鋼W及憐酸鐘粉末添加到果膠-NaCl溶液且混合 直到成溶液。砸、鋼酸鹽W及巧樣酸鐵在憐酸鹽緩沖鹽水(PBS)中稀釋且混合直到成溶液。 添加甘油，且使用1N化0H使溶液pH到7.2。將Pluronic添加到溶液且體積用d地2〇增加到1 升。
[0148] 為組合脂質和液體混合物，隨后將1毫升脂質混合物在10毫升血清替代物基礎液 體中混合。經由低粘結過濾器孔徑(例如0.22微米)過濾脂質混合物。將10毫升基礎培養基 混合物置入100毫升無菌容器。將脂質混合物緩慢滴入10毫升基礎培養基，同時例如使用滿 旋，且隨后震蕩瓶來滿旋10毫升基礎培養基且劇烈混合。任選地，使脂質體混合物經過微流 化床，其將有助于制造均勻尺寸化的納米脂質體。為制得較大體積溶液，將10毫升脂質體混 合物緩慢滴入990毫升液體混合物，同時滿旋基礎培養基W達到1升溶液。
[0149] 實例2
[0150] 脂質體血清替代物促進細胞生長和存活
[0151] 為證明實例1中描述的血清替代物促進細胞的細胞生長和增殖的能力，在包含血 清替代物的儲備液培養基中培養分離自小鼠的初生細胞或細胞系。
[0152]如先前所描述，脾細胞自預先用憐酸脂蛋白（phospholipop;rotein;F>LP)139-151 免疫接種的S化小鼠分離(McRae等人，《實驗醫學雜志(J Exp Med.)》182( 1): 75-85，1995)， 且將在D M E M + 1 0 %血清替代物中的細胞生長與在可商購無血清培養基AIM - V⑥ (Invitrogen，Carlsbad CA)中的生長相比較。將5X105個細胞于200微升生長培養基中置 于96孔板中，且在3天后測量回應PLP139-15U0微克/毫升、0.5微克/毫升、5微克/毫升或50 微克/毫升)再刺激的脾細胞增殖程度。圖1展示在DMEM+10%血清替代物中的細胞培養與無 血清培養基相比產生顯著更大的增殖。也比較脾細胞在含FBS的DMEM或DMEM+10%血清替代 物中的生長。圖2A展示無論受刺激還是未受刺激，在DMEM+10%FBS中培養的細胞均增殖，刺 激指數低，而DMEM+10%血清替代物中培養的脾細胞的數目加倍。圖2B表示第二增殖分析， 其中脾細胞在DMEM+10 % FBS或DMEM+10 %血清替代物中培養。圖2B展示在DMEM/10 % FBS中 培養的細胞具有高于3的刺激指數，而在DMEM/10%血清替代物中培養的細胞具有略低于3 的刺激指數。有趣的是，圖2A和圖2B中的數據展示在DMEM/10 %血清替代物中的細胞培養與 在DMEM/FBS中的細胞培養相比提供一致的增殖結果，即使在未受刺激細胞群體中其也可產 生非特定增殖。相比于在FBS中培養，本文中所描述的血清替代物提供更一致、可再生的細 胞培養條件，其可具有細胞刺激特性且可引起具有內部批間差異的細胞刺激。
[0153] 除了原生細胞培養外，測定血清替代物對細胞系生長的影響。單獨在漢姆氏(F12) 或含10 %血清替代物的漢姆氏培養基中培養中國倉鼠卵巢(化inese hams ter ovary; C冊） 細胞(5 XIO5個，在96孔板中），且測量細胞生長和存活率。在漢姆氏培養基中培養的C冊細 胞數目在4天內加倍，而在漢姆氏/10%血清替代物中培養的CH0細胞數目在4天內增加大約 8倍。在4天內，細胞在任一培養條件中的存活率為大約90 %。
[0154] 也已證明相比于具有缺乏抗氧化劑的脂質體的血清替代物，包括包含a生育酪的 脂質體的血清替代物培養基改良細胞生長。運個結果與a生育酪在培養中抑制細胞生長的 報導形成對比。參見例如Sylvester等人，"維生素巧巧制正常乳房上皮細胞生長與蛋白激酶 C(曰）活性減小相關（Vitamin E inhibition of normal mammary epithelial cell growth is associated with a reduction in protein kinase C(alpha)activation)'' 《細胞增殖(Cell Prolif.)》34(6):347-57,2001或化uzil等人/'維生素E類似物作為細胞 調亡的誘導劑：其潛在抗腫瘤作用的影響（Vitamin E analogues as inducers of apoptosis: implications for their potential antineoplastic role)''《氧化還原報告 (Redox R巧.）》6(3):143-51,2001。
[0155] 運些結果證明包含本文中所描述的脂質體的血清替代物有效地提供體外細胞系 生長。
[0156] 實例3
[0157] 相比于血清，脂質體血清替代物減少細胞死亡和實驗內變化
[0158] 也使用經分離的CD4+T細胞，檢驗本文中所描述的血清替代物在培養期間減緩或 減少細胞死亡的能力。
[0159] 使用磁珠分離度方案（參見例如Miltenyi Biotec Inc. ,Auburn,CA的MACS及分 離或Life Technologies,Carlsbad,CA的DYNABEADS?)，自小鼠脾分離CD4+T細胞。比較 細胞在DMEM+10%血清替代物中的生長與在包含10%FBS的DMHM中的生長。包含血清替代物 的培養基也補充有各種生長因子W補償在FBS中發現的那些額外生長因子(參見例如美國 專利公開案20130130373)。將5 X 105個CD4+T細胞于200微升生長培養基中置于96孔板中，且 經由并入WST-1歷經3天測量回應于抗-CD3/抗-CD28刺激的T細胞增殖程度（參見例如 Francoeur等人，《生物化學（81〇油61111。日）》3:19-25，1996)。胖51'-1分析使用四挫鐵鹽胖51'-1 斷裂成可溶性甲染料來測量細胞增殖。隨著細胞數目增加，四挫鐵還原酶的含量上升，使 WST-1到可檢測染料的轉化增加。在440納米處，通過吸光度測量染料的量。
[0160] 圖3展示受刺激CD4+T細胞的增殖比在培養基加FBS中培養的細胞中觀察到的增殖 更好或至少相當。八個復制培養物用于各刺激組W可W計算實驗內變量。差異確定為增殖 中觀察到的標準偏差的平方。圖3B展示與在FBS中培養相比，血清替代物與生長因子中的細 胞培養產生最低實驗內差異。通過乳酸脫氨酶（lactate dehy化ogenase;LDH)細胞調亡分 析，也測量歷經3天培養過程的細胞死亡（參見例如Wolterbeek H.T.和van deer Meer J.G.M.《分析藥物發展技術(Assay Drug Dev Technol)》3:675-682,2005)。分析測量LDH在 由細胞膜斷裂產生的上清液中的含量。經由一系列反應，LDH引起可檢測可溶性染料產生， 通過490納米到520納米的吸光度來定量。更高LDH含量表示細胞調亡增加。圖4A展示與用 FBS培養相比，培養基加血清替代物和生長因子中的培養減少在培養期間發生的細胞調亡 程度。圖4B展示與用含FBS培養基培養的實驗內差異相比，在運個實驗中，在血清替代物中 培養的細胞中的實驗內差異也為最低。
[0161] 運些結果展示本文中所描述的血清替代物，W及包含脂質體的完全培養基或培養 基補充物提供類似于FBS中生長的細胞培養環境，但缺乏在用FBS培養中所見的缺點，如批 間差異和實驗內差異。
[0162] 預期所屬領域的技術人員想到如上文說明性實例中闡明的本發明的大量修改和 變化。因此，僅如在所附權利要求書中呈現的限制應施于本發明。
【主權項】
1. 一種用于懸浮或貼壁培養中細胞的培養基，所述培養基包含基礎生理緩沖劑液體混 合物和 (a) 包含膽固醇、卵磷脂以及脂肪酸的脂質體，其中所述脂質體的量使得膽固醇在細胞 懸浮液或貼壁培養物中的最終濃度為1毫克/升到20毫克/升，且其中卵磷脂在細胞懸浮液 或貼壁培養物中的最終濃度為100毫克/升到1000毫克/升;或 (b) 果膠;或 (a)和(b)〇2. 根據權利要求1所述的培養基，其中所述脂質體包含一或多種由次亞麻油酸、亞麻油 酸、肉豆蔻酸以及油酸所組成的群組中選出的脂肪酸。3. 根據權利要求1或2所述的培養基，其中所述脂質體進一步包含乙醇胺和聚山梨醇 酯。4. 根據權利要求1到3中任一項所述的培養基，其中果膠在細胞懸浮液或貼壁培養物中 的最終濃度為25毫克/升到500毫克/升。5. 根據權利要求1到4中任一項所述的培養基，其中所述基礎生理緩沖劑液體混合物包 含一或多種有機鹽、無機鹽、緩沖劑、鐵源或鐵轉運體、甘油、氨基酸、維生素、糖、抗氧化劑 以及微量元素。6. 根據權利要求5所述的培養基，其中甘油在細胞懸浮液或貼壁培養物中的最終濃度 為2微升/升到0.5毫升/升。7. 根據權利要求5所述的培養基，其中所述鐵源或鐵轉運體是由以下各者所構成的群 組中選出：轉鐵蛋白、乳鐵蛋白、硫酸亞鐵、檸檬酸亞鐵、檸檬酸鐵、硝酸鐵、硫酸鐵、檸檬酸 鐵銨、草酸鐵銨、反丁烯二酸鐵銨、蘋果酸鐵銨以及丁二酸鐵銨。8. 根據權利要求5所述的培養基，其中所述培養基包含一或多種由以下各者所構成的 群組中選出的氨基酸:甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-瓜氨酸、鹽 酸L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨 酸、L-甲硫氨酸、L-鳥氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨 酸以及L-纈氨酸。9. 根據權利要求5所述的培養基，其中所述培養基包含一或多種由以下各者所構成的 群組中選出的鹽:磷酸鉀、氯化鈣(無水）、硫酸銅、硝酸鐵、硫酸鐵、氯化鎂(無水）、硫酸鎂 (無水）、氯化鉀、氯化鈉、無水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化錫、硫酸鋅以及碳酸氫鈉。10. 根據權利要求5所述的培養基，其中所述培養基包含一或多種由以下各者所構成的 群組中選出的維生素：生物素、氯化膽堿、D-泛酸鈣、葉酸、煙堿酰胺、鹽酸吡哆醇、雙黃素 (bibof lavin)、鹽酸硫胺、維生素 B12以及異肌醇。11. 根據權利要求5所述的培養基，其中所述培養基包含一或多種由以下各者所構成的 群組中選出的微量元素:砸、鉬酸鹽、鉻、鈷、鎳、鋅、銅、錳、鋇、鎵、鋰、錫、鈦、溴、碘、釩、鍺、 鉬、硅、鐵、氟、銀、銣、鋯、鎘以及鋁。12. 根據權利要求11所述的培養基，其中所述微量元素為硒，且硒在細胞懸浮液或貼壁 培養物中的最終濃度為〇. 005毫克/升到0.05毫克/升。13. 根據前述權利要求中任一項所述的培養基，其中所述培養基為血清替代物、完全培 養基、培養基補充物或低溫保存培養基。14. 一種血清替代物、完全培養基或培養基補充物，其包含脂質體和基礎生理緩沖劑液 體混合物，其中所述脂質體包含卵磷脂、乙醇胺、次亞麻油酸、亞麻油酸、膽固醇以及聚山梨 醇酯，且所述基礎液體混合物包含至少一種無機鹽、至少一種糖、甘油以及至少一種微量元 素。15. 根據權利要求14所述的血清替代物、完全培養基或培養基補充物，進一步包含至少 一種非離子表面活性劑和至少一種鐵源。16. 根據權利要求14所述的血清替代物、完全培養基或培養基補充物，其中所述脂質體 的量使得膽固醇在細胞懸浮液或貼壁培養物中的最終濃度為1毫克/升到20毫克/升，且其 中卵磷脂在細胞懸浮液或貼壁培養物中的最終濃度為100毫克/升到1000毫克/升。17. 根據權利要求14到16中任一項所述的血清替代物、完全培養基或培養基補充物，其 中所述基礎生理緩沖劑液體混合物包含一或多種由以下各者所構成的群組中選出的鹽:磷 酸鉀、氯化鈣(無水）、硫酸銅、硝酸鐵、硫酸鐵、氯化鎂(無水）、硫酸鎂(無水）、氯化鉀、碳酸 氫鈉、氯化鈉、無水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸鋅以及氯化錫。18. 根據權利要求14到17中任一項所述的血清替代物、完全培養基或培養基補充物，其 中所述液體混合物包含氯化鈉、氯化鉀、磷酸鈉以及磷酸鉀。19. 根據權利要求14到18中任一項所述的血清替代物、完全培養基或培養基補充物，其 中所述液體混合物包含一或多種由以下各者所構成的群組中選出的微量元素:硒、鉬酸鹽、 鉻、鈷、鎳、鋅、銅、錳、鋇、鎵、鋰、錫以及鈦。20. 根據權利要求19所述的血清替代物、完全培養基或培養基補充物，其中所述液體混 合物包含硒和鉬酸鹽。21. 根據權利要求13到19中任一項所述的血清替代物、完全培養基或培養基補充物，其 中所述液體混合物包含一或多種由以下各者所構成的群組中選出的鐵源或鐵轉運體:轉鐵 蛋白、乳鐵蛋白、硫酸亞鐵、檸檬酸亞鐵、硝酸鐵、硫酸鐵、檸檬酸鐵、檸檬酸鐵銨、草酸鐵銨、 反丁烯二酸鐵銨、蘋果酸鐵銨以及丁二酸鐵銨。22. 根據權利要求20所述的血清替代物、完全培養基或培養基補充物，其中所述鐵源為 梓檬酸鐵。23. 根據權利要求14到22中任一項所述的血清替代物、完全培養基或培養基補充物，其 中所述液體混合物包含一或多種由以下各者所構成的群組中選出的非離子表面活性劑： Pluronic_68、F68 Pastille、Pluronic_128、去水山梨醇、聚山梨醇酯以及嵌段共聚物。24. 根據權利要求23所述的血清替代物、完全培養基或培養基補充物，其中所述非離子 表面活性劑為Pluronic-68〇25. 根據權利要求14到24中任一項所述的血清替代物，其中膽固醇在所述血清替代物 中的最終濃度為約10毫克/升到200毫克/升，且卵磷脂在所述血清替代物中的最終濃度為 約1000毫克/升到10克/升。26. 根據權利要求14到24中任一項所述的完全培養基，其中膽固醇在所述完全培養基 中的濃度為約1毫克/升到20毫克/升，且卵磷脂在所述完全培養基中的濃度為約100毫克/ 升到1000暈克/升。27. 根據權利要求14到24中任一項所述的培養基補充物，其中膽固醇在所述培養基補 充物中的濃度為約100暈克/升到2000_克/升，且卵磷脂在所述培養基補充物中的濃度為 約10克/升到100克/升。28. 根據權利要求14到24中任一項所述的血清替代物、完全培養基或培養基補充物，其 進一步包含果膠。29. 根據前述權利要求中任一項所述的培養基、血清替代物、完全培養基或培養基補充 物，其中所述脂質體為納米粒子。30. 根據權利要求28或29所述的培養基、血清替代物、完全培養基或培養基補充物，其 中所述納米粒子具有在約50納米到約500納米范圍內的平均直徑。31. 根據前述權利要求中任一項所述的培養基、血清替代物、完全培養基或培養基補充 物，其不含動物性成分。32. -種細胞低溫保存培養基，其包含脂質體和基礎生理緩沖劑液體混合物，其中膽固 醇在所述低溫保存培養基中的最終濃度為約10毫克/升到200毫克/升，且卵磷脂在所述低 溫保存培養基中的最終濃度為約1000毫克/升到10克/升。33. 根據權利要求32所述的低溫保存培養基，其進一步包含果膠。34. 根據權利要求33所述的低溫保存培養基，其中果膠在細胞懸浮液中的最終濃度為 約50暈克/升到5克/升。35. 根據權利要求32或33所述的低溫保存培養基，其進一步包含甘油。36. 根據權利要求35所述的低溫保存培養基，其中甘油在細胞懸浮液中的最終濃度為 約0.02毫升/升到5毫升/升。37. 根據權利要求32到36中任一項所述的低溫保存培養基，其進一步包含二甲亞砜 (dimethyl sulfoxide;DMSO)，其中所述DMSO的濃度小于4%。38. 根據權利要求32到37中任一項所述的低溫保存培養基，其中所述培養基進一步包 含聚賴氨酸。39. -種培養細胞的方法，其包含在含有如前述權利要求中任一項所述的血清替代物、 完全培養基或培養基補充物的培養基中培養細胞。40. 根據權利要求39所述的方法，其中所述細胞是由以下所構成的群組中選出：多能干 細胞、胚胎干細胞、骨髓基質細胞、造血祖細胞、淋巴干細胞、骨髓干細胞、T細胞、B細胞、巨 噬細胞、肝細胞、胰腺細胞、癌瘤細胞以及細胞系。41. 根據權利要求40所述的方法，其中所述細胞系是由以下各組所構成的群組中選出： CHO、CHOK1、DXB-11、DG-44、CHO/-DHFR、CV1、COS-7、HEK293、BHK、TM4、VERO、HELA、MDCK、BRL 3A、W138、Hep 62 51(-此？、]\^1'、了1?1、]\0^5、卩54、1'細胞系、8細胞系、3了3、1?預、厶549、？(：12、 K562、PER.C6、SP2/0、NS-0、U20S、HT1080、L929、融合瘤以及癌細胞系。42. -種低溫保存細胞的方法，其包含將細胞懸浮于如前述權利要求中任一項所述的 低溫保存培養基中，且將所述細胞置于小于8°C的環境中。43. 根據權利要求42所述的方法，其進一步包含使所述細胞解凍且將其置于如前述權 利要求中任一項所述的培養基中。44. 根據權利要求42或43所述的方法，其中至少30 %所述細胞在解凍后仍然有活力。45. 根據權利要求42到44中任一項所述的方法，其中所述細胞是由以下各者所構成的 群組中選出：多能干細胞、胚胎干細胞、骨髓基質細胞、造血祖細胞、淋巴干細胞、骨髓干細 胞、T細胞、B細胞、巨噬細胞、肝細胞、胰腺細胞、癌瘤細胞以及細胞系。46.根據權利要求45所述的方法，其中所述細胞系是由以下各者所構成的群組中選出： CHO、CHOK1、DXB-11、DG-44、CHO/-DHFR、CV1、COS-7、HEK293、BHK、TM4、VERO、HELA、MDCK、BRL 3A、W138、Hep 62 51(-此？、]\^1'、了1?1、]\0^5、卩54、1'細胞系、8細胞系、3了3、1?預、厶549、？(：12、 K562、PER.C6、SP2/0、NS-0、U20S、HT1080、L929、融合瘤以及癌細胞系。
【文檔編號】C12N5/00GK106062205SQ201480075947
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2014年12月19日
【發明人】A.埃爾霍菲, A.韋伯
【申請人】基本藥品有限責任公司