新型與人tlr2及人tlr4結合的雙特異性抗體的制作方法

新型與人tlr2及人tlr4結合的雙特異性抗體的制作方法
【專利摘要】本發明的目的在于提供一種雙特異性抗體，其與人TLR2及人TLR4這兩者作用，通過抑制人TLR2及人TLR4介導的免疫炎癥作用而預防或治療免疫炎癥性疾病。提供一種相對于人LR2及人TLR4的雙特異性抗體，其包含：由序列號4的氨基酸序號1至120的氨基酸序列構成的抗人TLR2抗體的重鏈可變區、由序列號6的氨基酸序號1至113的氨基酸序列構成的抗人TLR2抗體的輕鏈可變區、由序列號4的氨基酸序號491至609的氨基酸序列構成的抗人TLR4抗體的重鏈可變區、及由序列號4的氨基酸序號625至732的氨基酸序列構成的抗人TLR4抗體的輕鏈可變區。
【專利說明】
新型與人TLR2及人TLR4結合的雙特異性抗體
技術領域
[0001 ]本發明設及一種新型的與人TLR2及人TLR4結合的雙特異性抗體。
【背景技術】
[0002] Toll樣受體2(Toll-Like Receptor 2;TLR2)及Toll樣受體4(Toll-Like Receptor 4;TLR4)為在包含巨隧細胞及中性粒細胞等免疫活性細胞、血管內皮細胞、腎小 管上皮細胞等腎固有細胞的廣泛的細胞W及組織中表達的一次跨膜型的蛋白質（Folia Biol (Pr址a).、2005、Vol. 51、No. 6、p. 188-197)。化32與化1?1或化36形成復合體，與膚聚糖 或脂蛋白等的細菌成分進行反應。另一方面，TLR4與髓樣分化因子2(MD2)蛋白質或CD14蛋 白質等形成復合體，并與W脂多糖化PS)為代表的脂多糖等的細菌成分進行反應。另外，運 些受體通過與作為內源性的組織損傷因子的損傷相關分子模式(DAMPS)結合而被活化，從 而向細胞內傳遞信號。TLR2及化R4的活化例如經由作為轉錄因子的核因子kB(NF-kB)的活 化而誘導腫瘤壞死因子曰(TNFa)或白細胞介素6(IL-6)等炎癥性的細胞活素的表達，從而引 起炎癥應答(Nat. Immunol.、2010、V〇1.11、No.5、p.373-384)。
[0003] 已知運種化R2及化R4介導的各種細胞的活化參與免疫炎癥性疾病如敗血癥、急性 腎損傷、慢性腎臟病、急性呼吸窘迫綜合征、硬皮病、急性膜腺炎、慢性閉塞性肺疾病等疾 病。
[0004] 作為與敗血癥的關聯，據報道在作為敗血癥模型的沙口氏菌感染模型中化R2的遺 傳缺陷動物(基因敲除小鼠）顯示生存率改善，在大腸桿菌感染模型中化R4基因敲除小鼠顯 示生存率改善，進而，在各模型中化R2及化R4的雙基因敲除小鼠與化R2或化R4的單獨基因 敲除小鼠相比，生存率大幅度改善(J.Exp.Med.、2008、V〇1.205、p. 1747-1754)。另外，據報 道在前述兩個模型中，在抗化R2抗體(T2.5)或抗化R4抗體（1A6)的單獨給藥中，生存率沒有 改善，與此相對，通過兩抗體的并用給藥，生存率得到改善（J.Exp.Med.、2008、V〇1.205、 p.1747-1754)。
[0005] 作為與急性膜腺炎的關聯，據報道在牛橫膽酸誘發膜腺炎模型中化R4的基因敲除 小鼠的血中淀粉酶、膜臟髓過氧化物酶、及膜臟組織損傷降低（Inf lamm. Res.、2011、 Vol .60、p. 1093-1098)。另外，據報道在雨蛙素誘導膜腺炎模型中，在膜臟中，TLR2及化R4的 表達量上升（Pancreas、2013、Vol.42、p. 114-122)。
[0006] 作為與人化R2結合的抗體，報道有小鼠單克隆抗體T2.5(專利文獻1)、小鼠單克隆 抗體11G7(專利文獻2)、及T2.5的人源化單克隆抗體0PN305(專利文獻3)。其中，報道有11G7 抑制化R2/TLR1信號，但不抑制化R2/TLR6信號，與此相對，0PN305對兩信號均抑制。具體而 言，據報道在使用了人單核系細胞THP-1細胞的實驗中，0PN305對Pam3CSK4(TLR2ALRl激動 劑)刺激及F化-UTLR2ALR6激動劑）刺激運兩者具有中和活性，進而抑制通過Pam3CSK4給 藥而誘導的小鼠血中炎癥性細胞因子濃度上升(專利文獻3)。
[0007] 作為與人化R4結合的抗體，報道有小鼠單克隆抗體HTA125(非專利文獻1)、小鼠單 克隆抗體1細10、16G7、15C1及7E3(專利文獻4)、15C1的人源化單克隆抗體hul5Cl(專利文獻 5)、W及通過對hul5Cl的互補決定區的隨機突變而發現的人源化單克隆抗體1A6及 1E11.C2E3等(專利文獻6)。其中，關于小鼠單克隆抗體，15C1由使用了人血液的實驗結果而 示出中和活性最高（專利文獻4)，15C1的人源化單克隆抗體hul5Cl通過同樣的使用了人血 液的實驗而確認具有中和活性(專利文獻5)。進而，據報道人源化單克隆抗體化11.C2E3與 hul5Cl相比，在使用了人血液的實驗中具有優異的中和活性(專利文獻6)。
[000引另外，據報道在對于使用了人血液的加熱處理的大腸桿菌、假單胞菌屬 (Pseudomonas)及克雷伯氏菌屬化lebsiella)刺激而產生化-6的評價系統中，抗人化32抗 體(T2.5)較弱地抑制IL-6產生，抗人化34抗體（15C1)為抑制約50%IL-6產生的程度，與此 相對，通過兩抗體的并用添加而幾乎完全抑制IL-6產生(專利文獻7)。
[0009] 但是，與人TLR2及人TLR4結合的雙特異性抗體迄今為止沒有進行報道。
[0010] 現有技術文獻
[0011] 專利文獻
[0012] 專利文獻1:國際公開第2005/028509號
[0013] 專利文獻2:國際公開第2005/019431號
[0014] 專利文獻3:國際公開第2011/003925號
[0015] 專利文獻4:國際公開第2005/065015號
[0016] 專利文獻5:國際公開第2007/110678號 [0017] 專利文獻6:國際公開第2013/149111號
[0018] 專利文獻7:國際公開第2006/077471號
[0019] 非專利文獻
[0020] 非專利文獻 1:。實驗醫學雜志（The Journal of Experimental Medicine)"、（美 國）、1999、Vol.189、No.11、p.1777-1782

【發明內容】

[0021] 發明所要解決的課題
[0022] 本發明的課題在于提供一種雙特異性抗體，其通過與人TLR2及人化R4運兩者結合 而抑制人TLR2及人TLR4介導的免疫炎癥作用，由此預防或治療免疫炎癥性疾病。
[0023] 解決課題的手段
[0024] 本發明人等在與人化R2及人化R4結合的雙特異性抗體的制作中重復進行了大量 的獨創研究，結果發現:制作下述與人TLR2及人TLR4結合的雙特異性抗體(實施例1至8)，該 雙特異性抗體抑制由與化R2及TLR4反應的源自臨床分離株的綠脈桿菌Pseudomonas aeruginosa PA0-1的加熱處理死菌體后稱為死菌)誘導的炎癥性細胞因子TWa的產生 (實施例10)，所述雙特異性抗體含有1)由序列號4的氨基酸序號1至120的氨基酸序列構成 的抗人化R2抗體的重鏈可變區、及由序列號6的氨基酸序號1至113的氨基酸序列構成的抗 人化R2抗體的輕鏈可變區；W及2)由序列號4的氨基酸序號491至609的氨基酸序列構成的 抗人化R4抗體的重鏈可變區、及由序列號4的氨基酸序號625至732的氨基酸序列構成的抗 人化R4抗體的輕鏈可變區。運些結果提供了前述與人化R2及人化R4結合的雙特異性抗體， 從而完成了本發明。另外發現：該雙特異性抗體也抑制由源自臨床分離株的大腸桿菌 Escherichia coli 21006的死菌所誘導的TN陽產生(實施例11)。
[0025] 目P，本發明作為醫學上或工業上有用的物質或方法包含W下的發明。
[0026] [ 1 ]-種與人TLR2及人TLR4結合的雙特異性抗體，其從W下的（1)或(2)中選擇：
[0027] (1) 一種與人TLR2及人TLR4結合的雙特異性抗體，包含：
[00%] 1)由序列號4的氨基酸序號1至120的氨基酸序列構成的抗人化R2抗體的重鏈可變 區、及由序列號6的氨基酸序號1至113的氨基酸序列構成的抗人化R2抗體的輕鏈可變區，W 及
[0029] 2)由序列號4的氨基酸序號491至609的氨基酸序列構成的抗人化R4抗體的重鏈可 變區、及由序列號4的氨基酸序號625至732的氨基酸序列構成的抗人化R4抗體的輕鏈可變 區；或
[0030] (2)作為通過（1)的雙特異性抗體的翻譯后修飾而生成的雙特異性抗體的與人 TLR2及人TLR4結合的雙特異性抗體。
[0031] [2]根據[1]所述的雙特異性抗體，其從W下的（1)或(2)中選擇：
[0032] (1)-種含有抗人TLR2抗體及抗人TLR4抗體片段的雙特異性抗體，
[0033] 該抗人化R2抗體為IgG抗體，且包含由序列號4的氨基酸序號1至120的氨基酸序列 構成的抗人化R2抗體的重鏈可變區、及由序列號6的氨基酸序號1至113的氨基酸序列構成 的抗人TLR2抗體的輕鏈可變區，
[0034] 該抗人化R4抗體片段為單鏈可變區片段（scFv)，且包含由序列號4的氨基酸序號 491至609的氨基酸序列構成的抗人化R4抗體的重鏈可變區、及由序列號4的氨基酸序號625 至732的氨基酸序列構成的抗人TLR4抗體的輕鏈可變區;或
[0035] (2)作為通過（1)的雙特異性抗體的翻譯后修飾而生成的雙特異性抗體的與人 TLR2及人TLR4結合的雙特異性抗體。
[0036] [ 3 ]根據[2 ]所述的雙特異性抗體，該雙特異性抗體含有抗人化R2抗體及抗人化R4 抗體片段，
[0037] 該抗人化R2抗體為IgG抗體，且包含由序列號4的氨基酸序號1至120的氨基酸序列 構成的抗人化R2抗體的重鏈可變區、及由序列號6的氨基酸序號1至113的氨基酸序列構成 的抗人TLR2抗體的輕鏈可變區，
[0038] 該抗人化R4抗體片段為scFv，且包含由序列號4的氨基酸序號491至609的氨基酸 序列構成的抗人化R4抗體的重鏈可變區、及由序列號4的氨基酸序號625至732的氨基酸序 列構成的抗人TLR4抗體的輕鏈可變區。
[0039] [4]根據[2]所述的雙特異性抗體，其中，翻譯后修飾為抗人化R2抗體的重鏈可變 區氨基末端(N末端）的焦谷氨酷化口少瓜夕抗人化R2抗體的重鏈簇基末端(C末 端)的賴氨酸缺失、和/或抗人TLR4抗體片段的重鏈可變區N末端的焦谷氨酷化。
[0040] [5]根據[2]至[4]中任一項所述的雙特異性抗體，其中，抗人化R2抗體包含作為人 Ig 丫 1恒定區的重鏈恒定區。
[0041] [6]根據[引所述的雙特異性抗體，其中，人Ig 丫 1恒定區為具有L234A及L235A的氨 基酸突變或L234A、L235A及I253A的氨基酸突變的人Ig 丫 1恒定區。
[0042] [7]根據[2]至[4]中任一項所述的雙特異性抗體，其中，抗人化R2抗體包含作為人 IgK恒定區的輕鏈恒定區。
[0043] [引根據[2]至[4]中任一項所述的雙特異性抗體，其中，抗人化R2抗體包含作為人 Ig 丫 1恒定區的重鏈恒定區及作為人IgK恒定區的輕鏈恒定區。
[0044] [9]根據[引所述的雙特異性抗體，其中，人Ig 丫 1恒定區為具有L234A及L235A的氨 基酸突變或L234A、L235A及I253A的氨基酸突變的人Ig 丫 1恒定區。
[0045] [10]根據[2]或[3]所述的雙特異性抗體，其中，抗人化R2抗體含有由序列號4的氨 基酸序號1至450的氨基酸序列構成的重鏈、及由序列號6的氨基酸序列構成的輕鏈。
[0046] [11]根據[2]至[10]中任一項所述的雙特異性抗體，其中，抗人化R4抗體片段為具 有在重鏈可變區的C末端經由接頭連結輕鏈可變區域的N末端的結構的scFv。
[0047] [12]根據[2]至[11]中任一項所述的雙特異性抗體，其中，抗人化R4抗體片段為由 序列號4的氨基酸序號491至732的氨基酸序列構成的scFv。
[0048] [13]根據[2]或[3]所述的雙特異性抗體，其中，抗人化R2抗體含有由序列號4的氨 基酸序號1至450的氨基酸序列構成的重鏈、及由序列號6的氨基酸序列構成的輕鏈，抗人 TLR4抗體片段為由序列號4的氨基酸序號491至732的氨基酸序列構成的scFv。
[0049] [14]根據[2]至[13]中任一項所述的雙特異性抗體，其中，在抗人化R2抗體的各重 鏈的C末端經由接頭連結抗人TLR4抗體片段的N末端。
[0050] [15]根據[14]所述的雙特異性抗體，其中，連結抗人化R2抗體的重鏈和抗人化R4 抗體片段的接頭由GS接頭構成。
[0051] [16]根據[1引所述的雙特異性抗體，其中，GS接頭由序列號9的氨基酸序列構成。
[0052] [17]根據[2]或[3]所述的雙特異性抗體，其中，抗人化R2抗體含有由序列號4的氨 基酸序號1至450的氨基酸序列構成的重鏈、及由序列號6的氨基酸序列構成的輕鏈，抗人 化R4抗體片段為由序列號4的氨基酸序號491至732的氨基酸序列構成的scFv，在該抗人 TLR2抗體的各重鏈的C末端經由接頭連結該抗人TLR4抗體片段的N末端。
[0053] [1引根據[17]所述的雙特異性抗體，其中，連結抗人化R2抗體的重鏈和抗人化R4 抗體片段的接頭由GS接頭構成。
[0054] [19]根據[1引所述的雙特異性抗體，其中，GS接頭由序列號9的氨基酸序列構成。
[0055] [20]-種雙特異性抗體，其是通過[17]至[19]中任一項所述的雙特異性抗體的翻 譯后修飾而生成的。
[0056] [21]-種多核巧酸，其含有編碼[1]所述的雙特異性抗體的抗人化R2抗體的重鏈 可變區、抗人化R2抗體的輕鏈可變區、抗人TLR4抗體的重鏈可變區、和/或抗人TLR4抗體的 輕鏈可變區的堿基序列。
[0057] [22]-種多核巧酸，其含有編碼在[17]至[19]中任一項所述的雙特異性抗體的抗 人化R2抗體的重鏈的C末端經由接頭連結抗人化R4抗體片段的N末端而成的融合體的堿基 序列。
[0058] [23]根據[22]所述的多核巧酸，其含有編碼由序列號4的氨基酸序列構成的所述 融合體的堿基序列。
[0059] [24]-種多核巧酸，其含有編碼[17]至[19]中任一項所述的雙特異性抗體的抗人 TLR2抗體的輕鏈的堿基序列。
[0060] [2引一種表達載體，其含有[21]所述的多核巧酸。
[0061] [26]-種表達載體，其含有[22]、[23]、和/或[24]所述的多核巧酸。
[0062] [27]-種用[25]所述的表達載體進行了轉化的宿主細胞，其選自由W下的（a)至 (d)構成的組：
[0063] (a)用包含含有編碼由序列號4的氨基酸序號1至120的氨基酸序列構成的抗人 化R2抗體的重鏈可變區的堿基序列的多核巧酸、含有編碼由序列號4的氨基酸序號491至 609的氨基酸序列構成的抗人化R4抗體的重鏈可變區的堿基序列的多核巧酸、及含有編碼 由序列號4的氨基酸序號625至732的氨基酸序列構成的抗人化R4抗體的輕鏈可變區的堿基 序列的多核巧酸的表達載體、和包含含有編碼由序列號6的氨基酸序號1至113的氨基酸序 列構成的抗人化R2抗體的輕鏈可變區的堿基序列的多核巧酸的表達載體進行了轉化的宿 主細胞；
[0064] (b)用包含含有編碼由序列號4的氨基酸序號1至120的氨基酸序列構成的抗人 化R2抗體的重鏈可變區的堿基序列的多核巧酸、含有編碼由序列號4的氨基酸序號491至 609的氨基酸序列構成的抗人化R4抗體的重鏈可變區的堿基序列的多核巧酸、含有編碼由 序列號4的氨基酸序號625至732的氨基酸序列構成的抗人化R4抗體的輕鏈可變區的堿基序 列的多核巧酸、及含有編碼由序列號6的氨基酸序號1至113的氨基酸序列構成的抗人化R2 抗體的輕鏈可變區的堿基序列的多核巧酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞；
[0065] (C)用包含含有編碼由序列號4的氨基酸序號1至120的氨基酸序列構成的抗人 化R2抗體的重鏈可變區的堿基序列的多核巧酸、含有編碼由序列號4的氨基酸序號491至 609的氨基酸序列構成的抗人化R4抗體的重鏈可變區的堿基序列的多核巧酸、及含有編碼 由序列號4的氨基酸序號625至732的氨基酸序列構成的抗人化R4抗體的輕鏈可變區的堿基 序列的多核巧酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞;W及
[0066] (d)用包含含有編碼由序列號6的氨基酸序號1至113的氨基酸序列構成的抗人 TLR2抗體的輕鏈可變區的堿基序列的多核巧酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞。
[0067] [2引一種用[26]所述的表達載體進行轉化的宿主細胞，其選自由W下的(a)至(d) 構成的組：
[0068] (a)用含有[22]或[23]所述的多核巧酸的表達載體和含有[24]所述的多核巧酸的 表達載體進行了轉化的宿主細胞；
[0069] (b)用含有[22]或[23]所述的多核巧酸和[24]所述的多核巧酸的表達載體進行了 轉化的宿主細胞；
[0070] (C)用含有[22]或[23]所述的多核巧酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞；W及
[0071] (d)用含有[24]所述的多核巧酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞。
[0072] [29] -種生產與人化R2及人化R4結合的雙特異性抗體的方法，包括:對選自由W 下的(a)至(C)構成的組中的宿主細胞進行培養，并使與人TLR2及人TLR4結合的雙特異性抗 體表達的工序：
[0073] (a)用包含含有編碼由序列號4的氨基酸序號1至120的氨基酸序列構成的抗人 化R2抗體的重鏈可變區的堿基序列的多核巧酸、含有編碼由序列號4的氨基酸序號491至 609的氨基酸序列構成的抗人化R4抗體的重鏈可變區的堿基序列的多核巧酸、及含有編碼 由序列號4的氨基酸序號625至732的氨基酸序列構成的抗人化R4抗體的輕鏈可變區的堿基 序列的多核巧酸的表達載體、和包含含有編碼由序列號6的氨基酸序號1至113的氨基酸序 列構成的抗人化R2抗體的輕鏈可變區的堿基序列的多核巧酸的表達載體進行了轉化的宿 主細胞；
[0074] (b)用包含含有編碼由序列號4的氨基酸序號1至120的氨基酸序列構成的抗人 化R2抗體的重鏈可變區的堿基序列的多核巧酸、含有編碼由序列號4的氨基酸序號491至 609的氨基酸序列構成的抗人化R4抗體的重鏈可變區的堿基序列的多核巧酸、含有編碼由 序列號4的氨基酸序號625至732的氨基酸序列構成的抗人化R4抗體的輕鏈可變區的堿基序 列的多核巧酸、W及含有編碼由序列號6的氨基酸序號1至113的氨基酸序列構成的抗人 TLR2抗體的輕鏈可變區的堿基序列的多核巧酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞;W及
[0075] (C)用包含含有編碼由序列號4的氨基酸序號1至120的氨基酸序列構成的抗人 化R2抗體的重鏈可變區的堿基序列的多核巧酸、含有編碼由序列號4的氨基酸序號491至 609的氨基酸序列構成的抗人化R4抗體的重鏈可變區的堿基序列的多核巧酸、及含有編碼 由序列號4的氨基酸序號625至732的氨基酸序列構成的抗人化R4抗體的輕鏈可變區的堿基 序列的多核巧酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞、W及用包含含有編碼由序列號6的氨 基酸序號1至113的氨基酸序列構成的抗人化R2抗體的輕鏈可變區的堿基序列的多核巧酸 的表達載體進行了轉化的宿主細胞。
[0076] [30] -種生產與人化R2及人化R4結合的雙特異性抗體的方法，包括:對選自由W 下的(a)至(C)構成的組中的宿主細胞進行培養，并使與人TLR2及人TLR4結合的雙特異性抗 體表達的工序：
[0077] (a)用含有[22]或[23]所述的多核巧酸的表達載體和含有[24]所述的多核巧酸的 表達載體進行了轉化的宿主細胞；
[0078] (b)用含有[22]或[23]所述的多核巧酸和[24]所述的多核巧酸的表達載體進行了 轉化的宿主細胞；W及
[0079] (C)用含有[22]或[23]所述的多核巧酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞、W及 用含有[24]所述的多核巧酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞。
[0080] [31]-種用[29]所述的方法所生產的與人TLR2及人TLR4結合的雙特異性抗體。
[0081] [32]-種用[30]所述的方法所生產的與人TLR2及人TLR4結合的雙特異性抗體。
[0082] [33]-種醫藥組合物，其含有[1]至[20]、[31]及[32]中任一項所述的雙特異性抗 體及藥學上可接受的賦形劑。
[0083] [34]根據[33]所述的醫藥組合物，其為免疫炎癥性疾病的預防或治療用醫藥組合 物。
[0084] [3引根據[34]所述的醫藥組合物，其中，免疫炎癥性疾病為敗血癥或急性膜腺炎。
[0085] [36]-種預防或治療免疫炎癥性疾病的方法，包括施用治療有效量的[1]至[20]、 [31 ]及[32 ]中任一項所述的雙特異性抗體的工序。
[0086] [37]根據[36]所述的預防或治療的方法，其中，免疫炎癥性疾病為敗血癥或急性 膜腺炎。
[0087] [3引根據[1]至[20]、[31]及[32]中任一項所述的雙特異性抗體，其用于在免疫炎 癥性疾病的預防或治療中使用。
[0088] [39]根據[3引所述的雙特異性抗體，其中，免疫炎癥性疾病為敗血癥或急性膜腺 炎。
[0089] [40] [1]至[20]、[31]及[32]中任一項所述的雙特異性抗體在免疫炎癥性疾病的 預防或治療用醫藥組合物制造中的應用。
[0090] [41]根據[40]所述的雙特異性抗體的應用，其中，免疫炎癥性疾病為敗血癥或急 性膜腺炎。
[0091] [42] -種抗人TLR2抗體或其抗原結合片段，其從W下的（1)或(2)中選擇：
[0092] (1)含有由序列號8的氨基酸序號1至120的氨基酸序列構成的重鏈可變區、W及由 序列號6的氨基酸序號1至113的氨基酸序列構成的輕鏈可變區的抗人化R2抗體或其抗原結 合片段;或
[0093] (2)作為通過（1)的抗人化R2抗體或其抗原結合片段的翻譯后修飾而生成的抗體 或其抗原結合片段的抗人TLR2抗體或其抗原結合片段。
[0094] [43]根據[42]所述的抗人TLR2抗體或其抗原結合片段，其含有由序列號8的氨基 酸序號1至120的氨基酸序列構成的重鏈可變區及由序列號6的氨基酸序號1至113的氨基酸 序列構成的輕鏈可變區。
[0095] [44]根據[42]所述的抗人化R2抗體或其抗原結合片段，其為通過含有由序列號8 的氨基酸序號1至120的氨基酸序列構成的重鏈可變區及由序列號6的氨基酸序號1至113的 氨基酸序列構成的輕鏈可變區的抗人TLR2抗體或其抗原結合片段的翻譯后修飾而生成的 抗體或其抗原結合片段。
[0096] [45]根據[42]或[44]所述的抗人TLR2抗體或其抗原結合片段，其中，翻譯后修飾 為重鏈可變區N末端的焦谷氨酷化和/或重鏈C末端的賴氨酸缺失。
[0097] [46]根據[42]至[45]中任一項所述的抗人化R2抗體或其抗原結合片段，其含有作 為人Ig 丫 1恒定區的重鏈恒定區。
[0098] [47]根據[46]所述的抗人化R2抗體或其抗原結合片段，其中，人Ig 丫 1恒定區為具 有L234A及L235A的氨基酸突變或L234A、L235A及I253A的氨基酸突變的人Ig 丫 1恒定區。
[0099] [4引根據[42]至[45]中任一項所述的抗人化R2抗體或其抗原結合片段，其含有作 為人IgK恒定區的輕鏈恒定區。
[0100] [49]根據[42]至[44]中任一項所述的抗人化R2抗體或其抗原結合片段，其含有作 為人Ig 丫 1恒定區的重鏈恒定區及作為人IgK恒定區的輕鏈恒定區。
[0101] [50]根據[49]所述的抗人化R2抗體或其抗原結合片段，其中，人Ig 丫 1恒定區為具 有L234A及L235A、或L234A、L235A及I253A的氨基酸突變的人Ig 丫 1恒定區。
[0102] [51]根據[42]或[43]所述的抗人化R2抗體，其含有由序列號8的氨基酸序號1至 450的氨基酸序列構成的重鏈、及由序列號6的氨基酸序列構成的輕鏈。
[0103] [52]根據[42]至[50]中任一項所述的抗原結合片段，其為單鏈可變區片段、Fab、 Fab'、或F(ab'）2。
[0104] [53]-種抗人化R2抗體，其為通過[51]所述的抗人化R2抗體的翻譯后修飾而生成 的抗體。
[0105] [54]根據[53]所述的抗人TLR2抗體，其中，翻譯后修飾為重鏈可變區N末端的焦谷 氨酷化和/或重鏈C末端的賴氨酸缺失。
[0106] [55]根據[42]或[44]所述的抗人化R2抗體，其含有由序列號8的氨基酸序號1至 449的氨基酸序列構成的重鏈、及由序列號6的氨基酸序列構成的輕鏈。
[0107] [56] -種生產抗人化R2抗體或其抗原結合片段的方法，包括對選自由W下的（a) 至(C)構成的組中的宿主細胞進行培養，使抗人TLR2抗體或其抗原結合片段表達的工序：
[0108] (a)用包含含有編碼[43]所述的抗人TLR2抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區的 堿基序列的多核巧酸和含有編碼該抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區的堿基序列的多 核巧酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞；
[0109] (b)用包含含有編碼[43]所述的抗人TLR2抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區的 堿基序列的多核巧酸的表達載體和包含含有編碼該抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區 的堿基序列的多核巧酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞;W及
[0110] (C)用包含含有編碼[43]所述的抗人TLR2抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區的 堿基序列的多核巧酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞、W及用包含含有編碼該抗體或其 抗原結合片段的輕鏈可變區的堿基序列的多核巧酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞。
[0111] [57] -種生產抗人化R2抗體的方法，包括對選自由W下的(a)至(C)構成的組中的 宿主細胞進行培養，使抗人TLR2抗體表達的工序：
[0112] (a)用包含含有編碼[51]所述的抗人化R2抗體的重鏈的堿基序列的多核巧酸和含 有編碼該抗體的輕鏈的堿基序列的多核巧酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞；
[0113] (b)用包含含有編碼[51]所述的抗人化R2抗體的重鏈的堿基序列的多核巧酸的表 達載體和包含含有編碼該抗體的輕鏈的堿基序列的多核巧酸的表達載體進行了轉化的宿 主細胞；W及
[0114] (C)用包含含有編碼[51]所述的抗人化R2抗體的重鏈的堿基序列的多核巧酸的表 達載體進行了轉化的宿主細胞、W及用包含含有編碼該抗體的輕鏈的堿基序列的多核巧酸 的表達載體進行了轉化的宿主細胞。
[0115] [5引一種用[56]所述的方法所生產的抗人TLR2抗體或其抗原結合片段。
[0116] [ 59 ] -種用[57 ]所述的方法所生產的抗人TLR2抗體。
[0117] [60]-種醫藥組合物，其含有[42]至[55]、[5引及[59]中任一項所述的抗人化尺2 抗體或其抗原結合片段及藥學上可接受的賦形劑。
[0118] [61]-種醫藥組合物，其含有[43]所述的抗人化R2抗體或其抗原結合片段、[44] 所述的抗人TLR2抗體或其抗原結合片段、及藥學上可接受的賦形劑。
[0119] [62]-種醫藥組合物，其含有[51]所述的抗人化R2抗體、[55]所述的抗人化R2抗 體、及藥學上可接受的賦形劑。
[0120] [63]根據[60]至[62]中任一項所述的醫藥組合物，其為癌的預防或治療用醫藥組 合物。
[0121] [64]-種預防或治療癌的方法，包括施用治療有效量的[42]至[55]、[5引及[59] 中任一項所述的抗人TLR2抗體或其抗原結合片段的工序。
[0122] [65]根據[42]至[55]、[5引及[59]中任一項所述的抗人化R2抗體或其抗原結合片 段，其用于在癌的預防或治療中使用。
[0123] [66][42]至[55]、[5引及[59]中任一項所述的抗人化R2或其抗原結合片段在癌的 預防或治療用醫藥組合物制造中的應用。
[0124] 所述與人化R2及人化R4結合的雙特異性抗體W及抗人化R2抗體及其抗原結合片 段也包含其與其它膚及蛋白質的融合抗體、或使其結合修飾劑而成的修飾抗體。
[0125] 發明效果
[0126] 本發明的雙特異性抗體通過人化R2及人化R4的功能抑制而具有強的抗免疫炎癥 作用，可w作為免疫炎癥性疾病的預防或治療劑使用。
【附圖說明】
[0127] 圖1表示在作為IgG抗體的抗人化R2抗體的各重鏈的C末端經由接頭連結抗人化R4 抗體scFv的N末端的本發明的雙特異性抗體的結構的一例。
[0128] 圖2表示各抗人化32抗體對于向THPl-xBlue細胞產生PamSCSM^LRS/e激動劑）誘 導堿性憐酸酶(AP)的抑制效果。
[0129] 圖3表示各雙特異性抗體對于向正常人末梢血單核細胞產生大腸桿菌死菌誘導 TNFa的抑制效果。
【具體實施方式】
[0130] W下，對本發明進行詳述。
[0131] 在抗體中存在1邑6、1邑1、1邑4、1曲及1姐運5類。抗體分子的基本結構在各類中是共 通的，由分子量5萬~7萬的重鏈和2~3萬的輕鏈構成。重鏈通常由含有約440個氨基酸的多 膚鏈構成，每類均具有特征性結構，對應于IgG、I gM、IgA、I曲、I巧被稱為Ig 丫、Igii、Iga、Ig 8、1邑6。此外，在1邑6中存在1邑61、1邑62、1邑63、1邑(；4的亞類，分別與之對應的重鏈被稱為1邑丫 l、Ig 丫 2、Ig 丫 3、Ig 丫 4。輕鏈通常由含有約220個氨基酸的多膚鏈構成，已知有L型和K型2 種，分別被稱為Ig^、IgK。就抗體分子的基本結構的膚構成而言，各自同源的2條重鏈及2條 輕鏈通過二硫鍵(S-S鍵)及非共價鍵結合，分子量為15萬~19萬。巧巾輕鏈可W與任一個重 鏈構成對。各個抗體分子通常可由2條相同的輕鏈和2條相同的重鏈形成。
[0132] 鏈內S-S鍵在重鏈上存在四個(在y、e鏈上存在五個），在輕鏈上存在兩個，每100~ 110個氨基酸殘基形成一個環，該立體結構在各環間類似，被稱為結構單元或結構域。即使 為來自同種動物的相同類(亞類)的標準品，重鏈、輕鏈中位于N末端的結構域的氨基酸序列 也不恒定，被稱為可變區，各結構域分別被稱為重鏈可變區(Vh)及輕鏈可變區(Vl)。來自可 變區的C末端側的氨基酸序列在各類或亞類中大致恒定，被稱為恒定區（各結構域分別表示 為ChI、Ch2、Ch3或Cl)。
[0133] 抗體的抗原決定部位由Vh及化構成，結合的特異性取決于該部位的氨基酸序列。另 一方面，與補體或各種細胞的結合運樣的生物學活性反映各類Ig的恒定區的結構差別。已 知輕鏈和重鏈的可變區的可變性大致限于在任一個鏈上均存在的3個小的超變區，將運些 區域稱為互補決定區（CDR;重鏈、輕鏈從N末端側起分別為CDR1、CDR2、CDR3)。可變區的剩余 部分被稱為骨架區(FR)，相對恒定。
[0134] 含有抗體的Vh及化的各種抗體片段也具有抗原結合活性，作為運種代表性的抗體 片段，可列舉單鏈可變區片段(3。。乂）^曰6^曰6'^仙'）2而6為由輕鏈和含有￥11、扣1結構域 和較鏈區的一部分的重鏈片段構成的一價的抗體片段。Fab'為由輕鏈和含有Vh、Ch1結構域 和較鏈區的一部分的重鏈片段構成的一價的抗體片段，在該較鏈區的部分中含有構成了重 鏈間S-S鍵的半脫氨酸殘基。F(ab'）2片段為2個化b'片段通過較鏈區中的重鏈間S-S鍵結合 的二價的抗體片段。scFv為由用接頭(例如膚接頭)連結的Vh和化構成的一價的抗體片段。
[0135] 雙特異性抗體為運樣的抗體，其含有辨識兩個不同的抗原、并與各自的抗原結合 的兩個抗體的重鏈可變區及輕鏈可變區。雙特異性抗體報道有各種格式（結構）化xped Rev.Clin.I^armacol.、2010、V〇1.3、No. 4、p. 491-508)。例女日，報道有在一個抗體的重鏈可 變區及輕鏈可變區的N末端經由接頭而分別連結另一個抗體的重鏈可變區及輕鏈可變區的 C末端的四價的雙特異性抗體、將各抗體的重鏈及輕鏈利用knobs-into-hol es技術經由C出 而接合的二價的雙特異性抗體、W及在一個抗體的重鏈或輕鏈的N末端經由接頭而連結另 一個抗體的scFv的C末端、或在一個抗體的重鏈或輕鏈的C末端經由接頭而連結另一個抗體 的scFv的N末端的四價的雙特異性抗體(NaUire Biotech.、1997、Vol.l5、p. 159-163)等。
[0136] <本發明的雙特異性抗體>
[0137] 在本說明書中，"與人化R2及人化R4結合的雙特異性抗體"是指具有對人化R2的結 合活性及對人化R4的結合活性的雙特異性抗體，具體而言，本發明的雙特異性抗體包含具 有W下的特征的雙特異性抗體：
[0138] -種與人TLR2及人TLR4結合的雙特異性抗體，其包含：
[0139] 1)由序列號4的氨基酸序號1至120的氨基酸序列構成的抗人化R2抗體的重鏈可變 區、及由序列號6的氨基酸序號1至113的氨基酸序列構成的抗人化R2抗體的輕鏈可變區；W 及
[0140] 2)由序列號4的氨基酸序號491至609的氨基酸序列構成的抗人化R4抗體的重鏈可 變區、及由序列號4的氨基酸序號625至732的氨基酸序列構成的抗人化R4抗體的輕鏈可變 區。
[0141] 在本說明書中，"抗人化32抗體"是指與人化32結合的抗體，"抗人化34抗體"是指 與人TLR4結合的抗體。本發明的雙特異性抗體只要具有抗人TLR2抗體及抗人TLR4抗體的各 個重鏈可變區及輕鏈可變區即可，例如可W具有任意的雙特異性抗體的結構，該結構含有 抗人化R2抗體或具有對人化R2的結合活性的抗人化R2抗體片段、和抗人TLR4抗體或具有對 人化R4的結合活性的抗人TLR4抗體片段。作為運種結構，可列舉例如:在一個抗體的重鏈可 變區及輕鏈可變區的N末端經由接頭而分別連結另一個抗體的重鏈可變區及輕鏈可變區的 C末端的雙特異性抗體(DVD-Ig)、利用knobs-into-holes技術將各抗體的重鏈及輕鏈經由 CH3而接合的雙特異性抗體、W及在一個抗體的重鏈或輕鏈的N末端經由接頭而連結另一個 抗體的scFv的C末端、或在一個抗體的重鏈或輕鏈的C末端經由接頭而連結另一個抗體的 scFv的N末端的四價的雙特異性抗體等。
[0142] 優選本發明的雙特異性抗體為含有抗人化R2抗體及抗人化R4抗體片段、該抗人 化R2抗體為IgG抗體、且該抗人化R4抗體片段為scFv的四價的雙特異性抗體。W下，將該結 構的四價的雙特異性抗體也稱為IgG(TLR2)-scFv(TLR4)。
[0143] 本發明的雙特異性抗體為1旨6(化32)-3。。巾(化1?4)的情況下，作為抗人化32抗體的 恒定區，也可W選擇任何亞類的恒定區（例如作為重鏈的Ig 丫 1、Ig 丫 2、Ig 丫 3或Ig 丫 4的恒 定區、作為輕鏈的I gA或IgK的恒定區），作為重鏈恒定區，優選人Ig 丫 1恒定區，作為輕鏈恒 定區，優選人IgK恒定區。
[0144] 作為用作抗人化R2抗體的重鏈恒定區的人Ig 丫 1恒定區，可列舉例如由序列號8的 氨基酸序號121至450構成的氨基酸序列。
[0145] 使用人Ig 丫 1恒定區作為抗人化R2抗體的重鏈恒定區的情況下，為了使抗體的抗 體依賴細胞毒性或補體依賴細胞毒性降低，也可W使用導入有L234A(基于Kabat等人的抓 索引的氨基酸234位的亮氨酸被丙氨酸取代KL235A(基于Kabat等人的抓索引的氨基酸235 位的亮氨酸被丙氨酸取代）等的氨基酸突變的人Ig 丫 1恒定區（Mol. Immunol.、1992、 Vo 1.29、No. 5、p . 633-639)。另外，從體內動態的觀點出發，為了使抗體從血液中迅速地消 失，也可W使用導入有I253A(基于Kabat等人的抓索引的氨基酸253位的異亮氨酸被丙氨酸 取代)等的氨基酸突變的人Ig 丫 1恒定區（J. Immunol.、1997、Vol. 158、p. 2211-2217)。關于 與本說明書中所使用的抗體的恒定區中的氨基酸突變導入有關的殘基編號，基于EU索引 (Rabat等、1991、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th Ed.、United States Public Health Service、National Institute of Health、Bethesda)。
[0146] 優選抗人化R2抗體的重鏈恒定區為具有L234A及L235A的氨基酸突變的人Ig 丫 1恒 定區或具有L234A、L235A、及I253A的氨基酸突變的人Ig 丫 1恒定區。更優選抗人化R2抗體的 重鏈恒定區為具有L234A、L235A、及I253A的氨基酸突變的人Ig 丫 1恒定區，作為運種人Ig 丫 1恒定區，可列舉例如由序列號4的氨基酸序號121至450構成的氨基酸序列。
[0147] 作為用作抗人化R2抗體的輕鏈恒定區的人IgK恒定區，可列舉例如由序列號6的氨 基酸序號114至219構成的氨基酸序列。
[0148] 優選抗人化R2抗體為含有作為人Ig 丫 1恒定區的重鏈恒定區及作為人IgK恒定區 的輕鏈恒定區的抗人化32抗體，更優選該人Ig 丫 1恒定區為具有L234A、L235A、及I253A的氨 基酸突變的人Ig 丫 1恒定區。
[0149] 例如作為抗人化R2抗體，可列舉含有由序列號4的氨基酸序號1至450的氨基酸序 列構成的重鏈、及由序列號6的氨基酸序列構成的輕鏈的抗人TLR2抗體。
[0150] 本發明的雙特異性抗體為1旨6(化32)-3。。乂(化1?4)的情況下，抗人化1?4抗體片段可 W為具有在重鏈可變區的C末端經由接頭連結輕鏈可變區的N末端的結構（重鏈可變區-接 頭-輕鏈可變區）的scFv、及具有在輕鏈可變區的C末端經由接頭連結重鏈可變區的N末端的 結構(輕鏈可變區-接頭-重鏈可變區）的scFv的任一種，優選為具有重鏈可變區-接頭-輕鏈 可變區的結構的scFvdScFv中的"接頭"為連結重鏈可變區和輕鏈可變區的任意的長度的膚 (膚接頭），優選為具有至少5個、更優選至少10個、進一步優選15~50個的氨基酸的膚。作為 優選的膚接頭，為含有氨基酸序列GlyGlyGlyGlySer(也表示為(Gly)4Ser)的膚接頭(本說 明書中稱為"GS接頭"），優選含有多個、更優選3~5個(Gly)4Ser。
[0151] 例如，作為抗人化R4抗體片段，可列舉作為由序列號4的氨基酸序號491至732的氨 基酸序列構成的S cFv的抗人TLR4抗體片段。
[0152] 在1個實施方式中，作為IgG(化R2)-scFv(TLR4)即本發明的雙特異性抗體，為抗人 化R2抗體含有由序列號4的氨基酸序號1至450的氨基酸序列構成的重鏈及由序列號6的氨 基酸序列構成的輕鏈、抗人化R4抗體片段為由序列號4的氨基酸序號491至732的氨基酸序 列構成的S cFv的雙特異性抗體。
[0153] 優選在IgG(化R2)-scFv(TLR4)即本發明的雙特異性抗體中，在抗人化R2抗體的各 重鏈的C末端經由接頭連結抗人化R4抗體片段的N末端。將運種雙特異性抗體的結構示于圖 1〇
[0154] 在抗人化R2抗體的各重鏈的C末端連結抗人化R4抗體片段的N末端的接頭為連結 兩者的任意的長度的膚(膚接頭），優選為具有至少5個、更優選至少10個、進一步優選15~ 50個的氨基酸的膚。作為優選的膚接頭，為GS接頭，優選含有多個、更優選5~10個(Gly) 4Ser。作為運種接頭，可列舉由序列號9所示的氨基酸序列構成的膚接頭。
[0巧5]在1個實施方式中，作為IgG(化R2)-scFv(TLR4)即本發明的雙特異性抗體，為抗人 化R2抗體含有由序列號4的氨基酸序號1至450的氨基酸序列構成的重鏈及由序列號6的氨 基酸序列構成的輕鏈、抗人化R4抗體片段為由序列號4的氨基酸序號491至732的氨基酸序 列構成的scFv、且在該抗人化R2抗體的各重鏈的C末端經由接頭連結該抗人化R4抗體片段 的N末端的雙特異性抗體。將在抗人化R2抗體的重鏈的C末端經由接頭連結抗人化R4抗體片 段的N末端的融合體也稱為"抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體"。優選在該雙特 異性抗體中，連結該抗人化R2抗體的重鏈和抗人化R4抗體片段的接頭為GS接頭，更優選該 GS接頭由序列號9的氨基酸序列構成。作為運種本發明的雙特異性抗體，可列舉含有由序列 號4的氨基酸序列構成的抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體、及由序列號6的氨 基酸序列構成的抗人TLR2抗體的輕鏈的雙特異性抗體。
[0156] -般而言，已知在使抗體在細胞中表達的情況下，在翻譯后抗體受到修飾。作為翻 譯后修飾的實例，可列舉:重鏈C末端的賴氨酸利用簇基膚酶的切斷、重鏈及輕鏈N末端的谷 氨酷胺或谷氨酸通過焦谷氨酷化修飾為焦谷氨酸等，在各種抗體中，已知重鏈C末端的賴氨 酸缺失或重鏈N末端的谷氨酷胺的大部分被修飾為焦谷氨酸(Journal of Pharmaceutical Sciences、2008、Vol.97、p.2426-p2447)。
[0157] 在本發明的與人化R2及人化R4結合的雙特異性抗體中，也包含與人化R2及人化R4 結合的受到了翻譯后修飾的雙特異性抗體。例如，不僅包含具有全長重鏈的雙特異性抗體， 而且也包含具有C末端的賴氨酸缺失的重鏈的雙特異性抗體。另外，也包含N末端的谷氨酷 胺或谷氨酸通過焦谷氨酷化被修飾為焦谷氨酸的雙特異性抗體。運種N末端的焦谷氨酷化 或C末端側賴氨酸缺失引起的翻譯后修飾對抗體的活性并不產生影響也是該領域中所公知 的（Analytical Biochemistry、Vol.：M8、2006、p.24-39)。
[0158] 在一個實施方式中，在本發明的與人化R2及人化R4結合的雙特異性抗體中也包含 W下記載的雙特異性抗體。
[0159] 含有由序列號4的氨基酸序列構成、且序列號4的氨基酸序號1的谷氨酸被修飾為 焦谷氨酸的抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體、及由序列號6的氨基酸序列構成 的抗人TLR2抗體的輕鏈的、與人TLR2及人TLR4結合的雙特異性抗體。
[0160] 本發明也包含具有W下的特征的與人TLR2及人TLR4結合的雙特異性抗體。
[0161 ] -種與人TLR2及人TLR4結合的雙特異性抗體，其包含：
[0162] 1)含有由序列號4的氨基酸序號31至35的氨基酸序列構成的CDR1、由序列號4的氨 基酸序號50至66的氨基酸序列構成的CDR2、及由序列號4的氨基酸序號99至109的氨基酸序 列構成的CDR3的抗人化R2抗體的重鏈可變區、W及含有由序列號6的氨基酸序號24至39的 氨基酸序列構成的CDR1、由序列號6的氨基酸序號55至61的氨基酸序列構成的CDR2、及由序 列號6的氨基酸序號94至102的氨基酸序列構成的CDR3的抗人TLR2抗體的輕鏈可變區；W及
[0163] 2)含有由序列號4的氨基酸序號521至525的氨基酸序列構成的CDR1、由序列號4的 氨基酸序號540至556的氨基酸序列構成的CDR2、及由序列號4的氨基酸序號589至598的氨 基酸序列構成的CDR3的抗人化R4抗體的重鏈可變區、W及含有由序列號4的氨基酸序號648 至658的氨基酸序列構成的CDR1、由序列號4的氨基酸序號674至680的氨基酸序列構成的 CDR2、及由序列號4的氨基酸序號713至721的氨基酸序列構成的CDR3的抗人化R4抗體的輕 鏈可變區。
[0164] 作為評價本發明的雙特異性抗體的活性的方法，可列舉評價對人化R2和/或人 TLR4的結合活性或中和活性的方法。
[0165] 是否具有對人化R2或人化R4的結合活性可W使用該領域中公知的測定方法來確 認。作為運種測定方法，可列舉例如表面等離子體共振（SPR)解析、酶聯免疫吸附測定 化nzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)等方法。例如，關于對人化1?2的結合活性進 行SPR解析的情況下，可W使用Biacore T200(GE Healthcare)，該情況下，通過將人化32蛋 白質（R&D systems公司）固相化于傳感器忍片的表面，將被驗抗體添加于流路并解析被驗 抗體和人TLR2蛋白質的解離常數化D)，由此可W評價被驗抗體對人TLR2的結合活性。作為 具體的評價方法，可W使用例如后述實施例5中所記載的方法。作為其它的實例，關于對人 化R4的結合活性使用化ISA進行評價的情況下，將人化R4及MD2復合體（W下，稱為人化R4/ MD2)蛋白質固定化于ELISA用板，向其中添加被驗抗體而使其反應之后，使利用辣根過氧化 物酶化RP)等酶進行了標記的抗IgG抗體等二次抗體反應并清洗，之后使用檢測其活性的試 劑(例如在HRP標記的情況下，3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺(TMB;M0S公司））等進行活性測定， 確定二次抗體的結合，由此可W評價被驗抗體對于人化R4的結合活性。作為具體的評價方 法，例如可W使用后述實施例9中所記載的方法。
[0166] 抗體對人化R2的中和活性是指利用對人化R2的結合抑制經由人化R2而產生的任 意的生物活性的活性，可運些1個或多個生物活性為指標進行評價。例如，作為運種對 人化R2的中和活性，可列舉抑制人單核系細胞THPl-xBlue細胞中的Pam2CSK4誘導性的AP產 生的活性，作為活性的具體的評價方法，例如可W使用后述實施例6中所記載的方法。
[0167] 對人化R4的中和活性是指利用對人化R4的結合抑制經由人化R4而產生的任意的 生物活性的活性，可運些1個或多個生物活性為指標進行評價。例如，作為運種對人 化R4的中和活性，可列舉抑制人單核系細胞株即U937細胞中的LPS誘導性的IL-6產生的活 性。
[0168] 本發明的雙特異性抗體具有對人化R2和人化R4的中和活性。具有對人化R2和人 化R4的中和活性是指具有對人化R2的中和活性和對人化R4的中和活性運兩者。是否具有對 人化R2和人化R4的中和活性可W分別使用前述對人TLR2或人TLR4的中和活性的評價方法 進行評價，可W使用表達人化R2和人TLR4運兩者的細胞來評價抑制人化R2和人化R4介導的 該細胞的1個或多個生物活性的活性。作為后者的評價方法的實例，可列舉例如抑制表達人 化R2及人化R4的人末梢血單核細胞中作為敗血癥的致病菌的綠脈桿菌Pseudomonas aeruginosa PA0-1 (例如ATCC:BAA-47)誘導性TN化產生的活性。具有運種活性的抗體可W 判斷為具有對人化R2和人化R4的中和活性的抗體。作為具體的評價方法，可W使用例如后 述實施例10中所記載的方法。
[0169] 本發明的與人化R2及人化R4結合的雙特異性抗體可W基于本說明書中所公開的 本發明的雙特異性抗體中所含的抗人TLR2抗體的重鏈可變區及輕鏈可變區、W及抗人TLR4 抗體的重鏈可變區及輕鏈可變區的序列信息，并使用該領域中公知的方法由本領域技術人 員容易地制作。本發明的與人TLR2及人化R4結合的雙特異性抗體沒有特別限定，例如，可W 按照后述的<本發明的雙特異性抗體的生產方法及利用該方法所生產的雙特異性抗體> 中記載的方法來制造。
[0170] 本發明的與人化R2及人化R4結合的雙特異性抗體根據需要進一步精制之后，按照 常規方法進行制劑化，可w用于免疫炎癥性疾病如敗血癥、急性腎損傷、慢性腎臟病、急性 呼吸窘迫綜合征、硬皮病、急性膜腺炎、慢性閉塞性肺疾病等人化R2及人化R4參與病態形成 的疾病的預防或治療。
[0171] <本發明的多核巧酸>
[0172] 本發明的多核巧酸包含:含有編碼本發明的與人化R2及人化R4結合的雙特異性抗 體中所含的抗人化R2抗體的重鏈可變區（由序列號4的氨基酸序號1至120的氨基酸序列構 成）的堿基序列的多核巧酸、含有編碼該雙特異性抗體中所含的抗人化R2抗體的輕鏈可變 區（由序列號6的氨基酸序號1至113的氨基酸序列構成）的堿基序列的多核巧酸、含有編碼 該雙特異性抗體中所含的抗人化R4抗體的重鏈可變區（由序列號4的氨基酸序號491至609 的氨基酸序列構成）的堿基序列的多核巧酸、或含有編碼該雙特異性抗體中所含的抗人 化R4抗體的輕鏈可變區（由序列號4的氨基酸序號625至732的氨基酸序列構成）的堿基序列 的多核巧酸。
[0173] 本發明的多核巧酸只要為含有編碼本發明的與人化R2及人化R4結合的雙特異性 抗體中所含的抗人化R2抗體的重鏈可變區的堿基序列的多核巧酸、或為含有編碼該雙特異 性抗體中所含的抗人化R2抗體的輕鏈可變區的堿基序列的多核巧酸、或為含有編碼該雙特 異性抗體中所含的抗人化R4抗體的重鏈可變區的堿基序列的多核巧酸、或為含有編碼該雙 特異性抗體中所含的抗人化R4抗體的輕鏈可變區的堿基序列的多核巧酸，就沒有特別限 定。例如，作為含有編碼該抗人化R2抗體的重鏈可變區的堿基序列的多核巧酸，可列舉含有 從序列號3的堿基序號1至360的堿基序列的多核巧酸，作為含有編碼該抗人化R2抗體的輕 鏈可變區的堿基序列的多核巧酸，可列舉含有從序列號5的堿基序號1至339的堿基序列的 多核巧酸，作為含有編碼該抗人化R4抗體的重鏈可變區的堿基序列的多核巧酸，可列舉含 有從序列號3的堿基序號1471至1827的堿基序列的多核巧酸，作為含有編碼該抗人化R4抗 體的輕鏈可變區的堿基序列的多核巧酸，可列舉含有從序列號3的堿基序號1873至2196的 堿基序列的多核巧酸。
[0174] 作為優選的本發明的多核巧酸，可列舉例如:含有編碼本發明的雙特異性抗體IgG (TLR2)-scFv (化R4)的堿基序列的多核巧酸，即含有編碼抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體 scFv融合體的堿基序列的多核巧酸，在抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體中，在 由序列號4的氨基酸序號1至450的氨基酸序列構成的抗人化R2抗體的重鏈的C末端經由接 頭而連結由序列號4的氨基酸序號491至732的氨基酸序列構成的抗人化R4抗體片段的N末 端；W及含有編碼由序列號6的氨基酸序列構成的抗人化R2抗體的輕鏈的堿基序列的多核 巧酸。作為前述含有編碼抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體的堿基序列的多核 巧酸，優選含有編碼由序列號4的氨基酸序列構成的該融合體的堿基序列的多核巧酸。
[0175] 在1個實施方式中，作為編碼由序列號4的氨基酸序列構成的抗人化R2抗體重鏈- 抗人TLR4抗體scFv融合體的多核巧酸，可列舉由序列號3的堿基序列構成的多核巧酸，作為 由序列號6的氨基酸序列構成的抗人化R2抗體的輕鏈的多核巧酸，可列舉由序列號5的堿基 序列構成的多核巧酸。
[0176] 本發明的多核巧酸可W基于其堿基序列，使用本領域中公知的方法由本領域技術 人員容易地制作。例如，可W利用本領域中公知的基因合成方法而合成。作為運種基因合成 方法，可W使用W090/07861中記載的抗體基因的合成方法等本領域技術人員所公知的各種 方法。另外，如果一旦取得本發明的多核巧酸，則通過在該多核巧酸的預定位點導入突變， 也可W取得本發明的其它多核巧酸。作為運種突變導入方法，可W使用位點特異性突變誘 發法（Current Protocols in Molecular Biology edi t.、1987 John Wi ley&Sons Section 8.1-8.5)等本領域技術人員所公知的各種方法。
[0177] <本發明的表達載體>
[0178] 本發明的表達載體包含W下表達載體，其包含:含有編碼本發明的與人化R2及人 化R4結合的雙特異性抗體中所含的抗人化R2抗體的重鏈可變區的堿基序列的多核巧酸、含 有編碼該雙特異性抗體中所含的抗人化R2抗體的輕鏈可變區的堿基序列的多核巧酸、含有 編碼該雙特異性抗體中所含的抗人化R4抗體的重鏈可變區的堿基序列的多核巧酸、和/或 含有編碼該雙特異性抗體中所含的抗人化R4抗體的輕鏈可變區的堿基序列的多核巧酸，其 為可W用于本發明的與人TLR2及人TLR4結合的雙特異性抗體的生產的載體。本領域中各種 格式的雙特異性抗體及其生產方法為公知的，本發明的表達載體可W按照運些生產方法， 根據所表達的雙特異性抗體的格式由本領域技術人員容易地構建。
[0179] 例如，作為用于生產IgG(化R2)-scFv(TLR4)即本發明的雙特異性抗體的表達載 體，優選W下表達載體，其包含:含有編碼該雙特異性抗體中所含的抗人化R2抗體的重鏈可 變區、該雙特異性抗體中所含的抗人化R4抗體的重鏈可變區、及該雙特異性抗體中所含的 抗人TLR4抗體的輕鏈可變區的堿基序列的多核巧酸、和含有編碼該雙特異性抗體中所含的 抗人TLR2抗體的輕鏈可變區的堿基序列的多核巧酸的任一個或兩者。
[0180] 更優選的是，用于生產IgG(TLR2)-scFv(化R4)即本發明的雙特異性抗體的表達載 體為運樣的表達載體，其包含:含有編碼抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體的堿 基序列的多核巧酸、和含有編碼由序列號6的氨基酸序列構成的抗人化R2抗體的輕鏈的堿 基序列的多核巧酸的任一個或兩者，其中在抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體 中，在由序列號4的氨基酸序號1至450的氨基酸序列構成的抗人化R2抗體的重鏈的C末端經 由接頭而連結由序列號4的氨基酸序號491至732的氨基酸序列構成的抗人化R4抗體片段的 N末端。
[0181] 用于生產IgG(化R2)-scFv(TLR4)即本發明的雙特異性抗體的表達載體進一步優 選為運樣的表達載體，其包含：含有編碼由序列號4的氨基酸序列構成的抗人化R2抗體重 鏈-抗人化R4抗體scFv融合體的堿基序列的多核巧酸、和含有編碼由序列號6的氨基酸序列 構成的抗人TLR2抗體的輕鏈的堿基序列的多核巧酸的任一個或兩者。
[0182] 作為用于表達多核巧酸的表達載體，只要在真核細胞(例如動物細胞、昆蟲細胞、 植物細胞、酵母)和/或原核細胞(例如大腸桿菌)的各種宿主細胞中表達含有編碼本發明的 與人化R2及人化R4結合的雙特異性抗體中所含的抗人化R2抗體的重鏈可變區的堿基序列 的多核巧酸、含有編碼該雙特異性抗體中所含的抗人化R2抗體的輕鏈可變區的堿基序列的 多核巧酸、含有編碼該雙特異性抗體中所含的抗人TLR4抗體的重鏈可變區的堿基序列的多 核巧酸、和/或含有編碼該雙特異性抗體中所含的抗人化R4抗體的輕鏈可變區的堿基序列 的多核巧酸，并可W產生運些多膚，就沒有特別限制，可使用例如質粒載體、病毒載體(例如 腺病毒、反轉錄病毒)等，優選可W使用祀E6.4或祀E12.4(Lonza公司）。另外，也可W通過在 AG-丫 1或AG-K(例如參照W0 94/20632)等預先具有人Ig恒定區基因的表達載體中導入可變 區基因片段而表達抗體基因。
[0183] 使用動物細胞、昆蟲細胞或酵母作為宿主細胞的情況下，本發明的表達載體可W 含有起始密碼子及終止密碼子。而且該情況下，本發明的表達載體可W含有增強子序列、編 碼本發明的雙特異性抗體或其重鏈可變區或輕鏈可變區的基因的5'側及3'側的非翻譯區 域、分泌信號序列、剪接接合部、聚腺巧酸化位點、或者可復制單元等。另一方面，使用大腸 桿菌作為宿主細胞的情況下，本發明的表達載體可W含有起始密碼子、終止密碼子、終止子 區域、及可復制單元。而且本發明的表達載體可W根據目的含有通常所使用的選擇標記(例 如四環素抗性基因、氨節青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、新霉素抗性基因、二氨葉酸 還原酶基因）。
[0184] 本發明的表達載體可W含有能夠與多核巧酸可操作地連接的啟動子。作為用于用 動物細胞使本發明的多核巧酸表達的啟動子，可列舉例如：CMV、RSV、SV40等來自病毒的啟 動子、肌動蛋白啟動子、EF(elongation factorHa啟動子、熱激啟動子等。宿主細胞為大腸 桿菌(例如大腸埃希氏菌屬菌）的情況下，可列舉例如：trp啟動子、lac啟動子、WL啟動子、 tac啟動子等。另外，作為酵母中的表達用啟動子，可列舉例如:GAL1啟動子、GAL10啟動子、 P冊5啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子等。
[0185] <本發明的進行了轉化的宿主細胞>
[0186] 本發明的進行了轉化的宿主細胞只要用本發明的表達載體進行轉化，就沒有特別 限定，例如，作為用于生產IgG(化R2)-ScFv(TLR4)即本發明的雙特異性抗體的本發明的進 行了轉化的宿主細胞，可列舉用W下表達載體進行了轉化的宿主細胞，該表達載體包含:含 有編碼該雙特異性抗體中所含的抗人化R2抗體的重鏈可變區、該雙特異性抗體中所含的抗 人化R4抗體的重鏈可變區、及該雙特異性抗體中所含的抗人化R4抗體的輕鏈可變區的堿基 序列的多核巧酸、和含有編碼該雙特異性抗體中所含的抗人化R2抗體的輕鏈可變區的堿基 序列的多核巧酸的任一個或兩者。
[0187] IgG巧LR2)-scFv(TLR4)即本發明的進行了轉化的宿主細胞包含選自由W下的(a) ~(d)構成的組中的、用本發明的表達載體進行了轉化的宿主細胞：
[0188] (a)用包含含有編碼由序列號4的氨基酸序號1至120的氨基酸序列構成的抗人 化R2抗體的重鏈可變區的堿基序列的多核巧酸、含有編碼由序列號4的氨基酸序號491至 609的氨基酸序列構成的抗人化R4抗體的重鏈可變區的堿基序列的多核巧酸、和含有編碼 由序列號4的氨基酸序號625至732的氨基酸序列構成的抗人化R4抗體的輕鏈可變區的堿基 序列的多核巧酸的表達載體、W及包含含有編碼由序列號6的氨基酸序號1至113的氨基酸 序列構成的抗人化R2抗體的輕鏈可變區的堿基序列的多核巧酸的表達載體進行了轉化的 宿主細胞；
[0189] (b)用包含含有編碼由序列號4的氨基酸序號1至120的氨基酸序列構成的抗人 化R2抗體的重鏈可變區的堿基序列的多核巧酸、含有編碼由序列號4的氨基酸序號491至 609的氨基酸序列構成的抗人化R4抗體的重鏈可變區的堿基序列的多核巧酸、含有編碼由 序列號4的氨基酸序號625至732的氨基酸序列構成的抗人化R4抗體的輕鏈可變區的堿基序 列的多核巧酸、及含有編碼由序列號6的氨基酸序號1至113的氨基酸序列構成的抗人化R2 抗體的輕鏈可變區的堿基序列的多核巧酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞；
[0190] (C)用包含含有編碼由序列號4的氨基酸序號1至120的氨基酸序列構成的抗人 化R2抗體的重鏈可變區的堿基序列的多核巧酸、含有編碼由序列號4的氨基酸序號491至 609的氨基酸序列構成的抗人化R4抗體的重鏈可變區的堿基序列的多核巧酸、及含有編碼 由序列號4的氨基酸序號625至732的氨基酸序列構成的抗人化R4抗體的輕鏈可變區的堿基 序列的多核巧酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞;W及
[0191] (d)用包含含有編碼由序列號6的氨基酸序號1至113的氨基酸序列構成的抗人 TLR2抗體的輕鏈可變區的堿基序列的多核巧酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞。
[0192] 在1個實施方式中，本發明的進行了轉化的宿主細胞為選自由W下的（a)~(d)構 成的組中的、用本發明的表達載體進行了轉化的宿主細胞：
[0193] (a)用包含含有編碼抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體的堿基序列的 多核巧酸的表達載體、和包含含有編碼由序列號6的氨基酸序列構成的抗人化R2抗體的輕 鏈的堿基序列的多核巧酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞，其中在抗人化R2抗體重鏈- 抗人化R4抗體scFv融合體中，由序列號4的氨基酸序號1至450的氨基酸序列構成的抗人 化R2抗體的重鏈的C末端經由接頭而連結由序列號4的氨基酸序號491至732的氨基酸序列 構成的抗人TLR4抗體片段的N末端；
[0194] (b)用包含含有編碼抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體的堿基序列的 多核巧酸和含有編碼由序列號6的氨基酸序列構成的抗人化R2抗體的輕鏈的堿基序列的多 核巧酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞，其中在抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv 融合體中，在由序列號4的氨基酸序號1至450的氨基酸序列構成的抗人化R2抗體的重鏈的C 末端經由接頭而連結由序列號4的氨基酸序號491至732的氨基酸序列構成的抗人TLR4抗體 片段的N末端。
[01M] (C)用包含含有編碼抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體的堿基序列的 多核巧酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞，其中在抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體 scFv融合體中，在由序列號4的氨基酸序號1至450的氨基酸序列構成的抗人化R2抗體的重 鏈的C末端經由接頭而連結由序列號4的氨基酸序號491至732的氨基酸序列構成的抗人 TLR4抗體片段的N末端；W及
[0196] (d)用包含含有編碼由序列號6的氨基酸序列構成的抗人化R2抗體的輕鏈的堿基 序列的多核巧酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞。
[0197] 在1個實施方式中，本發明的進行了轉化的宿主細胞為選自由W下的（a)~(d)構 成的組中的、用本發明的表達載體進行了轉化的宿主細胞：
[0198] (a)用包含含有編碼由序列號4的氨基酸序列構成的抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4 抗體scFv融合體的堿基序列的多核巧酸的表達載體、和包含含有編碼由序列號6的氨基酸 序列構成的抗人化R2抗體的輕鏈的堿基序列的多核巧酸的表達載體進行了轉化的宿主細 胞；
[0199] (b)用包含含有編碼由序列號4的氨基酸序列構成的抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4 抗體scFv融合體的堿基序列的多核巧酸和含有編碼由序列號6的氨基酸序列構成的抗人 TLR2抗體的輕鏈的堿基序列的多核巧酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞；
[0200] (C)用包含含有編碼由序列號4的氨基酸序列構成的抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4 抗體scFv融合體的堿基序列的多核巧酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞;W及
[0201] (d)用包含含有編碼由序列號6的氨基酸序列構成的抗人化R2抗體的輕鏈的堿基 序列的多核巧酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞。
[0202] 作為IgG巧LR2)-scFv(TLR4)即本發明的進行了轉化的宿主細胞，優選列舉：用包 含含有編碼由序列號4的氨基酸序列構成的抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體 的堿基序列的多核巧酸的表達載體、和包含含有編碼由序列號6的氨基酸序列構成的抗人 化R2抗體的輕鏈的堿基序列的多核巧酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞；W及用包含含 有編碼由序列號4的氨基酸序列構成的抗人TLR2抗體重鏈-抗人TLR4抗體scFv融合體的堿 基序列的多核巧酸和含有編碼由序列號6的氨基酸序列構成的抗人化R2抗體的輕鏈的堿基 序列的多核巧酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞。
[0203] 生產本發明的IgG(化R2)-scFv(TLR4)的方法只要包括將本發明的進行了轉化的 宿主細胞進行培養、并使IgG(TLR2)-scFv(化R4)表達的工序，就沒有特別限定。作為該方法 中所使用的優選的宿主細胞，可列舉上述的優選的本發明的進行了轉化的宿主細胞。
[0204] 作為進行轉化的宿主細胞，只要適合于所使用的表達載體、用該表達載體進行轉 化從而能夠表達抗體，就沒有特別限定，例如可舉出在本發明的技術領域中通常使用的天 然細胞或人工建立的細胞等各種細胞(例如，動物細胞(例如CH0-K1SV細胞）、昆蟲細胞(例 如Sf9)、大腸桿菌(大腸埃希氏菌屬菌等）、酵母(酵母屬、畢赤酵母屬等)等），優選可W使用 CH0-K1SV細胞、CH0-DG44細胞、293細胞、NS0細胞等培養細胞。
[0205] 轉化宿主細胞的方法沒有特別限定，例如可W使用憐酸巧法、電穿孔法等。
[0206] <生產本發明的雙特異性抗體的方法及利用該方法所生產的雙特異性抗體>
[0207] 生產本發明的與人化R2及人化R4結合的雙特異性抗體的方法只要包括對本發明 的進行了轉化的宿主細胞進行培養、并使與人TLR2及人TLR4結合的雙特異性抗體表達的工 序，就沒有特別限定。作為該方法中所使用的優選的宿主細胞，可列舉上述的優選的本發明 的進行了轉化的宿主細胞。
[0208] 在一個實施方式中，在生產IgG (化R2) -scFv (TLR4)即本發明的雙特異性抗體的方 法中，包括運樣的生產與人化R2及人化R4結合的雙特異性抗體的方法:該方法包括對選自 由W下的(a)~(C)構成的組中的宿主細胞進行培養，并使與人化R2及人TLR4結合的雙特異 性抗體表達的工序。
[0209] (a)用包含含有編碼由序列號4的氨基酸序號1至120的氨基酸序列構成的抗人 化R2抗體的重鏈可變區的堿基序列的多核巧酸、含有編碼由序列號4的氨基酸序號491至 609的氨基酸序列構成的抗人化R4抗體的重鏈可變區的堿基序列的多核巧酸、及含有編碼 由序列號4的氨基酸序號625至732的氨基酸序列構成的抗人化R4抗體的輕鏈可變區的堿基 序列的多核巧酸的表達載體、和包含含有編碼由序列號6的氨基酸序號1至113的氨基酸序 列構成的抗人化R2抗體的輕鏈可變區的堿基序列的多核巧酸的表達載體進行了轉化的宿 主細胞；
[0210] (b)用包含含有編碼由序列號4的氨基酸序號1至120的氨基酸序列構成的抗人 化R2抗體的重鏈可變區的堿基序列的多核巧酸、含有編碼由序列號4的氨基酸序號491至 609的氨基酸序列構成的抗人化R4抗體的重鏈可變區的堿基序列的多核巧酸、含有編碼由 序列號4的氨基酸序號625至732的氨基酸序列構成的抗人化R4抗體的輕鏈可變區的堿基序 列的多核巧酸、及含有編碼由序列號6的氨基酸序號1至113的氨基酸序列構成的抗人化R2 抗體的輕鏈可變區的堿基序列的多核巧酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞;W及
[0211] (C)用包含含有編碼由序列號4的氨基酸序號1至120的氨基酸序列構成的抗人 化R2抗體的重鏈可變區的堿基序列的多核巧酸、含有編碼由序列號4的氨基酸序號491至 609的氨基酸序列構成的抗人化R4抗體的重鏈可變區的堿基序列的多核巧酸、及含有編碼 由序列號4的氨基酸序號625至732的氨基酸序列構成的抗人化R4抗體的輕鏈可變區的堿基 序列的多核巧酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞、W及用包含含有編碼由序列號6的氨 基酸序號1至113的氨基酸序列構成的抗人化R2抗體的輕鏈可變區的堿基序列的多核巧酸 的表達載體進行了轉化的宿主細胞。
[0212] 在1個實施方式中，生產本發明的與人化R2及人化R4結合的雙特異性抗體的方法 包括運樣的生產與人TLR2及人化R4結合的雙特異性抗體的方法:該方法包括對選自由W下 的(a)~k)構成的組中的宿主細胞進行培養，并使與人TLR2及人TLR4結合的雙特異性抗體 表達的工序。
[0213] (a)用包含含有編碼抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體的堿基序列的 多核巧酸的表達載體、和包含含有編碼由序列號6的氨基酸序列構成的抗人化R2抗體的輕 鏈的堿基序列的多核巧酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞，其中在抗人化R2抗體重鏈- 抗人化R4抗體scFv融合體中，在由序列號4的氨基酸序號1至450的氨基酸序列構成的抗人 化R2抗體的重鏈的C末端經由接頭而連結由序列號4的氨基酸序號491至732的氨基酸序列 構成的抗人TLR4抗體片段的N末端；
[0214] (b)用包含含有編碼抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體的堿基序列的 多核巧酸和含有編碼由序列號6的氨基酸序列構成的抗人化R2抗體的輕鏈的堿基序列的多 核巧酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞，其中在抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv 融合體中，在由序列號4的氨基酸序號1至450的氨基酸序列構成的抗人化R2抗體的重鏈的C 末端經由接頭而連結由序列號4的氨基酸序號491至732的氨基酸序列構成的抗人TLR4抗體 片段的N末端；W及
[0215] (C)用包含含有編碼抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體的堿基序列的 多核巧酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞、和用包含含有編碼由序列號6的氨基酸序列 構成的抗人化R2抗體的輕鏈的堿基序列的多核巧酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞，其 中在抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體中，在由序列號4的氨基酸序號1至450的 氨基酸序列構成的抗人化R2抗體的重鏈的C末端經由接頭而連結由序列號4的氨基酸序號 491至732的氨基酸序列構成的抗人TLR4抗體片段的N末端。
[0216] 在1個實施方式中，生產本發明的與人化R2及人化R4結合的雙特異性抗體的方法 包括運樣的生產與人TLR2及人化R4結合的雙特異性抗體的方法:該方法包括對選自由W下 的(a)~k)構成的組中的宿主細胞進行培養，并使與人TLR2及人TLR4結合的雙特異性抗體 表達的工序。
[0217] (a)用包含含有編碼由序列號4的氨基酸序列構成的抗人TLR2抗體重鏈-抗人TLR4 抗體scFv融合體的堿基序列的多核巧酸的表達載體、和包含含有編碼由序列號6的氨基酸 序列構成的抗人化R2抗體的輕鏈的堿基序列的多核巧酸的表達載體進行了轉化的宿主細 胞；
[0218] (b)用包含含有編碼由序列號4的氨基酸序列構成的抗人TLR2抗體重鏈-抗人TLR4 抗體scFv融合體的堿基序列的多核巧酸和含有編碼由序列號6的氨基酸序列構成的抗人 TLR2抗體的輕鏈的堿基序列的多核巧酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞;W及
[0219] (c)用包含含有編碼由序列號4的氨基酸序列構成的抗人TLR2抗體重鏈-抗人TLR4 抗體scFv融合體的堿基序列的多核巧酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞、和用包含含有 編碼由序列號6的氨基酸序列構成的抗人化R2抗體的輕鏈的堿基序列的多核巧酸的表達載 體進行了轉化的宿主細胞。
[0220] 進行了轉化的宿主細胞的培養可W利用公知方法來進行。培養條件例如溫度、培 養基的pH及培養時間可適當選擇。宿主細胞為動物細胞的情況下，作為培養基，例如可W使 用含有約5~20% 的胎牛血清的MEM培養基（Science，1959，Vol. 130，No. 3373，p.432-7)、 DMEM 培養基（Virology ,1959, Vol. 8，p. 396)、RPMI 1640 培養基（J. Am. Med. Assoc. ,1967， Vol. 199，p. 519)、199 培養基化邱.Biol.Med. ,1950, Vol. 73，p. 1-8)等。培養基的抑優選為 約6~8,培養時，根據需要一邊進行通氣或攬拌，一邊在通常約30~4(TC下進行約15~72小 時。宿主細胞為昆蟲細胞的情況下，作為培養基，例如可W使用含有胎牛血清的Grace's培 養基(Proc.化11.4。日(1.5(31.1]54，1985，￥〇1.82,9.8404)等。培養基的抑優選為約5~8，培養 時，根據需要一邊進行通氣或攬拌，一邊在通常約20~40°C下進行約15~100小時。宿主細 胞為大腸桿菌或酵母的情況下，作為培養基，例如含有營養源的液體培養基是適當的。營養 培養基優選含有進行了轉化的宿主細胞的生長所必需的碳源、無機氮源或有機氮源。作為 碳源，例如可列舉葡萄糖、葡聚糖、可溶性淀粉、薦糖等，作為無機氮源或有機氮源，例如可 列舉錠鹽類、硝酸鹽類、氨基酸、玉米漿、腺、酪蛋白、肉類提取物、大豆巧、馬鈴馨提取液等。 根據期望可W含有其它營養素(例如，無機鹽(例如氯化巧、憐酸二氨鋼、氯化儀）、維生素類 等）、抗生素(例如四環素、新霉素、氨節青霉素、卡那霉素等）。培養基的抑優選為約5~8。宿 主細胞為大腸桿菌的情況下，作為優選的培養基，例如可W使用LB培養基、M9培養基 (Mol.Clo.，Cold Spring 化rbor Laborato;ry，Vol.3，A2.2)等。培養時，根據需要一邊進行 通氣或攬拌，一邊在通常約14~39°C下進行約3~24小時。宿主細胞為酵母的情況下，作為 培養基，例如可 W 使用Burkholder 基本培養基（Proc.化 tl. Acad. Sci.USA，1980, Vol. 77， P .4505)等。培養時，根據需要一邊進行通氣或攬拌，一邊在通常約20~35°C下進行約14~ 144小時。通過如上所述的培養，可W使本發明的與人化R2和人化R4結合的雙特異性抗體表 達。
[0221] 生產本發明的與人化R2及人化R4結合的雙特異性抗體的方法除了包括對如上所 述的進行了轉化的宿主細胞進行培養、并使本發明的雙特異性抗體表達的工序之外，還可 W進一步包括從該進行了轉化的宿主細胞中回收(優選分離或精制)本發明的雙特異性抗 體的工序。作為分離或精制方法，例如可列舉:鹽析、溶劑沉淀法等利用溶解度的方法，透 析、超濾、凝膠過濾等利用分子量差的方法，離子交換色譜或徑基憐灰石色譜等利用電荷的 方法，親和色譜法等利用特異親和性的方法，反相高效液相色譜等利用疏水性差的方法，等 電點電泳等利用等電點差的方法等。優選的是，蓄積于培養上清液中的抗體可W利用各種 色譜法(例如使用了Protein A柱或Protein G柱的各種柱色譜法)進行精制。
[0222] <本發明的醫藥組合物>
[0223] 本發明的醫藥組合物包含含有本發明的與人化R2及人化R4結合的雙特異性抗體 及藥學上可接受的賦形劑的醫藥組合物。本發明的醫藥組合物可W使用該領域中通常所用 的賦形劑（即，藥劑用賦形劑或藥劑用載體等)并通過通常所使用的方法來制備。作為運些 醫藥組合物的劑型的實例，例如可列舉注射劑、點滴用劑等非經口劑，可W通過靜脈內給 藥、皮下給藥等進行給藥。在制劑時，可w在藥學上所允許的范圍內使用與運些劑型相應的 載體或添加劑等。
[0224] 本發明的醫藥組合物可W含有多種本發明的與人化R2及人化R4結合的雙特異性 抗體。例如，含有沒有經受翻譯后修飾的抗體、W及通過該抗體的翻譯后修飾而生成的抗體 的醫藥組合物也包含在本發明中。
[0225] 在1個實施方式中，含有與人化R2及人化R4結合的雙特異性抗體的本發明的醫藥 組合物也包含下述中記載的醫藥組合物。
[0226] 一種醫藥組合物，其包含下述與人化R2及人化R4結合的雙特異性抗體，該雙特異 性抗體為含有1)由序列號4的氨基酸序號1至120的氨基酸序列構成的抗人化R2抗體的重鏈 可變區、及由序列號6的氨基酸序號1至113的氨基酸序列構成的抗人化R2抗體的輕鏈可變 區、W及
[0227] 2)由序列號4的氨基酸序號491至609的氨基酸序列構成的抗人化R4抗體的重鏈可 變區、及由序列號4的氨基酸序號625至732的氨基酸序列構成的抗人化R4抗體的輕鏈可變 區的、與人TLR2及人TLR4結合的雙特異性抗體、W及
[0228] 通過該雙特異性抗體的翻譯后修飾而生成的雙特異性抗體。
[0229] 本發明的醫藥組合物也包含運樣的醫藥組合物，其含有:重鏈C末端的賴氨酸缺失 的雙特異性抗體、經受了 N末端翻譯后修飾的雙特異性抗體、重鏈C末端賴氨酸缺失且經受 了 N末端翻譯后修飾的雙特異性抗體、和/或具有重鏈C末端賴氨酸且沒有經受N末端翻譯后 修飾的雙特異性抗體。
[0230] 在1個實施方式中，含有下述（1)和（2)的與人化R2及人化R4結合的雙特異性抗體 的醫藥組合物也包含在本發明中。
[0231] (1)含有由序列號4的氨基酸序列構成、氨基酸序號1的谷氨酸被修飾為焦谷氨酸 的抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體、及由序列號6的氨基酸序列構成的抗人 TLR2抗體的輕鏈的、與人TLR2及人TLR4結合的雙特異性抗體。
[0232] (2)含有由序列號4的氨基酸序列構成的抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融 合體、及由序列號6的氨基酸序列構成的抗人TLR2抗體的輕鏈的、與人TLR2及人TLR4結合的 雙特異性抗體。
[0233] 進而，在1個實施方式中，含有與人TLR2及人TLR4結合的雙特異性抗體的本發明的 醫藥組合物也包含下述中記載的醫藥組合物。
[0234] 一種醫藥組合物，其包含與人化R2及人化R4結合的雙特異性抗體、及藥學上可接 受的賦形劑，所述與人化R2及人化R4結合的雙特異性抗體含有由序列號4所示的氨基酸序 列構成的抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體及由序列號6所示的氨基酸序列構 成的抗人TLR2抗體的輕鏈。
[0235] 在上述制劑化時本發明的與人化R2及人化R4結合的雙特異性抗體的添加量根據 患者的癥狀程度或年齡、使用的制劑的劑型、或抗體的結合效價等而不同，例如可W使用 0.0 Olmg/kg ~lOOmg/kg左右。
[0236] 本發明的醫藥組合物可W作為人化R2及人化R4參與病態形成的免疫炎癥性疾病 (例如敗血癥、急性腎損傷、慢性腎臟病、急性呼吸窘迫綜合征、硬皮病、急性膜腺炎、慢性閉 塞性肺疾病等)的預防或治療劑使用。
[0237] 本發明包括免疫炎癥性疾病的預防或治療用醫藥組合物，其含有本發明的與人 化R2及人TLR4結合的雙特異性抗體。另外，本發明包括預防或治療免疫炎癥性疾病的方法， 包括施用治療有效量的該雙特異性抗體的工序。另外，本發明包括用于在免疫炎癥性疾病 的預防或治療中使用的本發明的雙特異性抗體。此外，本發明包括本發明的雙特異性抗體 在免疫炎癥性疾病的預防或治療用醫藥組合物制造中的用途。
[0238] <本發明的抗人TLR2抗體及含有其的醫藥組合物>
[0239] 本發明含有抗人化R2抗體或其抗原結合片段，其包含含有由序列號8的氨基酸序 號31至35的氨基酸序列構成的CDR1、由序列號8的氨基酸序號50至66的氨基酸序列構成的 CDR2、及由序列號8的氨基酸序號99至109的氨基酸序列構成的CDR3的抗人化R2抗體的重鏈 可變區、W及含有由序列號6的氨基酸序號24至39的氨基酸序列構成的CDR1、由序列號6的 氨基酸序號55至61的氨基酸序列構成的CDR2、及由序列號6的氨基酸序號94至102的氨基酸 序列構成的CDR3的抗人TLR2抗體的輕鏈可變區。
[0240] 另外，本發明也包含含有由序列號8的氨基酸序號1至120的氨基酸序列構成的重 鏈可變區及由序列號6的氨基酸序號1至113的氨基酸序列構成的輕鏈可變區的抗人化R2抗 體或其抗原結合片段、W及通過該抗體或其抗原結合片段的翻譯后修飾而生成的抗體或其 抗原結合片段。作為翻譯后修飾的實例，可列舉重鏈可變區N末端的焦谷氨酷化和/或重鏈C 末端的賴氨酸缺失。在本發明的抗人化R2抗體或其抗原結合片段中優選的重鏈恒定區及輕 鏈恒定區與關于上述的< 本發明的雙特異性抗體> 中的抗人化R2抗體所記載的重鏈恒定 區及輕鏈恒定區相同。
[0241] 在一個實施方式中，本發明的抗人TLR2抗體為具有下述的特征的抗人TLR2抗體。
[0242] 含有由序列號8的氨基酸序號1至450的氨基酸序列構成的重鏈及由序列號6的氨 基酸序列構成的輕鏈的抗人TLR2抗體。
[0243] 進而，在一個實施方式中，本發明的抗人化R2抗體為具有下述的特征的抗人化R2 抗體。
[0244] 含有由序列號8的氨基酸序號1至449的氨基酸序列構成的重鏈及由序列號6的氨 基酸序列構成的輕鏈的抗人TLR2抗體。
[0245] 本發明的抗人化R2抗體或其抗原結合片段可W使用含有各自編碼上述的本發明 的雙特異性抗體中所含的抗人化R2抗體的重鏈可變區及輕鏈可變區的堿基序列的多核巧 酸，參照上述的 <本發明的表達載體 >、<本發明的進行了轉化的宿主細胞 >及< 生產本 發明的雙特異性抗體的方法及利用該方法所生產的雙特異性抗體>的記載由本領域技術 人員容易地生產。
[0246] 本發明也包含含有本發明的抗人化R2抗體或其抗原結合片段、及藥學上可接受的 賦形劑的醫藥組合物。本發明的醫藥組合物可W使用該領域中通常所用的賦形劑（即，藥劑 用賦形劑或藥劑用載體等)并通過通常所使用的方法來制備。作為運些醫藥組合物的劑型 的實例，例如可列舉注射劑、點滴用劑等非經口劑，可W通過靜脈內給藥、皮下給藥等進行 給藥。在制劑時，可W在藥學上所允許的范圍內使用與運些劑型相應的賦形劑、載體、添加 劑等。
[0247] 本發明的醫藥組合物可W含有多種本發明的抗人化R2抗體或其抗原結合片段。例 如，含有沒有經受翻譯后修飾的抗體或其抗原結合片段、及通過該抗體或其抗原結合片段 的翻譯后修飾而生成的抗體或其抗原結合片段的醫藥組合物也包含在本發明中。
[0248] 在1個實施方式中，含有抗人化R2抗體或其抗原結合片段的本發明的醫藥組合物 也包含下述中記載的醫藥組合物。
[0249] 包含含有由序列號8的氨基酸序號1至120的氨基酸序列構成的重鏈可變區及由序 列號6的氨基酸序號1至113的氨基酸序列構成的輕鏈可變區的抗人化R2抗體或其抗原結合 片段、W及作為通過該抗體或其抗原結合片段的翻譯后修飾而生成的抗體或其抗原結合片 段的抗人TLR2抗體或其抗原結合片段的醫藥組合物。
[0250] 在1個實施方式中，在含有抗人化R2抗體的本發明的醫藥組合物中，含有下述（1) 至(4)的與人TLR2結合的抗體的醫藥組合物也包含在本發明中。
[0251] (1)含有由序列號8的氨基酸序號1至449的氨基酸序列構成的重鏈及由序列號6所 示的氨基酸序列構成的輕鏈的抗人TLR2抗體。
[0252] (2)含有由序列號8所示的氨基酸序列構成且氨基酸序號1的谷氨酸被修飾為焦谷 氨酸的重鏈及由序列號6所示的氨基酸序列構成的輕鏈的抗人TLR2抗體。
[0253] (3)含有由序列號8的氨基酸序號1至449的氨基酸序列構成且氨基酸序號1的谷氨 酸被修飾為焦谷氨酸的重鏈及由序列號6所示的氨基酸序列構成的輕鏈的抗人TLR2抗體。
[0254] (4)含有由序列號8所示的氨基酸序列構成的重鏈及由序列號6所示的氨基酸序列 構成的輕鏈的抗人TLR2抗體。
[0255] 進而，在一個實施方式中，在含有抗人化R2抗體的本發明的醫藥組合物中，下述的 含有與人TLR2結合的抗體的醫藥組合物也包含在本發明中。
[0256] 包含含有由序列號8的氨基酸序號1至450的氨基酸序列構成的重鏈及由序列號6 的氨基酸序列構成的輕鏈的抗人化R2抗體、含有由序列號8的氨基酸序號1至449的氨基酸 序列構成的重鏈及由序列號6的氨基酸序列構成的輕鏈的抗人化R2抗體、及藥學上可接受 的賦形劑的醫藥組合物。
[0257] 在上述制劑化時，本發明的抗人TLR2抗體或其抗原結合片段的添加量根據患者的 癥狀程度或年齡、使用的制劑的劑型、或抗體的結合效價等而不同，例如可W使用O.OOlmg/ kg ~lOOmg/kg 左右。
[0258] 本發明的抗人化R2抗體或其抗原結合片段根據需要進一步進行精制之后，按照常 規方法進行制劑化，可W用于治療敗血癥、癌等人TLR2參與病態形成的疾病。
[0259] <融合抗體及修飾抗體>
[0260] 如果是本領域技術人員，則也可W使用該領域中公知的方法將與人化R2及人化R4 結合的雙特異性抗體、抗人TLR2抗體或其抗原結合片段制作成融合有其它膚或蛋白質的融 合抗體，或制作成使之與修飾劑結合而成的修飾抗體。本發明的與人TLR2及人TLR4結合的 雙特異性抗體、抗人化R2抗體或其抗原結合片段也包含運種融合體或修飾體的形態的抗體 或抗原結合片段。只要本發明的與人TLR2及人TLR4結合的雙特異性抗體作為融合抗體具有 對人TLR2及人TLR4的結合活性、或本發明的抗人TLR2抗體或其抗原結合片段作為融合抗體 具有對人化R2的結合活性，則用于融合的其它膚或蛋白質沒有特別限定，例如，可列舉:人 血清白蛋白、各種標記膚、人工螺旋基序膚、麥芽糖結合蛋白質、谷脫甘膚S轉移酶、各種毒 素、能夠促進多聚化的其它膚或蛋白質等。只要本發明的與人TLR2及人TLR4結合的雙特異 性抗體作為融合抗體具有對人化R2及人化R4的結合活性、或本發明的抗人化R2抗體或其抗 原結合片段作為修飾抗體具有對人化R2的結合活性，則用于修飾的修飾劑沒有特別限定， 可列舉例如聚乙二醇、糖鏈、憐脂、脂質體、低分子化合物等。
[0261] 為了對本發明進一步進行理解在此提供參考的特定實施例，但是它們作為例示性 目的，而并不限定本發明。
[0262] 實施例
[0263] 關于使用了市售試劑盒或試劑等的部分，如果沒有特殊說明，則按照隨附的實驗 方案進行實驗。另外，為了方便，將濃度mol/L表示為M。例如，1M氨氧化鋼水溶液是指Imol/L 的氨氧化鋼水溶液。（實施例1:產生抗人TLR2抗體的雜種瘤的制作）
[0264] 使用人單克隆抗體開發技術 "Veloclmmune" (Velocimmune antibody technology; Regeneron公司（美國專利6596541號））小鼠制作抗人化R2抗體。與引起免疫反 應的佐劑一起，用人化32蛋白質（R&D systems公司、2616-TR-050)免疫Velocimmune小鼠。 按照常規方法摘出免疫后的小鼠的脾臟或淋己節等并收集淋己細胞，將其與小鼠骨髓瘤細 胞SP2/0(ATCC:邸L-1581)進行細胞融合而制作雜種瘤。進行單克隆化，在作為無血清培養 基的CD雜種瘤培養基（ク^フテ夕7 口公一乂社）中進行培養。由得到的培養上清液使用 Protein G柱(GE~瓜乂少7社）將抗體進行精制。在Velocimmune技術中，使用了內源性的 免疫球蛋白重鏈及輕鏈的可變區被對應的人可變區取代的轉基因小鼠，因此，得到的抗體 為具有人抗體的可變區和小鼠抗體的恒定區的抗體(也稱為嵌合抗體）。
[0265] (實施例2:抗人TLR2抗體的中和活性評價）
[0266] 為了評價實施例1中確定的抗人化R2抗體的中和活性，使用內源性表達人化R2的 人單核系細胞THPl-xBlue細胞，檢測對化R2/6激動劑Pam2CSK4誘導堿性憐酸酶(AP)產生的 抑制。
[0267] 其結果可知:命名為31-5F5-2F3的抗人化R2抗體(嵌合抗體)抑制了 AP產生，具有 對人TLR2的中和活性。
[0268] (實施例3:抗人TLR2抗體的序列確定及突變體制作）
[0269] 由產生抗人化R2抗體31-5巧-2F3的雜種瘤解析編碼抗體的重鏈及輕鏈的基因的 序列，進行序列確定。
[0270] 抗體的序列確定后，為了提高抗體的物性及穩定性，將31-5F5-2F3的重鏈及輕鏈 的FR替換為其它人抗體的FR，制作抗人TLR2抗體31-5巧-2F3 .ml。
[0271] (實施例4:完全人型抗人TLR2抗體的制作）
[0272] 實施例3中制作的抗體為可變區源自人、恒定區源自小鼠的抗體。因此，使用哺乳 細胞表達用載體GS載體化onza公司）構建含有重鏈及輕鏈的兩基因的表達載體，制作完全 人型抗體。具體而言，在31-5F5-2F3.ml的抗體的重鏈可變區基因的5'側連接編碼信號序列 (化gel 怖ittle等、Protein Enginee;ring、1987、Vol. l、No.6、p.499-505.)的基因，而且在 3'側連接人Ig 丫 1恒定區基因（由序列號7的堿基編號361至1350的堿基序列構成），將該重 鏈基因插入于GS載體pEE6.4。另外，在輕鏈可變區基因的5'側連接編碼信號序列（Nigel Whittle等、前述）的基因，而且在3'側連接人K鏈的恒定區基因（由序列號5的堿基編號340 至657的堿基序列構成），將該輕鏈基因插入于GS載體祀E12.4。
[0273] 用測序儀分析插入于pEE6.4的抗體的重鏈基因序列、插入于PEE12.4的抗體的輕 鏈基因序列，由該結果得到的氨基酸序列，參照Kabat等的數據庫（"Sequences of Proteins of Immunological Interest''、US Department of Health and Human Services'US Government Printing Office)確定CDR序列。
[0274] 將制作的31-5F5-2F3.ml的完全人型抗體(完全人型31-5F5-2F3.ml)的重鏈的堿 基序列示于序列號7,將由此所編碼的氨基酸序列示于序列號8,將該抗體的輕鏈的堿基序 列示于序列號5,將由此所編碼的氨基酸序列示于序列號6。
[0275] 序列號8所示的重鏈的可變區由序列號8的氨基酸序號1至120的氨基酸序列構成， 重鏈的CDR1、CDR2、CDR3分別由序列號8的氨基酸序號31至35、50至66、99至109的氨基酸序 列構成。序列號6所示的輕鏈的可變區由序列號6的氨基酸序號1至113的氨基酸序列構成， 輕鏈的CDR1、CDR2、CDR3分別由序列號6的氨基酸序號24至39、55至61、94至102的氨基酸序 列構成。
[0276] 使用分別插入有抗體的重鏈和輕鏈的基因的上述的GS載體，用瞬時表達及永久表 達運兩種方法進行抗體表達。關于瞬時表達，對于在化eeSt^e 293Expression medium(弓 斗フテ夕7 口公一乂社）中W約100萬cells/mL培養的Freestyle 293細胞（弓^フテ夕7 口公一乂社），使用基因導入試劑293Fectin(^ 斗フテ夕7 口公一乂社)將上述的重鏈及輕 鏈的兩表達載體轉染，培養7天。或者，對于在Expi293Expression medium(^ ^フテ夕7 口 公一乂社）中W約300萬ce 11 s/mL培養的E邱i293細胞（弓^ 7テ夕7 口公一乂社），使用基 因導入試劑E邱iFectamine293(ク^フテ夕7口ッ一乂社）將上述的重鏈及輕鏈的兩表達 載體轉染，培養7天。或者，對于在CD-C冊medium(ク^フテ夕7 口公一乂社）中W約1000萬 cells/mL培養的C冊-K1SV細胞化onza公司），使用電穿孔法將上述的重鏈及輕鏈的兩表達 載體轉染，培養7天。將培養上清液使用Protein A或Protein G柱（均為GE~瓜乂少7社)進 行精制，得到完全人型抗體的精制抗體。關于永久表達，將分別插入有抗體的重鏈和輕鏈的 基因的上述的GS載體用Notl和Pvul進行限制酶切斷，使用連接用試劑盒Ligation- Convenience Kit(NIPP0NGE肥公司）或連接試劑Ligation-higMTOYOBO公司）進行連接，構 建插入有重鏈和輕鏈的兩基因的GS載體。該表達載體編碼全長的重鏈及輕鏈和谷氨酷胺合 成酶，通過對C冊-K1SV細胞的轉染使抗體表達。將培養上清液用Protein A柱或Protein G 柱進行精制，得到完全人型抗體的精制抗體。（實施例5:完全人型抗人化R2抗體的結合活性 評價）
[0277] 為了評價實施例4中制作的完全人型31-5巧-2F3.ml對人化R2的結合活性，實施 SPR分析。
[027引在sra分析中，使用Biacore T200(GE~瓜乂少7社）。使用His Capture Kit(GE~ 瓜乂少7社、28-9950-56)和Amine Coupling Kit(GE~瓜乂少7社、BR-1000-50)將Anti- His IgG化is CapUire Kit附屬）固定于CM5傳感器忍片（GE~瓜乂少7社、BR-1005-30)。將 流路No. 1作為參照，在該流路上不結合人化R2蛋白質，分別在其它流路(No. 2、No. 3、No .4) 上W流速化L/分鐘添加用皿S-EP+buffer(GE~瓜乂少7社、BR-1006-69)稀釋為0.66iig/mL 的人化R2蛋白質(R&Dsystems公司、2616-TR-050)2分鐘，并使其固相化。其后，W流速50化/ 分鐘添加將完全人型31-5F5-2F3.ml用皿S-EP+buffer稀釋為200nM的溶液2分鐘，測定完全 人型抗體和人化R2的結合。接著，W流速50化/分鐘添加皿S-EP+buff er 5分鐘，測定完全人 型抗體和人化R2的解離。用Fit local分析二價分析物模型、Rmax，算出結合速度常數化a) 及解離速度常數化d)，用kd除Wka，由此算出結合解離常數化D)。
[02巧]其結果可知:邸為88.5pM，完全人型31-5F5-2F3.ml具有對人TLR2的結合活性。
[0280] (實施例6:完全人型抗人TLR2抗體的中和活性評價）
[0281] 為了評價實施例4中制作的完全人型31-5巧-2F3.ml對人化R2的中和活性，使用 THPl-xBlue細胞實施Pam2CSK4誘導AP產生抑制檢測。W在96孔板（貝克頓-迪金森公司）上 W75化/孔在RPMI1640培養基（弓斗フテ夕7 口公一乂社）下接種THPl-xBlue細胞 (Invivogen公司、thpx-sp)使之成為5X 104cells/孔。細胞接種后立即添加25化的在855nM ~2.19pM的范圍內用RPMI1640培養基稀釋了9級的完全人型31-5巧-2F3 .ml，并在37°C、5% C〇2條件下培養30分鐘。進而，添加25化用RPMI1640培養基稀釋的化m2CSK4(Invivogen公 司、tlrl-pm2s;最終濃度lOOng/mL)。作為對照，準備取代抗體而添加有RPMI1640培養基的 孔，準備取代化m2CSK4而添加有RPMI1640培養基的孔。在37 °C、5 %C〇2條件下培養一夜之 后，回收培養上清液，使用市售的Quanti-Blue(Invivogen公司）測定培養上清液中所含的 AP濃度。進一步算出抗體對于Pam2CSK4誘導AP產生的IC50值。在計算IC50值時，將取代抗體 而添加有RPMI1640培養基的孔設為0 %抑制對照，將取代Pam2CSK4而添加有RPMI1640培養 基的孔作為100%抑制對照設定。通過4參數logistic曲線擬合來計算IC50值。
[0282] 其結果，完全人型31-5巧-2F3 .ml抑制AP產生，I巧0值為97.7pM。可知：完全人型 31-5F5-2F3. ml具有對人TLR2的中和活性。
[0283] (實施例7:完全人型抗人TLR2抗體的中和活性評價(2))
[0284] 為了評價實施例4中制作的完全人型31-5巧-2F3.ml對人化R2的中和活性，使用 THPl-xBlue細胞實施Pam2CSK4誘導AP產生抑制檢測。作為比較抗體，使用作為抗人化R2抗 體的T2.5(專利文獻1)及0PN305(專利文獻3)。
[0285] 對于完全人型31-5F5-2F3.ml(在855nM~2.19pM的范圍內WRPMI1640培養基稀釋 9級）、T2.5(在83：3nM~2.13pM的范圍內WRPMI1640培養基稀釋9級）、W及0PN305(在861nM ~2.20pM的范圍內WRPMI1640培養基稀釋9級）的巧巾抗體實施與實施例6同樣的實驗，并通 過4參logistic曲線擬合算出IC50值。
[02化]其結果，完全人型31-5F5-2F3.ml完全抑制Pam2CSK4誘導引起的AP產生，I巧0值為 130pM。另一方面，T2.5及0PN305的Pam2CSK4誘導引起的AP產生抑制為部分的（圖2)。
[0287] (實施例8:與人TLR2及人TLR4結合的雙特異性抗體的制作）
[0288] 制作含有抗人化R2抗體(IgG抗體)和抗人化R4抗體單鏈可變區片段(scFv)的兩種 抗人化R2及抗人化R4雙特異性抗體。本實施例中制作的雙特異性抗體為上述的IgG(化R2)- scFv(TLR4)型的雙特異性抗體，具有在抗人化R2抗體的各重鏈的C末端經由接頭連結抗人 TLR4抗體scFv的N末端的結構（圖1)。
[0289] 使用PCR法在實施例4中制作的完全人型31-5巧-2F3.ml的重鏈基因的3'末端連結 編碼GS接頭(序列號9)的基因，進而使用PCR法在編碼該GS接頭的基因的3'末端連結編碼抗 人化34抗體scFv的基因，制作將完全人型31-5F5-2F3.ml的重鏈的C末端和抗人化34抗體 scFv的N末端用該GS接頭連結的、編碼抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體的基 因。該基因所編碼的該融合體中所含的抗人化R4抗體scFv由序列號4的氨基酸序號491至 732的氨基酸序列構成，具有在由序列號4的氨基酸序號491至609的氨基酸序列構成的重鏈 可變區的C末端經由GS接頭(序列號10)連結由序列號4的氨基酸序號625至732的氨基酸序 列構成的輕鏈可變區的N末端的結構。將制作的抗人TLR2抗體重鏈-抗人TLR4抗體scFv融合 體稱為ICU-1-Ig 丫 1重鏈。在ICU-1-Ig 丫 1重鏈基因的5'側連接編碼信號序列（Nigel Whittle等、前述)的基因，并插入于祀E6.4載體。
[0巧0] 另外，制作在ICU-1-Ig 丫 1重鏈的人Ig 丫 1重鏈恒定區導入有L2%A、L235A、及 I253A的氨基酸突變的改變型的ICU-1-Ig 丫 1重鏈(稱為ICU-1-Ig 丫 1-LAsh重鏈)的基因，將 該基因插入于祀E6.4載體。
[0巧1] 將插入有ICU-1-Ig 丫 1重鏈基因或ICU-1-Ig 丫 1-LAsh重鏈基因的祀E6.4載體和實 施例4中制作的插入有完全人型31-5巧-2F3.ml的輕鏈基因的祀E12.4組合，使用與實施例4 中記載的抗體的表達及精制法同樣的方法，制作兩種與人化R2及人化R4結合的雙特異性抗 體。
[0292] 將含有ICU-1-Ig 丫 1重鏈和完全人型31-5F5-2F3.ml的輕鏈的雙特異性抗體稱為 完全人型ICU-1-Ig 丫 1，將含有ICU-1-Ig 丫 1-LAsh重鏈和完全人型31-5巧-2F3 .ml的輕鏈的 雙特異性抗體稱為完全人型ICU-1-Ig 丫 1-LAsh。
[029；3]將完全人型ICU-1-Ig 丫 1的ICU-1-Ig 丫 1重鏈的堿基序列示于序列號1，將由此所 編碼的氨基酸序列示于序列號2。將完全人型ICU-1-Ig 丫 1-LAsh的ICU-1-Ig 丫 1-LAsh重鏈 的堿基序列示于序列號3,將由此所編碼的氨基酸序列示于序列號4。
[0294]序列號2所示的抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體中所含的抗人化R2 抗體重鏈由序列號2的氨基酸序號1至450的氨基酸序列構成。
[0巧日]序列號4所示的抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體中所含的抗人化R2 抗體重鏈由序列號4的氨基酸序號1至450的氨基酸序列構成。
[0296] 序列號2及序列號4所示的所述兩個抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體 中所含的抗人化R2抗體重鏈的可變區是共通的，由序列號4的氨基酸序號1至120的氨基酸 序列構成，該重鏈可變區的CDR1、CDR2、CDR3分別由序列號4的氨基酸序號31至35、50至66、 99至109的氨基酸序列構成。
[0297] 序列號2及序列號4所示的所述兩個抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體 中所含的抗人化R4抗體scFv是共通的，由序列號4的氨基酸序號491至732的氨基酸序列構 成，構成該抗人化R4抗體scFv的抗人化R4抗體的重鏈可變區由序列號4的氨基酸序號491至 609的氨基酸序列構成，該重鏈可變區的CDR1、CDR2、CDR3分別由序列號4的氨基酸序號521 至525、540至556、589至598的氨基酸序列構成。構成該抗人化R4抗體scFv的抗人化R4抗體 的輕鏈可變區由序列號4的氨基酸序號625至732的氨基酸序列構成，該輕鏈可變區的CDR1、 CDR2、CDR3分別由序列號4的氨基酸序號648至658、674至680、713至721的氨基酸序列構成。
[0298] 完全人型ICU-1-Ig 丫 1及完全人型ICU-1-Ig 丫 1-LAsh的輕鏈的堿基序列是共通 的，將該堿基序列示于序列號5,將由此所編碼的氨基酸序列示于序列號6。序列號6所示的 抗人化R2抗體輕鏈的可變區由序列號6的氨基酸序號1至113的氨基酸序列構成，該輕鏈可 變區的CDR1、CDR2、CDR3分別由序列號6的氨基酸序號24至39、55至61、94至102的氨基酸序 列構成。
[0299] (實施例9:與人TLR2及人TLR4結合的雙特異性抗體的結合活性評價）
[0300] 為了評價實施例8中制作的兩種雙特異性抗體對人化R2及人化R4的各自的結合活 性，使用人化R2蛋白質及人化R4/MD2蛋白質進行化ISA。在透明的MAXIS0RP384孔板(哥一子 フ々/シ中一哥斗工シテ^フ々/夕社）中W15化/孔添加用PBS(^ 斗フテ夕7 口公一乂社、 10010-023)稀釋為lOiig/mL的濃度的人化32蛋白質（R&D systems公司、2616-TR-050)，在室 溫下固相化1小時。同樣地，W15化/孔添加 lOiig/mL的濃度的人I'LRA/MDS蛋白質（R&D systems公司、3146-TM/CF)，在室溫下固相化1小時。在1小時后用清洗液(含0.05%Tween- 20的Tris緩沖生理食鹽水(TBS))清洗孔3次，W10化L/孔添加 Blocking化e(十力弓^テ乂 夕社、03953-95)，在室溫下進行封閉1小時。再次用清洗液清洗3次，分別對固相化有人化R2 蛋白質的孔、固相化有人化R4/MD2蛋白質的孔W15化/孔添加實施例8中制作的兩種雙特異 性抗體。使用等量混合有PBS及Blocking One的反應緩沖液進行運些抗體的稀釋，從75. OnM 至4.47fM稀釋13級。在室溫下靜置1小時后，用清洗液進行清洗3次。W15化/孔添加用反應 緩沖液將人IgG重鏈輕鏈交叉吸附抗體化uman IgG-heavy and light chain cross- adsorbed Antibody) (BETHYL 公司、 A80-219P) 稀釋 4000 倍而成的液體 ，在室溫下靜置 1 小 時。用清洗液清洗3次，W 15化/孔添加 TMB PEROXIDASE SUBSTRATE化ISA(M0SS公司、# TMBE-500)。15分鐘后在固相化有人化R2蛋白質的孔中W15化/孔添加1M硫酸（和光純藥工 業公司、198-09595)而停止反應。5分鐘后在固相化有人化R4/MD2蛋白質的孔中W15化/孔 添加1M硫酸而停止反應。用Safire2(TECAN公司）測定450皿處的吸光度，分別算出相對于人 化R2蛋白質及人化R4/MD2蛋白質的各抗體的EC50值。在計算EC50值時，由縱軸W測定值描 繪、橫軸W抗體濃度值描繪的圖表上的Sigmoid曲線的形狀，將隨著濃度的上升可W判斷為 測定值達到收斂值的各抗體的測定值的最大值設定為100%，將隨著抗體濃度的下降可W 判斷為測定值達到收斂值的各抗體的測定值的最小值設定為0%。將通過4參數logistic曲 線擬合算出的EC50值示于W下(表1、表2)。
[0301] 表1:相對于人TLR2蛋白質的結合活性
[0302] [表1]
[0303] _
[0304]表2:相對于人TLR4/MD2蛋白質的結合活性
[0305][表 2] 「nwAl
[0307] ~其結果可知：完全人型ICU-1-Ig 丫 1及完全人型ICU-1-Ig 丫 1-LAsh與人化32蛋白' 質及人TLR4/MD2蛋白質運兩者結合。
[0308] (實施例10:與人化R2及人化R4結合的雙特異性抗體的正常人末梢血單核細胞綠 脈桿菌死菌誘導TN陽產生抑制檢測）
[0309] 為了評價實施例8中制作的雙特異性抗體的中和活性，使用內源性表達人化R2及 人化R4/MD2的人末梢血單核細胞實施綠脈桿菌死菌誘導TWa產生抑制檢測。已知的是，綠 脈桿菌Pseudomonas aeruginosa為敗血癥的致病菌的一個，刺激人末梢血單核細胞上的 TLR2和TLR4并產生TN陽（Scand.J. Immunol.、2008、V〇1.67、No.2、p. 193-203)。
[0310] 在384孔板シ夕社）中使用含有適當制備成終濃度10~30%的人血清化onza公 司、14-490E)的RPMI1640培養基（弓^ 7テ夕7 口公一乂社）W30化/孔接種正常人末梢血 單核細胞化onza公司、CC-2702)使之成為1.875X 104cells/孔。其后立即添加在375nM~ 7.680fM的范圍內用RPMI1640培養基稀釋12級的精制抗體完全人型ICU-1-Ig 丫 1或在5(K)nM ~10.24fM的范圍內用RPMI1640培養基稀釋13級的完全人型ICU-1-Ig 丫 1-LAsh 10化，并在 37°C、5%C02條件下培養30分鐘。進而，將臨床分離株的綠脈桿菌Pseudomonas aeruginosa PAO-1的加熱處理死菌用RPMI1640培養基進行稀釋，W終濃度成為1X106C即(菌落形成單 位)/mL的方式添加10化。作為對照，分別準備取代抗體而添加有RPMI1640培養基的孔、取代 綠脈桿菌死菌而添加有RPMI1640培養基的孔。在37 °C、5 % C〇2條件下培養一夜之后，回收培 養上清液，使用市售的A1地aLISA TN化試劑盒一年シ工瓜7-社、AL208C)測定培養上 清液中所含的TWa濃度。進一步算出各抗體對于綠脈桿菌死菌誘導TWa產生的IC50值。在 IC50值算出時，將取代抗體而添加有RPMI1640培養基的孔作為0%抑制對照、將取代綠脈桿 菌死菌而添加有RPMI1640培養基的孔作為100%抑制對照設定。將通過4參數logistic曲線 擬合算出的IC50值示于W下(表3)。
[0311] 表3:正常人末梢血單核細胞綠脈桿菌死菌誘導TNFa產生抑制活性
[0312] [表 3]
[0314] 由其結果可知：完全人型ICU-1-Ig 丫 1及完全人型ICU-1-Ig 丫 1-LAsh抑制TN化產 生，具有對人TLR2及人TLR4的中和活性。
[0315] (實施例11:正常人末梢血單核細胞大腸桿菌死菌誘導TNFa產生抑制檢測）
[0316] 在384孔板（スシ夕社）中使用含有適當制備成終濃度10%的人血清化onza公司、 14-490E)的RPMI1640培養基（ク^フテ夕7 口公一乂社）W30化/孔接種正常人末梢血單核 細胞化onza公司、CC-2702)使之成為lX104Cells/孔。其后立即添加在2.500咖至20.00fM 的范圍內用RPMI1640培養基稀釋12級的精制完全人型ICU-1-Ig 丫 1或完全人型ICU-1-Ig 丫 1-LAsh 1化L。另外，作為比較抗體，添加在7.75祉M至52.96fM的范圍內用RPMI1640培養基 稀釋13級的精制抗人化R4抗體化ll.C2E3(專利文獻6)及抗人化R2抗體0PN305(專利文獻3) 的混合溶液10化。其后，在37°C、5%C02條件下培養30分鐘。進而，將臨床分離株的大腸桿菌 Escherichia coli (21006)的加熱處理死菌用RPMI1640培養基進行稀釋，W終濃度成為1 X 106C即/mL的方式添加10化。作為對照，分別準備取代抗體而添加有RPMI1640培養基的孔、 取代大腸桿菌死菌而添加有RPMI1640培養基的孔。在37°C、5%C02條件下培養一夜之后，回 收培養上清液，使用市售的A1地aLISA TN化試劑盒一年シ工瓜7-社)測定培養上清液 中所含的TWa濃度。進一步算出各抗體對于大腸桿菌死菌誘導TWa產生的IC50值。在計算 IC50值時，將取代抗體而添加有RPMI1640培養基的孔作為0 %抑制對照、將取代大腸桿菌死 菌而添加有RPMI1640培養基的孔作為100%抑制對照設定。將通過4參數logistic曲線擬合 算出的IC50值示于W下(表4、圖3)。
[0317] 表4:正常人末梢血單核細胞大腸桿菌死菌誘導TNFa產生抑制活性
[031 引[表4]
[0319]
[0320] 由其結果可知:完全人型ICU-1-Ig 丫 1及完全人型ICU-1-Ig 丫 1-LAsh與化11.C沈3 及0PN305的并用相比，具有約10倍的效力(潛能）的TN陽產生抑制活性。
[0321] 工業實用性
[0322] 本發明的與人化R2及人化R4結合的雙特異性抗體對參與人化R2及人化R4介導的 病態形成的各種疾病的預防或治療是有用的。另外，本發明的多核巧酸、表達載體、進行了 轉化的宿主細胞及生產雙特異性抗體的方法對生產所述與人TLR2及人化R4結合的雙特異 性抗體是有用的。
[0323] 序列表自由文本
[0324] 在W下的序列表的數字標題<223>中，記載"人工序列"的說明。具體而言，序列 表的序列號1表示的堿基序列為完全人型ICU-1-Ig 丫 1的抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體 scFv融合體的堿基序列，序列號2表示的氨基酸序列為由序列號1所編碼的抗人化R2抗體重 鏈-抗人化R4抗體scFv融合體的氨基酸序列。序列表的序列號3表示的堿基序列為完全人型 ICU-1-Ig 丫 1-LAsh的抗人化R2抗體重鏈-抗人TLR4抗體scFv融合體的堿基序列，序列號4表 示的氨基酸序列為由序列號3所編碼的抗人化R2抗體重鏈-抗人化R4抗體scFv融合體的氨 基酸序列。序列表的序列號5表不的堿基序列為完全人型ICU-1-Ig 丫 1及完全人型ICU-1-Ig 丫 1-LAsh的抗人化R2抗體輕鏈、W及完全人型31-5F5-2F3.ml的輕鏈的堿基序列，序列號6 表示的氨基酸序列為由序列號5所編碼的抗人化R2抗體輕鏈的氨基酸序列。序列表的序列 號7表不的堿基序列為完全人型31-5F5-2F3 .ml的重鏈的堿基序列，序列表的序列號8表不 的氨基酸序列為由序列號7所編碼的重鏈的氨基酸序列。序列表的序列號9表不的氨基酸序 列為連結完全人型ICU-1-Ig 丫 1及完全人型ICU-1-Ig 丫 1-LAsh中所含的抗人化32抗體的重 鏈恒定區的C末端和抗人化R4抗體scFv的N末端的GS接頭的氨基酸序列。序列表的序列號10 表示的氨基酸序列為連結完全人型ICU-1-Ig 丫 1及完全人型ICU-1-Ig 丫 1-LAsh中所含的抗 人TLR4抗體scFv中的重鏈可變區和輕鏈可變區的GS接頭的氨基酸序列。
【主權項】
1. 一種與人TLR2及人TLR4結合的雙特異性抗體，其從以下的（1)或(2)中選擇： (1) 一種與人TLR2及人TLR4結合的雙特異性抗體，包含： 1) 由序列號4的氨基酸序號1至120的氨基酸序列構成的抗人TLR2抗體的重鏈可變區、 及由序列號6的氨基酸序號1至113的氨基酸序列構成的抗人TLR2抗體的輕鏈可變區、以及 2) 由序列號4的氨基酸序號491至609的氨基酸序列構成的抗人TLR4抗體的重鏈可變 區、及由序列號4的氨基酸序號625至732的氨基酸序列構成的抗人TLR4抗體的輕鏈可變區； 或 (2) 作為通過（1)的雙特異性抗體的翻譯后修飾而生成的雙特異性抗體的與人TLR2及 人TLR4結合的雙特異性抗體。2. 根據權利要求1所述的雙特異性抗體，其從以下的（1)或(2)中選擇： (1) 一種包含抗人TLR2抗體及抗人TLR4抗體片段的雙特異性抗體， 該抗人TLR2抗體為IgG抗體，且包含由序列號4的氨基酸序號1至120的氨基酸序列構成 的抗人TLR2抗體的重鏈可變區、及由序列號6的氨基酸序號1至113的氨基酸序列構成的抗 人TLR2抗體的輕鏈可變區， 該抗人TLR4抗體片段為單鏈可變區片段(scFv)，且包含由序列號4的氨基酸序號491至 609的氨基酸序列構成的抗人TLR4抗體的重鏈可變區、及由序列號4的氨基酸序號625至732 的氨基酸序列構成的抗人TLR4抗體的輕鏈可變區;或 (2) 作為通過（1)的雙特異性抗體的翻譯后修飾而生成的雙特異性抗體的與人TLR2及 人TLR4結合的雙特異性抗體。3. 根據權利要求2所述的雙特異性抗體，該雙特異性抗體含有抗人TLR2抗體及抗人 TLR4抗體片段， 該抗人TLR2抗體為IgG抗體，且包含由序列號4的氨基酸序號1至120的氨基酸序列構成 的抗人TLR2抗體的重鏈可變區、及由序列號6的氨基酸序號1至113的氨基酸序列構成的抗 人TLR2抗體的輕鏈可變區， 該抗人TLR4抗體片段為scFv，且包含由序列號4的氨基酸序號491至609的氨基酸序列 構成的抗人TLR4抗體的重鏈可變區、及由序列號4的氨基酸序號625至732的氨基酸序列構 成的抗人TLR4抗體的輕鏈可變區。4. 根據權利要求2所述的雙特異性抗體，其中，翻譯后修飾為抗人TLR2抗體的重鏈可變 區氨基末端(N末端）的焦谷氨酰化、抗人TLR2抗體的重鏈羧基末端(C末端）的賴氨酸缺失、 和/或抗人TLR4抗體片段的重鏈可變區N末端的焦谷氨酰化。5. 根據權利要求2至4中任一項所述的雙特異性抗體，其中，抗人TLR2抗體包含作為人 Igyl恒定區的重鏈恒定區。6. 根據權利要求5所述的雙特異性抗體，其中，人Igy 1恒定區為具有L234A及L235A的 氨基酸突變或L234A、L235A及I253A的氨基酸突變的人Ig γ 1恒定區。7. 根據權利要求2至4中任一項所述的雙特異性抗體，其中，抗人TLR2抗體包含作為人 IgK恒定區的輕鏈恒定區。8. 根據權利要求2至4中任一項所述的雙特異性抗體，其中，抗人TLR2抗體包含作為人 Igyl恒定區的重鏈恒定區及作為人IgK恒定區的輕鏈恒定區。9. 根據權利要求8所述的雙特異性抗體，其中，人Igy 1恒定區為具有L234A及L235A的 氨基酸突變或L234A、L235A及I253A的氨基酸突變的人Ig γ 1恒定區。10. 根據權利要求2或3所述的雙特異性抗體，其中，抗人TLR2抗體包含由序列號4的氨 基酸序號1至450的氨基酸序列構成的重鏈、及由序列號6的氨基酸序列構成的輕鏈。11. 根據權利要求2至10中任一項所述的雙特異性抗體，其中，抗人TLR4抗體片段為具 有在重鏈可變區的C末端經由接頭連結輕鏈可變區的Ν末端的結構的scFv。12. 根據權利要求2至11中任一項所述的雙特異性抗體，其中，抗人TLR4抗體片段為由 序列號4的氨基酸序號491至732的氨基酸序列構成的scFv。13. 根據權利要求2或3所述的雙特異性抗體，其中，抗人TLR2抗體包含由序列號4的氨 基酸序號1至450的氨基酸序列構成的重鏈、及由序列號6的氨基酸序列構成的輕鏈，抗人 TLR4抗體片段為由序列號4的氨基酸序號491至732的氨基酸序列構成的scFv。14. 根據權利要求2至13中任一項所述的雙特異性抗體，其中，在抗人TLR2抗體的各重 鏈的C末端經由接頭連結抗人TLR4抗體片段的N末端。15. 根據權利要求14所述的雙特異性抗體，其中，連結抗人TLR2抗體的重鏈和抗人TLR4 抗體片段的接頭由GS接頭構成。16. 根據權利要求15所述的雙特異性抗體，其中，GS接頭由序列號9的氨基酸序列構成。17. 根據權利要求2或3所述的雙特異性抗體，其中，抗人TLR2抗體包含由序列號4的氨 基酸序號1至450的氨基酸序列構成的重鏈、及由序列號6的氨基酸序列構成的輕鏈，抗人 TLR4抗體片段為由序列號4的氨基酸序號491至732的氨基酸序列構成的scFv，在該抗人 TLR2抗體的各重鏈的C末端經由接頭連結該抗人TLR4抗體片段的N末端。18. 根據權利要求17所述的雙特異性抗體，其中，連結抗人TLR2抗體的重鏈和抗人TLR4 抗體片段的接頭由GS接頭構成。19. 根據權利要求18所述的雙特異性抗體，其中，GS接頭由序列號9的氨基酸序列構成。20. -種雙特異性抗體，其是通過權利要求17至19中任一項所述的雙特異性抗體的翻 譯后修飾而生成的。21. -種多核苷酸，其含有編碼權利要求1所述的雙特異性抗體的抗人TLR2抗體的重鏈 可變區、抗人TLR2抗體的輕鏈可變區、抗人TLR4抗體的重鏈可變區、和/或抗人TLR4抗體的 輕鏈可變區的堿基序列。22. -種多核苷酸，其含有編碼在權利要求17至19中任一項所述的雙特異性抗體的抗 人TLR2抗體的重鏈的C末端經由接頭連結抗人TLR4抗體片段的N末端的融合體的堿基序列。23. 根據權利要求22所述的多核苷酸，其含有編碼由序列號4的氨基酸序列構成的所述 融合體的堿基序列。24. -種多核苷酸，其含有編碼權利要求17至19中任一項所述的雙特異性抗體的抗人 TLR2抗體的輕鏈的堿基序列。25. -種表達載體，其包含根據權利要求21所述的多核苷酸。26. -種表達載體，其包含根據權利要求22、23、和/或24所述的多核苷酸。27. -種用權利要求25所述的表達載體進行了轉化的宿主細胞，其選自由以下的（a)至 (d)構成的組： (a)用包含含有編碼由序列號4的氨基酸序號1至120的氨基酸序列構成的抗人TLR2抗 體的重鏈可變區的堿基序列的多核苷酸、含有編碼由序列號4的氨基酸序號491至609的氨 基酸序列構成的抗人TLR4抗體的重鏈可變區的堿基序列的多核苷酸、及含有編碼由序列號 4的氨基酸序號625至732的氨基酸序列構成的抗人TLR4抗體的輕鏈可變區的堿基序列的多 核苷酸的表達載體、和包含含有編碼由序列號6的氨基酸序號1至113的氨基酸序列構成的 抗人TLR2抗體的輕鏈可變區的堿基序列的多核苷酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞； (b) 用包含含有編碼由序列號4的氨基酸序號1至120的氨基酸序列構成的抗人TLR2抗 體的重鏈可變區的堿基序列的多核苷酸、含有編碼由序列號4的氨基酸序號491至609的氨 基酸序列構成的抗人TLR4抗體的重鏈可變區的堿基序列的多核苷酸、含有編碼由序列號4 的氨基酸序號625至732的氨基酸序列構成的抗人TLR4抗體的輕鏈可變區的堿基序列的多 核苷酸、及含有編碼由序列號6的氨基酸序號1至113的氨基酸序列構成的抗人TLR2抗體的 輕鏈可變區的堿基序列的多核苷酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞； (c) 用包含含有編碼由序列號4的氨基酸序號1至120的氨基酸序列構成的抗人TLR2抗 體的重鏈可變區的堿基序列的多核苷酸、含有編碼由序列號4的氨基酸序號491至609的氨 基酸序列構成的抗人TLR4抗體的重鏈可變區的堿基序列的多核苷酸、及含有編碼由序列號 4的氨基酸序號625至732的氨基酸序列構成的抗人TLR4抗體的輕鏈可變區的堿基序列的多 核苷酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞;以及 (d) 用包含含有編碼由序列號6的氨基酸序號1至113的氨基酸序列構成的抗人TLR2抗 體的輕鏈可變區的堿基序列的多核苷酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞。28. -種用權利要求25所述的表達載體進行了轉化的宿主細胞，其選自由以下的（a)至 (d)構成的組： (a) 用含有權利要求22或23所述的多核苷酸的表達載體和含有權利要求24所述的多核 苷酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞； (b) 用含有權利要求22或23所述的多核苷酸和權利要求24所述的多核苷酸的表達載體 進行了轉化的宿主細胞； (c) 用含有權利要求22或23所述的多核苷酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞；以及 (d) 用含有權利要求24所述的多核苷酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞。29. -種生產與人TLR2及人TLR4結合的雙特異性抗體的方法，包括：對選自由以下的 (a)至(c)構成的組中的宿主細胞進行培養，使與人TLR2及人TLR4結合的雙特異性抗體表達 的工序： (a) 用包含含有編碼由序列號4的氨基酸序號1至120的氨基酸序列構成的抗人TLR2抗 體的重鏈可變區的堿基序列的多核苷酸、含有編碼由序列號4的氨基酸序號491至609的氨 基酸序列構成的抗人TLR4抗體的重鏈可變區的堿基序列的多核苷酸、及含有編碼由序列號 4的氨基酸序號625至732的氨基酸序列構成的抗人TLR4抗體的輕鏈可變區的堿基序列的多 核苷酸的表達載體、和包含含有編碼由序列號6的氨基酸序號1至113的氨基酸序列構成的 抗人TLR2抗體的輕鏈可變區的堿基序列的多核苷酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞； (b) 用包含含有編碼由序列號4的氨基酸序號1至120的氨基酸序列構成的抗人TLR2抗 體的重鏈可變區的堿基序列的多核苷酸、含有編碼由序列號4的氨基酸序號491至609的氨 基酸序列構成的抗人TLR4抗體的重鏈可變區的堿基序列的多核苷酸、含有編碼由序列號4 的氨基酸序號625至732的氨基酸序列構成的抗人TLR4抗體的輕鏈可變區的堿基序列的多 核苷酸、及含有編碼由序列號6的氨基酸序號1至113的氨基酸序列構成的抗人TLR2抗體的 輕鏈可變區的堿基序列的多核苷酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞;以及 (C)用包含含有編碼由序列號4的氨基酸序號1至120的氨基酸序列構成的抗人TLR2抗 體的重鏈可變區的堿基序列的多核苷酸、含有編碼由序列號4的氨基酸序號491至609的氨 基酸序列構成的抗人TLR4抗體的重鏈可變區的堿基序列的多核苷酸、及含有編碼由序列號 4的氨基酸序號625至732的氨基酸序列構成的抗人TLR4抗體的輕鏈可變區的堿基序列的多 核苷酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞、以及用包含含有編碼由序列號6的氨基酸序號1 至113的氨基酸序列構成的抗人TLR2抗體的輕鏈可變區的堿基序列的多核苷酸的表達載體 進行了轉化的宿主細胞。30. -種生產抗與人TLR2及人TLR4結合的雙特異性抗體的方法，包括:對選自由以下的 (a)至(c)構成的組中的宿主細胞進行培養，使與人TLR2及人TLR4結合的雙特異性抗體表達 的工序： (a) 用含有權利要求22或23所述的多核苷酸的表達載體和含有權利要求24所述的多核 苷酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞； (b) 用含有權利要求22或23所述的多核苷酸和權利要求24所述的多核苷酸的表達載體 進行了轉化的宿主細胞；以及 (c) 用含有權利要求22或23所述的多核苷酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞、以及 用含有權利要求24所述的多核苷酸的表達載體進行了轉化的宿主細胞。31. -種與人TLR2及人TLR4結合的雙特異性抗體，其是通過權利要求29所述的方法生 產的。32. -種與人TLR2及人TLR4結合的雙特異性抗體，其是通過權利要求30所述的方法生 產的。33. -種醫藥組合物，其含有權利要求1至20、31及32中任一項所述的雙特異性抗體及 藥學上可接受的賦形劑。34. 根據權利要求33所述的醫藥組合物，其為免疫炎癥性疾病的預防或治療用醫藥組 合物。35. 根據權利要求34所述的醫藥組合物，其中，免疫炎癥性疾病為敗血癥或急性胰腺 炎。36. -種預防或治療免疫炎癥性疾病的方法，包括施用治療有效量的權利要求1至20、 31及32中任一項所述的雙特異性抗體的工序。37. 根據權利要求36所述的預防或治療的方法。其中，免疫炎癥性疾病為敗血癥或急性 胰腺炎。38. 根據權利要求1至20、31及32中任一項所述的雙特異性抗體，其用于在免疫炎癥性 疾病的預防或治療中使用。39. 根據權利要求38所述的雙特異性抗體，其中，免疫炎癥性疾病為敗血癥或急性胰腺 炎。40. 權利要求1至20、31及32中任一項所述的雙特異性抗體在免疫炎癥性疾病的預防或 治療用醫藥組合物制造中的應用。41. 根據權利要求40所述的雙特異性抗體的應用，其中，免疫炎癥性疾病為敗血癥或急 性胰腺炎。42. -種與人TLR2及人TLR4結合的雙特異性抗體，包含： 1) 含有由序列號4的氨基酸序號31至35的氨基酸序列構成的CDR1、由序列號4的氨基酸 序號50至66的氨基酸序列構成的CDR2、及由序列號4的氨基酸序號99至109的氨基酸序列構 成的CDR3的抗人TLR2抗體的重鏈可變區、以及含有由序列號6的氨基酸序號24至39的氨基 酸序列構成的CDR1、由序列號6的氨基酸序號55至61的氨基酸序列構成的CDR2、及由序列號 6的氨基酸序號94至102的氨基酸序列構成的CDR3的抗人TLR2抗體的輕鏈可變區；以及 2) 含有由序列號4的氨基酸序號521至525的氨基酸序列構成的CDR1、由序列號4的氨基 酸序號540至556的氨基酸序列構成的CDR2、及由序列號4的氨基酸序號589至598的氨基酸 序列構成的CDR3的抗人TLR4抗體的重鏈可變區、以及含有由序列號4的氨基酸序號648至 658的氨基酸序列構成的CDR1、由序列號4的氨基酸序號674至680的氨基酸序列構成的 CDR2、及由序列號4的氨基酸序號713至7 21的氨基酸序列構成的⑶R3的抗人TLR4抗體的輕 鏈可變區。
【文檔編號】C12N1/15GK106062193SQ201580011160
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2015年2月27日 公開號201580011160.9, CN 106062193 A, CN 106062193A, CN 201580011160, CN-A-106062193, CN106062193 A, CN106062193A, CN201580011160, CN201580011160.9, PCT/2015/55860, PCT/JP/15/055860, PCT/JP/15/55860, PCT/JP/2015/055860, PCT/JP/2015/55860, PCT/JP15/055860, PCT/JP15/55860, PCT/JP15055860, PCT/JP1555860, PCT/JP2015/055860, PCT/JP2015/55860, PCT/JP2015055860, PCT/JP201555860
【發明人】竹內聰, 佐藤雅人, 鈴木丈太郎, 曽我真司, 高崎淳, 青山康二, 奧山千枝
【申請人】安斯泰來制藥株式會社