新型玉米泛素啟動子的制作方法

新型玉米泛素啟動子的制作方法
【專利摘要】玉米栽培種B73泛素?1(玉米栽培種B73 Ubi?1)啟動子在植物中驅動組成型轉基因的高水平表達。在多基因構建體中反復使用相同的玉米栽培種B73 Ubi?1啟動子還會導致基因沉默，從而使轉基因產物有效性降低。提供了基因調控啟動子元件、構建體，和使用來自不同玉米基因型玉米栽培種Hi?II的Ubi?1啟動子的基因調節元件在植物細胞和/或植物組織中表達轉基因的方法。
【專利說明】新型玉米泛素啟動子
[0001] 相關專利申請相互參考
[0002] 本申請要求根據35 US巧119(e)獲得于2013年12月31日提交的美國臨時專利申請 系列號61/922，526的利益，其全部公開內容通過提述并入本文。
[0003] 援引電子提交的序列表
[0004] 序列表的正式拷貝已作為ASCII格式序列表通過EFS-Web電子提交，文件名為 "75664_ST25.txt"，創建于2014年12月30日，大小為11.4千字節，并與本說明書同時提交。 該ASCII格式文檔中包含的序列表是本說明書的一部分，并且其全部內容通過提述并入本 文。 發明領域
[0005] 本發明一般地設及植物分子生物學領域，更具體地，設及在植物中表達轉基因的 領域。
[0006] 背景
[0007]許多植物物種能夠被轉基因轉化，W引入農藝學期望的性狀或特征。開發和/或修 飾植物物種使之具有特定的期望性狀。一般地，期望的性狀包括，例如，提高營養價值品質、 增加產量、賦予病蟲害抗性、提高干旱和脅迫耐受性、提高園藝品質（例如，色素沉著和生 長）、賦予除草劑抗性、能夠從植物生產工業上有用的化合物和/或材料，和/或賦予生產藥 物的能力。
[000引通過植物轉化技術產生在單個基因組座位上堆疊多個轉基因的轉基因植物物種。 植物轉化技術將轉基因引入到植物細胞中，回收在植物基因組中穩定整合了轉基因拷貝的 能育的轉基因植物，隨后通過轉基因的轉錄和翻譯進行轉基因表達，從而產生具有期望性 狀和表型的轉基因植物。不過，能夠產生高表達W性狀堆疊的形式工程構建的多個轉基因 的轉基因植物物種的辦法是令人期望的。
[0009] 類似地，能夠在植物的特定組織或器官中表達轉基因的辦法也是令人期望的。例 如，通過用病原體抗性基因轉化植物基因組從而使病原體抗性蛋白在植物的根部強烈表 達，可能實現植物對±壤源性病原體感染的抗性提高。或者，可能期望在處于特定生長或發 育階段，例如細胞分裂或伸長期，的植物組織中表達轉基因。
[0010] 本文描述了玉米化i-1啟動子調節元件，其包括啟動子、上游啟動子、5'-UTR和內 含子。進一步描述了使用該基因調節元件的構建體和方法。
[00川概要
[0012] 本文公開了用于在植物細胞和/或植物組織中表達轉基因的啟動子、構建體和方 法。在一個實施方案中，轉基因的表達包括使用啟動子。在一個實施方案中，啟動子包含多 核巧酸序列。在一個實施方案中，啟動子多核巧酸序列包含上游啟動子，5'-非翻譯區（5'- UTR)或前導序列，和內含子。在一個實施方案中，啟動子多核巧酸序列包含泛素-1基因 化bi-1)。在一個實施方案中，啟動子多核巧酸序列包含玉米(Z.mays)的化i-1基因。
[0013] 在一個實施方案中，構建體包括基因表達盒，所述基因表達盒包含從玉米化i-1基 因獲得的啟動子多核巧酸序列。在一個實施方案中，來自玉米的化i-1啟動子多核巧酸序列 包括上游啟動子區，5'-UTR或前導序列，和內含子。在一個實施方案中，構建體包括基因表 達盒，所述基因表達盒包含從玉米化i-1基因獲得的啟動子多核巧酸序列，該啟動子多核巧 酸序列與來自杯水母屬(PMalidium)物種的黃色巧光蛋白編碼基因（PMYFP)的內含子融 合。在一個實施方案中，構建體包括基因表達盒，該基因表達盒包含來自玉米化i-1基因的 啟動子多核巧酸序列，所述啟動子多核巧酸序列與來自杯水母屬物種的黃色巧光蛋白編碼 基因（PMYFP)的內含子融合，隨后是來自玉米過氧化物酶5基因（ZmPer5)的3'-非翻譯區 (3'-UTR)。所得的多核巧酸序列包括新的啟動子基因調控元件。
[0014] 在一個實施方案中，基因表達盒包括與轉基因或異源編碼序列可操作連接的基因 啟動子調節元件。在一個實施方案中，基因表達盒包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更 多個轉基因。
[0015] 本文公開了培植植物的方法，所述植物使用新型基因啟動子調節元件(例如，上游 啟動子，5'-UTR和內含子)表達轉基因。本文還公開了培養植物組織和細胞的方法，所述植 物組織和細胞使用新的基因啟動子調節元件表達轉基因。在一個實施方案中，本文公開的 方法包括植物葉、根、愈傷組織和花粉中的組成型基因表達。本文還公開了純化包含新的基 因啟動子調節元件的多核巧酸序列的方法。
[0016] 附圖簡述
[0017]圖1顯示構成玉米栽培種B73化i-1基因的示意性的新型啟動子。該啟動子包括上 游元件、5'-UTR或前導序列，和內含子。該上游元件位于轉錄起始位點（TSS)的5'上游，用長 箭頭指示。該上游元件由調節元件（例如TATA盒，用短箭頭指示）和熱休克元件（用星號指 示)構成。
[0018]圖2顯示了載體PDAB105713的質粒圖，其包括PCR擴增的玉米栽培種化-II Ubi-1 基因的啟動子序列。
[0019] 圖3顯示了玉米栽培種B73 Ubi-1基因對照啟動子（SEQ ID N0:1)的多核巧酸序 列，上游啟動子區用下劃線指示，5'-UTR/前導序列用陰影指示，內含子區用小寫字母指示。
[0020] 圖4顯示了玉米栽培種化-II Ubi-1啟動子(SEQ ID N0:2)的多核巧酸序列，上游 啟動子區用下劃線指示，5'-UTR/前導序列用陰影指示，內含子區用小寫字母指示。
[0021] 圖5顯示了玉米栽培種化-II的上游啟動子區（SEQ ID NO:4)與玉米栽培種B73的 對照上游啟動子序列(SEQ ID N0:3)的多核巧酸序列比對。
[0022] 圖6顯示了玉米栽培種化-n的5'-UTR/前導區（SEQ ID N0:6)與玉米栽培種B73的 對照5'-UTR/前導序列（SEQ ID N0:5)的多核巧酸序列比對。
[0023] 圖7顯示了玉米栽培種化-II的內含子區（SEQ ID NO:8)與玉米栽培種B73的對照 內含子序列(SEQ ID NO:7)的多核巧酸序列比對。
[0024] 圖8顯示了二元表達構建體PDAB105748的載體圖，其包括插入在目的載體 pDABl0197中的對照入口載體pDABl05742(玉米栽培種B73)。
[002引圖9顯示了二元表達構建體PDAB105746的載體圖，其包括插入在目的載體 PDAB10197中的入口載體pDAB105740(玉米栽培種Hi-II)。
[0026] 詳細說明
[0027] 定義
[002引如本文所使用的，除非在上下文中清晰且明確地指出，否則冠詞"一"、"一個"和 "該"包括復數指代。
[0029] 如本文所使用的，術語"回交"是指如下的過程，其中育種者將雜交后代與其中一 個親本雜交，例如第一代雜交體F1與F1雜交體的親本基因型的其中一個雜交。
[0030] 如本文所使用的，術語"內含子"是指基因（或者被表達的感興趣核巧酸序列）中包 含的任何被轉錄但不被翻譯的核酸序列。內含子包括被表達的DNA序列內的非翻譯核酸序 列，W及從其轉錄的RNA分子中的相應序列。
[0031] 本文所述的構建體還可W包含可增強翻譯和/或mRNA穩定性的序列，例如內含子。 運樣的一個內含子的實例是擬南芥組蛋白H3變異體基因 II的第一內含子，或者任何其它公 知的內含子序列。內含子可W和啟動子序列組合使用，W提高翻譯和/或mRNA穩定性。
[0032] 如本文所使用的，術語"5 '非翻譯區"或"5 ' -UTR"是指前mRNA或成熟mRNA 5 '端的 非翻譯區段。例如，在成熟的mRNA上，5'-UTR通常在其5'端有一個7-甲基鳥巧帽，并且參與 許多過程，例如剪接、多酷巧酸化、mRNA外排到細胞質、mRNA的5 '端被翻譯機構識別，和保護 mRNA免于降解。
[0033] 如本文所使用的，術語"3 '非翻譯區"或"3 ' -UTR"是指前mRNA或成熟mRNA 53 '端的 非翻譯區段。例如，在成熟的mRNA上，運個區域具有多-(A)尾己，并且已知在mRNA穩定性、翻 譯起始和mRNA外轉運中具有多種功能。
[0034] 如本文所使用的，術語"多腺巧酸化信號"是指mRNA轉錄本中存在的核酸序列，其 在多-(A)聚合酶存在時允許轉錄本的多酷巧酸化位點（例如位于多-(A)信號下游10-30個 堿基）多酷巧酸化。許多多酷巧酸化信號是本領域已知的，并可用于本發明。一個示例性序 列包括AAUAAA及其變異體，如Loke J.，et al.，（2005)Plant Physiology 138(3); 1457- 1468所述。
[0035] 如本文所使用的，術語"分離的"是指與該組分自然存在的生物體細胞中的其它生 物組分（即，其它染色質和染色質外DNA)分離的生物組分(包括核酸或蛋白質）。
[0036] 如本文所使用的，在指示核酸分子時，術語"純化的"不需要絕對的純(例如，同質 的制備物）。相反，它表示該序列比其在天然的細胞環境中相對更純。例如，核酸的"純化"水 平在濃度或基因表達水平上應當比自然水平大至少2-5倍。
[0037] 請求保護的DNA分子可W從總DNA或總RNA中直接分離。此外，cDNA克隆不是自然存 在的，但優選地通過對部分純化的、天然存在的物質（信使RNA)進行操作而得。從mRNA構建 cDNA文庫設及創制合成的物質（cDNA)。單個cDNA克隆能夠通過對攜帶cDNA文庫的細胞進行 克隆選擇而從合成文庫中純化。因此，包括從mRNA構建cDNA文庫和純化不同cDNA克隆的過 程會產出純化大約1〇6倍的天然信息。類似地，啟動子DNA序列可W被克隆到質粒中。運種質 粒不是天然存在的，而是優選地通過對部分純化的、天然存在的物質例如基因組DNA文庫進 行操作而獲得的。因此，在運些技術中，優選地使純化放大至少1個數量級，在一些實施方案 中，放大2個或3個數量級，在其它實施方案中，放大4個或5個或更多個數量級。
[003引類似地，純化表示組分DNA序列發生了化學或功能上的改變。"被純化"的核酸分子 和蛋白質包括通過標準純化方法純化的核酸分子和蛋白質。術語"純化的"還包括通過重組 DNA方法在宿主細胞(例如植物細胞）中制備的核酸和蛋白質，W及化學合成的核酸分子、蛋 白質和膚。
[0039] 術語"重組的"意思是其中發生了遺傳重組的細胞或生物體。它還包括通過人為干 預被人工或合成（即非自然的）改變的分子(例如，載體、質粒、核酸、多膚或小RNA)。對分子 進行改變可W在其自然環境或狀態下執行或者從其自然環境或狀態下移除。
[0040] 如本文所使用的，術語"表達"是指多核巧酸被轉錄成mRNA(包括小RNA分子）的過 程，和/或被轉錄的mRNA(也稱作"轉錄本"）被隨后翻譯成膚、多膚或蛋白質的過程。基因表 達可能受到外部信號的影響，例如細胞、組織或生物體暴露于可增加或降低基因表達的試 劑。基因的表達還可W在從DNA到RNA到蛋白質的通路的任何位置被調節。基因表達的調節 通過例如控制轉錄、翻譯、RNA轉運和加工、中間分子如mRNA的降解，或者通過在特定蛋白質 分子被制造出后使它們激活、失活、區室化或降解，或者通過它們的組合，而發生。基因表達 可W在RNA水平或蛋白質水平通過本領域已知的任何方法進行測量，包括但不僅限于， No;rthe;rn印跡、RT-PCR、Weste;rn印跡、或者體外、原位或體內蛋白活性測定。
[0041 ]如本文所使用的，術語"基于同源性的基因沉默"或"HBGS"是通用術語，其包括轉 錄基因沉默和轉錄后基因沉默。祀基因座被非連鎖的沉默基因座沉默可W由轉錄抑制(轉 錄基因沉默;TGS)或mRNA降解(轉錄后基因沉默;PTGS)導致，它們分別是由于產生了相應于 啟動子或轉錄序列的雙鏈RNA(dsRNA)。每個過程設及不同的細胞組分，運表明dsRNA誘導的 TGS和PTGS很可能來自于一個共同的古老機制的多樣化。然而，難W進行對TGS和PTGS的嚴 格比較，因為運一般依賴于對不同沉默基因座的分析。單個轉基因座位可W被描述為可觸 發TGS和PTGS二者，因為它會產生相應于不同祀基因的啟動子和被轉錄序列的dsRNA。
[0042] 如本文所使用的，術語"核酸分子"、"核酸"或"多核巧酸"（所有運S個術語彼此之 間是同義的）是指多聚體形式的核巧酸，其可W包括RNA、cDNA、基因組DNA的有義和反義鏈， 及其合成形式和混合聚合物。"核巧酸"可W指核糖核巧酸、脫氧核糖核巧酸或或任一種核 巧酸的修飾形式。除非另外指出，否則核酸分子的長度通常為至少10個堿基。該術語可W指 不定長度的RNA或DNA分子。該術語包括單鏈和雙鏈形式的DNA。核酸分子可W包括天然存在 的和/或經過修飾的核巧酸，藉由天然存在的和/或非天然存在的核巧酸鍵連而連接在一 起。
[0043] 核酸分子可W被化學修飾或者生物化學修飾，或者可W包含非天然的或衍生化的 核巧酸堿基，運是本領域技術人員可W容易理解的。運些修飾包括，例如，標簽、甲基化、一 個或多個天然發生的核巧酸用類似物取代、核巧酸內部修飾(例如不帶電的連接:例如，甲 基麟酸醋，憐酸=醋，憐酷胺，氨基甲酸醋等;帶電荷的連接:例如，硫代憐酸醋，二硫代憐酸 醋等;懸垂部分:例如，膚;嵌入劑:例如，叮晚，補骨脂素等;馨合劑;燒化劑;和修飾的鍵:例 如，a異頭核酸等）。術語"核酸分子"還包括任何拓撲構象，包括單鏈、雙鏈、部分雙鏈體、= 鏈體(triplexed)，發針式化airpinned)，圓形和掛鎖構象。
[0044] 轉錄沿著DNA鏈沿著5'-3'的方式前進。運意味著，RNA的制備是通過向生長鏈的3' 端順次添加核糖核巧酸-5'-=憐酸(要求清除焦憐酸）。在線性或環狀核酸分子中，如果離 散的元件（例如，特定的核巧酸序列）鍵合或者將要鍵合于相同核酸上的其他元件的5'方 向，則其被稱作位于該其他元件的"上游"。類似地，如果離散的元件鍵合或者將要鍵合于相 同核酸上的其他元件的3'方向，則其被稱作位于該其他元件的"下游"。
[0045] 如本文所使用的，術語"堿基位置"是指給定堿基或核巧酸殘基在指定核酸內的位 置。指定的核酸可W通過與參考核酸進行比對加 W定義。
[0046] 如本文所使用的，術語"雜交"是指多核巧酸或寡核巧酸和它們的類似物通過互補 堿基之間的氨鍵鍵合而雜交的過程，氨鍵包括巧曰13011-吐；[。4、化0旨3166]1或反向化0旨3166]1 氨鍵。一般地，核酸分子包括含氮堿基，含氮堿基是喀晚(胞喀晚(C)，尿喀晚化)和胸腺喀晚 (T))或者嚷嶺（腺嚷嶺(A)和鳥嚷嶺(G))。運些含氮堿基在喀晚與嚷嶺之間形成氨鍵，喀晚 與嚷嶺的鍵合稱作"堿基配對"。更具體地，A與T或U氨鍵鍵合，G與C鍵合。巧補"是指兩個不 同核酸序列或同一核酸序列的兩個不同區域之間發生的堿基配對。
[0047] 如本文所使用的，術語"可特異性雜交"或"特異性互補"是指足夠程度的互補性， 使得在寡核巧酸/多核巧酸和DNA或RNA祀之間發生穩定而特異的結合。寡核巧酸/多核巧酸 不需要與祀序列100%互補才能特異性雜交。當寡核巧酸/多核巧酸與祀DNA或RNA分子的結 合會干擾祀DNA或RNA的正常功能，并且存在足夠程度的互補性W避免寡核巧酸/多核巧酸 在特異性結合所期望的條件下（例如在體內測定或系統的生理條件下）與非祀序列發生非 特異性結合時，寡核巧酸/多核巧酸是可特異性雜交的。運種結合被稱作特異性雜交。導致 特定嚴格程度的雜交條件隨著所選雜交方法的性質和雜交核酸序列的組成和長度而改變。 一般地，雜交溫度和雜交緩沖液的離子強度(特別是化+和/或Mgh濃度)對雜交嚴格度有貢 獻，但清洗次數也會影響嚴格度。關于獲得特定嚴格程度所需的雜交條件的計算在 Sambrooket al. (ed.) .Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2片反，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York, 1989中有討論。
[0048] 如本文所使用的，術語"嚴格條件"包括如下條件，其中只有當雜交分子和DM祀之 間的錯配小于50 %時才會發生雜交。"嚴格條件"包括進一步特定水平的嚴格性。因此，如本 文所使用的，"中等嚴格"條件是指序列錯配超過50%的分子不會雜交的條件；"高嚴格"條 件是指序列錯配超過20 %的序列不會雜交的條件；和"極高嚴格"條件是指序列錯配超過 10%的序列不會雜交的條件。在特定的實施方案中，嚴格條件可W包括在65°C雜交，隨后在 65°C用0. lx SSC/0.1 %SDS清洗40分鐘。下面是代表性的、非限制性的雜交條件：
[0049] ?極高嚴格性:在5x SSC緩沖液中65°C雜交16個小時；在2x SSC緩沖液中室溫下 清洗2次，每次15分鐘;和在0.5x SSC緩沖液中65 °C清洗2次，每次20分鐘。
[0化0] ?高嚴格性:在5-6x SSC緩沖液中65-70°C雜交16-20個小時；在2x SSC緩沖液中 室溫下清洗2次，每次5-20分鐘;和在lx SSC緩沖液中55-70°C清洗2次，每次30分鐘。
[0化1] ?中等嚴格性:在6x SSC緩沖液中在室溫-55°C雜交16-20個小時；在2-3x SSC緩 沖液中室溫下清洗至少2次，每次20-30分鐘。
[0052] 在一個實施方案中，可特異性雜交的核酸分子能夠在極高嚴格性雜交條件下保持 結合。在一個實施方案中，可特異性雜交的核酸分子能夠在高嚴格性雜交條件下保持結合。 在一個實施方案中，可特異性雜交的核酸分子能夠在中等嚴格性雜交條件下保持結合。
[0053] 如本文所使用的，術語"寡核巧酸"是指短核酸多聚體。寡核巧酸可W通過切割長 核酸區段或者通過聚合單個核巧酸前體而形成。自動合成儀允許合成長度達數百個堿基對 的寡核巧酸。因為寡核巧酸可W結合互補的核巧酸序列，所W它們被用作檢測DNA或RNA的 探針。由DNA構成的寡核巧酸(寡脫氧核糖核巧酸)可W用在聚合酶鏈式反應中，運是一種用 于擴增小DNA序列的技術。在聚合酶鏈式反應中，寡核巧酸通常被稱作"引物"，其允許DNA聚 合酶延伸寡核巧酸并復制互補鏈。
[0054] 如本文所使用的，術語"聚合酶鏈式反應"或"PCR"是指一種微量的核酸、RNA和/或 DM被擴增的程序或技術，其中，如美國專利No. 4，683，195所述。一般地，來自感興趣區域末 端或超過該末端的序列信息必須可得，才能設計寡核巧酸引物;運些引物在序列上與待擴 增模板的相對鏈相同或相似。兩個引物的5'端核巧酸可W和被擴增材料的末端一致。PCR可 用于擴增特定的RNA序列，從總基因組DNA中擴增特定的DNA序列，和從總細胞RNA、隧菌體或 質粒序列中轉錄cDNA，等。一般地參見Mul 1 is et al Cold Spring Harbor Symp .Quant .Biol. ,51: 263( 1987) ;E；;rlich編輯，PCR Technology, (Stockton Press ,NY, 1989)。
[0055] 如本文所使用的，術語"引物"是指當條件適合于合成引物延伸產物時，能夠作為 沿著互補鏈的合成起始點的寡核巧酸。合成條件包括四種不同的脫氧核糖核巧酸=憐酸和 至少一種聚合誘導劑例如逆轉錄酶或DNA聚合酶的存在。它們處于合適的緩沖液中，該緩沖 液包括輔助因子或可W在各種合適的溫度下影響條件(例如抑等）的成分。引物優選地是單 鏈序列，從而可W使擴增效率最佳，但是也可W使用雙鏈序列。
[0056] 如本文所使用的，術語"探針"是指與祀序列雜交的寡核巧酸或多核巧酸序列。在 TaqMan 1'或TaqMan K類測定程序中，探針與位于兩個引物退火位點之間的祀部分雜交。 探針包括大約8個核巧酸，大約10個核巧酸，大約15個核巧酸，大約20個核巧酸，大約30個核 巧酸，大約40個核巧酸，或者大約50個核巧酸。在一些實施方案中，探針包括大約8個核巧 酸-大約15個核巧酸。
[0化7] 在Southern印跡測定程序中，探針與附著在膜上的DNA片段雜交。在運種測定中， 探針包括大約10個核巧酸，大約100個核巧酸，大約250個核巧酸，大約500個核巧酸，大約1， 000個核巧酸，大約2，500個核巧酸，或者大約2，500個核巧酸。
[0058] 探針可W進一步包括可檢測的標簽，例如放射性標簽、生物素化標簽、巧光團（ Texas-Red?,異硫氯酸巧光素，等）。可檢測的標簽可W直接共價連接到探針寡核巧酸上， 例如位于探針的5'端或探針的3'端。包含巧光團的探針還進一步包括澤滅劑（例如Black Hole 如encher?,i〇wa Black?等）。
[0059] 如本文所使用的，術語"序列同一性"或"同一性"可W互換使用，指當通過比對兩 個序列W在特定比較窗口上實現最大的相應度時，兩個序列中相同的核酸殘基。
[0060] 如本文所使用的，術語"百分比序列同一性"是指通過比較在比較窗口上最佳比對 的序列(例如，核酸序列或氨基酸序列)而確定的數值，其中為了使兩個序列實現最佳比對， 一個序列在比較窗口中的部分與參考序列（其不包含添加或缺失)相比，可W包含添加或缺 失（即，缺口）。通過確定兩個序列中出現相同核酸或氨基酸殘基的位置的數目W產生匹配 位置的數目，用匹配位置的數目除W比較窗口中的位置總數，所得結果乘W100計算出百分 數，從而產生百分比序列同一性。比對序列W供比較的方法是眾所周知的。各種程序和比對 算法在下列文獻中有描述，例如：Smith and Watermark 1981)AdV. A郵1. Math . 2 : 482 ; Needleman and Wunsch(1970)J.Mo 1. Biol.48:443；Pearson and Lipman(1988) Proc.化tl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444;Higgins and 化arp(1988)Gene 73:237-44; Higgins and Sha;rp(1989)CABI0S 5:151_3;Corpetet al.(1988)Nucleic Acids Res.16: 10881-90;Huang et al.(1992)Comp.Appl.Biosci.8:155_65;Pearson et al.(1994) Methods Mol.Biol.24:307-31；Tatiana et al.(1999)FEMS Microbiol. Lett.174:247- 50 o
[0061 ] 美國國家生物技術信息中屯、(NCBI)基本局部比對捜索工具(BLAST?;Altschulet al.( 1990) J.Mol. Biol. 215:403-10)可W從多個來源訪問，包括美國國家生物技術信息中 屯、(Bethesda，MD)和在互聯網上，用于和多種序列分析程序結合使用。關于如何使用該程序 確定序列同一性的描述可W在互聯網上在化AST?的"幫助"部分獲得。對于核酸序列的比 較，可W使用默認參數執行BLAST?程序的"blast 2序列"功能(Blastn)。當使用運種方法進 行評估時，與參考序列的相似性越大的核酸序列將顯示更高的百分比同一性。
[0062] 如本文所使用的，術語"可操作連接"是指核酸被置于與另一個核酸的功能關系 中。一般地，"可操作連接"可W表示被連接的各核酸是郵連的。連接可W通過在方便限制位 點處進行連接作用來實現。如果不存在運些位點，則用合成的寡核巧酸銜接子或結構與核 酸進行連接作用或退火，并用于連接郵連的多核巧酸片段。然而，元件不必是郵連的才能可 操作連接。
[0063] 如本文所使用的，"啟動子"是指一段DNA區域，其一般位于基因的上游(朝著基因 的5'區），并且是觸發和驅動基因轉錄所需要的。啟動子可W允許它所控制的基因被合適地 激活或抑制。啟動子可能含有被轉錄因子識別的特定序列。運些因子可W結合啟動子DNA序 列，導致RNA聚合酶被招募，運種酶從基因的編碼區合成RNA。啟動子一般指位于基因上游的 全部基因調節元件，包括上游啟動子、5'-UTR、內含子和前導序列。
[0064] 如本文所使用的，術語"上游啟動子"是指足夠指導轉錄起始的一段郵連的多核巧 酸序列。如本文所使用的，上游啟動子包括轉錄起始位點，其具有多個序列基序，包括TATA 盒、起始子序列（initiator sequence)、TFI IB識別元件（BRE )和其它啟動子基序 (Jennifer，E.F.et al.，（ 2002 )Genes&Dev .，16: 2583-2592)。上游啟動子提供了RNA 聚合酶 11( 一種多亞基酶)與基礎或一般轉錄因子如TFIIA，B，D，E，F和H的作用位點。運些因子組裝 成轉錄前-起始復合體，后者催化從DNA模板合成RNA。
[0065] 上游啟動子的激活是通過加入調節性DNA序列元件，多種蛋白質與調節性DNA序列 元件結合，并隨后與轉錄起始復合體接觸從而激活基因表達。運些基因調節元件序列與特 定的DNA結合因子相互作用。運些序列基序有時被稱作順式元件。運些順式元件與組織特異 性或發育特異性轉錄因子結合，它們可W單獨或者組合地在轉錄水平上決定啟動子的時空 表達模式。運些順式元件對可操作連接基因的控制類型可能差異很大。一些元件會響應環 境響應(例如溫度、濕度、和致傷)使可操作連接基因的轉錄增加。其它順式元件可W響應發 育線索（例如萌發、種子成熟和開花）或者響應空間信息（例如組織特異性）。參見例如 Langridge et al.,(1989)P;roc.Natl.Acad.Sci.USA 86:3219-23。運些順勢元件的位置與 轉錄起始點的距離并不相同，一些順式元件(稱作鄰近元件)與最小核屯、啟動子區域郵鄰， 而其它元件可W位于啟動子上游或下游數千堿基的位置(增強子）。
[0066] 如本文所使用的，術語"轉化"包括所有能夠將核酸分子引入到細胞內的技術。實 例包括，但不僅限于：病毒載體轉染；質粒載體轉化；電穿孔；脂質體轉染；顯微注射 (Mueller et al.(1978)Cell 15:579-85) ;±壤桿菌介導的轉移;直接DNA攝入;WHISKERS? 介導的轉化;和微射彈轟擊。運些技術可用于植物細胞的穩定轉化和瞬時轉化二者。"穩定 轉化"是指核酸片段引入到宿主生物體的基因組內，導致在遺傳上穩定的繼承。一旦被穩定 轉化，核酸片段便穩定地整合進宿主生物體和任何后代的基因組中。含有轉化核酸片段的 宿主生物被稱為"轉基因"生物。"瞬時轉化"是指核酸片段被引入到宿主生物體的細胞核或 含DNA的細胞器中，引起基因表達但不會在遺傳上穩定的繼承。
[0067] 如本文所使用的，術語"轉導"是指病毒將核酸轉移到細胞內的過程。
[0068] 如本文所使用的，術語"轉基因"是指外源核酸序列。在一個實例中，轉基因是基因 序列(例如，除草劑抗性基因），編碼工業或制藥上有用的化合物的基因，或者編碼期望農藝 學性狀的基因。在另外的實施例中，轉基因是反義核酸序列，其中該反義核酸序列的表達會 抑制祀核酸序列的表達。轉基因可W含有與轉基因可操作連接的調節序列（例如，啟動子、 內含子或3'-UTR)。在一些實施方案中，感興趣的核酸是轉基因。然而，在其它實施方案中， 感興趣的核酸是內源核酸，其中該內源核酸的額外基因組拷貝是期望的，或者是與宿主生 物體中的祀核酸序列處于反義取向的核酸。
[0069] 如本文所使用的，術語"載體"是指被引入到細胞內從而產生轉化細胞的核酸分 子。載體可W包括允許它在宿主細胞內復制的核酸序列，例如復制原點。實例包括，但不僅 限于，質粒、粘粒、隧菌體、細菌人工染色體(BAC)，或可攜帶外來DNA進入細胞的病毒。載體 還可W包括一個或多個基因、反義分子和/或選擇標志物基因和本領域已知的其它遺傳元 件。載體可W轉導、轉化或感染細胞，借此導致細胞表達核酸分子和/或由該載體編碼的蛋 白質。載體可W任意地包括幫助核酸分子進入細胞內的材料(例如脂質體）。
[0070] 如本文所使用的，術語"盒子"、"表達盒"和"基因表達盒"是指能夠被插入到核酸 或多核巧酸的特定限制位點處或者通過同源重組插入核酸或多核巧酸的DNA區段。DNA區段 包括含有感興趣基因的多核巧酸，感興趣基因編碼感興趣的小RNA或多膚，并且該盒子和限 制位點被設計成確保盒子W正確的閱讀框被插入，W保證轉錄和翻譯。在一個實施方案中， 表達盒可包括編碼感興趣的小RNA或多膚的多核巧酸，并可具有除該多核巧酸之外的促進 特定宿主細胞的轉化的元件。在一個實施方案中，基因表達盒還可W包括如下元件，其允許 在宿主細胞中增強編碼感興趣的小RNA或多膚的多核巧酸的表達。運些元件可W包括，但不 僅限于：啟動子，最小啟動子，增強子，應答元件，內含子，5'非翻譯區序列，3'非翻譯區序 列，終止子序列，多腺巧酸化序列，等。
[0071] 如本文所使用的，術語"異源編碼序列"用于指示任何編碼、或者最終編碼膚或蛋 白質或其等價氨基酸序列(例如酶)的多核巧酸，所述膚或蛋白質或其等價氨基酸序列在宿 主生物體中通常不存在，并且在合適的條件下能夠在宿主細胞中表達。運樣，"異源編碼序 列"可W包括一個或多個拷貝的在宿主細胞中通常不存在的編碼序列，從而使細胞表達額 外拷貝的在細胞中通常不存在的編碼序列。異源編碼序列可W是RNA或者其任何類型(例如 mRNA)，DNA或其任何類型（例如cDNA)，或RNA/DNA的雜交體。編碼序列的實例包括，但不僅限 于，全長轉錄單元，其包括例如編碼序列、內含子、啟動子區、5/-UTR、3/-UTR和增強子區等 特征。
[0072] "異源編碼序列"還包括膚或酶的編碼部分（即cDNA或mRNA序列），全長轉錄單元的 編碼部分（即包含內含子和外顯子的基因），編碼酶或者編碼其等價氨基酸序列的"密碼子 優化"序列、截短的序列和其它具有改變的序列的形式，前提是該等價氨基酸序列可產生功 能性蛋白。運樣的等價氨基酸序列可W具有一個或多個氨基酸缺失，該缺失在N端、C端或內 部。也設想了截短的形式，只要它們具有本文所述的催化能力即可。
[0073] 如本文所使用的，術語"對照"是指在分析程序中用于比較目的的樣品。對照可W 是"陽性"或"陰性"。例如，當分析程序的目的是檢測細胞或組織中差異表達的轉錄本或多 膚時，一般優選地包含陽性對照，例如來自已知顯示期望表達的植物的樣品，和陰性對照， 例如來自已知缺少期望表達的植物的樣品。
[0074]如本文所使用的，術語"植物"包括植物和植物部分，包括但不僅限于，植物細胞和 植物組織，例如葉、愈傷組織、莖、根、花、花粉和種子。可W在本發明中使用的植物類別寬泛 到包括適合于誘變的高等和低等植物，包括被子植物，裸子植物，藤類植物和多細胞藻類。 因此，"植物"包括雙子葉和單子葉植物。雙子葉植物的實例包括煙草，擬南芥，大豆，番茄， 木瓜，芥花(canola),向日葵，棉花，首猜，馬鈴馨，葡萄，木豆，魏豆，蕓苔(Brassica)，鷹嘴 豆，甜菜，油菜，西瓜，甜瓜，辣椒，花生，南瓜，蘿h渡菜，倭瓜，西蘭花，卷屯、菜，胡蘿h花挪 菜，芹菜，大白菜，黃瓜，茄子，和窩宦。單子葉植物的實例包括玉米，大米，小麥，甘薦，大麥， 黑麥，高梁，蘭花，竹，香蕉，香蒲，百合，燕麥，洋蔥，小米和黑小麥。
[007引如本文所使用的，術語"植物部分"是指葉、愈傷組織、莖、根、花或花的部分、果實、 花粉、卵細胞、合子、種子、插條、細胞或組織培養物，或者植物的任何其它部分或產物。在一 個實施方案中，植物材料包括子葉和葉。在一個實施方案中，植物材料包括根組織和其它位 于地下的植物組織。
[0076] 如本文所使用的，術語"選擇標志物基因"是指在植物轉化中被任選地用于例如保 護植物細胞免于選擇劑的傷害或者提供對選擇劑的抗性/耐受性的基因。此外，"選擇標志 物基因"意圖包括報告基因。只有那些接受了功能性的選擇標志物的細胞或植物才能夠在 具有選擇劑的條件下分裂或生長。選擇劑的實例可包括，例如，抗生素，包括壯觀霉素，新霉 素，卡那霉素，己龍霉素，慶大霉素，和潮霉素。運些選擇標志物包括新霉素憐酸轉移(npt II)，其表達的酶可賦予對抗生素卡那霉素的抗性，和針對相關抗生素新霉素、己龍霉素、慶 大霉素和G418的基因，或者潮霉素憐酸轉移酶化pt)的基因，其表達的酶可賦予對潮霉素的 抗性。其它選擇標志物基因可W包括編碼除草劑抗性的基因，包括bar或pat(抵抗草錠麟錠 鹽或麟絲菌素），乙酷乳酸合酶(ALS，抵抗抑制劑例如橫酷脈類(SU)，咪挫嘟酬類（IMI)，S 挫并喀晚(TP)，喀晚氧基苯甲酸(pyrimidinyloxybenzoate)(POB)，和橫酷幾基S挫嘟酬， 其可阻止支鏈氨基酸合成的第一步，草甘麟，2,4-D和金屬抗性或敏感性。可W用來作為選 擇標志物基因的"報告基因"的實例包括可W視覺觀察所表達報告基因的蛋白，例如編碼0 葡糖巧酸酶(GUS)、巧光素酶、綠色巧光蛋白（GFP)、黃色巧光蛋白蛋白（YFP)、化RecUe-半乳 糖巧酶、氯霉素乙酷轉移酶(CAT)、堿性憐酸酶和類似物的蛋白質。短語"標志物陽性"是指 已經被轉化為包含選擇標志物基因的植物。
[0077] 如本文所使用的，術語"可檢測標志物"是指能夠檢測的標記，例如放射性同位素， 巧光化合物，生物發光化合物，化學發光化合物，金屬馨合劑，或酶。可檢測標記物的實例包 括，但不僅限于，下述者：巧光標記(例如，FITC，羅丹明，銅系憐光體），酶標記(例如辣根過 氧化物酶，e半乳糖巧酶，蛋光素酶，堿性憐酸酶），化學發光，生物素基團，可W被第二報告 分子識別的預定多膚表位(例如，亮氨酸拉鏈對序列，第二抗體的結合位點，金屬結合結構 域，附加表位）。在一個實施方案中，可檢測標記物可W附加各種長度的間隔臂，W減少潛在 的空間位阻。
[0078] 如本文所使用的，術語"檢測"使用其最廣泛的含義，包括對特定分子的定性和定 量測量，例如測量特定的多膚。
[0079] 除非另有具體說明，否則本文使用的所有技術和科學術語具有與本公開所屬領域 普通技術人員所公知的相同的含義。分子生物學常用術語的定義可W在列文獻中找到，例 如：Lewin,Genes V,Oxford University Press,1994;Kendrew et al.(編輯），^6 Encyclopedia of Molecular Biology,Blackwell Science Ltd., 1994;和Meyers(編輯）， Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference ,VCH Publishers,Inc.,1995。
[0080] 啟動子作為基因表達調節元件
[0081] 用于基礎研究或生物技術應用的植物啟動子一般是單向的，指導融合到其3'端 (下游）的轉基因的組成型表達。代謝工程和性狀堆疊通常需要在植物體內強表達轉基因。 此外，在轉基因作物中通常需要多個新啟動子來驅動多個基因的表達。本文公開了能夠指 導融合在其3'端的轉基因的表達的組成型啟動子。
[0082] 轉基因產品的開發日益復雜，需要強表達轉基因并在單個基因座中堆疊多個轉基 因。傳統上，每個轉基因的表達通常需要一個獨特的啟動子，其中在一個基因堆疊內需要多 個啟動子來表達不同的轉基因。隨著基因堆疊規模的增加，運經常導致為了表達單個多基 因性狀而重復使用相同的啟動子，W獲得不同轉基因的相似水平的表達模式。
[0083] 已知受相同啟動子驅動的多基因構建體會導致基因沉默，導致轉基因產物在大田 中有效的效力降低。由于啟動子重復而產生的過多的轉錄因子(TF)結合位點會導致內源TF 的枯竭，從而使轉錄失活。轉基因沉默很可能對為表達轉基因而產生的轉基因植物的性能 帶來不利影響。轉基因內的重復序列會導致基因座位內的同源重組，進而導致多核巧酸重 排。
[0084] 除了組成型啟動子，組織特異性或者器官特異性啟動子驅動基因在特定的組織 中，如在谷粒、根、葉、愈傷組織、花粉或植物的絨拉層中表達。組織和發育階段特異的啟動 子驅動基因在特定的組織中或者在植物發育過程的特定時間段內表達。組織特異性啟動子 對于轉基因植物產業的某些應用是需要的，并且是期望的，因為它們允許在不同組織和/或 在選定的發育階段中特異性地表達異源基因，指示異源基因在各種器官、組織和/或在不同 時間內差異性表達，而非在其他情況下表達。
[0085] 例如，可W通過用病原抗性基因轉化植物基因組，使得病原體抗性蛋白在植物中 強烈表達，來實現增強植物對±壤傳播的病原體的感染的抵抗力。或者，可能期望在處于特 定生長或發育階段，例如細胞分裂或伸長期，的植物組織中表達轉基因。另一個應用是使用 組織特異性啟動子的可取之處，使得啟動子能夠將編碼農藝性狀的轉基因的表達限制在發 育中的植物部分(即，根，葉，愈傷組織，或花粉)中。
[0086] 本文所述的啟動子可望成為制備含有多個基因的商業轉基因構建體的工具。運些 啟動子還提供了在細菌宿主內的結構穩定性和在植物細胞中的功能穩定性，例如減少轉基 因沉默，從而為轉基因表達創造條件。具有不同表達范圍的啟動子，也可W通過使用本文所 述的方法獲得。相比于多次使用單個啟動子的轉基因構建體，本申請中描述的多樣化啟動 子構建體更加適合轉基因事件的下游分子分析。使用本文描述的多樣化啟動子還可W減少 在用鋒指技術進行祀定過程中轉基因多基因座位的重排(SHUKLA等人.2009)。
[0087] 玉米泛素-1啟動子
[0088] 玉米師i-1啟動子已經成為生物技術產業的標準手段，主要用于在玉米中穩定高 表達轉基因 （CHRISTENSEN and QUAIL 1996;CHRISTENSEN et al.l992;T0KI et al. 1992)。每個轉基因的充分表達通常需要一個特定的啟動子。在一個基因堆疊中通常需 要多個啟動子來表達不同的轉基因。運種范式經常導致重復使用玉米化i-1啟動子，因為它 有令人期望的高水平蛋白質表達和組成型表達模式。
[0089] 然而，在轉基因座位內故意引入重復的序列也會對轉基因的表達和穩定性產生不 期望的負面影響（FLADUNG and KUMAR 2002;KUMAR and FLADUNG 2000a;KUMAR and FLADUNG 2000b；KUMAR and FLADUNG 200la；KUMAR and FLADUNG 2001b；KUMAR and 化ADUNG 2002;METTE et al.l999;M0URRAIN et al.2007)。多個轉基因協調表達運一挑戰 可W使用啟動子多樣化方法來解決，其中不同的啟動子用于驅動具有相同的表達概貌的不 同轉基因 （PEREMARTI et al.2010)。本申請描述了通過從不同玉米基因型中鑒定和純化新 啟動子而獲得的多樣化化i-1啟動子序列。
[0090] 植物基因中基因表達的轉錄起始和調節受到多個DNA序列元件的指導，運些序列 元件集合排列成一個較大的序列，稱為啟動子。真核啟動子通常由最小核屯、啟動子和上游 調節序列構成。核屯、啟動子是足W指導轉錄的準確起始的最小一段連續DNA序列。植物中的 核屯、啟動子一般包括與轉錄起始相關的規范區（canonical region)，例如CAAT和TATA框 (共有序列TATAWAWKTATA框元件通常位于轉錄起始位點（TSS)上游大約20-35個堿基對 (bp)。核屯、啟動子的激活由上游調節序列實現，它們結合各種蛋白質，隨后與轉錄起始復合 體相互作用，從而激活基因表達。運些調節元件包括確定啟動子時空表達模式的DNA序列。
[0091] 參考圖1，玉米化i-1基因啟動子來自于玉米近交細胞系B73。玉米師i-1啟動子包 括位于TSS 5'上游的大約89化P的DNA序列（即，上游元件）。此外，玉米師i-1啟動子包括位 于TSS 3'下游的大約1093bp的DNA序列（參見美國專利5,510,474)。因此，玉米化1-1啟動子 的總DNA序列包括大約2000個堿基對化b)。
[0092] 玉米化i-1啟動子的上游元件包括位于TSS 5'上游大約30bp的TATA框（圖1和3)。 此外，該上游元件包括位于TSS 5 '直接上游的兩個重疊的熱休克共有元件。一個82bp的5 '- UTR或前導序列位于TSS的3'直接下游，隨后是內含子，其從堿基83延伸到1093(圖1和3)。
[0093] W前的工作已經描述了由玉米師i-1啟動子調節的基因和/或轉基因的基因表達 增加。例如，氯霉素乙酷轉移酶(CAT)基因與玉米化i-1啟動子的轉錄融合使得CAT在玉米原 生質體中的活性是由花挪菜花葉病毒35S啟動子驅動的表達的超過10倍(CHRISTENSEN and QUAIL 1996;CHRISTENSEN et al.1992)。
[0094] 除了對照玉米化i-1啟動子之外，本申請還描述了新型玉米化i-1啟動子。與來自 玉米基因型栽培種B73的對照化i-1啟動子不同，新型化i-1啟動子來自玉米基因型栽培種 化-II。還提供了使用包含多核巧酸序列的玉米化i-1啟動子的構建體和方法。在一個實施 方案中，啟動子可W包括來自玉米栽培種B73化i-1基因的多核巧酸，如下：
[0095] GTGCAGCGTGACCCGGTCGTGCCCCTCTCTAGAGATAATGAGCATTGCATGTCTAAGTTATAAAAAATTACCACATA TTTTTTTTGTCACACTTGTTTGAAGTGCAGTTTATCTATCTTTATACATATATTTAAACTTTACTCTACGAATAATA TAATCTATAGTACTACAATAATATCAGTGTTTTAGAGAATCATATAAATGAACAGTTAGACATGGTCTAAAGGACAA TTGAGTATTTTGACAACAGGACTCTACAGTTTTATCTTTTTAGTGTGCATGTGTTCTCCTTTTTTTTTGCAAATAGC TTCACCTATATAATACTTCATCCATTTTATTAGTACATCCATTTAGGGTTTAGGGTTAATGGTTTTTATAGACTAAT TTTTTTAGTACATCTATTTTATTCTATTTTAGCCTCTAAATTAAGAAAACTAAAACTCTATTTTAGTTTTTTTATTT AATAGTTTAGATATAAAATAGAATAAAATAAAGTGACTAAAAATTAAACAAATACCCTTTAAGAAATTAAAAAAACT AAGGAAACATTTTTCTTGTTTCGAGTAGATAATGCCAGCCTGTTAAACGCCGTCGACGAGTCTAACGGACACCAACC AGCGAACCAGCAGCGTCGCGTCGGGCCAAGCGAAGCAGACGGCACGGCATCTCTGTCGCTGCCTCTGGACCCCTCTC GAGAGTTCCGCTCCACCGTTGGACTTGCTCCGCTGTCGGCATCCAGAAATTGCGTGGCGGAGCGGCAGACGTGAGCC GGCACGGCAGGCGGCCTCCTCCTCCTCTCACGGCACCGGCAGCTACGGGGGATTCCTTTCCCACCGCTCCTTCGCTT TCCCTTCCTCGCCCGCCGTAATAAATAGACACCCCCTCCACACCCTCTTTCCCCAACCTCGTGTTGTTCGGAGCGCA CACACACACAACCAGATCTCCCCCAAATCCACCCGTCGGCACCTCCGCTTCAAGGTACGCCGCTCGTCCTCCCCCCC CCCCCCCCTCTCTACCTTCTCTAGATCGGCGTTCCGGTCCATGCATGGTTAGGGCCCGGTAGTTCTACTTCTGTTCA TGTTTGTGTTAGATCCGTGTTTGTGTTAGATCCGTGCTGCTAGCGTTCGTACACGGATGCGACCTGTACGTCAGACA CGTTCTGATTGCTAACTTGCCAGTGTTTCTCTTTGGGGAATCCTGGGATGGCTCTAGCCGTTCCGCAGACGGGATCG ATTTCATGATTTTTTTTGTTTCGTTGCATAGGGTTTGGTTTGCCCTTTTCCTTTATTTCAATATATGCCGTGCACTT GTTTGTCGGGTCATCTTTTCATGCTTTTTTTTGTCTTGGTTGTGATGATGTGGTCTGGTTGGGCGGTCGTTCTAGAT CGGAGTAGAATTCTGTTTCAAACTACCTGGTGGATTTATTAATTTTGGATCTGTATGTGTGTGCCATACATATTCAT AGTTACGAATTGAAGATGATGGATGGAAATATCGATCTAGGATAGGTATACATGTTGATGCGGGTTTTACTGATGCA TATACAGAGATGCTTTTTGTTCGCTTGGTTGTGATGATGTGGTGTGGTTGGGCGGTCGTTCATTCGTTCTAGATCGG AGTAGAATACTGTTTCAAACTACCTGGTGTATTTATTAATTTTGGAACTGTATGTGTGTGTCATACATCTTCATAGT TACGAGTTTAAGATGGATGGAAATATCGATCTAGGATAGGTATACATGTTGATGTGGGTTTTACTGATGCATATACA TGATGGCATATGCAGCATCTATTCATATGCTCTAACCTTGAGTACCTATCTATTATAATAAACAAGTATGTTTTATA ATTATTTCGATCTTGATATACTTGGATGATGGCATATGCAGCAGCTATATGTGGATTTTTTTAGCCCTGCCTTCATA CGCTATTTATTTGCTTGGTACTGTTTCTTTTGTCGATGCTCACCCTGTTGTTTGGTGTTACTTCTGCA(SEQ ID N0:1)
[0096] 在一個實施方案中，啟動子可W包括來自玉米栽培種化-II Ubi-1基因的多核巧 酸序列，如下：
[0097] GACCCGGTCGTGCCCCTCTCTAGAGATAAAGAGCATTGCATGTCTAAGTTATAAAAAATTACCACAATTTTTTAAGT GCAGTTTACGTATCTCTATACATATATTTAAACTTTACTATACGAATAATATAGTTTATAATACTAAAATAATATCA GTGTTTTAGAGAATTATATAAATGAACTGCTAGACATGGTCTAAATAACAATTGAGTGTTTTGACAACAGGACTCTA CAGTTTTATCTTTTTAGTGTGCATGTGTCCTATTTTTTTTTTGCAAATAGCTTCACCTATATAATACTTCACCAATT TATTAGTACATCCATTTAGGGTTTAGGGTTAATGGTTTCTATAGACTAATTTTTAGTACATCTATTTTATTCTATTT TAGCCTCTAAATTAAGAAAACTAAAACTTTATTTTAGTTTTTTTAATAATTTAGATATAAATAGAATAAAATAAAGT GACTAAAAATTAACTAAATACCTTTTAAAAAAATAAAAAACTAAGGAAACATTTTTCTTGTTCCGAGTAGATAATGA CAGGCTGTTCAACGCCGTCGACGAGTCTAACGGACACCAACCAGCGAACCAGCAGCGTCGCGTCGGGCCAAGCGAAG CAGACGGCACGGCATCTCTGTCGCTGCCTCTGGACCCCTCTCGAGAGTTCCGCTCCACCGTTGGACTTGCTCCGCTG TCGGCATCCAGAAATTGCGTGGCGGAGCGGCAGACGTGAGGCGGCACGGCAGGCGGCCTCTTCCTCCTCTCACGGCA CCGGCAGCTACGGGGGATTCCTTTCCCACCGCTCCTTCGCTTTCCCTTCCTCGCCCGCCGTAATAAATAGACACCCC CTCCACACCCTCTTTCCCCAACCTCGTGTTCGTTCGGAGCGCACACACACACAACCAGATCTCCCCCAAATCCACCC GTCGGCACCTCCGCTTCAAGGTACGCCGCTCATCCTCCCCCCCCCCCCCCCTCTCTCTACCTTCTCTAGATCGGCGT TCCGGTCCATGGTTAGGGCCCGGTAGTTCTACTTCTGTTCATGTTTGTGTTAGATCCGTGTTTGTGTTAGATCCGTG CTGCTAGCGTTCGTACACGGATGCGACCTGTACATCAGACATGTTCTGATTGCTAACTTGCCAGTGTTTCTCTTTGG GGAATCCTGGGATGGCTCTAGCCGTTCCGCAGACGGGATCGATTTCATGATTTTTTTTGTTTCGTTGCATAGGGTTT GGTTTGCCCTTTTCCTTTATTTCAATATATGCCGTGCACTTGTTTGTCGGGTCATCTTTTCATGTTTTTTTTTGGCT TGGTTGTGATGATGTGGTCTGGTTGGGCGGTCGTTCTAGATCGGAGTAGAATACTGTTTCAAACTACCTGGTGGATT TATTAAAGGATCTGTATGTATGTGCCATACATCTTCATAGTTACGAGTTTAAGATGATGGATGGAAATATCGATCTA GGATAGGTATACATGTTGATGCGGGTTTTACTGATGCATATACAGAGATGCTTTTTTTTTCGCTTGGTTGTGATGAT GTGGTCTGGTTGGGCGGTCGTTCTAGATCGGAGTAGAATACTGTTTCAAACTAACTGGTGGATTTATTAATTTTGGA TCTGTATGTGTGTGCCATACATCTTCATAGTTACGAGTTTAAGATGATGGATGGAAGTATCGATCTAGGATAGGTAT ACATGTTGATGTTGGTTTTACTGATGCATATACATGATGGCATATGCAGCATCTATTCATTCATATGCTCTAACCTT GAGTACCTATCTATTATAATAAACAAGTATGTTTTATAATTATTTTGATCTTGATATACTTGGATGATGGCATATGC AGCAGCTATATGTGGATTTTTTTAGCTCTGCCTTCATACGCTATTTATTTGCTTGGTACTGTTTCTTTTGTCGATGC TCACCCTGTTGTTTGGTGTTACTTCTGCAG(SEQ ID NO:2)
[0098] 對本文所描述的啟動子通過克隆W及隨后的DM序列同源性分析進行了表征，W 鑒定啟動子的特定區域（即，上游的啟動子，5'-UTR，和內含子區域）。提供了使用組成型玉 米化i-1啟動子在植物中表達轉基因的構建體和方法，其包括上游啟動子區，5-UTR或前導 區，和內含子。在一個實施方案中，啟動子可W包括來自玉米栽培種B73 Ubi-1基因的上游 啟動子多核巧酸序列，如下：
[0099] GTGCAGCGTGACCCGGTCGTGCCCCTCTCTAGAGATAATGAGCATTGCATGTCTAAGTTATAAAAAATTACCACATA TTTTTTTTGTCACACTTGTTTGAAGTGCAGTTTATCTATCTTTATACATATATTTAAACTTTACTCTACGAATAATA TAATCTATAGTACTACAATAATATCAGTGTTTTAGAGAATCATATAAATGAACAGTTAGACATGGTCTAAAGGACAA TTGAGTATTTTGACAACAGGACTCTACAGTTTTATCTTTTTAGTGTGCATGTGTTCTCCTTTTTTTTTGCAAATAGC TTCACCTATATAATACTTCATCCATTTTATTAGTACATCCATTTAGGGTTTAGGGTTAATGGTTTTTATAGACTAAT TTTTTTAGTACATCTATTTTATTCTATTTTAGCCTCTAAATTAAGAAAACTAAAACTCTATTTTAGTTTTTTTATTT AATAGTTTAGATATAAAATAGAATAAAATAAAGTGACTAAAAATTAAACAAATACCCTTTAAGAAATTAAAAAAACT AAGGAAACATTTTTCTTGTTTCGAGTAGATAATGCCAGCCTGTTAAACGCCGTCGACGAGTCTAACGGACACCAACC AGCGAACCAGCAGCGTCGCGTCGGGCCAAGCGAAGCAGACGGCACGGCATCTCTGTCGCTGCCTCTGGACCCCTCTC GAGAGTTCCGCTCCACCGTTGGACTTGCTCCGCTGTCGGCATCCAGAAATTGCGTGGCGGAGCGGCAGACGTGAGCC GGCACGGCAGGCGGCCTCCTCCTCCTCTCACGGCACCGGCAGCTACGGGGGATTCCTTTCCCACCGCTCCTTCGCTT TCCCTTCCTCGCCCGCCGTAATAAATAGACACCCCCTCCACACCCTCTT(沈Q ID N0:3)
[0100] 在另一個實施方案中，啟動子可W包括來自玉米栽培種化-II Ubi-1基因的上游 啟動子多核巧酸序列，如下：
[0101] GACCCGGTCGTGCCCCTCTCTAGAGATAAAGAGCATTGCATGTCTAAGTTATAAAAAATTACCACAATTTTTTAAGT GCAGTTTACGTATCTCTATACATATATTTAAACTTTACTATACGAATAATATAGTTTATAATACTAAAATAATATCA GTGTTTTAGAGAATTATATAAATGAACTGCTAGACATGGTCTAAATAACAATTGAGTGTTTTGACAACAGGACTCTA CAGTTTTATCTTTTTAGTGTGCATGTGTCCTATTTTTTTTTTGCAAATAGCTTCACCTATATAATACTTCACCAATT TATTAGTACATCCATTTAGGGTTTAGGGTTAATGGTTTCTATAGACTAATTTTTAGTACATCTATTTTATTCTATTT TAGCCTCTAAATTAAGAAAACTAAAACTTTATTTTAGTTTTTTTAATAATTTAGATATAAATAGAATAAAATAAAGT GACTAAAAATTAACTAAATACCTTTTAAAAAAATAAAAAACTAAGGAAACATTTTTCTTGTTCCGAGTAGATAATGA CAGGCTGTTCAACGCCGTCGACGAGTCTAACGGACACCAACCAGCGAACCAGCAGCGTCGCGTCGGGCCAAGCGAAG CAGACGGCACGGCATCTCTGTCGCTGCCTCTGGACCCCTCTCGAGAGTTCCGCTCCACCGTTGGACTTGCTCCGCTG TCGGCATCCAGAAATTGCGTGGCGGAGCGGCAGACGTGAGGCGGCACGGCAGGCGGCCTCTTCCTCCTCTCACGGCA CCGGCAGCTACGGGGGATTCCTTTCCCACCGCTCCTTCGCTTTCCCTTCCTCGCCCGCCGTAATAAATAGACACCCC CTCCACACCCTCTT(沈Q ID N0:4)
[0102] 其他的基因調節元件
[0103] 轉基因表達還可W受到位于上游啟動子序列3'下游的5'-UTR和/或內含子區的調 節。包含與5'-UTR和/或內含子可操作連接的上游啟動子區的啟動子能夠調節轉基因的表 達。上游啟動子是驅動轉錄必需的，而5'-UTR和/或內含子的存在能夠增加表達水平，導致 產生更多的mRNA轉錄物用于翻譯和蛋白質合成。在上游啟動子多核巧酸序列中添加5'-UTR 和/或內含子能夠幫助轉基因的穩定表達。
[0104] 此外，包含上游啟動子多核巧酸序列的組成型啟動子的后面可W跟隨5'-UTR或前 導序列，W幫助轉基因在植物內的表達。在一個實施方案中，啟動子可W包括來自玉米栽培 種B73化i-1基因的5'-UTR或前導多核巧酸序列，如下：
[0105] TCCCCAACCTCGTGTTGTTCGGAGCGCACACACACACAACCAGATCTCCCCCAAATCCACCCGTCGGCACCTCCGCT TCAAG(SEQ ID NO:5)
[0106] 在另一個實施方案中，啟動子可W包括來自玉米栽培種化-II Ubi-1基因的5'- UTR或前導多核巧酸序列，如下：
[0107] TCCCCAACCTCGTGTTCGTTCGGAGCGCACACACACACAACCAGATCTCCCCCAAATCCACCCGTCGGCACCTCCGC TTCAAG(SEQ ID NO:6)
[010引進一步地，包含上游啟動子多核巧酸序列后隨5'-UTR或前導序列的組成型啟動子 還可W后隨內含子，W幫助轉基因在植物內的表達。在一個實施方案中，啟動子可W包括來 自玉米栽培種B73化i-1基因的內含子多核巧酸序列，如下：
[0109] GTACGCCGCTCGTCCTCCCCCCCCCCCCCCCTCTCTACCTTCTCTAGATCGGCGTTCCGGTCCATGCATGGTTAGGG CCCGGTAGTTCTACTTCTGTTCATGTTTGTGTTAGATCCGTGTTTGTGTTAGATCCGTGCTGCTAGCGTTCGTACAC GGATGCGACCTGTACGTCAGACACGTTCTGATTGCTAACTTGCCAGTGTTTCTCTTTGGGGAATCCTGGGATGGCTC TAGCCGTTCCGCAGACGGGATCGATTTCATGATTTTTTTTGTTTCGTTGCATAGGGTTTGGTTTGCCCTTTTCCTTT ATTTCAATATATGCCGTGCACTTGTTTGTCGGGTCATCTTTTCATGCTTTTTTTTGTCTTGGTTGTGATGATGTGGT CTGGTTGGGCGGTCGTTCTAGATCGGAGTAGAATTCTGTTTCAAACTACCTGGTGGATTTATTAATTTTGGATCTGT ATGTGTGTGCCATACATATTCATAGTTACGAATTGAAGATGATGGATGGAAATATCGATCTAGGATAGGTATACATG TTGATGCGGGTTTTACTGATGCATATACAGAGATGCTTTTTGTTCGCTTGGTTGTGATGATGTGGTGTGGTTGGGCG GTCGTTCATTCGTTCTAGATCGGAGTAGAATACTGTTTCAAACTACCTGGTGTATTTATTAATTTTGGAACTGTATG TGTGTGTCATACATCTTCATAGTTACGAGTTTAAGATGGATGGAAATATCGATCTAGGATAGGTATACATGTTGATG TGGGTTTTACTGATGCATATACATGATGGCATATGCAGCATCTATTCATATGCTCTAACCTTGAGTACCTATCTATT ATAATAAACAAGTATGTTTTATAATTATTTCGATCTTGATATACTTGGATGATGGCATATGCAGCAGCTATATGTGG ATTTTTTTAGCCCTGCCTTCATACGCTATTTATTTGCTTGGTACTGTTTCTTTTGTCGATGCTCACCCTGTTGTTTG GTGTTACTTCTGCA(SEQ ID NO:7)
[0110] 在另一個實施方案中，啟動子可W包括來自玉米栽培種化-II Ubi-1基因的內含 子多核巧酸序列，如下：
[0111] GTACGCCGCTCATCCTCCCCCCCCCCCCCCCTCTCTCTACCTTCTCTAGATCGGCGTTCCGGTCCATGGTTAGGGCC CGGTAGTTCTACTTCTGTTCATGTTTGTGTTAGATCCGTGTTTGTGTTAGATCCGTGCTGCTAGCGTTCGTACACGG ATGCGACCTGTACATCAGACATGTTCTGATTGCTAACTTGCCAGTGTTTCTCTTTGGGGAATCCTGGGATGGCTCTA GCCGTTCCGCAGACGGGATCGATTTCATGATTTTTTTTGTTTCGTTGCATAGGGTTTGGTTTGCCCTTTTCCTTTAT TTCAATATATGCCGTGCACTTGTTTGTCGGGTCATCTTTTCATGTTTTTTTTTGGCTTGGTTGTGATGATGTGGTCT GGTTGGGCGGTCGTTCTAGATCGGAGTAGAATACTGTTTCAAACTACCTGGTGGATTTATTAAAGGATCTGTATGTA TGTGCCATACATCTTCATAGTTACGAGTTTAAGATGATGGATGGAAATATCGATCTAGGATAGGTATACATGTTGAT GCGGGTTTTACTGATGCATATACAGAGATGCTTTTTTTTTCGCTTGGTTGTGATGATGTGGTCTGGTTGGGCGGTCG TTCTAGATCGGAGTAGAATACTGTTTCAAACTAACTGGTGGATTTATTAATTTTGGATCTGTATGTGTGTGCCATAC ATCTTCATAGTTACGAGTTTAAGATGATGGATGGAAGTATCGATCTAGGATAGGTATACATGTTGATGTTGGTTTTA CTGATGCATATACATGATGGCATATGCAGCATCTATTCATTCATATGCTCTAACCTTGAGTACCTATCTATTATAAT AAACAAGTATGTTTTATAATTATTTTGATCTTGATATACTTGGATGATGGCATATGCAGCAGCTATATGTGGATTTT TTTAGCTCTGCCTTCATACGCTATTTATTTGCTTGGTACTGTTTCTTTTGTCGATGCTCACCCTGTTGTTTGGTGTT ACTTCTGCAG(SEQ ID NO:8)
[0112] 轉基因和報告基因表達盒
[0113] 轉基因表達還可W受到基因表達盒的調節。在一個實施方案中，基因表達盒包括 啟動子。在一個實施方案中，基因表達盒包括化i-1啟動子。在一個實施方案中，基因表達盒 包括來自植物的化i-1啟動子。在一個實施方案中，基因表達盒包括來自玉米栽培種化-II 的化i-1啟動子。
[0114] 在一個實施方案中，基因表達盒包括玉米栽培種化-II Ubi-1啟動子，其中該啟動 子與SEQ ID N0:2具有至少80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%, 98 %，99 %，99.5 %，99.8 %，或100 %的同一性。在一個實施方案中，基因表達盒包括組成型 啟動子，例如玉米栽培種化-II Ubi-1啟動子，其與報告基因或轉基因可操作連接。在一個 實施方案中，基因表達盒包括與轉基因可操作連接的組成型啟動子，其中該轉基因可W是 殺蟲抗性轉基因，除草劑耐受性轉基因，氮利用效率轉基因，水利用效率轉基因，營養品質 轉基因，DNA結合轉基因，選擇標志物轉基因，或其組合。在一個實施方案中，包含組成型啟 動子的基因表達盒可W驅動一個或多個轉基因或報告基因的表達。在一個實施方案中，包 含組成型啟動子的基因表達盒可W驅動兩個或多個轉基因或報告基因的表達。
[0115] 在一個實施方案中，基因表達盒包括玉米栽培種化-II Ubi-1啟動子，其中上游啟 動子序列與SEQ ID N0:4至少80% ,85% ,90% ,91% ,92% ,93% ,94% ,95% ,96% ,97%, 98% ,99% ,99.5% ,99.8%，或100%相同。在一個實施方案中，基因表達盒包括組成型啟動 子，例如玉米栽培種化-II Ubi-1上游啟動子，其與報告基因或轉基因可操作連接。在一個 實施方案中，基因表達盒包括與轉基因可操作連接的組成型上游啟動子，其中該轉基因可 W是殺蟲抗性轉基因，除草劑耐受性轉基因，氮利用效率轉基因，水利用效率轉基因，營養 品質轉基因，DM結合轉基因，選擇標志物轉基因，或其組合。在一個實施方案中，包含組成 型上游啟動子的基因表達盒可W驅動一個或多個轉基因或報告基因的表達。在一個實施方 案中，包含組成型上游啟動子的基因表達盒可W驅動兩個或更多個轉基因或報告基因的表 達。在進一步的實施方案中，上游啟動子可W包括內含子。在一個實施方案中，上游啟動子 可W包括與報告基因或轉基因可操作連接的內含子序列。在另一個實施方案中，上游啟動 子可W包括5'-UTR或前導序列。在一個實施方案中，上游啟動子可W包括與報告基因或轉 基因可操作連接的5'-UTR或前導序列。在另外一個實施方案中，上游啟動子可W包括5'- UTR或前導序列和內含子序列。在一個實施方案中，上游啟動子可W包括與報告基因或轉基 因可操作連接的5 '-UTR或前導序列和內含子序列。
[0116] 在一個實施方案中，基因表達盒包括玉米栽培種化-II Ubi-1啟動子，其中該5'- 1^'尺或前導序列與560 1〇^:6至少80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%， 97% ,98% ,99% ,99.5% ,99.8%，或100%相同。在一個實施方案中，基因表達盒包括來自 編碼泛素-1蛋白的玉米基因的或前導序列，其與啟動子可操作連接，其中該啟動子是玉米 栽培種化-II Ubi-1啟動子，或者來自植物(例如玉米泛素-1啟動子）、病毒(例如木馨葉脈 花葉病毒啟動子），或細菌(例如±壤桿菌delta mas)的啟動子。在一個例示性實施方案中， 基因表達盒包括玉米栽培種化-II 5'-UTR或前導序列，其來自編碼泛素-1蛋白的玉米基 因，并與轉基因可操作連接，其中該轉基因可W是殺蟲抗性轉基因，除草劑耐受性轉基因， 氮利用效率轉基因，水利用效率轉基因，營養品質轉基因，DNA結合轉基因，選擇標志物轉基 因，或其組合。
[0117] 在一個實施方案中，基因表達盒包括玉米栽培種化-II Ubi-1啟動子，其中內含子 序列與沈Q ID N0:8至少80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%, 99% ,99.5% ,99.8%，或100%相同。在一個實施方案中，基因表達盒包括來自編碼泛素-1 蛋白的玉米基因的內含子，其與啟動子可操作連接，其中該啟動子是玉米栽培種Hi-II 郵i-1啟動子，或者來自植物(例如玉米泛素-1啟動子）、病毒(例如木馨葉脈花葉病毒啟動 子），或細菌(例如±壤桿菌delta mas)的啟動子。在一個例示性實施方案中，基因表達盒包 括來自編碼泛素-1蛋白的玉米基因的內含子，其與轉基因可操作連接，其中該轉基因可W 是殺蟲抗性轉基因，除草劑耐受性轉基因，氮利用效率轉基因，水利用效率轉基因，營養品 質轉基因，DNA結合轉基因，選擇標志物轉基因，或其組合。
[0118] 在一個實施方案中，載體可W包括如本文所述的基因表達盒。在一個實施方案中， 載體可W是質粒、粘粒、細菌人工染色體(BAC)、隧菌體、病毒、或用于直接轉化或基因祀定 的切離的多核巧酸片段，例如供體DNA。
[0119] 在一個實施方案中，細胞或植物包括如本文所述的基因表達盒。在一個實施方案 中，細胞或植物包括包含如本申請中公開的基因表達盒的載體。在一個實施方案中，載體可 W是質粒、粘粒、細菌人工染色體(BAC)、隧菌體、或病毒。據此，包含基因表達盒的細胞或植 物分別是轉基因細胞或轉基因植物。
[0120] 在一個實施方案中，轉基因植物可W是單子葉植物或雙子葉植物。轉基因單子葉 植物的實施方案可W是，但不僅限于，玉米、小麥、水稻、高梁、燕麥、黑麥、香蕉、甘薦、和小 米。轉基因雙子葉植物的實施方案可W是，但不僅限于大豆、棉花、向日葵、或芥花。實施方 案還包括來自轉基因植物的轉基因種子，如本文所述的。
[0121] 選擇標志物
[0122] 各種選擇標志物，也稱為報告基因，可W整合到所選表達載體中，W允許鑒定和選 擇被轉化的植物（"轉化體"）。有多種方法可用于確認選擇標志物在轉化的植物中的表達， 包括例如DNA測序、聚合酶鏈式反應(PCR)、Southern印跡、RNA印跡、用于檢測從載體表達的 蛋白質的免疫學方法，例如介導麟絲菌素抗性的沉淀蛋白，或者視覺觀察其它蛋白質，例如 編碼e-葡糖巧酸酶(GUS)、巧光素酶、綠色巧光蛋白（GFP)、黃色巧光蛋白（YFP)、DsRed、0-半 乳糖巧酶、氯霉素乙酷轉移酶（CAT)、堿性憐酸酶等的報告基因（參見Sambrook，et al.， Molecular Cloning:A Laboratory Manual ,第；片反，Cold Spring Harbor Press,N.Y., 2001，其全部內容通過引用并入本文）。
[0123] 選擇標志物基因用于選擇被轉化的細胞或組織。選擇標志物基因包括編碼抗生素 抗性的基因，例如編碼新霉素憐酸轉移酶II(NEO)和潮霉素憐酸轉移酶化PT)的基因，W及 賦予對除草化合物抗性的基因。除草劑抗性基因一般編碼經過修飾的對除草劑不敏感的祀 蛋白，或者編碼在除草劑在植物中發揮作用之前將其降解或脫毒的酶。例如，已經通過使用 編碼突變型祀酶，5-締醇丙酬莽草酸-3-憐酸合酶化PSPS)，的基因而獲得了對草甘麟的抗 性。EPSPS的基因和突變體是眾所周知的，并且在下文中有進一步的描述。對草胺麟錠鹽、漠 苯臘和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-0)的抗性已經通過使用編碼9曰1:或051-2、臘水解酶、曰曰(1-1 或aad-12基因的細菌基因得W實現，運些基因可W將各自的除草劑脫毒。
[0124] 在一個實施方案中，除草劑可W抑制生長點或分生組織，包括咪挫嘟酬或橫酷脈， 且用于抵抗/耐受運些除草劑的乙酷徑酸合酶(AHAS)和乙酷乳酸合酶(ALS)的基因。草甘麟 抗性基因分別包括突變的5-締醇丙酬莽草酸-3-憐酸合酶化PSPS)和dgt-28基因（通過引入 重組核酸和/或各種形式的天然EPSP基因的體內誘變），aroA基因和草甘麟乙酷轉移酶 (GAT)基因。對其它含麟化合物的抗性基因包括來自鏈霉菌屬，包括吸水鏈霉菌 (Streptomyces hygroscopicus)和Streptomyces viridichromogenes，的BAR基因，和口比晚 氧基(pyridinoxy)或苯氧基(phenoxy)丙酸和環己酬(ACC酶抑制劑編碼基因）。可賦予對環 己二酬和/或芳氧苯氧丙酸（a巧1〇巧地enoxypropanoic acid)(包括蓋草能，禾草靈，嗯挫 禾草靈，化氣禾草靈，精哇禾靈）的抗性的示例性基因包括乙酷輔酶A簇化酶(ACC酶)一一 Accl-Sl，Accl-S2和ACC1-S3的基因。在一個實施方案中，除草劑能夠抑制光合作用，包括S 嗦(psbA和ls+基因）或節臘(臘水解酶基因）。
[0125] 在一個實施方案中，選擇標志物包括，但不僅限于，編碼如下的基因：新霉素憐酸 轉移酶II;氨臘水合酶;天冬氨酸激酶;二氨化晚二簇酸合酶;色氨酸脫簇酶;二氨化晚二簇 酸合酶和脫敏的天冬氨酸激酶;bar基因；色氨酸脫簇酶;新霉素憐酸轉移酶(NE0);潮霉素 憐酸轉移酶化PT或肌G);二氨葉酸還原酶(畑FR);麟絲菌素乙酷轉移酶;2,2-二氯丙酸脫面 素酶；乙酷徑酸合成酶;5-締醇丙酬酸-莽草酸-憐酸合酶(aroA);面代乙臘；乙酷輔酶A簇化 酶;二氨蝶酸合酶(sul I);和32kD光系統II多膚(psbA)。
[0126] 實施方案還包括編碼對如下者的抗性的基因：氯霉素；甲氨蝶嶺；潮霉素;壯觀霉 素;漠苯臘;草甘麟;和麟絲菌素。
[0127] 上述的選擇標志物基因的列表并不意味著有限制性。本發明可W包含任何報告或 選擇標志物基因。
[0128] 選擇標志物基因 W在植物中最佳表達為目的而合成。例如，在一個實施方案中，基 因的編碼序列已經被密碼子優化修飾，w提高在植物中的表達。選擇標志物基因可w被優 化用于在特定的植物物種中表達，或者，可W被修飾用于在雙子葉或單子葉植物中最佳表 達。植物優選的密碼子可W從感興趣的特定植物物種中W表達量最大的蛋白質的頻率最高 的密碼子中確定。在一個實施方案中，選擇標志物基因被設計成在植物中W更高的水平被 表達，從而產生更高的轉化效率。對于植物基因優化的方法是眾所周知的。關于合成多核巧 酸序列的優化和制造的指導可見于，例如，W02013016546，W02011146524，W01997013402,美 國專利6166302和美國專利5,380,831，其內容通過引用并入本文。
[0129] 轉基因
[0130] 公開的方法和組合物可用于在植物基因組中表達多核巧酸基因序列。因此，編碼 除草劑抗性、昆蟲抗性、營養、抗生素或治療性分子的基因的表達可W被新型啟動子驅動。
[0131] 在一個實施方案中，本公開的組成型啟動子調節元件與一個或多個編碼多核巧酸 序列的基因組合或可操作連接，該基因可提供對草甘麟、2,4-D、草錠麟或其他除草劑的抗 性或耐受性，提供對選擇昆蟲或疾病的抗性或耐受性，和/或營養增強，改良的農學特征，用 于在飼料、食品、工業、醫藥或其它用途中有用的蛋白質或其它產品。轉基因可W在植物基 因組中與兩個或多個感興趣的核酸序列"堆疊"。堆疊可W通過例如使用兩個或多個事件的 傳統植物育種，用含有感興趣序列的構建體轉化植物，轉基因植物的再轉化，或者通過同源 重組的祀向整合添加新的性狀，來實現。
[0132] 運些感興趣的多核巧酸序列包括，但不僅限于，下面提供的實例：
[0。引 1.賦予害蟲或疾病抗性的轉基因或編碼序列(例如iRNA)
[0134] (A)植物疾病抗性基因。植物防御經常通過植物中疾病抗性基因(R)的產物與病原 體中相應的無毒性(Avr)基因的產物的特異相互作用而被激活。可W用克隆的抗性基因轉 化植物品種，從而工程構建對特定病原體株有抗性的植物。運些基因的實例包括:提供黃枝 抱霉（Cladosporium fulvum)抗性的番茄Cf-9 基因 （Jones et al., 1994 Science 266: 789);，提供下香假單胞桿菌番茄致病變種抗性的番茄Pto基因，其編碼一種蛋白激酶 (Madin et al.，1993 Science 262:1432)，和提供下香假單胞菌抗性的擬南芥RSSP2基因 (Mindrinos et al.，1994 Cell 78:1089)。
[0135] (B)蘇云金芽抱桿菌蛋白質、其衍生物或W其為模本的人造多膚，例如化S-內毒素 基因的多核巧酸序列（Geiser et al.，1986 Gene 48:109)和植物殺蟲(VIP)基因（見，例 如，Estruch et al.(1996)P;roc .Natl .Acad. Sci . 93:5389-94)。此外，編碼S-內毒素基因的 DM分子可W從美國典型培養物保藏中屯、（Rockville，Md.)購得，ATCC登錄號為40098， 67136,31995和31998。
[0136] (C)植物凝集素，例如，多種君子蘭(Clivia miniata)甘露糖結合性植物凝集素基 因的核巧酸序列（化n Damme et al. ,1994 Plant Molec.Biol.24:825)。
[0137] (D)維生素結合蛋白質，例如親和素及親和素同源物，其可用作針對昆蟲類害蟲的 殺幼蟲劑。見美國專利5，659，026。
[0138] 化)酶抑制劑，例如蛋白酶抑制劑或淀粉酶抑制劑。運些基因的實例包括水稻半脫 氨酸蛋白質酶抑制劑(Abe et al. ,1987 J.Biol.化em.262:16793)，煙草蛋白酶抑制劑I 化uubetal.，1993 PlantMolec.Biol.21:985)，和a-淀粉酶抑制劑（Sumitanietal.， 1993 Biosci.Biotech.Biochem.57:1243)。
[0139] (F)昆蟲特異性激素或信息素，例如蟻皮激素和保幼激素或其變體、基于它們的模 擬物，或其括抗劑或激動劑，例如桿狀病毒表達的克隆保幼激素醋酶，保幼激素的失活子 (Hammock et al.,1990 Na1:ure 344:458)。
[0140] (G)昆蟲特異性膚或神經膚，其在表達時會擾亂受影響的害蟲的生理機能 (J.Biol.化em. 269:9)。運些基因的實例包括昆蟲利尿激素受體(Regan, 1994)，在太平洋折 翅賺(Diploptera punctata)中鑒定的咽側體抑制素（allostatin) (Pratt, 1989)，和昆蟲 特異性麻搏神經毒素(美國專利No. 5，266，361)。
[0141] 化)在自然界中由蛇、馬蜂等產生的昆蟲特異性毒液，例如蝸子昆蟲毒性膚(Pang, 1992 Gene 116:165)。
[0142] (I)負責超富集單祗、倍半祗、醬體、異徑朽酸、苯丙烷衍生物或其它具有殺蟲活性 的非蛋白質分子的酶。
[0143] (J)參與生物活性分子修飾(包括翻譯后修飾）的酶；例如糖酵解酶、蛋白質水解 酶、脂肪分解酶、核酸酶、環化酶、轉氨酶、醋酶、水解酶、憐酸酶、激酶、憐酸化酶、聚合酶、彈 性蛋白酶、幾下質酶和葡聚糖酶，無論是天然的還是人造的。運些基因的實例包括馬蹄蓮 (callas)基因（PCT公開的申請W0 93/02197)，幾下質酶編碼序列（其可W從例如ATCCW登 錄號3999637和67152獲得），煙草鉤蟲幾下質酶（Kramer et al. ,1993 Insect Molec.Biol.23:691)，和歐芹ubi4-2多聚泛素基因化awalleck et al. ,1993 Plant Molec.Biol.21:673)。
[0144] 化)刺激信號轉導的分子。運些分子的實例包括綠豆巧調蛋白cDNA克隆的核巧酸 序列（Botella et al. ,1994 Plant Molec.Biol.24:757)，和玉米巧調蛋白cDNA克隆的核 巧酸序列(Griess et al., 1994 Plant F*hysiol. 104:1467)。
[0145] (L)疏水矩膚化yho曲obic moment peptide)。見例如美國專利Nos.5,659,026和 5，607，914，后者教導了賦予疾病抗性的人造抗微生物膚。
[0146] (M)膜透性酶，通道形成劑或通道阻斷劑，例如殺菌膚-0裂解膚類似物(Jaynes et al. ,1993 Plant Sci.89:43)，其使轉基因煙草植物對青枯病有抗性。
[0147] (N)病毒侵襲性蛋白質或由其衍生的復雜毒素。例如，在經轉化的植物細胞中，病 毒衣殼蛋白的積累可賦予針對該衣殼蛋白所來源的病毒W及相關病毒所致的病毒感染和/ 或疾病發展的抗性。已經給轉化植物賦予了衣殼蛋白介導的，針對首猜花葉病毒、黃瓜花葉 病毒、煙草條紋病毒、馬鈴馨X病毒、馬鈴馨Y病毒、煙草蝕紋病毒、煙草脆裂病毒和煙草花葉 病毒的抗性。參見，例如，Beachy et al. (1990)Ann.Rev.F*h}ftopathol.28:451。
[0148] (0)昆蟲特異性抗體或由其衍生的免疫毒素。因此，祀向昆蟲腸道關鍵代謝功能的 抗體可W使受影響的酶失活，殺死昆蟲。例如，Taylor等人(1994)，在第屯屆國際分子植物- 微生物相互作用研討會（Seventh Int'l. Symposium on Molecular Plant Microbe Interactions)上的第497號摘要顯示了轉基因煙草中通過產生單鏈抗體片段的酶失活。
[0149] (P)病毒特異性抗體。見例如hvladoraki et al. (1993)化 1:ure 266:469,其顯示 了表達重組抗體基因的轉基因植物被保護免于病毒攻擊。
[0150] (Q)由病原體或寄生物自然產生的發育阻滯(developmen^^arrestive)蛋白質。 因此，真菌內切Q-1，4-D多聚半乳糖醒酸酶通過溶解植物細胞壁的均聚-a-1，4-D-半乳糖醒 酸而促進真菌定殖和植物營養素釋放化amb et al.,1992)Bio/Technology 10:1436。 1'〇油曰的等（1992 Plant J.2:367)描述了豆類內切多聚半乳糖醒酸酶抑制蛋白的編碼基因 的克隆和表征。
[0151] (R)由植物自然產生的發育阻滯(developmental-arrestive)蛋白質，例如大麥核 糖體失活基因，其提供了增加的針對真菌疾病的抗性化ongemann et al.，1992) .Bio/ Technology 10:3305。
[0152] (S)RNA干擾，其中用RNA分子抑制祀基因的表達。一個實施例中的RNA分子是部分 或完全雙鏈的，其觸發沉默響應，導致dsRNA被切割成小的干擾RNA，它們隨后被納入到祀向 復合體中，祀向復合體破壞同源的mRNA。見例如Fire等人，美國專利6,506,559; Graham等 人，美國專利6,573,099。
[。巧引 2.賦予除草劑抗性的基因
[0154] ( A )編碼針對抑制生長點或分生組織的除草劑，例如咪挫嘟酬類 (imidazalinone)、橫酷苯胺類（3111的]1日]1；[11(1日）或橫酷脈類除草劑的抗性或耐受性的基 因。運類基因的實例編碼一種突變ALS酶化ee et al.，1988 6]\?〇17:1241)，其也稱4歴巧每 (Miki et al.,1990 Hieor.Appl.Genet.80:449)。
[0155] (B)-種或多種額外的編碼針對草甘麟抗性或耐受性的基因，所述抗性或耐受性 是由突變體EPSP合酶和aroA基因賦予的，或者是通過一些基因如DGT-28、2mEPSPS、GAT(草 甘麟乙酷轉移酶)或G0X(草甘麟氧化酶)和其它麟酷基化合物，如草胺麟(pat, bar,和dsm-2 基因），和芳氧基苯氧基丙酸和環己二酬(ACC酶抑制劑編碼基因）所致的代謝失活而獲得 的。見例如美國專利4,940,835，其公開了可賦予草甘麟抗性的6?5?形式的核巧酸序列。編 碼突變體aroA基因的DNA分子能夠WATCC登錄號39256獲得，突變體基因的核巧酸序列在美 國專利4，769，061中公開。歐洲專利申請No. 0 333 033和美國專利4，975，374公開了可賦予 除草劑如心草錠麟抗性的谷氨酷胺合酶基因的核巧酸序列。歐洲專利申請No.0 242 246提 供了草錠麟乙酷轉移酶基因的核巧酸序列。De Greef et al.(1989)Bio/Technology 7:61 中描述了表達編碼草錠麟乙酷轉移酶活性的嵌合bar基因的轉基因植物的產生。賦予針對 芳氧基苯氧基丙酸和環己二酬如稀禾定和甲禾靈化aloxWop)的抗性的示例性基因是 Acc]_-Sl ,Acc]_-S2和Accl-S3基因，如Marshall et al. (1992)111601^.Appl .Genet.83:435所 述。
[0156] (C)編碼針對可抑制光合作用的除草劑例如=嗦(psbA和gs+基因）和節臘(臘水解 酶基因）的抗性的基因。Prz化illaetal.a991)PlantCell3:169描述了使用編碼突變 體psbA基因的質粒轉化衣藻。在美國專利4,810,648中公開了臘水解酶基因的核巧酸序列， 含有運些基因的DNA分子可W通過ATCC登錄號53435、67441和67442獲得。Hayes et al. (1992)81〇油6111.1285:173中描述了編碼谷脫甘膚5-轉移酶的0臟的克隆和表達。
[0157] (D)編碼針對可結合徑基苯基丙酬酸二加氧酶化PPD)的除草劑的抗性基因 ，HPPD 是催化對-?基苯基丙酬酸（HPP)轉化形成尿黑酸的反應的酶。運包括例如異嗯挫 化口418175,6口470856,6口487352,6口527036,6口560482,6口682659，美國專利5,424,276)，特 別是異嗯挫草酬，其是玉米的選擇性除草劑，二酬臘（diketonitrileKEP496630, EP496631)，特別是2-氯基-3-環丙基-1-(2-S02C冊-4-CF3苯基）丙烷-1，3-二酬和2-氯基- 3-環丙基-1-(2-S02C 冊-4-2，3C12 苯基）丙烷-1，3-二酬，S 酬類化 P625505，EP625508，美國 專利5,506，195)，特別是橫草酬、和pyrazolinate等除草劑。在植物中產生過量HPPD的基因 能夠提供針對運些除草劑的耐受性或抗性，包括例如美國專利6，268，549和6，245，968和美 國專利申請公開No. 2003/0066102中描述的基因。
[0158] 化)編碼針對苯氧基生長素除草劑，如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)的抗性或耐受 性的基因，其也可W賦予針對芳氧基苯氧基丙酸類(A0PP)除草劑的抗性或耐受性。運些基 因的實例包括a-酬戊二酸依賴性的雙加氧酶(aad-1)基因，如美國專利7，838，733所述。
[0159] (F)編碼針對苯氧基生長素除草劑如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)的抗性或耐受 性的基因，其也可W賦予針對化晚基氧基生長素除草劑，如氣草煙或綠草定的抗性或耐受 性。運些基因的實例包括a-酬戊二酸依賴性的雙加氧酶(aad-12)基因，如W02007/053482- A2所述。
[0160] (G)編碼針對麥草畏的抗性或耐受性的基因（見例如美國專利公開0030135879)。
[0161] 化)編碼針對抑制原化嘟原氧化酶(PP0)的除草劑的抗性或耐受性的基因（見美國 專利No. 5,767,373)。
[0162] (I)提供針對可結合光系統II反應中屯、(PS II)核屯、蛋白質的S嗦除草劑(例如莽 去津）和尿素衍生物（如敵草隆）除草劑的抗性或耐受性的基因。見化ussian et al.， (1989)EMB0 J.1989,8(4):1237-1245。
[01創 3.可賦予或貢南犬數量疊加性狀(Value Added Trait)的基因
[0164] (A)修飾的脂肪酸代謝，例如通過用反義基因或硬脂酷-ACP去飽和酶轉化玉米或 蕓苔屬植物從而增加植物的硬脂酸含量化nultzon et al. ,1992)P;roc.Nat.Acad.Sci.USA 89:2624。
[0165] (B)降低的植酸含量
[0166] (1)引入植酸酶編碼基因，如黑曲霉植酸酶基因 （Van Hartingsveldt et al., 1993 Gene 127:87)，提高植酸降解，向被轉化植物添加更多游離憐酸鹽。
[0167] (2)可引入降低植酸含量的基因。在玉米中，運可W通過，例如，克隆然后重新導入 如下所述的單個等位基因的相關DNA來實現:該單個等位基因導致W植酸水平低為特征的 玉米突變體的原因 （Raboy et al. ,1990 Maydica 35:383)。
[0168] (C)改良的碳水化合物組成，例如通過用編碼改變淀粉的分支模式的酶的基因轉 化植物而實現。運些酶的實例包括，粘液鏈球菌(Streptococcus mucus)果糖基轉移酶基因 (化iroza et al.,1988)J.Bacte;riol.170:810,枯草芽抱桿菌果聚糖薦糖酶基因 (Steinmetz et al.,1985 Mol.Gen.Genel.200:220)，地衣芽抱桿菌a-淀粉酶（Pen et al. ,1992 Bio/Technology 10:292)，番茄轉化酶基因巧lliot et al. ,1993)，大麥淀粉酶 基因 （Sogaard et al. ,1993 J.Biol.Chem.268:22480)，和玉米胚乳淀粉分支酶 iKFisher et al., 1993 Plant F*hysiol. 102:10450)。
[0169] 轉化
[0170] 用于轉化植物的合適方法包括任何能夠將DNA引入到細胞內的方法，例如但不僅 限于：電穿孔(參見例如美國專利5,384,253);微粒射彈(參見例如美國專利5,015,580;5， 550，318; 5，538，880; 6，160，208; 6，399，861;和6，403，865); ±壤桿菌介導的轉化(參見例 如美國專利5,635,055 ;5,824,877; 5,591，616;5,981,840;和 6,384,301);和原生質體轉化 (參見例如美國專利5,508，184)。運些方法可用于穩定轉化或瞬時轉化植物。
[0171] DNA構建體可W使用下述技術直接引入到植物細胞的基因組DNA中，例如用碳化娃 纖維攬動(參見，例如，美國專利5,302,523和5,464,765)，或者DNA構建體可W使用生物射 彈方法，例如DNA粒子轟擊，直接引入到植物組織中（參見，例如，Klein et al. ,(1987) 化ture 327 :70-73)。或者，DNA構建體可W通過納米顆粒轉化引入到植物細胞中（參見，例 如，美國專利公開No. 2009/0104700，通過提述將其整體并入本文）。
[0172] 此外，基因轉移可W使用非±壤桿菌或病毒實現，例如根瘤菌NGR234、首猜中華根 瘤菌、中慢生根瘤菌、馬鈴馨X病毒、花挪菜花葉病毒、木馨葉脈花葉病毒和/或煙草花葉病 毒，參見例如，Qiung et 日1.,(2006)化611(13 Plant Sci.ll(l):l-4。
[0173] 通過運些轉化技術的應用，幾乎任何植物物種的細胞都可W被穩定地轉化，并且 運些細胞可W通過眾所周知的技術發育成轉基因植物。例如，美國專利5，846，797; 5，159， 135 ; 5，004，863和6，624，344中描述了特別可用于棉花轉化內容的技術；例如美國專利5， 750,871中描述了特別用于轉化蕓苔屬植物的技術;美國專利6,384,301中描述了用于轉化 大豆的技術;美國專利7,060,876和5,591，616和國際口(：1'公開胖0 95/06722中描述了用于轉 化玉米的技術。
[0174] 在將外源核酸遞送到受體細胞之后，通常要鑒定出轉化細胞用于進一步的培養和 植物再生。為了提高鑒定轉化體的能力，可能期望采用選擇標志物基因，與用于產生轉化體 的轉化載體一起使用。在示例性實施方案中，可W通過將細胞暴露于一種或多種選擇劑對 被轉化的細胞群體進行測定，或者可W根據期望的標記基因性狀對細胞進行篩選。
[0175] 對于在暴露于選擇劑時存活的細胞，或者在篩選測定中被評定為陽性的細胞，可 W在支持植物再生的培養基中加 W培養。在一個實施方案中，可W對任何合適的植物組織 培養基進行修改，使之包含更多的物質，例如生長調節劑。植物組織可W維持在含有生長調 節劑的基礎培養基中，直到可W獲得足夠的組織用于開始植物再生工作，或者經過重復多 輪的人工選擇，直到組織的形態適合于再生為止(例如，至少2周），然后可W將組織轉移到 有助于芽形成的培養基中。周期性地轉移培養物，直到發生充分的芽形成。一旦形成芽，便 將它們轉移到有助于根形成的培養基中。一旦形成了足夠的根，可將植物轉移到±壤中，用 于進一步的生長和成熟。
[0176] 為了確認再生植物中存在包含所提供構建體的期望核酸，可W多種測定。運樣的 測定可W包括:分子生物學測定，例如Southern和Nodhern印跡和PCR;生物化學測定，通過 免疫學方法如化ISA，western印跡，和/或LC-MS MS分光光度法，或者通過酶促功能檢測蛋 白質產物的存在，例如通過植物部分測定法，例如葉、愈傷組織或花粉測定;和/或分析整個 再生植物的表型。
[0177] 可W通過例如PCR擴增，使用特異針對感興趣的核酸分子的寡核巧酸引物對轉基 因事件進行篩選。PCR基因分型被理解為包括，但不僅限于，對分離和/或純化自預計含有整 合在基因組內的感興趣核酸分子的宿主植物組織的基因組DNA進行PCR擴增，隨后進行常規 克隆和PCR擴增產物序列分析。PCR基因分型方法已經有充分描述(參見，例如，Rios et al. (2002)Plant J.32:243-53)，并且可應用于來自任何植物物種或組織類型（包括細胞培養 物）的基因組DNA。一組結合祀序列和引入序列的寡核巧酸引物可W在PCR擴增反應中順次 使用或復用。可W產生設計為結合祀位點、引入核酸序列、和/或運兩種類型的核酸序列之 組合的寡核巧酸引物。因此，PCR基因分型策略可W包括，例如但不僅限于:擴增植物基因組 中的特有序列;擴增植物基因組中的多個特有序列;擴增植物基因組中的非特有序列;和上 述的任意組合。本領域的技術人員可w設計出其它的引物和擴增反應的組合來查詢基因 組。例如，可W設計一組正向和反向寡核巧酸引物，使之與引入核酸序列的邊界之外的祀標 特有序列退火。
[0178] 正向和反向寡核巧酸引物可被設計為與引入的核酸分子特異性退火，例如在引入 的核酸分子中包含的感興趣核巧酸序列內的編碼區的相應序列處退火，或者在該核酸分子 的其它部分退火。引物可W和本文描述的引物聯合使用。寡核巧酸引物可W根據期望的序 列合成，并且是可商購的（例如，從Integrated DNA Technologies,Inc. ,Coralville,IA)。 擴增之后可W進行克隆和測序，或者對擴增產物直接進行序列分析。在一個實施方案中，在 PCR擴增中使用特異針對基因祀標的寡核巧酸引物。
[0179] 表達轉基因的方法
[0180] 在一個實施方案中，在植物中表達至少一種轉基因的方法包括培植包含與至少一 個轉基因可操作連接的玉米栽培種化-II Ubi-1啟動子(SEQ ID NO: 2)的植物。在一個實施 方案中，在植物組織或植物細胞中表達至少一種轉基因的方法包括培植包含與至少一個轉 基因可操作連接的玉米栽培種化-II化i-1啟動子(SEQ ID N0:2)的植物組織或植物細胞。
[0181] 在一個實施方案中，在植物中表達至少一種轉基因的方法包括培植包含與至少一 個轉基因可操作連接的玉米栽培種化-II Ubi-1啟動子(SEQ ID N0:2)的基因表達盒的植 物。在一個實施方案中，在植物組織或植物細胞中表達至少一種轉基因的方法包括培養包 含與至少一個轉基因可操作連接的玉米栽培種化-II Ubi-1啟動子(SEQ ID NO: 2)的基因 表達盒的植物組織或植物細胞。
[0182] 在一個實施方案中，植物、植物組織或植物細胞包括基因表達盒，其包括與轉基因 可操作連接的玉米栽培種化-II Ubi-1啟動子（SEQ ID NO: 2)。其中，該玉米栽培種化-II Ubi-1 啟動子(SEQ ID N0:2)包括上游啟動子(SEQ ID N0:4)、5'-UTR(SEQ ID N0:6)、和內 含子(SEQ ID NO:8)。在一個實施方案中，植物、植物組織或植物細胞包括基因表達盒，其包 括玉米栽培種化-II Ubi-1上游啟動子(SEQ ID N0:4)、5'-UTR(SEQ ID N0:6)、和內含子 (SEQ ID NO:8)。在一個實施方案中，植物、植物組織或植物細胞包括基因表達盒，其包括玉 米栽培種化-II Ubi-1上游啟動子(SEQ ID N0:4)、5'-UTR(SEQ ID N0:6)、和玉米栽培種 Hi-II Ubi-1基因的內含子(SEQ ID N0:8)。在一個實施方案中，植物、植物組織或植物細胞 包括基因表達盒，其包括玉米栽培種化-II Ubi-1上游啟動子(SEQ ID N0:4)、5'-UTR(SEQ ID N0:6)和玉米栽培種化-II化i-1基因的內含子(SEQ ID N0:8)。
[0183] 在一個實施方案中，植物、植物組織或植物細胞包括玉米栽培種化-II化i-1啟動 子。在一個實施方案中，玉米栽培種化-II Ubi-1啟動子可W是SEQ ID N0:2。在一個實施方 案中，植物、植物組織或植物細胞包括基因表達盒，所述基因表達盒包含啟動子，其中該啟 動子與沈Q ID N0:2至少80% ,85% ,90% ,91% ,92% ,93% ,94% ,95% ,96% ,97% ,98%, 99 %，99.5 %，99.8 %，或100 %相同。在一個實施方案中，植物、植物組織或植物細胞包括基 因表達盒，所述基因表達盒包含與轉基因可操作連接的玉米栽培種化-II化i-1啟動子。在 一個示例性實施方案中，植物、植物組織或植物細胞包括基因表達盒，所述基因表達盒包含 與轉基因可操作連接的玉米栽培種化-II Ubi-1啟動子，其中該轉基因可W是殺蟲抗性轉 基因，除草劑耐受性轉基因，氮利用效率轉基因，水利用效率轉基因，營養品質轉基因 ，DNA 結合轉基因，選擇標志物轉基因，或其組合。
[0184]在一個實施方案中，植物、植物組織或植物細胞包括玉米栽培種化-II化i-1上游 啟動子。在一個實施方案中，玉米栽培種化-II化i-1上游啟動子可W是SEQ ID N0:4。在一 個實施方案中，植物、植物組織或植物細胞包括基因表達盒，所述基因表達盒包含上游啟動 子，其中該上游啟動子與SEQ ID N0:4至少80% ,85% ,90% ,91% ,92% ,93% ,94% ,95%, 96%，97% ,98% ,99% ,99.5% ,99.8%，或100%相同。在一個實施方案中，植物、植物組織 或植物細胞包括基因表達盒，其包含與轉基因可操作連接的玉米栽培種化-II Ubi-1上游 啟動子。在一個示例性實施方案中，植物、植物組織或植物細胞包括基因表達盒，其包含與 轉基因可操作連接的玉米栽培種化-II Ubi-1上游啟動子，其中該轉基因可W是殺蟲抗性 轉基因，除草劑耐受性轉基因，氮利用效率轉基因，水利用效率轉基因，營養品質轉基因， DNA結合轉基因，選擇標志物轉基因，或其組合。
[01化]在一個實施方案中，植物、植物組織或植物細胞包括玉米栽培種化-II Ubi-1 5'- UTR或前導序列。在一個實施方案中，玉米栽培種Hi-II Ubi-1 5'-UTR或前導序列可W是 SEQ ID N0:6的多核巧酸。在一個實施方案中，植物、植物組織或植物細胞包括基因表達盒， 所述基因表達盒含有5'-UTR或前導序列，其中該5'-UTR或前導序列與SEQ ID NO:6至少 80% ,85% ,90% ,91% ,92% ,93% ,94% ,95% ,96% ,97% ,98% ,99% ,99.5% ,99.8%,或 100%相同。在一個實施方案中，基因表達盒包括與啟動子可操作連接的玉米栽培種化-II Ubi-1 5'-UTR或前導序列，其中該啟動子是泛素啟動子，或者來自植物(例如玉米泛素-1啟 動子）、病毒(例如木馨葉脈花葉病毒啟動子），或細菌(例如±壤桿菌delta mas)的啟動子。 在一個實施方案中，植物、植物組織或植物細胞包括基因表達盒，所述基因表達盒含有與轉 基因可操作連接的玉米栽培種化-II Ubi-1 5'-UTR或前導序列。在一個示例性實施方案 中，植物、植物組織或植物細胞包括基因表達盒，所述基因表達盒含有與轉基因可操作連接 的玉米栽培種化-II師i-1 5'-UTR或前導序列，其中該轉基因可W是殺蟲抗性轉基因，除 草劑耐受性轉基因，氮利用效率轉基因，水利用效率轉基因，營養品質轉基因，DNA結合轉基 因，選擇標志物轉基因，或其組合。
[0186] 在一個實施方案中，植物、植物組織或植物細胞包括化i-1內含子。在一個實施方 案中，植物、植物組織或植物細胞包括玉米栽培種化-II Ubi-1內含子。在一個實施方案中， 玉米栽培種化-II化i-1內含子可W是SEQ ID N0:8的多核巧酸。在一個實施方案中，植物、 植物組織或植物細胞包括基因表達盒，所述基因表達盒含有內含子，其中該內含子與SEQ ID NO: 8 至少 80 % ,85% ,90% ,91% ,92% ,93% ,94% ,95% ,96% ,97% ,98% ,99%， 99.5% ,99.8%，或100%相同。在一個實施方案中，基因表達盒包括與啟動子可操作連接的 玉米栽培種化-II Ubi-1內含子，其中該啟動子是泛素啟動子，或者來自植物(例如玉米泛 素-1啟動子）、病毒(例如木馨葉脈花葉病毒啟動子），或細菌(例如±壤桿菌delta mas)的 啟動子。在一個實施方案中，植物、植物組織或植物細胞包括基因表達盒，所述基因表達盒 含有與轉基因可操作連接的玉米栽培種化-II Ubi-1內含子。在一個示例性實施方案中，植 物、植物組織或植物細胞包括基因表達盒，所述基因表達盒含有與轉基因可操作連接的玉 米栽培種化-II Ubi-1內含子，其中該轉基因可W是殺蟲抗性轉基因，除草劑耐受性轉基 因，氮利用效率轉基因，水利用效率轉基因，營養品質轉基因，DNA結合轉基因，選擇標志物 轉基因，或其組合。
[0187] 在一個實施方案中，植物、植物組織或植物細胞包括與轉基因可操作連接的玉米 栽培種化-II Ubi-1上游啟動子、Ubi-1內含子和化i-1 5'-UTR。當基因表達盒包括2個或更 多個轉基因時，該玉米栽培種化-II Ubi-1上游啟動子、Ubi-1內含子和化i-1 5'-UTR可W 和基因表達盒內的不同轉基因可操作連接。在一個示例性實施方案中，基因表達盒包括與 轉基因可操作連接的玉米栽培種化-II Ubi-1啟動子，其中該轉基因可W是殺蟲抗性轉基 因，除草劑耐受性轉基因，氮利用效率轉基因，水利用效率轉基因，營養品質轉基因，DNA結 合轉基因，選擇標志物轉基因，或其組合。在一個示例性實施方案中，基因表達盒包括與轉 基因可操作連接的玉米栽培種化-II Ubi-1內含子，其中該轉基因可W是殺蟲抗性轉基因， 除草劑耐受性轉基因，氮利用效率轉基因，水利用效率轉基因，營養品質轉基因，DNA結合轉 基因，選擇標志物轉基因，或其組合。在一個實施方案中，基因表達盒包括與啟動子可操作 連接的玉米栽培種化-II Ubi-1內含子，其中該啟動子是泛素啟動子，或者來自植物(例如 玉米泛素-1啟動子）、病毒（例如木馨葉脈花葉病毒啟動子），或細菌（例如±壤桿菌delta mas)的啟動子。在一個示例性實施方案中，基因表達盒包括與轉基因可操作連接的玉米栽 培種化-II Ubi-1 5'-UTR，轉基因可W是殺蟲抗性轉基因，除草劑耐受性轉基因，氮利用效 率轉基因，水利用效率轉基因，營養品質轉基因，DNA結合轉基因，選擇標志物轉基因，或其 組合。
[0188] 在一個實施方案中，植物、植物組織或植物細胞包括含有如本文所述的組成型基 因啟動子調節元件的載體。在一個實施方案中，植物、植物組織或植物細胞包括含有如本文 所述的與轉基因可操作連接的組成型基因啟動子調節元件的載體。在一個實施方案中，植 物、植物組織或植物細胞包括含有如本文所述的基因表達盒的載體。在一個實施方案中，載 體可W是質粒、粘粒、細菌人工染色體(BAC)、隧菌體、或病毒片段。
[0189] 在一個實施方案中，根據本文公開方法的植物、植物組織或植物細胞可W是單子 葉植物。該單子葉植物、植物組織或植物細胞可W是，但不僅限于，玉米，水稻，小麥，甘薦， 大麥，黑麥，高梁，蘭花，竹子，香蕉，香蒲，百合，燕麥，洋蔥，小米，和黑小麥。
[0190] 在另一個實施方案中，根據本文公開方法的植物、植物組織或植物細胞可W是雙 子葉植物。該雙子葉植物、植物組織或植物細胞可W是，但不僅限于，油菜，芥花(canola)， 印度芥，埃塞俄比亞芥，大豆，向日葵和棉花。
[0191] 關于遺傳修飾植物的產生，用于將植物基因工程的方法是本領域眾所周知的。例 如，已經開發了許多用于植物轉化的方法，包括用于雙子葉植物W及單子葉植物的生物和 物理轉化方案（例如Goto-Fumiyukiet al.,化 ture Biotech 17:282-286( 1999) ;M;Lki et al.,Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology ,G1ick,B.R.和 Thompson, J. E.編輯，CRC Press , Inc. ,Boca Raton,第67-88頁（1993))。此外，用于植物細 胞或組織轉化和植物再生的載體和體外培養方法可W在例如下列文獻中獲取:Gruber et al.,Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology ,G1ick,B.R.和 HiompsonJ.E.編輯，CRC Press,Inc.,Boca Raton,第89-119頁（1993)。
[0192] 本領域的技術人員會意識到，在外源序列穩定組入到轉基因植物體內并被確認可 W工作之后，可W通過有性雜交將它引入到其它植物中。可W使用大量標準育種技術中的 任一種，取決于待雜交的物種。
[0193] 通過對經過工程化的植物材料選擇或篩選由轉化DNA上存在的標記基因所編碼的 性狀，可W鑒定并分離出轉化的植物細胞、根、葉、愈傷組織、組織或植物。例如，可W通過在 含有抑制量的抗生素或除草劑(轉化基因構建體可w賦予對該抗生素或除草劑的抗性）的 培養基上培育工程化的植物材料來進行選擇。另外，還可W通過篩選重組核酸構建體上可 能存在的任何可見的標志物基因（例如，YFP，GFP，e-葡萄糖醒酸酶，巧光素酶，B或C1基因） 的活性來鑒定轉化細胞。運些選擇和篩選方法是本領域技術人員眾所周知的。
[0194] 還可W使用物理和生物化學方法鑒定含有插入基因構建體的植物或植物細胞轉 化體。運些方法包括但不僅限于：1) Southern分析或PCR擴增，用于檢測和確定重組DNA插入 物的結構；2)Northern印跡、S1 RNA酶保護、引物延伸或逆轉錄酶-RNA擴增，用于檢測并檢 查基因構建體RNA轉錄本;3)酶學測定，用于檢測酶或核酶活性，如果運樣的基因產物由所 述基因構建體編碼的話;4)二代測序(NGS)分析;或5)蛋白凝膠電泳、we stern印跡技術、免 疫沉淀或酶聯免疫吸附測定巧LISA)，如果所述基因構建體的產物是蛋白質的話。也可W使 用其它的技術，例如原位雜交、酶染色和免疫染色，來檢測重組構建體在特定植物器官和組 織中的存在或表達。實施運些實驗的方法是本領域技術人員眾所周知的。
[0195] 使用本文公開的方法進行的基因操作的效果可W通過，例如，從感興趣的組織中 分離的RNA(例如，mRNA)的Nodhern印跡來進行觀察。通常，如果存在mRNA或者mRNA的量增 加了，則可W推定相應的轉基因被表達。可W使用其它用于測量基因和/或編碼多膚活性的 方法。可W使用不同類型的酶測定，取決于所用的底物W及檢測反應產物或副產物增加或 降低的方法。此外，多膚的表達水平可W用免疫化學手段測量，通過使用化ISA，RIA，EIA和 本領域技術人員眾所周知的其它基于抗體的測定，例如通過電泳檢測方法(無論是與染色 還是印跡法聯用）。作為一個非限制性的實例，在美國專利公開號2009/0093366(通過提述 并入其全部內容）中描述了使用化ISA測定檢測AAD-1 (芳氧基鏈燒酸雙加氧酶；參見W0 2005/107437)和PAT(麟絲菌素-N-乙酷基轉移酶)蛋白。轉基因還可W選擇性地在一些細胞 類型或植物組織中表達，或者在某些發育階段中表達。轉基因還可W在基本上所有的植物 組織中沿著其整個生命周期表達。然而，任何組合的表達模式也是可W使用的。
[0196] 本公開還包括上述轉基因植物的種子，其中該種子包括報告基因、轉基因、或基因 表達盒。本公開進一步包括上述轉基因植物的后代、克隆、細胞系或細胞，其中所述后代、克 隆、細胞系或細胞包括所述報告基因、轉基因或基因構建體。
[0197] 盡管已經參考具體的方法和實施方案對本發明進行了描述，但是應當意識到，在 不背離本文中描述的本發明的前提下可W進行各種修改和變化。 實施例
[0198] 實施例1:新型啟動子鑒定和分離
[0199] 使用聚合酶鏈式反應(PCR)從玉米栽培種化-n的化i-1基因擴增了新型啟動子序 列。設計用于擴增該新型啟動子，稱為玉米栽培種化-II，的寡核巧酸(表1)來自于用作對照 的玉米栽培種B73化i-1啟動子序列的保守區。從玉米栽培種化-II獲得了一個PCR產物，并 進行了表征。
[0200] 使用Invi化ogen ZeroBlimt敏TQPO⑥PCR克隆試劑盒并根據制造商的使用說 明，將包含新型啟動子的PCR產物克隆到Topo?載體中。提供了一幅載體圖來顯示包含新型 啟動子PCR產物的克隆質粒。質粒PDAB105713對應于玉米栽培種化-IK圖2)。
[0201]
[0202] 克隆之后，使用本領域技術人員已知的方法對含有PCR產物的啟動子插入物進行 測序。將玉米栽培種化-II的各啟動子多核巧酸序列（圖4)計算比對，隨后分析它們與玉米 栽培種B73郵i-1對照序列（圖3)的序列同源性。序列同源性分析使用本領域技術人員已知 的生物信息學方法和/或軟件程序，例如Clus化1W或Sequencher來執行。
[0203] 實施例2:新啟動子表征
[0204] 序列同源性分析（圖3-7)，包括與玉米栽培種B73 Ubi-1對照序列（SEQ ID N0:1; 圖3)的序列比對和比較，顯示了一個供進一步表征的新化i-1啟動子。還觀察到運個獲自玉 米栽培種化-II的新化i-1啟動子序列（SEQ ID N0:2;圖4)包括S個不同區域的多核巧酸序 列：1)上游啟動子區（SEQ ID N0:4)，2)5'-UTR(SEQ ID N0:6)，和3)內含子（SEQ ID N0:8)。 分析了來自玉米栽培種化-n的啟動子區和特異性啟動子元件與玉米栽培種B73 Ubi-1對 照序列的序列同源性（圖5-7)。更具體地，進行序列比對來獨立地比較玉米栽培種化-II啟 動子的上游啟動子、5'-UTR和內含子區，W及TATA框和熱休克元件化SE)調節元件與玉米栽 培種B73化i-1對照序列的相應區域(圖5-7,表2)。
[0205]
[0206] 圖5顯示了玉米栽培種化-II啟動子的上游啟動子區與玉米栽培種B73 Ubi-1對照 啟動子序列的上游啟動子區的序列比對。圖6顯示了玉米栽培種化-n啟動子的5'-UTR或前 導序列與玉米栽培種B73 Ubi-1對照啟動子序列的5'-UTR或前導序列的序列比對。圖7顯示 了玉米栽培種化-II啟動子的內含子區與玉米栽培種B73 Ubi-1對照啟動子序列的內含子 序列的序列比對。
[0207] 從玉米栽培種化-II得到的啟動子元件與玉米栽培種B73 Ubi-1序列顯示94.7% 的總體序列同一性(表2)。來自玉米栽培種化-II的新型啟動子序列的特征確認，通常在功 能性啟動子中發現的大多數啟動子調節元件（即，TATA框或熱休克元件)在玉米栽培種化- II啟動子的核屯、啟動子區域內也是高度保守的（表2)。例如，圖5顯示了高度保守的TATA框 (堿基對861-873,用斜體和下劃線顯示），它被鑒定并被發現定位在新型玉米栽培種化-II Ubi-1啟動子的上游啟動子區的TSS 5'上游大約50bp處。類似地，圖5顯示了兩個重疊的熱 休克元件化SE)序列(分別為堿基對454-781，用下劃線顯示，和479-498,用雙下劃線顯示）， 它們在本項研究分析的新型玉米栽培種化-II Ubi-1啟動子中是相當保守的，并且位于TSS 5'上游大約2(K)bp處。
[0208] 新型玉米栽培種化-II化i-1啟動子的5'-UTR或前導序列中僅觀察到低水平的變 化，其與玉米栽培種B73 Ubi-1對照序列具有98.8%的同一性（圖6)，但是在上游啟動子區 (圖5)和內含子區（圖7)中也鑒定了序列保守性較低的區域。例如，位于玉米栽培種化-II Ub i -1啟動子的上游啟動子區中的一個1 Obp啟動子調控元件(堿基對90-100，下劃線表示） 不是保守的（圖5)。實際上，玉米栽培種化-II啟動子中大多數的序列變化是專口由上游啟 動子序列和內含子序列貢獻的，運兩者與玉米栽培種B73 Ubi-1上游啟動子和內含子區域 顯示的序列相似性分別僅為93.3%和95.4% (圖5和7，表2)。
[0209] 此外，在延伸到TSS 5'上游100-2(K)bp的玉米化i-1上游啟動子區內存在更多的調 芐基序。運些基序與轉錄因子結合，運些轉錄因子與轉錄起始復合體相互作用并易化其組 裝，提高其穩定性，或一旦轉錄機構開始工作，增加啟動子脫離的效率（PEREMARTI et al.2010)。因此，運個調節區域內的缺失、取代和錯配會潛在影響啟動子的強度和特異性。
[0210] 實施例3:使用新型啟動子用于基因表達的載體構建
[0211] 除非另外指出，否則運個實施例和后續實施例中描述的分子生物學和生物化學操 作通過標準方法實施，例如在Ausubel et al.(1995)和Sambrook et al.(1989)及其更新 版本中公開的。本實驗中使用的構建體在下面有更詳細的描述(表3)。
[0212] 從玉米物種的化i-1基因提取包含如前所述上游啟動子、5'-UTR和內含子區的玉 米啟動子，并且PCR擴增子使用QIAquick凝膠提取試劑盒愈（Qiagen Ca;rlsbad，CA)進行凝 膠純化。然后使用本領域已知的標準克隆技術將啟動子多核巧酸序列克隆到Gateway入口 載體⑧（Invitrogen)中。通過限制性消化和測序進行確認所得的Gateway入口載體猿包括 玉米栽培種化-II的化i-1啟動子序列。將包括玉米栽培種B73 Ubi-1啟動子序列的對照入 口載體也使用本領域的標準克隆技術克隆到Gateway入口載體中。
[0213] 除了師i-1啟動子序列之外，入口載體還包括來自杯水母物種的黃色巧光蛋白報 告基因（PhiYFP;aiagin, D.A.，（2004)M〇1 Biol Evol. 21; 841-50)，在其序列中納入了ST- LS1 內含子(Vancann巧t，G.，（ 1990)M〇1 Gen Genet. 220; 245-50)，和玉米過氧化物酶5基因 (ZmPer5;美國專利6，699，984)的3 ' -UTR區。提供了顯示包含每一個啟動子序列的克隆入口 載體的載體圖。構建體PDAB105742對應于包含玉米栽培種B73 Ubi-1啟動子序列的對照入 口載體。構建體PDAB105740對應于包含玉米栽培種化-II Ubi-1啟動子序列的對照入口載 體。運樣，建立了包含玉米化i-1啟動子、PhiYFP基因和ZmPe巧3'-UTR的基因表達盒的入口 載體。
[0214] 如表3所示，構建了二元表達載體構建體，其包括受所述新啟動子序列驅動并W ZmPe巧3'-UTR終止的曲巧FP報告基因。使用標準目的二元載體PDAB101917和包含如上所 述的基因表達盒的入口載體通過使用標準克隆方法和G勸eway夠重組反應構建了用于± 壤桿菌介導的玉米胚轉化的轉化或表達載體。
[021引二元目的載體PDAB101917包括除草劑耐受基因，草胺麟乙酷轉移酶（PAT; Wehrmann et al., 1996,Nature Biotechnology 14:1274-1278)。在pDAB101917載體中， PAT基因的表達受到玉米化i-1啟動子、5'-UTR和內含子的控制。該PDAB101917載體還包括 來自玉米脂肪酶基因（ZmLip;美國專利7，179，902)的3 ' -UTR區。該ZmLip 3 ' -UTR用于終止 PAT mRNA的轉錄。該Gateway貨重組反應能夠將每個包含基因表達盒（即玉米栽培種化-II 或玉米栽培種B73 Ubi-1啟動子、PhiYFP基因和ZmPer5 3'-UTR)的入口載體插入到 pDAB 101917目的二元載體中。入口載體被插入在pDAB 101917目的載體內T-DNA邊界A和B之 間，并位于PAT表達盒的上游。
[0216]
[0217]提供了顯示二元表達載體PDAB101917的載體圖，其具有基因表達盒，該表達盒包 括納入的玉米Ubi-1啟動子、PhiYFP基因和Zm化巧3'-UTR。對照構建體PDAB105748對應于 包含玉米栽培種B73 Ubi-1啟動子的基因表達盒（圖8)。此外，構建體PDAB105746對應于包 含玉米栽培種化-II化i-1啟動子序列（圖9)的基因表達盒。
[021引實施例4:植物轉化
[0219] 使用本領域已知的標準轉化技術將二元載體構建體，pDAB105748(玉米栽培種 B73)和PDAB105746(玉米栽培種化-II)，各自轉化進入根癌±壤桿菌菌株EHA101中。分離細 菌菌落，并提取二元質粒DNA，純化，并通過限制酶消化進行確認。
[0220] 玉米植物的轉化根據Vega et al.，2008，Plant Cell Rep 27:297-305中描述的 方案進行，采用±壤桿菌介導的轉化和麟絲菌素乙酷轉移酶基因（PAT;Wehrmann et al.， 1996,化1:ure Biotechnology 14:1274-1278)作為選擇性植物標志物。使用包含二元載體 構建體(如上所述）的根癌±壤桿菌培養物轉化玉米栽培種化-II植物，產生了第一輪To轉 基因玉米事件。在轉化2.5個月之后，產生、制備并收獲了未成熟的合子胚。
【主權項】
1. 一種基因表達盒，其包括與轉基因可操作連接的啟動子，其中該啟動子包括與SEQ ID NO:2具有至少90%序列同一性的多核苷酸。2. 權利要求1的基因表達盒，其中該啟動子在嚴格條件下與如下所述的多核苷酸探針 雜交:該多核苷酸探針包含與SEQ ID NO:2的互補物的至少90%的序列同一性。3. 權利要求1的基因表達盒，其中該可操作連接的轉基因編碼多肽或小RNA。4. 權利要求1的基因表達盒，其中該轉基因選自下組:殺蟲劑抗性轉基因、除草劑耐受 性轉基因、氮利用效率轉基因、水分利用效率轉基因、營養品質轉基因、DNA結合轉基因、和 選擇標志物轉基因。5. 權利要求1的基因表達盒，其進一步包括3 非翻譯區。6. -種重組載體，其包括權利要求1的基因表達盒。7. 權利要求6的重組載體，其中該載體選自下組:質粒、粘粒、細菌人工染色體、病毒、和 噬菌體。8. -種轉基因細胞，其包括權利要求1的基因表達盒。9. 權利要求8的轉基因細胞，其中該轉基因細胞是轉基因植物細胞。10. -種轉基因植物，其包括權利要求9的轉基因植物細胞。11. 權利要求10的轉基因植物，其中該轉基因植物是單子葉植物或雙子葉植物。12. 權利要求11的轉基因植物，其中該單子葉植物選自下組:玉米植物，水稻植物，和小 麥植物。13. 來自權利要求10的轉基因植物的轉基因種子。14. 一種轉基因細胞，其包含與SEQ ID N0:2具有至少90%序列同一性的合成多核苷 酸。15. 權利要求14的轉基因細胞，其中該合成多核苷酸在嚴格條件下與如下所述的多核 苷酸探針雜交:該多核苷酸探針與SEQ ID NO:2的互補物包含至少90%的序列同一性。16. 權利要求14的轉基因細胞，其中該轉基因細胞是轉基因植物細胞。17. 權利要求16的轉基因細胞，其中該轉基因植物細胞是通過植物轉化方法產生的。18. 權利要求17的轉基因細胞，其中該植物轉化方法選自下組：土壤桿菌介導的轉化 法，生物射彈轉化法，碳化硅轉化法，原生質體轉化法和脂質體轉化法。19. 一種轉基因植物，其包括權利要求14的轉基因植物細胞。20. 權利要求19的轉基因植物，其中該轉基因植物是單子葉植物。21. 權利要求20的轉基因植物，其中該單子葉植物選自下組:玉米植物，水稻植物，和小 麥植物。22. 來自權利要求21的轉基因植物的轉基因種子。23. -種重組載體，其包括權利要求14的基因表達盒。24. 權利要求23的重組載體，其中該載體選自下組:質粒、粘粒、細菌人工染色體、病毒 和噬菌體。25. -種用于在轉基因植物中表達異源編碼序列的方法，該方法包括： a) 用含有如下所述的多核苷酸序列的基因表達盒轉化植物細胞:該多核苷酸序列包含 與異源編碼序列可操作連接的SEQ ID N0:2,該異源編碼序列與3'非翻譯區可操作連接； b) 分離包含該基因表達盒的轉化植物細胞； C)將該轉化植物細胞再生成轉基因植物;和 d)獲得該轉基因植物，其中該轉基因植物包括所述含有包含SEQ ID NO: 2的多核苷酸 序列的基因表達盒。26. 權利要求25的方法，其中該異源編碼序列選自下組:殺蟲劑抗性編碼序列、除草劑 抗性編碼序列、氮利用效率編碼序列、水分利用效率編碼序列、營養品質編碼序列、DNA結合 編碼序列、和選擇標志物編碼序列。27. 權利要求25的方法，其中轉化植物細胞是植物轉化方法。28. 權利要求27的方法，其中該植物轉化方法選自下組:土壤桿菌介導的轉化法，生物 射彈轉化法，碳化硅轉化法，原生質體轉化法和脂質體轉化法。29. 權利要求25的方法，其中該轉基因植物是單子葉植物或雙子葉轉基因植物。30. 權利要求29的方法，其中該單子葉轉基因植物選自下組:玉米植物，小麥植物，和水 稻植物。31. 來自權利要求25的轉基因植物的轉基因種子。32. 權利要求25的方法，其中該異源編碼序列在轉基因植物組織中表達。33. 權利要求25的方法，其中該轉基因植物組織是轉基因植物根、芽、莖或花粉組織。34. -種用于分離包含與SEQ ID NO: 2的至少90%序列同一性的多核苷酸序列的方法， 該方法包括： a) 鑒定包含與SEQ ID的至少90%序列同一性的多核苷酸序列； b) 產生多個寡核苷酸引物序列，其中該寡核苷酸引物序列能結合包含與SEQ ID的至少 90 %序列同一性的多核苷酸序列； c) 用選自該多個寡核苷酸引物序列的寡核苷酸引物序列從DNA樣品擴增包含與SEQ ID 的至少90%序列同一性的多核苷酸序列;和 d) 分離包含與SEQ ID的至少90%序列同一性的多核苷酸序列。35. 權利要求34的方法，其中該包含與SEQ ID N0:2的至少90%序列同一性的分離多核 苷酸序列與轉基因可操作連接。36. 權利要求35的方法，其中該可操作連接的轉基因編碼多肽或小RNA。37. -種純化的多核苷酸序列，其包含與SEQ ID N0:2的至少90%的序列同一性，其中 該純化的多核苷酸序列促進轉基因的表達。38. 權利要求37的純化多核苷酸序列，其中包含與SEQ ID NO: 2的至少90%序列同一性 的多核苷酸探針序列在嚴格條件下與權利要求37的純化多核苷酸序列雜交。39. 權利要求37的純化多核苷酸序列，其中該純化多核苷酸序列與轉基因可操作連接。40. 權利要求39的可操作連接的轉基因，其中該可操作連接的轉基因編碼多肽。41. 一種基因表達盒，其包含與轉基因可操作連接的權利要求37的純化多核苷酸序列， 所述轉基因與3 非翻譯區可操作連接。42. 權利要求41的基因表達盒，其中該轉基因選自下組:殺蟲劑抗性轉基因、除草劑抗 性轉基因、氮利用效率轉基因、水分利用效率轉基因、營養品質轉基因、DNA結合蛋白轉基 因、和選擇標志物轉基因。43. -種重組載體，其包括權利要求41的基因表達盒。44. 權利要求43的重組載體，其中該載體選自下組:質粒載體、粘粒載體、和BAC載體。45. -種轉基因細胞，其包括權利要求37的純化多核苷酸序列。46. 權利要求45的轉基因細胞，其中該轉基因細胞是轉基因植物細胞。47. -種轉基因植物，其包括權利要求46的轉基因植物細胞。48. 權利要求47的轉基因植物，其中該轉基因植物是單子葉植物。49. 權利要求48的轉基因植物，其中該單子葉植物選自下組:玉米植物，小麥植物，和水 稻植物。50. 來自權利要求49的轉基因植物的轉基因種子。
【文檔編號】C12N15/00GK106062189SQ201480076574
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2014年12月31日
【發明人】S·庫馬爾, M·古普塔, T·R·賴特, S·M·杰恩, D·A·史密斯, D·阿拉貝德
【申請人】美國陶氏益農公司