基于合成生物學的新型adcc技術的制作方法
【專利摘要】提供基于合成生物學的新型ADCC技術，其增強或確保ADCC應答。該新型的ADCC技術能用于預防或治療癌癥、傳染性疾病、炎癥性或自身免疫疾病，和需要消除病變細胞的其他疾病。
【專利說明】基于合成生物學的新型ADCC技術 相關申請的交叉引用
[0001] 本申請要求于2014年1月8日提交的有相同題目的序列號為61/925,217的共同待 審的美國臨時專利申請的優先權和權益，所述申請的全部內容并入本文作為參考。
技術領域
[0002] 本發明設及能增強免疫效應細胞介導抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)的能力或使 細胞能介導ADCC的合成生物學產品和方法，及使用它們治療和預防癌癥、傳染性疾病、炎癥 性和自身免疫疾病和其他疾病的方法。
【背景技術】
[0003] 哺乳動物，特別是包括人類的高等脊椎動物，已經發展出高度復雜的免疫系統，使 用多種機制和效應器來檢測、破壞、或至少控制外來病原體及病變的或應激的自體細胞。運 些病變細胞可能已經被病毒或細菌感染，或已經變成癌性的。
[0004] 免疫系統識別和消除病變的宿主細胞及侵入細胞內的微生物(例如，病毒、細菌或 寄生蟲）的機制之一是通過細胞介導的細胞毒作用，其可W由許多白細胞和蛋白實施。運些 潛在的細胞毒性效應器包括:來自淋己系的一一自然殺傷(NK)細胞和細胞毒性T淋己細胞 (CTLs);和來自骨髓系的一一巨隧細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞。
[0005] 免疫系統啟動細胞介導的細胞毒作用的一個重要途徑依賴于抗體。過去十年，祀 向于腫瘤-特異性細胞-表面蛋白的單克隆抗體(mAbs)已經成為受歡迎的抗癌治療方法。一 些mAbs已經進入常規臨床實踐，包括利妥昔單抗（Ri tuxan，Mabthera)、曲妥珠單抗 巧erceptin)和西妥昔單抗化;rbitux；LmAbs因其雙功能的性質而受歡迎。可W使抗體的一 端(Fab)精確地針對特定腫瘤蛋白而不改變招募各種效應細胞和蛋白來殺死腫瘤細胞的另 一端(Fc)。
[0006] 具體地，抗體首先識別和結合祀細胞表面抗原后，充當接頭蛋白（adapter)，通過 與那些免疫效應細胞上的特定受體的第二結合繼而激活免疫效應細胞的細胞毒性能力。運 被稱為抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)。例如，在抗癌的固有免疫中，ADCC主要由表達相對低 親和力的Fc受體(Fc 丫 RIIla，又稱為CD 16a)的自然殺傷(NK)細胞(和，較少程度上的中性粒 細胞、單核細胞和巨隧細胞)介導，Fc受體只有通過與覆蓋祀病變細胞(例如，腫瘤細胞)上 的多價抗原的抗體的Fc(恒定的）部分結合才被激活。運一結合引起如穿孔素和顆粒酶(及 很多細胞因子，包括IFN-丫）的細胞毒性顆粒的釋放，導致祀細胞的溶解。體外實驗和動物 實驗已經顯示了 ADCC應答的重要性。此外，一些臨床研究顯示，攜帶更低親和力的CD16變體 (F158)的患者具有更差的臨床療效。
[0007] 然而，主要由內源的自然殺傷(NK)細胞介導的ADCC的療效在體內是局限的（就完 全由內源的細胞毒性T淋己細胞參與腫瘤清除而言，發現其療效也是非常局限和不足的）， 歸因于許多生理及病理原因，解釋如下。
[000引第一，參與ADCC應答的大部分細胞，例如，巨隧細胞和中性粒細胞，在被激活時不 傾向于增殖。NK細胞對激活的反應同樣具有有限的增殖潛能，并且它們也迅速地死亡。因 此，即使ADCC效應器識別覆蓋病變細胞的抗體，體內的固有ADCC應答仍然有抵不過疾病進 展(例如，病毒感染、癌癥)的風險。
[0009] 第二，許多ADCC效應細胞也表達抑制性受體W減弱它們的免疫應答，從而建立制 衡系統。運些受體包括對CD56<6的NK細胞的抑制性KIRs(殺傷細胞免疫球蛋白樣受體）、單核 細胞和B細胞上的化丫 Rllb、和對T細胞的CTLA-4(CD152)和PD-1 (程序性-死亡-1，CD279)。 癌細胞和病毒通過異常地擴大運些抑制性通路來對抗體內的基于ADCC的防御系統。
[0010] 第S，ADCC效應細胞上的主要Fc受體，化丫 Rllla，對抗體有相對低的親和力化 1(T6M)--即使受體的V158變體與受體的無效F158型相比僅具有兩倍高的親和力。通過運 一機制，一旦細胞表面祀標降至低于特定水平，癌細胞變得對一些治療性單克隆抗體 (mAbs)有抵抗力。
[0011] 鑒于其在疾病(例如，癌癥或其他疾病）中增殖和親和力的天然局限性及通過抑制 性Fc受體的進一步減弱，體內的ADCC功能具有巨大潛力從未被完全實現。因此，合成生物學 代表新的和高度期望的方法，在預防和治療人類疾病中啟動ADCC活性的所有潛能。 發明概述
[0012] 本發明開發新方法W提高免疫系統對癌癥、傳染性疾病和其他疾病的防御。使用 合成生物學和重組技術工具，本發明旨在設計和建立ADCC增強子或增強系統，其將大大提 高ADCC應答對抗許多種疾病(包括癌癥）的效力。在一方面，本發明通過在系統的"傳感器" 部分增強它的結合親和力而不減弱其特異性來提高ADC邱方御系統的檢測靈敏度和效率。在 另一方面，本發明通過增強細胞毒性效應細胞的增殖潛能來提高系統的"效應器"部分。在 優選的實施方案中，將多于一個的W上方面組合。然而，本發明的其他實施方案，可能只反 映上述的發明方面的其中之一。
[OOU]本發明的ADCC增強子可W與抗體療法聯合使用，或單獨使用來祀向被天然存在的 抗體或W治療為目施用的合成抗體識別或結合的病變細胞。
[0014]在第一方面，其關注于ADCC增強系統的"效應器"部分，本發明著手于建立與野生 型人CD16(例如，最普遍的人CD16型，F158變體)相比對抗體有更高親和力的胞外域，或細胞 外結構域。運產生高親和力的跨膜Fc受體，其細胞外部分可W是基于現有的化受體的胞外 域。該"嵌合的"或"融合"受體，其部分或全部，可W來自免疫系統的另一大分子或重新設 計。具有高親和力的Fc受體能夠使免疫效應細胞有效地結合不同抗體所共有的相同Fc片 段，其相應地祀向廣泛的多種細胞表面抗原并由此祀向廣泛的多種疾病和適應癥。與抗原 依賴性免疫療法(其每次需要針對每個具體的抗原建立不同的抗體，其過程對時間和其他 資源耗費昂貴)相比，運是極大的優勢。
[001引在第二方面，其關注點移向ADCC系統的"效應器"部分，本發明并入模塊，一旦其表 達，能促進ADCC效應細胞的擴增。
[0016] 相應地，在一個實施方案中，本發明提供基因構建體，編碼:跨膜嵌合受體，其包含 與人CD16的F158變體相比對抗體的化具有更高結合親和力的胞外域，跨膜結構域和調節 ADCC激活和擴增的胞內域。
[0017] 本發明的基因構建體可包括DNA或RNA分子。該構建體可大體上地包括CD64 (例如， 人)的EC3外顯子，或，除此之外，大體上地包括(人)CD64的EQ和EC2外顯子。可選地，本發明 的基因構建體包括能翻譯成大體上包含CD64胞外域的胞外域的RNA。在一個特征中，胞外域 的選擇基于CD64的外顯子邊界或結構域邊界。優選地，與人CD16的V158變體相比，該胞外域 對Fc具有更高的親和力。在另一特征中，跨膜嵌合受體表達為融合蛋白。此外，胞內域可包 括擴大模塊，其可 W 選自 CD3C、CD28、CD 134、CD 137、CD27、CD79a、CD79b、CD40和 GM-CSF 受體 的部分或全部的細胞內結構域。
[0018] 在進一步的實施方案中，本發明提供了從W上基因構建體翻譯而來的跨膜嵌合受 體。在一個特征中，本發明受體的胞外域大體上地包含CD64的胞外域中的免疫球蛋白樣折 疊，其在CD16中沒有，或，大體上地包含CD64的胞外域。在一個特征中，該跨膜結構域大體上 地包含CD16的跨膜結構域。該受體可W進一步包括ADCC擴大模塊，其增強宿主免疫效應細 胞的存活和增殖。該擴大模塊可W選自CD3C、CD28、CD134、CD137、CD27、CD79a、CD79b、CD40 和GM-CSF受體的部分或全部的細胞內結構域。
[0019] 在另一實施方案中，本發明提供用本發明的基因構建體或蛋白離體感染或轉染的 免疫效應細胞。該免疫效應細胞可W是，例如，細胞毒性T淋己細胞、自然殺傷細胞、嗜酸性 粒細胞、巨隧細胞、中性粒細胞、嗜堿性粒細胞、單核細胞、B細胞和表達或改造后表達細胞 毒性因子的其他細胞。
[0020] 在又一實施方案中，本發明提供藥物組合物，其包括本發明的基因構建體、蛋白或 免疫效應細胞，和藥學上可接受的賦形劑。
[0021] 在進一步的實施方案中，本發明提供一種方法，治療性地或預防性地治療某種狀 況下的有此需要的受試者，其方法包括給所述受試者施用治療有效量或預防有效量的本發 明的藥物組合物。在一個特征中，方法進一步包括施用針對至少一種指示所述狀況的細胞 表面抗原的治療性抗體。免疫效應細胞可W是對所述受試者自體同源的，狀況選自癌癥、炎 癥性疾病、自身免疫疾病、移植排斥和感染。在一個特征中，本發明的藥物組合物作為針對 所述狀況的疫苗施用。
[0022] 在又一實施方案中，本發明提供一種方法，治療性地或預防性地治療某種狀況下 的有此需要的受試者，通過(a)用某種抗原源致敏從所述受試者中分離的樹突細胞；（b)將 所述致敏的樹突細胞輸注回所述受試者；（C)給所述受試者施用治療或預防有效量的本發 明的藥物組合物。抗原的來源可W是自體同源的或外源的，狀況可W選自癌癥、炎癥性疾 病、自身免疫疾病、移植排斥和感染。 附圖簡述
[0023] 圖1示例性地描述了根據本發明的嵌合抗體受體的實施方案。嵌合受體具有對抗 體的化部分有相對高親和力的細胞外結構域和有相對高的刺激增殖活性的細胞內信號結 構域。
[0024] 圖2示例性地比較了 CD16和CD64的蛋白結構域結構，其中CD16和CD64的細胞外結 構域分別由兩個和=個免疫球蛋白折疊組成。相似的陰影代表類似的折疊。
[0025] 圖3示例性地比較了 CD16和CD64的基因外顯子圖譜:分泌信號序列是白色，細胞外 區域是陰影線，跨膜和細胞內區域是黑色。內含子和外顯子區域都不是按比例繪制的。
[0026] 圖4示例性地示出了根據一個實施方案的生成本發明嵌合受體的克隆策略。旁側 的字母表示克隆時使用的限制性酶切位點：H-HindIIirr )、B-BamHir'B")和Bg-Bglll ("郵'）。
[0027] 圖5是根據本發明的實施方案的用于克隆受體的可商購的慢病毒載體的圖譜。
[0028] 圖6是根據本發明的可用于克隆受體的可選的載體構建的圖譜。
[0029] 圖7顯示了轉染了（a)陰性對照，（b)空載體，（C)表達CD16V的載體，和（d)表達 CD64-16(外顯子）構建體的載體的E邱i293細胞的流式細胞術結果，通過表達載體發出的 GFP信號測定。
[0030] 圖8顯示了轉染了（a)陰性對照，（b)空載體，（C)表達CD16V的載體，和（d)表達 CD64-16(外顯子）構建體的載體的E邱i293細胞的流式細胞術結果，通過巧光標記的抗- CD16(SMPUW和CD16V)或抗-CD64(基于外顯子融合的CD64-16)發出的巧光測定。
[0031] 圖9顯示了轉染了（a)陰性對照，（b)空載體，（C)表達CD16V的載體，和（d)表達 CD64-16(外顯子)構建體的載體后用Ri化ximab(治療性抗體)染色的E邱i293細胞的流式細 胞術結果，通過巧光標記的抗-人IgG發出的巧光測定。
[0032] 圖10列出了根據本發明的實施方案能翻譯成嵌合受體的DNA序列（SEQ ID NO: 1) (上圖），其中該人CD64的細胞外區域用基于結構域的策略與人CD16的區域融合（用破折號 標記融合位點）。下圖列出了相應的蛋白序列（SEQ ID NO:2)。
[0033] 圖11列出了根據本發明的實施方案能翻譯成嵌合受體的DNA序列（SEQ ID N0:3) (上圖），其中該人CD64的細胞外區域用基于外顯子的策略與人CD16的區域融合（用破折號 標記融合位點）。下圖列出了相應的蛋白序列（SEQ ID N0:4)。
[0034] 圖12列出了根據本發明的實施方案的嵌合受體的細胞內區域的DNA序列（SEQ ID ^:5)，其中該區域由來自人〔028、人〔0134、人〔0137和人〔03(的擴大模塊組成。下圖列出了 相應的蛋白序列（SEQ ID N0:6)。間隔區序列W小寫字母書寫。
[0035] 圖13列出了根據本發明的實施方案能翻譯成嵌合受體的DNA序列（SEQ ID N0:7) (上圖），其中該人CD64的細胞外區域用基于結構域的策略與人CD16的區域融合，進一步與 圖13中描述的擴大模塊融合。下圖列出了相應的蛋白序列（SEQ ID N0:8)。間隔區序列W小 寫字母書寫。
[0036] 圖14列出了根據本發明的實施方案能翻譯成嵌合受體的DNA序列（SEQ ID N0:9) (上圖），其中該人CD64的細胞外區域用基于外顯子的策略與人CD16的區域融合，進一步與 圖13中描述的擴大模塊融合。下圖列出了相應的蛋白序列（SEQ ID NO: 10)。間隔區序列和 突變序列W小寫字母書寫。 發明詳述 I.定義
[0037] 除非另外說明，技術術語根據常規用法使用。分子生物學中的常見術語定義可在， 例如，Benjamin Lewin，Genes VII，0xford University Press 出版，2000(ISBN 019879276X)；Kendrew et al.(eds.)；The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell出版社出版，1994(ISBN 0632021829);和Robed A.Meyers(ed.)，Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference，Wiley,John&Sons,Inc. 出版，1995(ISBN 0471186341);和其他相似的技術參考資料中找到。
[0038] 如文中所使用的，"一個"或"一種"可W表示一個或多個。如文中所使用的，當與詞 語"包含"結合使用時，詞語"一個"或"一種"可W表示一個或多于一個。如文中所使用的"另 一個"可W表示至少第二或更多。進一步地，除非上下文另有要求，單數術語包括復數，復數 術語包括單數。
[0039] 如文中所使用的，無論是否明確指明，"大約"指數值，例如，包括整數、分數和百分 數。術語"大約"通常指數值的范圍（例如，所述值的+/-5-10%)，該數值范圍本領域的普通 技術人員會認為等同于所述值(如，有同樣的功能或結果）。在一些情況下，術語"大約"包含 的數值四舍五入到最接近的有效數字。
[0040] CD16表達為兩種不同的形式，CD16a和CD16b，其為兩個不同但高度同源基因的產 物。CD16a是多膚錯定跨膜蛋白而CD16b是糖基憐脂酷肌醇錯定蛋白。如本文中所使用的， CD16指該蛋白的兩種形式，除非對于技術人員來說顯而易見不合適。
[0041] 本發明的ADCC增強子可W包含于任何具有細胞毒性能力的免疫效應器中，包括但 不限于:T細胞(包括細胞毒性T淋己細胞(CTLs)和輔助T細胞），NK細胞(大顆粒淋己細胞）， 嗜酸性粒細胞，巨隧細胞，中性粒細胞，嗜堿性粒細胞，單核細胞和B細胞。本發明的效應細 胞可W是自體同源的、同源的或異源的，其選擇依賴于所治療的疾病和可用方法。 n.組合物
[0042] 本發明開發了ADCC增強系統，其具有一個或多個W下區別特征：（a)遺傳物質，其 編碼對結合在祀細胞表面的抗體的Fc片段具有提高的親和力的嵌合受體；（b)遺傳物質，其 編碼當ADCC效應細胞吸引被天然存在或治療性抗體標記的祀病變細胞時，增強ADCC效應細 胞的增殖和存活的蛋白和/或RNA模塊；（C)遺傳物質，其編碼擴大ADCC應答效能的蛋白和/ 或RNA模塊。為此目的，編碼運些組分的基因構建體(作為ADCC增強系統)在體內或離體導入 宿主(例如，患者受試者)細胞：
[0043] 嵌合受體，其包含高親和力Fc結合胞外域，與激活ADCC和引起效應器增殖的跨膜 和細胞內結構域融合(圖1); (1)嵌合受體
[0044] 根據效應器，嵌合受體可W包括效應器的天然組成部分，例如，天然受體的部分或 全部的胞外域、跨膜結構域和/或細胞內結構域。本發明考慮的宿主是高等脊椎動物，優選 地是哺乳動物，更優選地是人。本發明的嵌合受體包括細胞外結構域(胞外域）、跨膜結構域 和細胞內結構域(胞漿結構域或胞內域）。 (l)(a)胞外域
[0045] 參見圖1，在一個實施方案中（左側），本發明的嵌合受體包含部分或全部的CD64 (Fc 丫 RI)的胞外域。雖然CD64和CD16都結合抗體的Fc區域，但前者有約100至1000倍更高的 親和力。高親和力的化受體(對IgGl和IgG3的Kd>l〇-9M)化丫 RKCD64)，存在于單核吞隧細 胞系的所有細胞(例如，巨隧細胞和中性粒細胞)上，與抗體介導的吞隧作用和介質的釋放 有關。如圖2中顯示的，Fc 丫 RI包括糖蛋白a鏈，其細胞外結構域由與結合抗體有關的=個免 疫球蛋白結構域組成，且已顯示，=個都存在是與抗體高親和力相互作用的關鍵。相反， CD16的胞外域只有兩個免疫球蛋白樣結構域。CD64中存在的額外免疫球蛋白樣折疊可能是 其高化親和力的強有力的決定因素。就此而言，本發明同樣考慮只將CD64中額外的免疫球 蛋白樣折疊或其突變形式插入CD16的胞外域，W構建對抗體高親和力的受體。
[0046] 根據本發明的實施方案，CD64(Fc 丫 RI)的胞外域融合任何合適的跨膜和細胞內結 構域，形成高親和力的化受體，從而介導ADCC。在一個優選的實施方案中，人CD64(化丫 RI) 的胞外域融合部分的人CD16(化丫 RIII)，例如，CD16(優選地，CD16a(化丫 Rllla))的跨膜結 構域和細胞內結構域兩者。有利地，由于胞外域源于機體，該實施方案中的嵌合受體是同源 的，因此是非免疫原性的。
[0047] 如圖1中顯示的，本發明嵌合受體的細胞內結構域中可有額外的模塊。運可包括能 擴大增殖和擴展信號的一個或多個模塊(例如，CD28)、促進效應細胞存活和阻止激活誘導 調亡的一個或多個模塊(例如，CD134和CD137)、激活或促進增殖和細胞毒作用信號轉導的 一個或多個模塊(例如，CD30。在W下部分進一步描述運些擴大模塊和刺激模塊的詳細內 容。 (l)(b)跨膜結構域
[0048] 本發明嵌合受體的跨膜結構域可W是能跨越細胞膜的任何合適的疏水的區域，優 選地W穩定的方式。在一個優選地實施方案中，該跨膜結構域對其細胞內結構域的鄰近組 分是天然的。例如，如圖1中顯示的，在一個實施方案中，其離膜最近的細胞內結構域的組分 或區域源自CD16，該跨膜結構域優選地是CD16的跨膜結構域。 (1) (c)胞內域 (iKcKi)ADCC 信號
[0049] 再參見圖1，在本發明的多個實施方案中，嵌合受體包括一個或多個ADCC的信號模 塊。CD16是天然的抗體受體，其激活與我們機體內大多數ADCC活動有關的效應細胞，特別是 NK細胞。因此，在多個實施方案中，本發明嵌合受體的胞內域包括CD16的部分或全部細胞內 結構域，優選地，CD 16a。也可包括其他模塊促進ADCC信號，例如與CD 1貼共享類似ITAM結構 域的CD3C。在一些實施方案中，只要CDlfe的細胞內結構域與其他共刺激模塊或元件協同表 達，ADCC信號可不需要CD3C。相反地，像CD3C的模塊可代替CD16的細胞內結構域的功能，使 其非必要。 (iKcKii)擴大模塊
[0050] 如圖1中顯示的，本發明的嵌合受體可W包括擴大ADCC應答的元件。根據效應細 胞，嵌合受體可W包括一個或多個擴大模塊，提供不同的功能。W下描述的模塊作為非限制 性示例和用于示例性目的。
[0051 ]在一個實施方案中，本發明嵌合受體的胞內域包括CD3C的部分或全部的細胞內結 構域。已顯示，源于T細胞表面的標記物CD3C對淋己細胞(例如，T細胞)的激活和增殖具有刺 激效果，引起很大程度放大的細胞毒性T細胞應答。
[0052] 在多個實施方案中，給本發明的嵌合受體加入一個或多個額外的共刺激模塊，W 便使激活效果維持顯著更長的時間，從而增加增殖和擴大潛能。一個示例是CD28的信號結 構域，當在抗原依賴的受體中與TC貼結構域表達時，其已顯示增強T淋己細胞的存活和增殖 化rause et al,J.Exp.Med.188:619-26,1998)。可W包含于本發明嵌合受體中的其他可選 模塊包括腫瘤壞死因子受體家族成員的細胞內結構域，例如CD134(0X40)、CD137(4-1BB)、 CD27，W通過阻止激活誘導調亡來促進效應細胞的存活（參見，例如，Finney et al.，J Immunol.，2014,172:104-13)。在一些或多種細胞類型中可W幫助增殖的其他細胞內結構 域存在于 CD79a、CD79b、CD40 和 GM-CSF 受體。 (2) 細胞表達
[0053] 使用標準的重組技術，構建嵌合受體的一個或多個表達盒，并克隆到載體上，例 如，質粒、源自腺病毒的載體、逆轉錄病毒或慢病毒。載體轉染(或，在病毒介導基因整合的 情況下轉導）入任何類型的免疫效應細胞。逆轉錄病毒轉導可w用已知的技術進行，例如 化hnson et al. (Blood 114,535-46,2009)中的。用傳統方法確認嵌合受體的成功的轉染 和表面展示，例如，通過流式細胞術。
[0054] 在一個實施方案中，從人患者的全血中提取免疫效應細胞作為外周血單核細胞 (PBMCs)，其包括淋己細胞(CD4+T細胞、CD8+T細胞、B細胞和NK細胞）、單核細胞、巨隧細胞等。 可選地，通過富集挑選的PBMCs子集進一步制備效應細胞，W實踐本發明。在一個具體的實 施方案中，B細胞從細胞混合物中移除。
[0055] 使用流式細胞術顯示轉導的細胞結合抗體的能力。用本領域技術人員熟知的標準 試驗和模型(例如，小鼠移植模型)離體和體內檢測和確認細胞結合覆蓋了抗體的細胞的能 力、釋放細胞因子的能力、進行ADCC的能力和增殖的能力。 III.治療和疫苗
[0056] ADCC增強子對于癌癥的臨床意義可W通過人癌細胞與治療抗體一起使用來顯示。 例如，處理化udi細胞，用（1)利妥昔單抗(商品名Riuixan"' )，祀向與淋己瘤、自身免疫疾病 和移植排斥有關的CD20,引起效應細胞激活、脫粒及增殖，和（2)用ADCC增強子轉導的免疫 效應細胞。同樣觀察到祀細胞殺傷。用可商購的N0D.scid.IL2R 丫小鼠進行體內檢測，其 有非常低的T細胞和B細胞，且沒有NK細胞。可選地，使用具有非常低的T細胞和B細胞和減少 的NK細胞的NOD. Scid小鼠。運些小鼠移植入標記的Daudi細胞，用任何合適的成像技術觀察 和檢測腫瘤的生長。在接受了 Ri tuximab和轉導了 ADCC增強子的免疫效應細胞的小鼠中觀 察到，持續時間的腫瘤緩解、腫瘤消退或長期的無進展。
[0057] 在另一個實施例中，處理SK-BR-3細胞或MDA-MB-231細胞，用（1)轉導了ADCC增強 子的免疫效應細胞和(2)Trastuzumab(商品名Herceptin? )，祀向與乳腺癌有關的肥R2/neu， 引起效應細胞激活、脫粒及增殖。同樣觀察到祀細胞殺傷。在類似于上面剛描述的示例的小 鼠模型中觀到察ADCC增強子的體內抗腫瘤能力。
[0058] ADCC增強子在自身免疫中的臨床應用可W用對運種疾病公認的小鼠模型之一來 展示。例如，在NOD小鼠中，已顯示抗體介導的B細胞缺失阻止和甚至逆轉1型糖尿病。然而， 該作用受Fc受體低親和力的限制化U et al.J Clin Invest.2007，117(12):3857-67; Xiuet al .J Immunol. 2008,180(5): 2863-75)。對照小鼠與或者單獨接受抗-CDl9或抗- CD20抗體的小鼠、或者接受抗-CD19或抗-CD20聯合轉導或表達本發明ADCC增強子的鼠免疫 效應細胞的小鼠對比。接受了 ADCC增強子的小鼠顯示疾病的延遲發生或癥狀的持續逆轉。
[0059] 類似的實驗可W在其他小鼠模型中進行，其中抗體介導的缺失已顯示影響疾病， 例如多發性硬化、實驗性自身免疫性腦脊髓炎（Barr et al.J Exp Med.2012,209(5): 1001-10)),art虹itis(化naba et al.J Immunol.2007,179(2):1369-80)等。
[0060] ADCC增強子在病毒性感染(例如HIV感染）中的臨床應用可W用公認的人源化小鼠 模型來顯示，其中聯合抗體的治療已顯示控制HIV的復制(化ture，2012,492(7427) :118- 22)。人源化小鼠最初通過NOD. RAG廠. IL2R 丫 小鼠與人胎肝源的CD34+造血干細胞重組 形成。運些小鼠有完整的人免疫系統，可W被HIV感染且不會消極地對人抗體做出反應。感 染的對照小鼠與或者單獨接受中和抗體混合物的小鼠、或者接受中和抗體混合物聯合轉導 了本發明ADCC增強子的免疫效應細胞的小鼠對比。接受了 ADCC增強子的小鼠顯示病毒血癥 的持續減少和T細胞數量的恢復。
[0061] 檢測ADCC增強子的臨床療效的可選的模型系統是猴-人免疫缺陷病毒(SHIV)感染 的幼兒恒河雜猴模型，其中中和抗體已顯示阻止疾病的快速發生（Jaworski et al.J Virol. 2013，87( 19): 10447-59)。感染的對照雜猴與或者只接受中和抗體混合物的雜猴、或 者接受中和抗體混合物聯合轉導了本發明ADCC增強子的免疫效應細胞的雜猴對比。接受了 ADCC增強子的雜猴類似地顯示病毒血癥的持續減少和T細胞數量的恢復。
[0062] 編碼本發明ADCC增強系統的DNA和RNA構建體可W使用技術人員所知的技術配制 給受試者施用。包含編碼ADCC增強系統的DNA和RNA構建體的制劑可W包括藥學上可接受的 賦形劑。制劑中包括的賦形劑基于，例如使用的基因構建體或效應細胞的類型，和給藥的模 式將有不同的用途。通常使用的賦形劑的示例包括，但不限于:鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、感 染水(￥日161'寸01-；[址6(31：；[0]1)、甘油、乙醇、和其組合、穩定劑、增溶劑和表面活性濟|、緩沖液 和防腐劑、張度劑、填充劑和潤滑劑。典型地，離體制備和培養表達ADCC增強子的免疫效應 細胞群。
[0063] 在本發明的一個方法實施方案中，首先用編碼本發明ADCC增強子的重組慢病毒 (或任何其他的基因治療載體，例如，瘤疹病毒、腺病毒、AAV等)離體感染從受試者的全血中 提取的免疫效應細胞。在確認成功轉染后，接著將被感染的PBMC細胞灌輸回同一個患者受 試者。然后，灌輸到患者受試者中的免疫效應細胞尋找和破壞病變細胞，包括被抗體覆蓋的 腫瘤細胞。為了實踐運個方法的實施方案，本發明提供了給醫生使用的試劑盒，其包括本發 明的制成的基因構建體，和，可選地，制備PBMC細胞的試劑及說明書。運個方法的一個改進 的實施方案包括感染或轉染PBMCs的細胞子集。運可W通過在優選地支持特定細胞型生長 的條件下培養PBMCs，或通過陽性或陰性篩選技術(如，巧光激活細胞分選或磁激發細胞分 選)選擇細胞，或結合兩者實現。本發明可選的方法的實施方案是用標準轉染技術將受體的 DM構建體或RNA轉染PBMCs或純化的細胞子集。
[0064] 在本發明的另一個實施方案中，制劑包含編碼ADCC增強子的基因構建體，其通過 脂質體或基于納米顆粒的技術遞送，可W用技術人員已知的模式和技術給受試者施用。示 例性模式包括，但不限于，靜脈注射。其他模式包括，但不限于，瘤內、皮內、皮下（S.C.， s.q.，sub-Q，Hypo)、肌肉（i .m.)、腹腔（i .P.)、動脈、髓內、屯、臟、關節內（關節）、滑膜內（關 節液區域）、煩內、脊柱內和銷內（脊髓液）。可W使用任何已知的用于制劑的胃腸外注射或 輸注的設備來進行運種給藥。
[0065] 包含給受試者施用的編碼ADCC增強子基因構建體的制劑，其包含對特定適應癥或 疾病的治療和/或預防有效的若干基因構建體或效應細胞。因此，當實踐本發明的方法時， 給受試者施用治療有效的編碼ADCC增強子的基因構建體。通常，施用基于細胞的制劑包含 約IxlO4到約lxl〇w之間的效應細胞。在大多數情況下，制劑會包含約IxlO5到約IxlO 9之間的 效應細胞。然而，給受試者施用的效應細胞的數量會在寬限度范圍內變動，其取決于癌癥或 疾病的部位、來源、特性、程度和嚴重性，被治療的個體的年齡和狀態等。醫生將最終決定合 適的使用劑量。
[0066] 如文中所使用的，術語"治療（treat)"、"治療（treating)"、和"治療（treatment)" 具有其普通及慣用含義，包括其中的一個或多個:阻止、減輕、或減少患者疾病(例如，癌癥） 癥狀的嚴重性和/或頻率，和/或抑制癌細胞的生長、分裂、傳播或增殖，或抑制患者癌癥進 展(例如，出現新腫瘤）。相對于未使用本發明的方法的受試者，治療指阻止、減輕、降低或抑 制約1%到約100%。優選地，相對于未使用本發明的方法的受試者，阻止、減輕、降低或抑制 是約 100%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、 10%、5% 或 1%。
[0067] 既作為治療劑又作為預防劑的表達本發明ADCC增強子的免疫效應細胞的臨床效 果可W通過使用樹突細胞(DCs)任選地增強。在淋己器官中，DCs呈遞抗原給輔助性T細胞， 進而調節免疫效應細胞，包括CTLs、B細胞、巨隧細胞、嗜酸性粒細胞和NK細胞。已有報道，改 造自體同源的DC表達HIV抗原或用外源HI V蛋白沖擊自體同源的DC，能夠在體外致敏CTLs對 抗HIV(Wilson et al.J Immunol., 1999,162:3070-78)。因此，在本發明的一個實施方案 中，首先從受試患者中分離DCs,然后通過與目標抗原源培養離體致敏，例如，可W是來自于 受試患者或外源的特定腫瘤相關抗原或其他疾病表面標記物。在用感染了本發明ADCC增強 系統的自體同源CTL和/或其他效應細胞，或包含編碼ADCC增強系統的DNA和RNA構建體的制 劑治療之前，將運些DCs最終輸注回患者。運提供了與疫苗一樣的增強治療的模型，在DCs幫 助下使用ADCC增強子。
[0068] 本發明還提供了包含一個或多個容器的試劑盒，容器填充了大量的編碼本發明 ADCC增強子的基因構建體和藥學上可接受的賦形劑。該試劑盒還可W包括使用說明書。進 一步地，與試劑盒一起的可W是一個W管理藥品或生物產品的生產、使用或銷售的政府機 構規定的形式的通知，其通知反映該機構批準生產、使用或銷售用于人類施用。 IV.實施例
[0069] (1)嵌合受體
[0070] 根據本發明的實施方案，嵌合的增強ADCC的受體的胞外域W兩種方式形成：
[0071] (a)結構域的融合:基于化丫 RKCD64)和化丫 RIIKCD 16)的胞外域和跨膜區之間 的預測的氨基酸邊界，將預測的人化丫 RI的胞外域與人Fc 丫 RIII的跨膜和細胞內區域融 合。圖10中分別顯示融合受體中所得區域的DNA和氨基酸序列，SEQ IDNOs: 1和2。明顯地，除 SEQ ID NO: 1之外的DNA序列同樣能翻譯成SEQ ID NO: 2蛋白，在運個和本申請全篇類似的 例子中，本發明也考慮那些DNA序列。
[0072] (b)基于外顯子的融合:基于化丫 RI和Fc 丫 RIII中的外顯子邊界，將預測的人Fey RI胞外域與人化丫 RIII的跨膜和細胞內區域融合。如圖3中顯示，兩個蛋白均有兩個編碼分 泌膚(別和S2)的外顯子，接著=個(CD64)或兩個(CD16)編碼細胞外區域的外顯子。具體地， CD64中的外顯子S1到EC3與CD16中的TM/C外顯子融合。圖11中分別顯示融合受體中所得區 域的DNA和氨基酸序列，SEQ ID N0s:3和4。
[0073] 為了制作嵌合受體，從化igene中獲得（同樣可W從多種其他的商業供應商得到） 人CD64和CD16的cDNA克隆。設計和合成側翼引物，用PCR擴增選擇的cDNA部分并重組結合到 一個載體中。引物包括限制性位點，其利于克隆W形成融合構建體，和亞克隆到不同的商業 化載體中。整個過程使用了標準的限制性酶切和連接步驟。
[0074] 現參見圖4,當人CD64的胞外域與人CD16的跨膜和細胞內結構域融合時，它們進一 步與各種人蛋白中發現的各種放大模塊融合，具體地，CD28(氨基酸162-202)、CD134(氨基 酸213-249)、CD137(氨基酸187-232)和CD3C(氨基酸31-142)(所有的氨基酸位置基于成熟 的蛋白序列）。序列中引入突變用星號標記如下：可商購的CD16CDNA有多態性，多態性被回 復。另外，將已知下調表面表達的CD28中的雙亮氨酸基序突變。每個模塊通過引入兩個間隔 子氨基酸的-GGATCT-序列分開。圖12中分別顯示融合受體中所得區域的DM和氨基酸序列， SEQ ID N0s:5和6。圖13(結構域的融合)和圖14(基于外顯子的融合）中分別顯示上述的具 有來自CD64、CD16和4個放大模塊的區域的整個融合/嵌合受體的DNA和氨基酸序列，SEQ ID NOs: 7到10。使用人CD16 "更高親和力"的突變體(VI58)作為對照。
[00對接著將嵌合受體克隆到可商購的具有替代標記(例如，圖5中顯示的pSMPUW-IRES- GFP)或不具有(例如，圖6中顯示的pSMPUW-puro)的慢病毒載體上。
[0076] 在pSMPUW-IRES-GFP(圖5)中，GFP的表達通過內部的核糖體進入位點與嵌合受體 連接。pSMPUW-puro載體中的嚷嶺霉素組件可W用于選擇穩定和成功的克隆。然而，為本發 明考慮的治療用途，如圖6中顯示被劃掉的，GFP和化ro組件將被移除W最小化載體的大小。 只有當使用基于外顯子的融合形成的嵌合受體時，受體的表達才與GFP的表達相關，因此， 該嵌合受體的形式成為本發明優選的和默認的實施方案。
[0077] (2)細胞表達
[0078] 在293T或E邱i293細胞中轉染慢病毒載體(pSMPUW)，通過流式細胞術檢測上述嵌 合受體的表達。轉染用類似于上述流程的標準流程進行。就pSMPUW-IRES-GFP來說，轉染2-3 天后首先通過GFP的表達確認轉染（圖7)。接著，通過用可商購的巧光素標簽的抗-CD16或 抗-CD64的抗體染色細胞和測定所得巧光（圖8)確認本發明的嵌合受體的表達。
[0079] 因為受體的表達通過IRES元件連接GFP的表達，所W受體的表達與GFP的表達相 關。通過收集和用有或無 5%胎牛血清(FBS)的憐酸鹽緩沖液(PBS)清洗106個細胞，典型地 實現抗體染色。細胞在合適量抗體的存在下在PBS-FBS中，于4°C培養30分鐘。細胞再次用 PBS清洗并通過流式細胞術分析。
[0080] 用結構域融合策略制作的CD64-CD16嵌合受體與基于外顯子融合制作的那些相比 顯示出弱得多的表達(未顯示數據）。
[0081] pSMPUW載體與可商購的輔助質粒共轉染W制作慢病毒顆粒。通過分析GFP和/或受 體的表達確認成功的轉染。
[00劇 (3)治療親和力
[0083] 為了檢測嵌合受體在結合人抗體方面的能力，細胞首先用如上可商購的利妥昔單 抗(RiUixan)抗體"染佐'。簡單地說，收集106個細胞，用PBS清洗，用O.lug/ml的利妥昔單抗 在4°C培養30分鐘。細胞再次用PBS清洗，用巧光素標簽的山羊抗人IgG(能夠結合利妥昔單 抗或任何其他人IgG的抗體)染色。
[0084] 在我們的檢測條件下，用基于外顯子融合策略制作的CD64-CD16嵌合受體與基準 的CD16的V158形式相比顯示出明顯更好的對利妥昔單抗的結合（圖9)。類似的實驗也可W 用其他治療性抗體進行。
[0085] 額外的功能性水平是結合抗體覆蓋的祀細胞的能力。為了檢測，首先用細胞追蹤 試劑，例如，CellTrace Far Red孤A0-沈，巧光素標記祀細胞，例如，Daudi(Burkitt淋己瘤 株)細胞。典型地通過收集5xl06個細胞，用PBS清洗它們，然后用合適量的試劑培養5分鐘來 進行。通過加入過量的PBS-FBS終止反應，然后用PBS清洗細胞兩次。然后標記的細胞如上所 述用利妥昔單抗覆蓋。利妥昔單抗結合化udi細胞上表達的細胞表面CD20分子。接著將利妥 昔單抗覆蓋的細胞與表達不同嵌合受體的細胞在37°C培養60分鐘，用流式細胞術測定W檢 測它們形成異源聚集體(GFP+，CellTrace+)的能力。當使用不含像GFP的替代標記物的慢病 毒載體時，表達嵌合受體的細胞也需要用兼容性染料染色，例如，CFSE。
[0086] 類似的實驗可W用其他的具有合適的祀向抗體的細胞系進行，例如，具有利妥昔 單抗的Ra j i或Ramos細胞、具有曲妥珠單抗的SK-BR-3 (乳腺癌)細胞等。
[0087] (4)免疫效應細胞
[0088] 在在293T細胞中制備慢病毒顆粒之后，它們可W用來檢測在T細胞中該受體的功 能性。例如，Jurkat (急性T細胞白血病)細胞是常用的原代T細胞的替代物。用在293T細胞中 上述的大致相同的方法顯示該受體的功能性。用標準的spinoculation方法感染化rkat細 胞。典型地，將lOOul中的2xl05個細胞平鋪于96孔板中。與聚凝胺(4ug/ml) -起加入合適量 的病毒上清液，在350xg下30°C離屯、2小時。感染2天或更多天后分析細胞。在含有pur〇K慢病 毒載體的情況下，可W用嚷嶺霉素選擇細胞來生成穩定細胞系。
[0089] 用抗-CD3/CD28激活后，可W用類似的方法感染天然原代T細胞。除了與化rkat或 293細胞類似的分析外，本發明的受體可W顯示出激活、增殖和引發細胞毒性的能力。典型 地，為了測定增殖，1〇6個轉導細胞在50IU/ml的IL-2存在下生長。在不同天數向培養液中W 1:1的比例加入覆蓋了利妥昔單抗的化udi細胞。同上，運些實驗也可W使用其他覆蓋了抗 體的細胞。理想地，祀細胞(例如，Daudi)用絲裂霉素C預處理W停滯增殖。用流式細胞術或 其他傳統方法(例如，胸巧滲入法、CFSE稀釋等)測定T細胞的增殖。
[0090] 已有描述，溶酶體相關膜蛋白-ULAMP-1或CD107a)是CD8+T細胞及NK細胞刺激后 裂解顆粒脫粒的標志物。在如上所述的共培養實驗中，可W用流式細胞術分析CD107a巧細 胞的水平測定脫粒。
[0091] 為了評估細胞毒性，在合適治療性抗體存在下，T細胞與Cell化ace標簽的祀細胞 共培養數小時。觀察到受體轉導依賴的、抗體依賴的活的祀細胞缺失。運可W通過流式細胞 儀用艦化丙晚或7-AAD測定。
[009。(5)體內抗腫瘤活性
[0093] 使用化ckson實驗室的NSG小鼠通過標準移植瘤模型來顯示抗腫瘤活性（參見， amltz et al.化t Rev Immunol.2007Feb;7(2):118-30)。NSG小鼠缺少功能T、B或NK細胞， 是嚴重免疫功能不全的，對移殖原代人細胞是理想的。也可W使用其他類似的小鼠品系，例 如，NOG小鼠。
[0094] 例如，腹腔注射表達巧光素酶的祀腫瘤細胞Q.P.0.3X106細胞/小鼠）。幾天后，用 利妥昔單抗（150ug)和轉導受體的T細胞（107個細胞)連同1000-2000IU的IL-2-起i.p.處 理小鼠。作為對照，在小鼠的亞集中排除利妥昔單抗、受體或T細胞之一。用Xenogen IVIS系 統測定腫瘤的移植和生長。
[0095] 可選的腫瘤模型包括S . C.注射107個化udi細胞、i . V給予治療。用卡尺直接測定或 通過存活來判斷腫瘤的生長。
[0096] 類似的實驗可W用其他的細胞系抗體組合進行，包括i .p.、s.c.或i.v.注射Ra j i 細胞。在后者中，通過存活來測定腫瘤的生長。
[0097] 為了治療的目的，可W移除嚷嶺霉素或GFP標志物W最小化不相關基因的表達。
[0098] 另一可選的例子是直接電穿孔或轉染mRNA。運將比慢病毒更加安全。
[0099] 對本領域技術人員顯而易見的是，在不背離本發明的范圍或精神的條件下，在本 發明中可W做出多種修改和改變。通過對本文公開發明的說明書和實踐的考慮，本發明的 其他實施方案將對本領域的技術人員而言是顯而易見的。說明書和實施例應該被認為僅是 示例性的，而本發明的真實范圍和精神由權利要求說明。
[0100]在整個申請中，參考多種出版物、專利和/或專利申請W更全面地描述本發明所屬 的領域的現狀。運些出版物、專利和/或專利申請公開的全部內容在此并入作為參考，在同 樣程度上，正如每一個獨立的出版物、專利和/或專利申請是特定地和單獨地說明并入作為 參考。
【主權項】
1. 一種基因構建體，其編碼跨膜嵌合受體，所述跨膜嵌合受體包含與人CD16相比對抗 體的Fc具有更高結合親和力的胞外域、跨膜結構域和調節ADCC激活和擴大的胞內域。2. 權利要求1所述的基因構建體，其包含DNA分子。3. 權利要求1所述的基因構建體，其包含RNA分子。4. 權利要求1所述的基因構建體，其大體上地包含⑶64的EC3外顯子。5. 權利要求4所述的基因構建體，其進一步大體上地包含⑶64的EC1和EC2外顯子。6. 權利要求1所述的基因構建體，其中所述胞外域的選擇基于CD64中的外顯子或結構 域的邊界。7. 權利要求1所述的基因構建體，其包含RNA，所述RNA翻譯成大體上包含CD64的胞外域 的胞外域。8. 權利要求1所述的基因構建體，其中所述胞外域與人CD16的V158變體相比對Fc具有 更高的親和力。9. 權利要求1所述的基因構建體，其中所述胞外域與人CD16的F158變體相比對Fc具有 更高的親和力。10. 權利要求1所述的基因構建體，其中胞內域選自CD3G、CD28、CD134、CD137、CD27、 ⑶79a、⑶79b、⑶40和GM-CSF受體的部分或全部的細胞內結構域。11. 權利要求1所述的基因構建體，其包含DNA序列，所述DNA序列選自SEQ ID NOs:l、3、 5、7和9〇12. -種跨膜嵌合受體，其包含與人CD16相比對抗體的Fc具有更高親和力的胞外域、跨 膜結構域和調節ADCC激活和擴大的胞內域。13. 權利要求12所述的跨膜嵌合受體，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列選自SEQ ID NOs:2、4、6、8和10。14. 權利要求12所述的跨膜嵌合受體，其中所述胞外域與人CD16的V158變體相比對Fc 具有更高的結合親和力。15. 權利要求12所述的跨膜嵌合受體，其中所述胞外域大體上地包含CD64的胞外域中 的免疫球蛋白樣折疊，所述免疫球蛋白樣折疊在CD16中沒有。16. 權利要求12所述的跨膜嵌合受體，其中所述胞外域大體上地包含CD64的胞外域。17. 權利要求12所述的跨膜嵌合受體，其中所述跨膜結構域大體上地包含CD16的跨膜 結構域。18. 權利要求12所述的跨膜嵌合受體，其進一步包含ADCC擴大模塊，所述擴大模塊增強 宿主免疫效應細胞的存活和增殖。19. 權利要求12所述的跨膜嵌合受體，其中所述擴大模塊選自CD3G、CD28、CD134、 CD137、CD27、CD79a、CD79b、CD40和GM-CSF受體的部分或全部的細胞內結構域。20. -種免疫效應細胞，其離體被權利要求1-11所述的基因構建體或權利要求12-19所 述的蛋白感染或轉染。21. 權利要求20所述的免疫效應細胞，其包含細胞毒性T淋巴細胞。22. 權利要求20所述的免疫效應細胞，其包含自然殺傷細胞。23. 權利要求20所述的免疫效應細胞，其選自嗜酸性粒細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、嗜 堿性粒細胞、單核細胞、B細胞和表達或改造后表達細胞毒性因子的其他細胞。24. -種藥物組合物，其包含權利要求1-11所述的基因構建體或權利要求12-19所述的 受體，和藥學上可接受的賦形劑。25. -種藥物組合物，其包含權利要求20-23所述的免疫效應細胞，和藥學上可接受的 賦形劑。
【文檔編號】C12N15/62GK106062183SQ201580003875
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2015年1月8日
【發明人】C·J·李, S·烏尼拉曼
【申請人】北京強新生物科技有限公司