用于制備睫狀緣干細胞的方法

用于制備睫狀緣干細胞的方法
【專利摘要】本發明提供一種用于制備由多能干細胞誘導分化的睫狀緣區干細胞的方法，所述方法包括下述步驟(1)或步驟(2)或兩者：(1)懸浮培養從由多能干細胞誘導分化的含有睫狀緣區樣結構的細胞團聚體獲得的細胞而獲得視網膜球體的步驟；和(2)從獲得自由多能干細胞誘導分化的含有睫狀緣區樣結構的細胞團聚體的細胞收集階段特異性胚胎抗原1陽性細胞的步驟。根據本發明，能夠以高的純度有效地制備具有分化成包括視網膜層特異性神經元的視網膜細胞的潛力和自我復制能力的睫狀緣區干細胞。
【專利說明】
用于制備睫狀緣干細胞的方法
技術領域
[0001] 本發明設及一種用于制備睫狀緣區干細胞的方法等。
【背景技術】
[0002] 預期具有分化成視網膜細胞的潛能和自我復制能力的組織干細胞適用于細胞移 植治療、藥物發現篩選等。
[0003] 已知體內視網膜的睫狀緣區（cilia巧marginal zone,CMZ)對于視網膜組織的結 構形成和維持執行重要功能（參見，例如，非專利文獻1)。具有分化成視網膜細胞如光感受 器細胞的潛能的視網膜組織的干細胞(視網膜干細胞)存在于睫狀緣區中（參見，例如，非專 利文獻2)。已知RdhlO基因（非專利文獻3)和化XI基因（非專利文獻1)作為睫狀緣區的基因 標志物。
[0004] 當將可W通過懸浮培養多能干細胞形成的包含視網膜組織的細胞團聚體在特定 條件下進一步培養時，獲得包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體(參見，例如，專利文獻1)。在 所述"包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體"中，所述睫狀緣區樣結構的功能是作為進展區 (progress zone)，并且此處可W高頻率形成具有與所述睫狀緣區樣結構鄰近的層結構的 連續的神經視網膜。所述"進展區"是位于一部分組織中的未分化的細胞群體，并且是在發 育和再生過程中具有連續增殖特性而有助于組織整體生長和/或通過分泌生長因子等而有 助于周圍組織生長的特性的細胞群體。
[000引[文獻列表]
[0006] [專利文獻]
[0007] 專利文獻 1:W0 2013/183774 A1 [000引[非專利文獻]
[0009] 非專利文獻 1 DEVELOPMENTAL DYNAMICS,239卷，第2066-2077頁(2010)
[0010] 非專利文獻 2 :Proc. Natl. Acad. Sci.USA，101 卷，第 15772-15777 頁（2004)
[0011] 非專利文獻 3: Development，136卷，第 1823-1833 頁（2009)
[0012] 發明概述
[001引發明要解決的問題
[0014]需要開發一種W高純度有效地制備具有分化成視網膜細胞的潛能和自我復制能 力的組織干細胞的方法。
[001引[解決問題的方式]
[0016] 本發明提供一種制備具有分化成視網膜細胞(諸如光感受器細胞）的潛能和自我 復制能力的細胞的方法，所述細胞存在于由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的 細胞團聚體中下有時稱為睫狀緣區干細胞或CMZ干細胞），等等。
[0017] [1]用于制備由多能干細胞誘導分化的睫狀緣區干細胞的方法，其包括下述步驟 (1)或步驟(2)或兩者下有時稱為本發明的干細胞制備方法1):
[0018] (1)懸浮培養獲得自由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體 的細胞由此獲得視網膜球體(retinos地ere)的步驟;和
[0019] (2)從獲得自由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體的細胞 收集階段特異性胚胎抗原1 (W下有時稱為SSEA-1)陽性細胞的步驟；
[0020] [2]根據上述[1]所述的方法，其中進行步驟（1)，并且其中"獲得自由多能干細胞 誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體的細胞"是通過下述方式獲得的細胞：
[0021] 分散由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體，或
[0022] 分散分離自所述細胞團聚體的睫狀緣區樣結構下有時稱為本發明的干細胞制 備方法2);
[0023] [3]根據上述[1]所述的方法，其中進行步驟(2)，并且其中"獲得自由多能干細胞 誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體的細胞"是通過下述方式獲得的細胞：
[0024] 分散由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體，或
[0025] 分散分離自所述細胞團聚體的睫狀緣區樣結構下有時稱為本發明的干細胞制 備方法3);
[0026] [4]根據上述[1]所述的方法，其中進行步驟（1)，接著進行步驟(2)，并且其中步驟 (1) 中"獲得自由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體的細胞"是通過 下述方式獲得的細胞：
[0027] 分散由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體，或
[0028] 分散分離自前述細胞團聚體的睫狀緣區樣結構;并且
[0029] 步驟(2)中"獲得自由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體 的細胞"是通過分散步驟(1)中獲得的視網膜球體獲得的細胞（W下有時稱為本發明的干細 胞制備方法4);
[0030] [5]根據上述[1]所述的方法，其中進行步驟(2)，接著進行步驟(1)，并且其中步驟 (2) 中"獲得自由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體的細胞"是通過 下述方式獲得的細胞：
[0031] 分散由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體，或
[0032] 分散分離自所述細胞團聚體的睫狀緣區樣結構;并且
[0033] 步驟（1)中"獲得自由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體 的細胞"是通過分散步驟(2)中收集的細胞獲得的細胞下有時稱為本發明的干細胞制備 方法5);
[0034] [6]根據前述[1]、[3]、[4]和[5]中任一項所述的方法，其中所述SSEA-1陽性細胞 還是Rax陽性的；
[0035] [7 ]根據前述[1 ]、[3]、[4]、[5]和[6]中任一項所述的方法，其中所述SSEA-1陽性 細胞是無色素沉著的；
[0036] [引根據前述[1]、[2]、[4]和[引中任一項所述的方法，其中步驟(1)中的懸浮培養 在無血清培養基或含血清培養基中進行，所述無血清培養基或含血清培養基各自含有一種 或多種選自由下述組成的組的物質:作用于FGF信號轉導途徑的物質和作用于EGF信號轉導 途徑的物質；
[0037] [9]根據上述[引所述的方法，其中所述無血清培養基或含血清培養基進一步包含 ROCK抑制劑；
[0038] [10]根據上述[1]、[2]、[4]、[5]、[引和[9]中任一項所述的方法，其中所述視網膜 球體是無色素沉著的；
[0039] [11]根據上述[1]-[10]中任一項所述的方法，其中所述多能干細胞是靈長類動物 多能干細胞；
[0040] [12]根據上述[1]-[11]中任一項所述的方法，其中所述多能干細胞是人多能干細 胞；
[0041] [13]用于制備視網膜層特異性神經元的方法，所述方法包括下述步驟:在存在一 種或多種選自由Notch信號抑制物質、類視黃醇和牛橫酸組成的組的物質的情況下，培養通 過上述[1]-[12]中任一項的方法獲得的睫狀緣區干細胞；
[0042] [14]用于由視網膜組織障礙導致的疾病的治療劑，所述治療劑包含通過上述[1]- [13]中任一項的方法制備的睫狀緣區干細胞或視網膜層特異性神經元；
[0043] [15]治療由視網膜組織障礙導致的疾病的方法，所述方法包括將有效量的通過上 述[1]-[ 13]中任一項的方法制備的睫狀緣區干細胞或視網膜層特異性神經元移植到需要 所述移植的受試者中；
[0044] [16]通過上述[1]-[13]中任一項的方法制備的睫狀緣區干細胞或視網膜層特異 性神經元，其用于治療由視網膜組織障礙導致的疾病；
[0045] [17]用于評價毒性或藥效的試劑，所述試劑包含通過上述[1]-[13]中任一項的方 法制備的睫狀緣區干細胞或視網膜層特異性神經元；
[0046] [1引評價測試物質的毒性或藥效的方法，所述方法包括使通過上述[1]-[13]中任 一項的方法制備的睫狀緣區干細胞或視網膜層特異性神經元與所述物質接觸，并且測定所 述物質對所述細胞的影響;等等。
[0047] [發明效果]
[004引根據本發明，可W高純度有效地制備具有分化成包括視網膜層特異性神經元在內 的視網膜細胞的潛能和自我復制能力的睫狀緣區干細胞。
[0049] [附圖簡述]
[0050] 圖1顯示包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體（自懸浮培養開始起的第35天)的相差 圖像(A)和GFP巧光圖像(BKRax)。
[0051] 圖2顯示包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體（自懸浮培養開始起的第60天)的相差 圖像(A)和GFP巧光圖像(BKRax)。
[0052] 圖3顯示包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體（自懸浮培養開始起的第63天)的冷凍 切片的染色圖像。"A"是化xlO陽性細胞的免疫染色圖像，"B"是化XI陽性細胞的免疫染色圖 像，"C"是R化10陽性細胞的免疫染色圖像，"護是Crx陽性細胞的免疫染色圖像，"護是l\ijl 陽性細胞的免疫染色圖像，并且甲'是SSEA-1陽性細胞的免疫染色圖像。
[0053] 圖4顯示通過分散分離自包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體（自懸浮培養開始起 的第90天）的神經視網膜區或睫狀緣區樣結構獲得的細胞的巧光顯微鏡圖像。"A" (Rax)是 神經視網膜區(NR)的GFP巧光圖像，"B"(SSEA1)是使用抗-SSEA-1抗體的神經視網膜區(NR) 的免疫巧光染色圖像，"C"(Rax)是睫狀緣區樣結構(CMZ)的GFP巧光圖像，并且"護（SSEA1) 是使用抗-SSEA-1抗體的睫狀緣區樣結構(CMZ)的免疫巧光染色圖像。
[0054] 圖5顯示通過分散分離自包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體（自懸浮培養開始起 的第90天）的視網膜色素上皮和睫狀緣區樣結構獲得的細胞的巧光顯微鏡圖像。"A" (SSEA1)是使用抗-SSEA-1抗體的免疫巧光染色圖像，"B"(Rax)是GFP巧光圖像，并且"C"(亮 視野)是亮視野圖像。
[0055] 圖6顯示通過分散包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體（自懸浮培養開始起的第63 天)并且對獲得的細胞進行懸浮培養形成的視網膜球體的巧光顯微鏡圖像。"A"和"C" (Rax) 是GFP巧光圖像，"B"(化xlO)是使用抗-化xlO抗體的免疫巧光染色圖像，并且"護（SSEA1)是 使用抗-SSEA-1抗體的免疫巧光染色圖像。
[0056] 圖7顯示通過分散分離自細胞團聚體（自懸浮培養開始起的第70天)的神經視網膜 區(NR)或睫狀緣區樣結構(CMZ)并且對獲得的細胞進行懸浮培養形成的視網膜球體的分析 結果。"A"和"B"是由睫狀緣區樣結構（CMZ)形成的視網膜球體的巧光顯微鏡圖像，"A"(BF) 是亮視野圖像，并且"B" (Rax)是GFP巧光圖像。"C"顯示原代視網膜球體的形成數目，并且 吧'顯示次生性視網膜球體的形成數目。"護顯示原代視網膜球體的直徑分布，并且甲'顯示 次生性視網膜球體的直徑分布。
[0057] 圖8"A"顯示通過分散分離自細胞團聚體（自懸浮培養開始起的第60天）的睫狀緣 區樣結構、用巧光標記的SSEA-1抗體免疫染色得到的細胞懸浮液并且用細胞分選儀進行 FACS分析獲得的結果。圖8 "B"顯示分離自上述細胞懸浮液的Rax陽性和SSEA-1陽性細胞級 分(分離自XQ2中所示的細胞的級分1)的FACS分析結果，并且圖8"C"顯示分離自上述細胞 懸浮液的Rax陽性和SSEA-1陰性細胞級分(分離自"A"Q4中所示的細胞的級分2)的FACS分析 結果。
[0058] 圖9顯示通過分散分離自細胞團聚體（自懸浮培養開始起的第60天)的睫狀緣區樣 結構、從得到的細胞懸浮液分離Rax陽性和SSEA-1陽性細胞級分(SSEA1+)、Rax陽性和SSEA- 1陰性細胞級分(SSEA1-)并且對分離的細胞級分進行懸浮培養而形成的視網膜球體的分析 結果。"A"和"B"是由Rax陽性和SSEA1陽性細胞級分(SSEA1+)形成的視網膜球體的巧光顯微 鏡圖像，X (BF)是亮視野圖像，"B" (Rax)是GFP巧光圖像。"C"顯示視網膜球體的形成數目。 "護顯示形成的視網膜球體的直徑分布。
[0059] 圖10顯示通過由通過分散分離自包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體（自懸浮培養 開始起的第90天)并且對得到的細胞進行懸浮培養形成的視網膜球體分化而獲得的細胞的 巧光顯微鏡圖像。"A"和"B"是由原代視網膜球體分化的細胞的圖像，"C"和"護是由次生性 視網膜球體分化的細胞的圖像。"A"和"C" (Rax)是GFP巧光圖像，并且"B"和"護（Crx)是使用 抗-化X抗體的免疫巧光染色圖像。
[0060] 圖11顯示通過由通過分散分離自包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體（自懸浮培養 開始起的第60天）的睫狀緣區樣結構、并且對得到的細胞進行懸浮培養形成的次生性視網 膜球體分化而獲得的細胞的巧光顯微鏡圖像。"A"(巧視網膜蛋白（化Iretinin))是使用抗- 巧視網膜蛋白抗體的免疫巧光染色圖像，"B"(Rax)是GFP巧光圖像，"C"(Pax6)是使用抗- 化x6抗體的免疫巧光染色圖像，并且"護（化J1)是使用抗-Tujl抗體的免疫巧光染色圖像。
[0061] 圖12顯示通過由通過分散自分離自包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體（自懸浮培 養開始起的第54天)的睫狀緣區樣結構分離的Rax陽性和SSEA1陽性細胞并且對得到的細胞 進行懸浮培養而形成的視網膜球體分化而得到的細胞的巧光顯微鏡圖像。"A" (&X)是使用 抗-Crx抗體的免疫巧光染色圖像，"B"和"F"(Rax)是GFP巧光圖像，"C"(Pax6)是使用抗- 化x6抗體的免疫巧光染色圖像，"護（Tujl)是使用抗-Tujl抗體的免疫巧光染色圖像，并且 "E"(巧視網膜蛋白）是使用抗-巧視網膜蛋白抗體的免疫巧光染色圖像。
[0062] 圖13顯示通過分散分離自細胞團聚體（自懸浮培養開始起的第79天）的睫狀緣區 樣結構、從得到的細胞懸浮液分離SSEA-1陽性細胞級分和SSEA-1陰性細胞級分并且對分離 前的細胞懸浮液、分離的SSEA-1陽性細胞級分和分離的SSEA-1陰性細胞級分中的每一個進 行懸浮生長培養而形成的視網膜球體的分析結果。"A"和"B"是由SSEA-1陽性細胞級分形成 的視網膜球體的巧光顯微鏡圖像，"A" (BF)是亮視野圖像，"B" (Rax)是GFP巧光圖像。"C"是 視網膜球體的形成數目。"未分選的"是由分離之前的細胞懸浮液形成的視網膜球體的數 目/'SSEAr'是由SSEA-1陽性細胞級分形成的視網膜球體的數目，并且"SSEAr"是由SSEA-1 陰性細胞級分形成的視網膜球體的數目。
[0063] [實施方案描述]
[0064] W下詳細說明用于進行本發明的方式。
[0065] 在本發明中，"干細胞"的實例包括具有分化成多種分化品系的能力（多能性)和在 維持多潛能性的同時W不變的方式生長的能力（自我復制能力）的細胞，所述細胞在組織受 損失時能夠再生。在本文中，"干細胞"可W是胚胎干細胞巧S細胞)或組織干細胞(也稱為組 織的干細胞、組織特異性干細胞或體干細胞），或人工多能干細胞（iPS細胞:誘導的多能干 細胞），但不限于此。如由來源于干細胞的組織細胞可W再生組織的事實理解的，已知干細 胞可W分化為與活體內的細胞接近的正常細胞。
[0066] 在本發明中，"組織干細胞"是，例如，存在于組織中的具有分化成多種組成組織的 分化品系的能力（多能性)和自我復制能力的細胞。已知"組織干細胞"具有在發育過程中、 細胞死亡和損傷組織再生過程中供應新細胞的作用。
[0067] 本發明中的"多能干細胞"的實例包括可W在體外培養并且具有分化為構成活體 的任意細胞(來源于S胚層(外胚層、中胚層、內胚層)的組織）的能力（多能性)的干細胞，包 括胚胎干細胞化S細胞）。"多能干細胞"獲自受精卵、克隆胚胎、生殖干細胞和組織干細胞。 其還包括在將多種類型的基因引入體細胞后具有誘導的與胚胎干細胞類似的多能性的細 胞(也稱為人工多能干細胞）。多能干細胞可W通過本身已知的方法產生。多能干細胞的制 備方法的實例包括Cell 131(5)第861-872頁（2007)，Cell 126(4)第663-676頁(2006)等中 描述的方法。
[0068] 本發明中"胚胎干細胞化S細胞r的實例包括具有自我復制能力和多潛能性(特別 是，"多能性"）的干細胞，其是來自早期胚胎的多能干細胞。胚胎干細胞最早化981年建立， 并且自從1989年起也已經被用于制備基因敲除小鼠。在1998年，建立了人胚胎干細胞，其也 被用于再生醫學。
[0069] 本發明中的"人工多能干細胞"的實例包括通過直接重編程分化的細胞(如成纖維 細胞等）通過表達多種基因如0ct3/4、Sox2、Klf4和Myc而誘導成具有多能性的細胞，其由 Yamanaka的小組在2006在小鼠細胞中建立（Takahashi K和化manaka S. Ce 11.2006，126 (4)，第663-676頁）。在2007年，人工多能干細胞還在人成纖維細胞中建立，并且具有與胚胎 干細胞類似的多潛能性(Cell ,131(5)，第861-872頁(2007) ;Science ,318(5858)，第 1917- 1920頁（2007);Nat Biotechnol.，26(1)，第101-106頁（2008))。
[0070] 多能干細胞可從指定組織獲得，或可W購買可商購的產品。例如，人胚胎干細胞， 趾ES-l、KhES-2和趾ES-3,可從京都大學的前沿醫學科學研究所（InstiUite for Frontier Medical Sciences)獲得。分別地，EB5細胞（其是小鼠胚胎干細胞）可從Inco;rporated A血inistrative Agency RIKEN獲得，并且D3細胞系可從ATCC獲得。
[0071] 多能干細胞可W通過根據本身已知的方法培養來維持。例如，人干細胞可W通過 使用Knockout?血清代替物化SR)培養來維持。例如，小鼠干細胞可W通過在添加胎牛血清 (FBS)和白血病抑制因子化I巧而沒有飼養細胞的情況下培養來維持。
[0072] 遺傳改造的多能干細胞可W通過使用，例如，同源重組技術產生。染色體上要被修 飾的基因的實例包括細胞標志物基因、組織相容性抗原基因、與由神經系統細胞障礙引起 的疾病相關的基因等。染色體上的祀基因可W用下述中所述的方法進行修飾： Manipulating the Mouse Embryo,A Laboratory Manual，第二片反，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994)；Gene Targeting,A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press(1993)；Biomanual Series 8,Gene Targeting,Making of Mu1:ant Mouse using ES cell,YODOSHA CO.，LTD. (1995)等。
[0073] 具體地，例如，分離要被修飾的祀基因的基因組基因（例如，細胞標志物基因，組織 相容性抗原基因，疾病相關的基因等），并且使用分離的基因組基因產生用于祀基因的同源 重組的祀向載體。將產生的祀向載體引入到干細胞中，并且選擇顯示出祀基因與祀向載體 之間的同源重組的細胞，由此可W產生在染色體上具有修飾的基因的干細胞。
[0074] 用于分離祀基因的基因組基因的方法的實例包括Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二片反，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989),Current Protocols in Molecular Biology John Wiley&Sons( 1987-1997)等中所述的已知方法。 也可W使用基因DNA文庫篩選系統（由Genome Systems供應）、Universal GenomeWalkeH式 劑盒（由CLONTECH供應)等分離祀基因的基因組基因。
[0075] 用于祀基因同源重組的祀向載體的制備和同源重組體的有效選擇可W按照Gene Targeting,A Practical Approach，IRL Press at Oxford University Press(1993)； Biomanual Series 8,Gene Targeting,Making of Mutant Mouse using ES cell， YODOSHA CO.，LTD. (1995)等中所述的方法進行。作為祀向載體，可W使用替代型或插入型 中的任一種。作為選擇方法，可W使用諸如陽性選擇、啟動子選擇、陰性選擇、聚腺巧酸 (po lyA)選擇等的方法。
[0076] 從選擇的細胞系選擇目標同源重組體的方法的實例包括用于基因組DM的 Southern雜交法、PCR法等。
[0077] 本發明中的"團聚體"的實例包括分散在培養基中但聚集而形成的細胞團塊。本發 明中的"團聚體"包括由在懸浮培養開始時分散的細胞形成的團聚體和在懸浮培養開始時 已經形成的團聚體。
[0078] "形成團聚體"意指聚集細胞形成細胞團聚體。當要形成干細胞團聚體時，分散的 干細胞可W自然地聚集。干細胞質量均勻的團聚體可W通過快速聚集給定數量的分散的干 細胞而形成。例如，當多能干細胞快速聚集W允許形成多能干細胞的團聚體時，可W在來自 形成的團聚體的被誘導分化的細胞中W良好的再現性形成上皮樣結構。
[0079] 形成團聚體的實驗操作的實例包括設及將細胞接種在具有大孔的懸浮培養皿中 并且等待非人工的聚集的方法，設及通過使用具有小孔的板(96孔板）、微孔等將細胞保持 在小的空間中的方法，設及通過使用小的離屯、管短時離屯、聚集細胞的方法等。
[0080]可W基于細胞團聚體的尺寸和細胞數目、宏觀形態、通過組織染色分析的微觀形 態及其均一性、分化和未分化標志物的表達及其均一性、分化標志物的表達的控制和它們 的同步性、團聚體之間的分化效率的再現性等確定多能干細胞團聚體的形成和在形成團聚 體的每個細胞中的上皮樣結構的形成。
[0081 ]本發明中的"組織"的實例包括細胞群體的結構，其具有運樣的構型，其中形狀和 性質不同的多于一種類型的細胞W給定樣式在空間上配置。
[0082] 在本發明中，"視網膜組織"的實例包括視網膜組織等，其中在體內視網膜中構成 相應視網膜層的至少兩種或更多種類型的細胞如光感受器細胞、視桿細胞、視錐細胞(corn cell)、水平細胞、雙極細胞、無長突細胞、視網膜神經節細胞(或神經節細胞）、其先祖細胞、 視網膜先祖細胞等在空間上層狀排列。關于各種細胞，哪種細胞構成哪個視網膜層可W通 過已知方法，例如，是否存在分化標志物和不分化標志物的表達或其水平等來檢驗。
[0083] 作為本發明中的"視網膜組織"，也可W提及含有視網膜先祖細胞或神經視網膜先 祖的上皮組織，其可W通過在適于分化為視網膜的條件下懸浮培養團聚體而在多能干細胞 的細胞團聚體的表面上形成。
[0084] 本發明中的"視網膜層"意為構成視網膜的各個層。其具體實例包括視網膜色素上 皮層、光感受器層、外界膜、外核層、外網織層、內核層、內網織層、神經節細胞層、神經纖維 層和內界膜。
[0085] 本發明中的"視網膜層特異性神經元'包括，例如，構成視網膜層的細胞，其是所述 視網膜層特有的神經細胞。視網膜層特異性神經元的具體實例包括光感受器細胞、視桿細 胞、視錐細胞、水平細胞、雙極細胞、無長突細胞、視網膜神經節細胞(或神經節細胞)和色素 上皮細胞。
[0086] 本發明中的"視網膜干細胞"的實例包括具有分化成光感受器細胞、視桿細胞、視 錐細胞、水平細胞、雙極細胞、無長突細胞、視網膜神經節細胞(或神經節細胞)和色素上皮 細胞中的任意成熟的視網膜細胞的能力和自我復制能力的細胞。
[0087] 作為本發明中的"視網膜先祖細胞"，可W提及能夠分化為任何構成神經視網膜和 視網膜色素上皮的成熟視網膜細胞的先祖細胞。
[0088] 作為"神經視網膜先祖"，可W提及先祖細胞，其是注定形成視杯的內層并且能夠 分化為構成神經視網膜的任何成熟細胞的細胞。
[0089] 視網膜細胞標志物的實例包括在視網膜先祖細胞中表達的Rax和PAX6,在神經視 網膜先祖細胞中表達的化xlO,在下丘腦神經元的先祖細胞中表達但在視網膜先祖細胞中 不表達的Nkx2.1，在下丘腦神經上皮中表達但在視網膜中不表達的Soxl，在光感受器細胞 的先祖細胞中表達的Crx等。視網膜層特異性神經元的標志物的實例包括在雙極細胞中表 達的化xlO和L7,在神經節細胞中表達的TUJI和化n3,在無長突細胞中表達的巧視網膜蛋白 (化Iretinin)，在水平細胞中表達的巧結合蛋白（Ca化indin)，在光感受器細胞中表達的視 紫紅質和恢復蛋白（Recoverin)，在色素上皮細胞中表達的RPE65和Mitf，在視桿細胞中表 達的化1，在視錐細胞中表達的Rxr-丫等。
[0090] 本發明中的"睫狀緣區（CMZr的實例包括體內視網膜中的視網膜組織(具體是，神 經視網膜)和視網膜色素上皮的邊界區域中存在的組織，其是包括視網膜的組織干細胞(視 網膜干細胞）的區域。睫狀緣區也被稱為睫狀緣或視網膜緣，并且睫狀緣區、睫狀緣和視網 膜緣是等價的組織。已知睫狀緣區在將視網膜先祖細胞和分化的細胞提供給視網膜組織、 維持視網膜組織結構等方面發揮重要作用。睫狀緣區的標志物基因的實例包括RdhlO基因 (陽性）、化XI基因（陽性)等。
[0091] 用于本發明的"培養基"可W由作為基礎培養基的用于培養動物細胞的培養基制 備。基礎培養基的實例包括可W用于培養動物細胞的培養基，如BME培養基、BG化培養基、 CM化1066培養基、Glasgow MEM培養基、改良的MEM Zinc Option培養基、IMDM培養基、 Mediuml 99培養基、Eagl e MEM培養基、aMEM培養基、DMEM培養基、ham培養基、F-12培養基、 DMEM/F-12培養基、RPMI1640培養基、Fischer's培養基和它們的混合培養基等。
[0092] 本發明中的"無血清培養基"的實例包括不含未調節或未純化的血清的培養基。在 本發明中，含有純化的血液來源的成分和動物組織來源的成分(例如，生長因子）的培養基 也包括在無血清培養基內，除非其中含有未調節的或未純化的血清。
[0093] 無血清培養基可W含有血清代替物。血清代替物的實例包括清蛋白、轉鐵蛋白、月旨 肪酸、膠原前體、微量元素、2-琉基乙醇或3'琉基甘油、適當含有運些的等效物等的血清代 替物等。運樣的血清代替物可W通過例如，W098/30679等中描述的方法制備。此外，血清代 替物可W是可商購的產品。此種可商購的血清代替物的實例包括Knockout?血清代替物 (In vitrogen:下文中有時也表示為KSR)，化學成分確定的脂質濃縮物（Chemically Defined Lipid Concentrate,由Gibco制備）和Glutamax(由Gibco制備）。
[0094] 用于懸浮培養的"無血清培養基"可W含有脂肪酸、脂質、氨基酸(例如，非必需氨 基酸）、維生素、生長因子、細胞因子、抗氧化劑、2-琉基乙醇、丙酬酸、緩沖劑、無機鹽等。
[00對為了避免復雜的制備，補充W適量(例如，約1-約20%)的可商購的KSR的無血清培 養基(GMEM或DMEM培養基，補充有0.1 mM 2-琉基乙醇，0.1 mM非必需氨基酸混合物和ImM丙酬 酸鋼;或補充W450iiM 1--硫代甘油等的F-12培養基和IMDM培養基的1:1混合物)可W優選 作為無血清培養基被提及。
[0096] 本發明中的"含血清培養基"的實例包括含有未調節或未純化的血清的培養基。所 述培養基可W含有脂肪酸、脂質、氨基酸(例如，非必需氨基酸）、維生素、生長因子、細胞因 子、抗氧化劑、2-琉基乙醇、丙酬酸、緩沖劑、無機鹽等。
[0097] 本發明中添加于培養基中的"血清"的實例包括哺乳動物血清，如牛血清、小牛血 清、胎牛血清、馬血清、小馬血清、胎馬血清、兔血清、小兔血清、胎兔血清和人血清等。
[0098] 在本發明中，"含有物質X的培養基"是補充有外源物質X的培養基或含有外源物質 X的培養基，并且"不含物質X的培養基"是未補充外源物質X的培養基或不含外源物質X的培 養基。如本文中使用的，"外源物質r意為相對于在培養基中培養的細胞或組織來說為外源 的物質X，并且不包括細胞或組織產生的內源物質X。
[0099] 例如，"含有作用于FGF信號轉導途徑的物質的培養基"是補充有作用于FGF信號轉 導途徑的外源物質的培養基或包含作用于FGF信號轉導途徑的外源物質的培養基。"不含抑 制FGF信號途徑的物質的培養基"是未補充抑制FGF信號途徑的外源物質的培養基或不含抑 制FGF信號途徑的外源物質的培養基。
[0100] 本發明中"懸浮培養"的實例包括在對細胞培養容器等非粘附條件下在培養基中 培養細胞團聚體。
[0101] 用于懸浮培養的細胞培養容器不特別限制，只要其使得能夠懸浮培養細胞即可。 運樣的細胞培養容器的實例包括燒瓶、組織培養燒瓶、盤、培養皿、組織培養盤、多皿 (multidish)、微板、微孔板、微孔（micropore)、多板（multiplate)、多孔板、室載玻片 (chamber slide)、碗(schale)、試管、淺盤、培養袋、轉瓶等。優選的容器是細胞非粘附性容 器。
[0102] 作為細胞非粘附性容器，可W使用表面未人工處理成提高細胞粘附性(例如，利用 細胞外基質的包被處理等）的容器等。作為細胞非粘附性容器，可W使用表面被人工處理成 降低對細胞的粘附性(例如，超疏水處理)的容器等。
[0103] 本發明的干細胞制備方法1是用于產生由多能干細胞誘導分化的睫狀緣區干細胞 的方法，所述方法包括下述步驟(1)或步驟(2)或兩者：
[0104] (1)懸浮培養獲得自由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體 的細胞由此獲得視網膜球體的步驟;和
[0105] (2)從獲得自由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體的細胞 收集SSEA-1陽性細胞的步驟。
[0106] 本發明中的"由多能干細胞誘導分化的睫狀緣區干細胞"存在于由多能干細胞誘 導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體中，并且具有分化成視網膜細胞(如光感受器 細胞）的潛能和自我復制能力。上述睫狀緣區干細胞是SSEA-1陽性的，Rax基因陽性的， Chx 10基因陽性的，R化10基因陽性的，Otx 1基因陽性的，Crx基因陰性的，和的-微管蛋白 (Tujl)基因陰性的。睫狀緣區干細胞是非色素沉積細胞。睫狀緣區中的此類干細胞可用作 用于評價化學物質的毒性或藥效等的試劑、或用于目的在于細胞治療的檢測或治療等的物 質。
[0107] SSEA-U階段特異性胚胎抗原1)是細胞表達的抗原，也稱為CD15或Lewis X化eX)。 有時SSEA-1表達在細胞表面上。
[010引本發明中的"SSEA-1陽性細胞'是在其中檢測到SSEA-1表達的細胞。
[0109] 多能干細胞的實例包括靈長類動物多能干細胞，更具體地，人多能干細胞。多能干 細胞的實例包括胚胎干細胞和人造多能干細胞。
[0110] 在本發明的干細胞制備方法1的步驟（1)和步驟(2)中所用的"由多能干細胞誘導 分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體"可W例如通過下述方法制備：
[0111] 制備包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體的方法，所述方法包括W下步驟:在各自 含有作用于Wnt信號途徑的物質和抑制FGF信號途徑的物質的無血清培養基或含血清培養 基中，僅在表達RPE65基因的細胞出現前的一段時間，培養包含視網膜組織的細胞團聚體， 其中化xlO陽性細胞W所述組織的20% W上至100% W下的比例存在，然后在各自不含作用 于Wnt信號途徑的物質的無血清培養基或含血清培養基中培養所得的"表達RPE65基因的細 胞不在其中出現的細胞團聚體"（W下有時稱為本發明的細胞團聚體制備方法1)。
[0112] 在本發明的細胞團聚體制備方法1中用作起始材料的"包含視網膜組織的細胞團 聚體"是運樣的細胞團聚體，其中在視網膜組織中化xlO陽性細胞W所述組織的20% W上至 100 % W下的比例存在。前述乂hx 10陽性細胞的比例"，例如，優選為40 % W上，更優選60 % 社。
[0113] 前述"包含視網膜組織的細胞團聚體"可W例如由多能干細胞（優選人多能干細 胞)制備。
[0114] 作為制備上述"包含視網膜組織的細胞團聚體"的方法，例如，可W提及包括下述 步驟(A)和(B)的方法：
[0115] (A)將多能干細胞在無血清培養基中進行懸浮培養W形成多能干細胞的團聚體的 步驟，和
[0116] (B)將步驟(A)中形成的團聚體在各自不含作用于Sonic hedgehog信號轉導途徑 的物質而含有作用于BMP信號轉導途徑的物質的無血清培養基或含血清培養基中進行懸浮 培養W得到包含視網膜先祖細胞的細胞團聚體的步驟。
[0117] 說明通過在無血清培養基中懸浮培養多能干細胞形成多能干細胞的團聚體的步 驟(A)。
[0118] 用于步驟(A)的無血清培養基不特別受限，只要其是如上文所述的。例如，可W提 及補充有適量的可商購的血清代替物如KSR等的無血清培養基(例如，補充有10%KSR、45化 M 1--硫代甘油和lx化學成分確定的脂質濃縮物的IMDM和F-12的1:1混合物的培養基）。在 人ES細胞的情形中，添加到無血清培養基中的KSR的量通常為約1%至約20%，優選約2%至 約 20 %。
[0119] 步驟(A)中的培養條件，如培養溫度、0)2濃度等可W適當確定。培養溫度例如是約 30°C至約40°C，優選約37°C。C〇2濃度例如是約1 %至約10%，優選約5%。
[0120] 步驟(A)中多能干細胞的濃度可W確定為適于更均勻和有效地形成多能干細胞的 團聚體。例如，當使用96孔微孔板對人ES細胞進行懸浮培養時，將制備為每孔約IX 103至約 1 X 105個細胞，優選約3 X 103至約5 X 104個細胞，更優選約5 X 103至約3 X 104個細胞，最優選 約1.2 X 104個細胞的液體加入孔中，并且將板靜置W形成細胞團聚體。
[0121] 形成細胞團聚體所需的懸浮培養時間可W根據使用的多能干細胞酌情確定，W使 細胞可W均勻聚集。為了形成均勻的細胞團聚體，希望其盡可能短。例如，在人ES細胞的情 況下，團聚體優選在約24hr內，更優選在約12hr內形成。細胞團聚體形成所需的時間可W通 過控制用于聚集細胞的工具、離屯、條件等適當調節。
[0122] 說明用于通過將步驟(A)中形成的細胞團聚體在各自不含作用于Sonic hedgehog 信號轉導途徑的物質而含有作用于BMP信號轉導途徑的物質的無血清培養基或含血清培養 基中懸浮培養獲得包含視網膜先祖細胞的細胞團聚體的步驟(B)。
[0123] 用于步驟(B)的培養基是未補充作用于Sonic hedgehog信號轉導途徑的物質而補 充有作用于BMP信號轉導途徑的物質的無血清培養基或含血清培養基，其不需要加入基底 膜制劑。
[0124] 用于運樣的培養基的無血清培養基或含血清培養基不特別受限，只要其是如上文 所述的即可。例如，可W提及補充有適量的可商購的血清代替物如KSR等的無血清培養基 (例如，補充有10%KSR、450iiM 1--硫代甘油和lx化學成分確定的脂質濃縮物的IMDM和F- 12的1:1混合物的培養基）。在人ES細胞的情況下，加入無血清培養基中的KSR的量通常是約 1 %至約20 %，優選約2 %至約20 %。
[0125] 作為用于步驟(B)中的無血清培養基，可W直接使用用于步驟(A)的無血清培養 基，或可W用新鮮無血清培養基替代。當將用于步驟(A)的無血清培養基直接用于步驟(B) 時，可W將作用于BMP信號轉導途徑的物質加入至所述培養基。
[01%]作用于Sonic hedgehog(下文有時表示為化h)信號轉導途徑的物質是能夠增強 S化介導的信號轉導的物質。作用于ah信號轉導途徑的物質的實例包括屬于化dgehog家族 的蛋白（例如，化h)、S化受體、S化受體激動劑、化rmo巧hamine或SAG等。
[0127] 作用于BMP信號轉導途徑的物質的實例包括BMP蛋白如BMP2、BMP4、BMP7等，GDF蛋 白如GDF7等，抗-BMP受體抗體，BMP部分膚等。BMP2蛋白、BMP4蛋白和BMP7蛋白可從例如R&D Systems獲得，并且GDF7蛋白可從例如Wako 化re Qiemical Industries,Ltd獲得。
[0128] 作用于BMP信號轉導途徑的物質的濃度僅需要是可W誘導形成多能干細胞的團聚 體的細胞向視網膜細胞分化的濃度。例如，在BMP4的情況下，將其加入至培養基中至約 0.0 lnM至約化M，優選約0.1 nM至約lOOnM，更優選約1.5nM的濃度。
[0129] 作用于BMP信號轉導途徑的物質僅需要在步驟(A)中的懸浮培養開始約24小時后 加入，并且可W在自懸浮培養開始起的數天內（例如，15天內）加入至培養基。優選地，作用 于BMP信號轉導途徑的物質在自懸浮培養開始起的第1天至第15天，更優選第1天至第9天， 更優選第6天加入至培養基中。
[0130] 在將作用于BMP信號轉導途徑的物質加入至培養基后，W及在形成多能干細胞的 團聚體的細胞向視網膜細胞的分化誘導開始后，不需要向培養基中添加作用于BMP信號轉 導途徑的物質，并且培養基可W用各自不含作用于BMP信號轉導途徑的物質的無血清培養 基或含血清培養基替換。W此方式，培養基的成本可W被遏制。開始向視網膜細胞分化誘導 的細胞可W通過例如檢測細胞中Rax基因的表達來確認。對通過使用在Rax基因基因座中敲 入有巧光報告蛋白基因如GFP等的多能干細胞在步驟(A)中形成的細胞團聚體在作用于BMP 信號轉導途徑的物質W分化誘導為視網膜細胞所需的濃度存在的情況下進行懸浮培養，并 且檢測從表達的巧光報告蛋白發出的巧光，從而可W檢驗開始分化誘導為視網膜細胞的時 間。步驟(B)的一個實施方案是運樣的步驟，其用于通過將步驟(A)中形成的細胞團聚體在 各自不含作用于Sonic hedgehog信號轉導途徑的物質而含有分化誘導為視網膜細胞所需 濃度的作用于BMP信號轉導途徑的物質的無血清培養基或含血清培養基中懸浮培養，直至 表達Rax基因的細胞開始出現，而獲得包含視網膜先祖細胞的細胞團聚體。
[0131] 步驟(B)中的培養條件如培養溫度、0)2濃度等可W適當確定。培養溫度例如是約 30°C至約40°C，優選約37°C。C〇2濃度例如是約1 %至約10%，優選約5%。
[0132] 獲得包含視網膜先祖細胞的細胞團聚體可W通過例如檢測表達Rax或PAX6(其是 視網膜先祖細胞標志物）的細胞在團聚體中的存在來檢驗。通過包括上述步驟(A)和(B)的 方法獲得的"包含視網膜先祖細胞的細胞團聚體"可W用作"包含視網膜組織的細胞團聚 體"作為本發明的細胞團聚體制備方法1中的起始材料。
[0133] 用作本發明的細胞團聚體制備方法1中的起始材料的"包含視網膜組織的細胞團 聚體"也可W專口制備，例如，通過包括下述步驟(C)、（D)和化)的方法制備：
[0134] (C)將多能干細胞在含有抑制Wnt信號途徑的物質的無血清培養基中進行懸浮培 養W形成多能干細胞的團聚體的步驟，
[0135] (D)將步驟(C)中形成的細胞團聚體在含有基底膜制劑的無血清培養基中進行懸 浮培養的步驟，和
[0136] 化)將步驟(D)中培養的細胞團聚體在含血清培養基中進行懸浮培養的步驟。
[0137] 用于步驟(C)的抑制Wnt信號途徑的物質不特別刻良，只要其可W抑制Wnt介導的 信號轉導即可。抑制Wnt信號途徑的物質的實例包括DkkUCerberus蛋白、Wnt受體抑制劑、 可溶型Wnt受體、Wnt抗體、酪蛋白激酶抑制劑、顯性陰性Wnt蛋白、CKI-7 (N-( 2-氨基乙基)- 5-氯-異哇嘟-8-橫酷胺）、D4476(4-{4-(2,3-二氨苯并[1,4]二P惡英-6-基)-5-11比晚-2-基- 1H-咪挫-2-基}苯甲酯胺）、IWR-1-endo(IWRle)、IWP-2等。抑制Wnt信號途徑的物質的濃度 僅需要是可W形成多能干細胞的團聚體的濃度。例如，常見抑制Wnt信號途徑的物質如 IWR1 e W約0.1咖至約100咖，優選約1咖至約10咖，更優選約化M的濃度加入。
[0138] 可W在懸浮培養開始前將抑制Wnt信號途徑的物質加入至無血清培養基，或在自 懸浮培養開始起的數天內（例如，5天內）加入至無血清培養基。優選地，在自懸浮培養開始 起的5天內，更優選在3天內，最優選在懸浮培養開始的同時將抑制Wnt信號途徑的物質加入 至無血清培養基中。此外，在添加抑制Wnt信號途徑的物質的情況下進行懸浮培養直至自懸 浮培養開始起的第18天，更優選第12天。
[0139] 步驟(C)中的培養條件，如培養溫度和C〇2濃度可W適當確定。雖然培養溫度不受 特別限制，但是其例如是約30°C至約40°C，優選約37°C。0)2濃度例如是約1 %至約10%，優 選約5 %。
[0140] 步驟(C)中多能干細胞的濃度可W由本領域技術人員酌情確定W更均勻和有效地 形成多能干細胞的團聚體。形成細胞團聚體時的多能干細胞的濃度不特別受限，只要其允 許形成干細胞的均勻團聚體即可。例如，當使用96孔微孔板對人ES細胞進行懸浮培養時，加 入被制備成每孔約1 X 103至約5 X 104個細胞，優選約3 X 103個細胞至約3 X 104個細胞，更優 選約5 X103個細胞至約2 X104個細胞，最優選約9 X103個細胞的液體，并且將板靜置W形成 細胞團聚體。
[0141] 形成細胞團聚體所需的懸浮培養時間可W根據使用的多能干細胞酌情確定，只要 所述細胞可W快速聚集即可。為了形成均勻的細胞團聚體，希望其盡可能短。例如，在人ES 細胞的情況下，希望細胞團聚體優選在24hr內，更優選在12虹內形成。細胞團聚體形成所需 的時間可W由本領域普通技術人員通過控制用于聚集細胞的工具、離屯、條件等適當調節。
[0142] 用于步驟(D)的基底膜制劑是指運樣的制劑，其含有與上皮細胞的那些類似的具 有控制細胞形態、分化、生長、運動、功能表達等的功能的基底膜構成成分（當在其上鋪板并 培養能夠形成基底膜的目的細胞時）。本文中，"基底膜構成成分"是指在動物組織中在上皮 細胞層和間質細胞層之間存在的薄膜形態的胞外基質分子等。基底膜制劑可W通過例如利 用能夠溶解細胞的脂質的溶液、堿溶液等移除經由基底膜附著在支持物上的能夠形成基底 膜的細胞制備。優選的基底膜制劑的實例包括可作為基底膜成分商購的產品（例如， Matrigel?(由Becton,Dickinson and Company生產：下文中，有時稱為Matrigel))，和已知 為基底膜成分的胞外基質分子(例如，層粘連蛋白、IV型膠原蛋白、硫酸乙酷肝素蛋白聚糖 (heparan sulfate proteoglycan)、巢蛋白等）。
[0143] Matrigel?是由來源于化ge化reth Holm Swarn化服）小鼠肉瘤的基底膜制備的產 品。Matrigel?的主要成分是IV型膠原蛋白、層粘連蛋白、硫酸乙酷肝素蛋白聚糖和巢蛋白。 除運些之外，還包含TGF-0、成纖維細胞生長因子(FGF)、組織纖溶酶原激活物和由EHS腫瘤 天然產生的生長因子。Matrigel?的"生長因子減少的(GFR)產品"具有比常規Matrigel?低 的生長因子濃度。在本發明，優選使用GFR產品。
[0144] 雖然步驟(D)中加入至無血清培養基W用于懸浮培養的基底膜制劑的濃度不特別 受限，只要神經組織（例如，視網膜組織）的上皮結構被穩定維持即可，但是例如，當使用 Madigel?時，其優選為培養基的1/20至1/200體積，更優選約1/100體積。雖然可W在開始 培養干細胞時將基底膜制劑加入至培養基，但優選地在自票浮培養開始起的5天內，更優選 在2天內將其加入至無血清培養基。
[0145] 作為用于步驟(D)的無血清培養基，可W直接使用用于步驟(C)的無血清培養基， 或可W用新鮮無血清培養基替代。
[0146] 當將步驟(C)中使用的無血清培養基直接用于步驟(D)時，可W將"基底膜制劑"加 入至所述培養基。
[0147] 步驟(D)中的培養條件，如培養溫度和C〇2濃度可W適當確定。雖然培養溫度不受 特別限制，但其例如是約30°C至約40°C，優選約37°C。C化濃度例如是約1 %至約10%，優選 約5 %。
[0148] 作為要用于步驟化)的含血清培養基，可W使用步驟(D)的培養中使用的無血清培 養基（向其直接加入血清），或用新鮮的含血清培養基替代。
[0149] 在自懸浮培養開始起的第7天或第7天后，更優選在第9天或第9天后，最優選在第 12天加入血清。加入的血清的濃度是約1 %至約30 %，優選約3 %至約20 %，更優選約10 %。
[0150] 在步驟化）中，除血清W外，添加作用于化h信號途徑的物質可W提高視網膜組織 的制備效率。
[0151] 作用于化h信號途徑的物質不特別受限，只要其可W增強化h介導的信號轉導即 可。作用于化h信號途徑的物質的實例包括屬于化dgehog家族的蛋白（例如，Shh)、S化受體、 SUi受體激動劑、Purmo巧hamine、SAG等。
[0152] 在例如常見的作用于化h信號途徑的物質如SAG的情況下，該步驟中使用的作用于 S化信號途徑的物質的濃度是約0.1 nM至約lOiiM，優選約lOnM至約化M，更優選約lOOnM。
[0153] 在運樣培養的細胞團聚體中，存在覆蓋細胞團聚體表面的視網膜組織。視網膜組 織可W通過免疫染色方法等檢驗。通過上述包括步驟(C)、（D)和化)的方法獲得的細胞團聚 體可W用作作為本發明的細胞團聚體制備方法1中的起始材料的"包含視網膜組織的細胞 團聚體"。
[0154] 視網膜組織在通過包括步驟(A)和(B)的上述方法或包括步驟(C)、（D)和化）的上 述方法獲得的細胞團聚體中的存在也可W如下檢驗。例如，將通過上述方法獲得的細胞團 聚體在含血清培養基中進行懸浮培養。用于懸浮培養的細胞培養容器的實例包括上述那 些。培養條件，如懸浮培養的培養溫度、0)2濃度和化濃度可W適當確定。盡管培養溫度不特 別受限，其例如是約30°C至約40°C。0)2濃度例如是約1 %至約10%。〇2濃度例如是約20%至 約70 %。盡管培養時間不特別限制，其通常是4她r W上，優選7天W上。
[0155] 完成懸浮培養后，將細胞團聚體用固定劑如多聚甲醒溶液固定，并且制備冷凍切 片。將獲得的冷凍切片免疫染色，并且檢驗每種分化譜系的視網膜細胞(光感受器、水平細 胞、雙極細胞、無長突細胞、視網膜神經節細胞）的存在。將獲得的冷凍切片免疫染色，并且 檢驗視網膜組織的層結構的形成。因為視網膜組織的各個層由不同視網膜先祖細胞(光感 受器，水平細胞，雙極細胞，無長突細胞，視網膜神經節細胞)構成，所W層結構的形成可W 通過使用針對表達在運些細胞中的上述標志物的抗體的免疫染色來檢驗。
[0156] 在如上述制備的細胞團聚體中含有的視網膜組織中的乂 hxlO陽性細胞的比例"可 w通過例如w下方法檢查。
[0157] (1)首先，制備"包含視網膜組織的細胞團聚體"的冷凍切片。
[0158] (2)然后，進行Rax蛋白的免疫染色。當使用通過將表達Rax基因的細胞改變成表達 巧光蛋白如GFP而獲得的基因重組細胞時，使用巧光顯微鏡等觀察上述巧光蛋白的表達。表 達Rax基因的視網膜組織區域在獲得的免疫染色圖像或巧光顯微圖像中被指明。
[0159] (3)使用與冷凍切片（其中表達Rax基因的視網膜組織區域已被指明）相同的切片 或相鄰切片作為樣品，將核用核染色劑如DAPI染色。然后，將上述表達Rax基因的視網膜組 織區域中染色的核的數目計數，從而測量所述視網膜組織區域中所述細胞的數量。
[0160] (4)使用與冷凍切片（其中表達Rax基因的視網膜組織區域已被指明）相同的切片 或相鄰切片作為樣品，將化xlO蛋白免疫染色。將上述視網膜組織區域中的化xlO陽性細胞 的數量計數。
[0161] (5)基于上述(3)和(4)中測量的各個核數量，將化xlO陽性細胞中核的數量除W上 述表達Rax基因的視網膜組織區域中的核的數量，從而計算"ChxlO陽性細胞的比例"。
[0162] 在本發明的細胞團聚體制備方法1中，首先，僅在表達RPE65基因的細胞出現之前 的一段時間在各自含有作用于Wnt信號途徑的物質和抑制FGF信號途徑的物質的無血清培 養基或含血清培養基中培養包含視網膜組織的細胞團聚體，在所述視網膜組織中化xlO陽 性細胞W所述組織的20 % W上和100 % W下的比例存在。
[0163] 作為本文中優選的培養，可W提及懸浮培養。
[0164] 作為無血清培養基，可W提及作為補充有N2或KSR的基礎培養基的無血清培養基。 更具體地，可W提及作為補充有N2補充物(N2，Invi化ogen)的DMEM/F-12培養基的無血清培 養基。作為含血清培養基，可W提及作為補充有胎牛血清的基礎培養基的含血清培養基。
[0165] 培養條件，如培養溫度、0)2濃度可W適當設置。培養溫度例如是在約30°C至約40 °C的范圍內，優選例如約3 7 °C。C0 2濃度例如是在約1 %至約10 %的范圍內，優選例如約5 %。
[0166] 當在培養基中培養上述"包含視網膜組織的細胞團聚體"時，無血清培養基或含血 清培養基中含有的作用于Wnt信號途徑的物質不特別受限，只要其可W增強Wnt介導的信號 轉導即可。作用于Wnt信號途徑的物質的具體實例包括屬于Wnt家族的蛋白（例如，Wntl、 胖11133、￥11173)、￥111受體、￥111受體激動劑、651(30抑制劑（例如，6-漠說玉紅-3'-目虧（81〇)、 CHIR99021、Ke 噸 aul lone)等。
[0167] 在常見的作用于Wnt信號途徑的物質如CHIR99021的情況下，包含在無血清培養基 或含血清培養基中的作用于Wnt信號途徑的物質的濃度例如在約O.liiM至約lOOiiM的范圍 內，優選例如在約化M至約30yM的范圍內，更優選例如為約化M。
[0168] 當在培養基中培養上述"包含視網膜組織的細胞團聚體"時，無血清培養基或含血 清培養基中含有的抑制FGF信號途徑的物質不受特別限制，只要其可W抑制FGF介導的信號 轉導即可。抑制FGF信號途徑的物質的實例包括FGF受體、FGF受體抑制劑（例如，SU-540 2、 AZD4547、BGJ398)、MAP激酶級聯抑制性物質（例如，M邸抑制劑、MAPK抑制劑、ERK抑制劑）、 PI3激酶抑制劑、Akt抑制劑等。
[0169] 無血清培養基或含血清培養基中含有的抑制FGF信號途徑的物質的濃度僅需要是 可W誘導形成多能干細胞的團聚體的細胞向視網膜細胞分化的濃度。例如，在SU-5402的情 況下，將其加入至培養基中至約0.化M至約10化M，優選約化M至約30礎，更優選約扣M的濃 度。
[0170] 本發明的細胞團聚體制備方法1中的"僅在表達RPE65基因的細胞出現前培養一段 時間"意為在表達RPE65基因的細胞出現前的整個時間或部分時間進行培養。即，在整個時 間或部分時間（任意時間）（在此期間，培養系統中的"包含視網膜組織的細胞團聚體"由基 本上不表達RPE65基因的細胞構成）的培養是足夠的。通過使用運樣的培養，可W獲得表達 RPE65基因的細胞不在其中出現的細胞團聚體/'表達RPE65基因的細胞不在其中出現的細 胞團聚體"包括"表達RPE65基因的細胞根本不在其中出現的細胞團聚體"和"表達RPE65基 因的細胞基本上不在其中出現的細胞團聚體"。作為"表達RPE65基因的細胞基本上不在其 中出現的細胞團聚體"，可W提及在細胞團聚體中含有的視網膜組織中W約1%W下的比例 含有RPE65陽性細胞的細胞團聚體。
[0171] 為了確定運樣的具體時間，"包含視網膜組織的細胞團聚體"用作樣品，并且存在 或不存在樣品中含有的RPE65基因的表達僅需要通過通常的基因工程方法或生化方法測 量。具體而言，例如，是否存在RPE65基因的表達或其水平可W通過對上述"包含視網膜組織 的細胞團聚體"的冷凍切片進行使用抗RPE65蛋白抗體的免疫染色方法來檢查。
[0172] "在表達RPE65基因的細胞出現前的一段時間"例如是運樣的一段時間，在其期間 上述視網膜組織中存在的化xlO陽性細胞的比例比在開始在各自含有作用于Wnt信號途徑 的物質和抑制FGF信號途徑的物質的無血清培養基或含血清培養基中培養上述細胞團聚體 時減小，并且落在30%至0%的范圍內。"表達RPE65基因的細胞不在其中出現的細胞團聚 體"是運樣的細胞團聚體，其中化xlO陽性細胞W上述視網膜組織的30%至0%內的比例存 在于所述組織中。
[0173] 雖然"在表達RPE65基因的細胞出現前的一段時間"的天數根據作用于Wnt信號途 徑的物質和抑制FGF信號途徑的物質的類型，無血清培養基或含血清培養基的類型，其他培 養條件等而變化，但其例如是在14天內。更具體地，當使用無血清培養基(例如，運樣的無血 清培養基，其是補充有N2的基礎培養基)時，上述時間優選例如是在10天內，更優選例如3天 至6天。當使用含血清培養基(例如，運樣的含血清培養基，其是補充有胎牛血清的基礎培養 基)時，上述時期優選例如在12天內，更優選例如6天至9天。
[0174] 然后將通過如上所述的培養獲得的"表達RPE65基因的細胞不在其中出現的細胞 團聚體"在各自不含作用于Wnt信號途徑的物質的無血清培養基或含血清培養基中培養。
[0175] 作為本文中優選的培養，可W提及懸浮培養。
[0176] 作為無血清培養基，可W提及作為補充有N2或KSR的基礎培養基的培養基。作為含 血清培養基，可W提及作為補充有胎牛血清的基礎培養基的培養基。更具體地，可W提及作 為補充有胎牛血清的DMEM/F-12培養基的含血清培養基。
[0177] 上述無血清培養基或含血清培養基可W含有已知的生長因子、促進生長的添加劑 和化學物質等。已知的生長因子的實例包括66。、。6。、16。、膜島素等。促進生長的添加劑的 實例包括N2補充物(N2，Invi化ogen)、B2巧h充物（Invitrogen)、KSR等。促進生長的化學物 質的實例包括類視黃醇(例如，視黃酸)和牛橫酸。
[0178] 優選的培養期例如是運樣的培養期，其間存在于上述視網膜組織中的化xlO陽性 細胞的比例比在開始在各自不含作用于Wnt信號途徑的物質的無血清培養基或含血清培養 基中培養上述細胞團聚體時增加，并且達到30% W上。
[0179] 培養條件如培養溫度、0)2濃度可W適當設置。培養溫度例如是在約30°C至約40°C 的范圍內，優選例如約3 7 °C。CO 2濃度例如是在約1 %至約10 %的范圍內，優選例如約5 %。
[0180] 雖然直至獲得"包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體"的上述培養天數根據無血清 培養基或含血清培養基的類型，其他培養條件等而改變，但其例如是在100天內。上述培養 天數優選為例如20天至70天，更優選例如30天至60天。
[0181] 在如上述產生的"包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體"中，視網膜色素上皮和視網 膜組織(具體地，神經視網膜)與相同細胞團聚體中的睫狀緣區樣結構鄰近地存在。所述結 構可W通過顯微觀察等檢驗。具體地，例如，當細胞團聚體由其中GFP基因被敲入Rax基因座 (RAX: : GFP敲入細胞）的多能干細胞產生時，神經視網膜(其是RAX: : GFP強陽性區）、視網膜 色素上皮(其是運樣的上皮組織，其中用透射光可W觀察到色素沉著)和在神經視網膜和視 網膜色素上皮之間的邊界區域中并且具有特征結構的睫狀緣區樣結構的存在可W通過使 用巧光立體顯微鏡(例如，Olympus公司生產的SZX16)來檢驗。
[0182] 在按上述產生的"包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體"中，在兩個神經視網膜組織 之間的區域中形成睫狀緣區樣結構。即，有時形成連續含有神經視網膜組織、睫狀緣區樣結 構和另一神經視網膜組織的組織。在該情況下，睫狀緣區樣結構的存在可W通過顯微觀察 檢驗，因為睫狀緣區樣結構的特征是比相鄰神經視網膜組織更薄。
[0183] 用于本發明的干細胞制備方法1的步驟（1)和步驟(2)中的"由多能干細胞誘導分 化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體"例如還可W通過專利文獻1所述的下述方法制備 (W下有時稱為本發明的細胞團聚體制備方法2):
[0184] 制備包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體的方法，所述方法包括W下步驟:僅在出 現表達RPE65基因的細胞之前的一段時間，在各自含有作用于Wnt信號途徑的物質的無血清 培養基或含血清培養基中，培養包含視網膜組織的細胞團聚體，其中化xlO陽性細胞W所述 組織的20% W上的比例存在，然后在各自不含作用于Wnt信號途徑的物質的無血清培養基 或含血清培養基中培養所得到的"表達RPE65基因的細胞不在其中出現的細胞團聚體"。
[0185] 在本發明的細胞團聚體制備方法2中用作起始材料的"包含視網膜組織的細胞團 聚體"是運樣的細胞團聚體，其中化xlO陽性細胞在視網膜組織中W所述組織的20% W上的 比例存在。前述乂hx 10陽性細胞的比例"，例如，優選為40 % W上，更優選60 % W上。作為所 述"包含視網膜組織的細胞團聚體"的制備方法，可W提及W上作為本發明的細胞團聚體制 備方法1的起始材料的制備方法提及的包括步驟(A)和(B)的方法，或包括步驟(C)、（D)和 化)的方法。
[0186] 在本發明的干細胞制備方法1的步驟（1)中，對按照上述制備的獲得自"由多能干 細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體"的細胞進行懸浮培養并且獲得視網膜 球體。
[0187] 獲得自"由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體"的細胞的 實例包括通過分散上述"由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體"得 到的細胞，通過分散由前述細胞團聚體分離的睫狀緣區樣結構得到的細胞和通過分散由前 述細胞團聚體收集的細胞得到的細胞。當對所述細胞在存在生長因子等的條件下W低密度 進行懸浮培養時，可W形成源自一個細胞或少量細胞（如2-約10個細胞）的球形細胞團聚 體，即，視網膜球體。
[0188] 從"由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體"分離睫狀緣區 樣結構的方法的實例包括在顯微鏡下用精細綴子、解剖刀等解剖的方法。例如，可W通過前 述方法檢驗睫狀緣區樣結構在"由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚 體"中的存在。使用從"由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體"切下 的睫狀緣區樣結構，可W增加在開始懸浮培養時細胞中睫狀緣區干細胞的含量。
[0189] 作為從"由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體"收集細胞 的方法，可W提及W下提及的步驟(2)中進行的用于收集SSEA-1陽性細胞的方法。
[0190] 分散細胞團聚體、睫狀緣區樣結構或細胞的方法的實例包括機械分散處理、細胞 分散處理和細胞保護劑加入處理。運些處理可W組合進行。優選地，進行細胞分散處理，然 后進行機械分散處理。
[0191]作為機械分散處理的方法，可W提及吹吸處理(pipetting treatment)。
[0192] 作為用于細胞分散處理的細胞分散液，可W提及包含酶(諸如膜蛋白酶、膠原酶、 透明質酸酶、彈性蛋白酶、鏈霉蛋白酶、木瓜蛋白酶等)和馨合劑(諸如乙二胺四乙酸等）的 溶液。優選地，使用膜蛋白酶、木瓜蛋白酶或膠原酶，更優選地，使用木瓜蛋白酶。還可W使 用可商購的包含木瓜蛋白酶的細胞分散液。
[0193] 作為用于細胞保護劑添加處理的細胞保護劑，可W提及作用于FGF信號轉導途徑 的物質、作用于EGF信號轉導途徑的物質、肝素、抑制ROCK途徑的物質、血清和血清替代物。
[0194] 例如，將細胞團聚體、睫狀緣區樣結構或細胞用包含木瓜蛋白酶的細胞分散液處 理，并且通過吹吸進一步分散。
[0195] 作為用于上文提及的分散的細胞的懸浮培養的培養基，可W提及各自補充有用于 神經細胞培養的添加劑和生長因子的無血清培養基或含血清培養基。優選地，可W提及各 自補充有選自由作用于FGF信號轉導途徑的物質和作用于EGF信號轉導途徑的物質組成的 組的一種或多種物質的無血清培養基或含血清培養基。
[0196] 當向上述培養基中加入抑制ROCK途徑的物質時，可W提高視網膜球體形成效率。
[0197] 也可W向上述培養基中加入肝素。已知肝素提高作用于FGF信號轉導途徑的物質 和作用于EGF信號轉導途徑的物質的效果。
[019引用于上述懸浮培養的作用于FGF信號轉導途徑的物質的實例包括FGF1、FGF2、FGF4 和FGF10。用作作用于FGF信號轉導途徑的物質的FGF2(bFGF)的濃度為，例如，約Ing/ml至約 200ng/ml，優選地約5ng/ml至約lOOng/ml，更優選地約lOng/ml至約50ng/ml。
[0199] 作用于EGF信號轉導途徑的物質的實例包括EGF、TGF-a和皿-EGF。用作作用于EGF 信號轉導途徑的物質的EGF的濃度為，例如，約Ing/ml至約lOOng/ml，優選地約5ng/ml至約 50ng/ml，更優選地約 lOng/ml至約40ng/ml。
[0200] 抑制ROCK途徑的物質是能夠抑制由化0激酶介導的信號的物質。抑制ROCK途徑的 物質的實例包括Y-27632和法舒地爾(Fasudil)。作為抑制ROCK途徑的物質加入的Y-27632 的濃度是，例如，約0.01咖至約1 〇〇咖，優選地約化M至約30咖，更優選地約10咖。
[0201] 步驟(1)中的懸浮培養中鋪板的細胞數目是，例如，約IxlO2個細胞/ml至約IxlO6個 細胞/ml,優選地約IxlO3個細胞/ml至約5xl05個細胞/ml,更優選地約5xl0 3個細胞/ml至約 IxlO5個細胞/ml。
[0202] 用于上述懸浮培養的培養材料優選是平底低粘附性培養材料。
[0203] 運樣形成的視網膜球體包含自我復制的睫狀緣區干細胞。當在開始懸浮培養時細 胞包含很多干細胞時，可W形成的視網膜球體的數目變高。當在懸浮培養開始時細胞中包 含的干細胞具有高自我復制能力時，可W形成的視網膜球體的尺寸(例如，直徑)變大。所形 成的視網膜球體可W通過與適當的因子反應分化成視網膜層特異性神經元。
[0204] 在本發明的干細胞制備方法1的步驟(2)中，從獲得自如上所述制備的"由多能干 細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體"的細胞收集SSEA-1陽性細胞。
[0205] 獲得自"由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體"的細胞的 實例包括通過分散上述"由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體"得 到的細胞，通過分散從上述細胞團聚體分離的睫狀緣區樣結構得到的細胞，和通過分散由 上述細胞團聚體或睫狀緣區樣結構形成的視網膜球體得到的細胞。從運些細胞收集SSEA-1 陽性細胞。
[0206] 從"由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體"分離睫狀緣區 樣結構的方法可W與在前述步驟(1)中進行的方法相似。
[0207] 作為由上述細胞團聚體或睫狀緣區樣結構形成視網膜球體的方法，可W提及包括 前述步驟(1)中的細胞懸浮培養的方法。
[0208] 作為分散細胞團聚體、睫狀緣區樣結構或視網膜球體的方法，可W提及前述步驟 (1)中的分散處理。
[0209] 可W提及用于收集SSEA-1陽性細胞的方法、使用流式細胞儀的方法和使用磁力的 方法。使用流式細胞儀的方法的實例包括運樣的方法，所述方法包括用巧光標記的抗- SSEA-1抗體標記SSEA-1陽性細胞，并且通過流式細胞儀選擇和收集細胞。使用磁力的方法 的實例包括運樣的方法，所述方法包括用磁化的抗-SSEA-1抗體標記SSEA-1陽性細胞，并且 通過磁力細胞分離裝置(MACS)選擇和收集細胞。
[0210] 作為抗-SSEA-1抗體，也可W使用任意抗體，只要其識別SSEA-1抗原即可。也可W 使用可商購的抗-S SEA-1抗體，諸如畑em i C on的抗-S SEA-1抗體，BD的抗-S SEA-1抗體， MiItenyi Biotec的抗-SSEA-1 抗體等。
[0別。當要分離SSEA-1陽性細胞時，除了SSEA-1陽性外，還可W通過使用Rax陽性或不存 在色素沉著作為指標來進行分離。
[0212] 運樣收集的SSEA-1陽性細胞級分包含睫狀緣區干細胞。通過將細胞與適當的因子 反應，所收集的SSEA-1陽性細胞級分可W分化成視網膜層特異性神經元。
[0213] 在本發明的干細胞制備方法2中，進行本發明的干細胞制備方法1的步驟（1)。在本 發明的干細胞制備方法2中，作為"獲得自由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的 細胞團聚體的細胞"，使用通過分散由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞 團聚體得到的細胞，或通過分散由細胞團聚體分離的睫狀緣區樣結構得到的細胞。
[0214] 目P，本發明的干細胞制備方法2是用于產生由多能干細胞誘導分化的睫狀緣區干 細胞的方法，所述方法包括進行懸浮培養通過W下方式獲得的細胞的步驟：
[0215] 分散由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體，或
[0216] 分散分離自所述細胞團聚體的睫狀緣區樣結構，由此形成視網膜球體。
[0217] 在本發明的干細胞制備方法3中，進行本發明的干細胞制備方法1的步驟(2)。在本 發明的干細胞制備方法3中，作為"獲得自由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的 細胞團聚體的細胞"，使用通過分散由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞 團聚體得到的細胞，或通過分散由細胞團聚體分離的睫狀緣區樣結構得到的細胞。
[0218] 目P，本發明的干細胞制備方法3是用于產生由多能干細胞誘導分化的睫狀緣區干 細胞的方法，所述方法包括進行從通過W下方式獲得的細胞收集SSEA-1陽性細胞的步驟：
[0219] 分散由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體，或
[0220] 分散分離自所述細胞團聚體的睫狀緣區樣結構。
[0221] 在本發明的干細胞制備方法4中，進行本發明的干細胞制備方法1的步驟（1)，接著 進行步驟(2)。作為步驟（1)中的"獲得自由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的 細胞團聚體的細胞"，使用通過分散由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞 團聚體得到的細胞，或通過分散由細胞團聚體分離的睫狀緣區樣結構得到的細胞。作為步 驟(2)中的"獲得自由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體的細胞"， 使用通過分散步驟(1)中得到的視網膜球體而得到的細胞。
[0222] 目P，本發明的干細胞制備方法4是用于產生由多能干細胞誘導分化的睫狀緣區干 細胞的方法，所述方法包括進行下述：
[0223] (1)懸浮培養通過W下方式得到的細胞的步驟：
[0224] 分散由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體，或
[0225] 分散分離自所述細胞團聚體的睫狀緣區樣結構，由此獲得視網膜球體;和
[0226] (2)從通過分散通過步驟（1)得到的視網膜球體而得到的細胞收集SSEA-1陽性細 胞的步驟。
[0227] 在本發明的干細胞制備方法5中，進行本發明的干細胞制備方法1的步驟(2)，接著 進行步驟（1)。作為步驟(2)中的"獲得自由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的 細胞團聚體的細胞"，使用通過分散由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞 團聚體得到的細胞，或通過分散由細胞團聚體分離的睫狀緣區樣結構得到的細胞。作為步 驟（1)中的"獲得自由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體的細胞"， 使用通過分散步驟(2)中收集的細胞而得到的細胞。
[0228] 目P，本發明的干細胞制備方法5是用于產生由多能干細胞誘導分化的睫狀緣區干 細胞的方法，所述方法包括進行從通過W下方式得到的細胞收集SSEA-1陽性細胞的步驟：
[0229] 分散由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體，或
[0230] 分散分離自所述細胞團聚體的睫狀緣區樣結構，和
[0231] 懸浮培養通過分散在前述步驟中收集的細胞而得到的細胞的步驟，由此得到視網 膜球體。
[0232] 通過本發明的干細胞制備方法1-5中的任一種方法下有時稱為本發明的干細 胞制備方法)得到的視網膜球體或SSEA-1陽性細胞級分可W用作包含高比例的睫狀緣區干 細胞的細胞群體。
[0233] 可W通過在存在選自由抑制Notch信號的物質、類視黃醇和牛橫酸組成的組的一 種或多種物質的條件下培養由本發明的干細胞制備方法得到的睫狀緣區干細胞而產生視 網膜層特異性神經元。
[0234] 睫狀緣區干細胞的實例包括在通過本發明的干細胞制備方法得到的視網膜球體 中包含的睫狀緣區干細胞和在通過本發明的干細胞制備方法得到的SSEA-1陽性細胞級分 中包含的睫狀緣區干細胞。
[0235] 例如，在適于神經元分化的條件下培育前述視網膜球體或前述SSEA-1陽性細胞級 分。通過分散前述視網膜球體或前述SSEA-1陽性細胞級分得到的細胞可W相似地進行培 養。
[0236] 作為用于所述培養的培養基，可W提及各自含有一種或多種選自由抑制Notch信 號的物質、類視黃醇和牛橫酸組成的組的物質的含血清培養基或無血清培養基。例如，可W 將前述視網膜球體、前述SSEA-1陽性細胞級分或通過分散它們得到的細胞在各自補充有一 種或多種選自由作用于FGF信號轉導途徑的物質和作用于EGF信號轉導途徑的物質組成的 組的物質的無血清培養基或含血清培養基中培養給定的時間，并且在各自補充有一種或多 種選自由抑制Notch信號的物質、類視黃醇和牛橫酸組成的組的物質的無血清培養基或含 血清培養基中培養。運些培養基可W適當地包含添加劑如B2巧h充劑（Invitrogen)。
[0237] 此處，"抑制Notch信號的物質"可W是任意物質，只要其抑制Notch信號的活性即 可，并且例如可W提及T-分泌酶抑制性物質，Notch受體抑制性物質，D11抑制性物質和化S 抑制性物質。作為前述丫-分泌酶抑制性物質，可W提及DAPT(N-[N-(3,5-二氣苯乙酷基)- 心丙氨酷]-S-苯基甘氨酸叔下基醋）。當使用DAPT作為抑制Notch信號的物質時，例如，其被 添加至約O.OlyM至約1〇〇咖的濃度。
[0238] 作為用于培養睫狀緣區干細胞的培養材料，可W提及懸浮培養材料和貼壁培養材 料。作為貼壁培養的培養皿的涂層材料，可W提及聚-D-賴氨酸、聚-k賴氨酸、聚鳥氨酸、層 粘連蛋白、巢蛋白、Matrigel或明膠。
[0239] 例如，在37°C，5%的C〇2濃度和20 %-40 %的氧濃度，培養睫狀緣區干細胞。
[0240] 例如，可W通過檢驗細胞標志物的表達來檢驗通過上述培養得到的細胞是否包含 視網膜層特異性神經元。
[0241] 本發明還包括通過本發明的方法制備的睫狀緣區干細胞或視網膜層特異性神經 元作為用于評價毒性或藥效的試劑的用途，通過本發明的方法制備的睫狀緣區干細胞或視 網膜層特異性神經元作為移植用生物材料的用途等。
[0242] 通過本發明的方法制備的睫狀緣區干細胞或視網膜層特異性神經元可W用于篩 選用于由視網膜細胞障礙導致的疾病的治療藥物，用于研究疾病的材料或藥物發現材料。 在化學物質等的毒性或藥效的評價中，通過本發明的方法制備的睫狀緣區干細胞或視網膜 層特異性神經元還用于毒性(諸如光毒性、神經毒性等)研究、毒性檢測等。例如，將通過本 發明的方法制備的睫狀緣區干細胞或視網膜層特異性神經元與測試物質接觸，并且測定所 述物質對所述細胞的影響，基于此來評價所述物質的毒性或藥效。
[0243] 通過本發明的方法制備的睫狀緣區干細胞或視網膜層特異性神經元可W用作移 植用生物材料，所述移植用生物材料用于補充處于細胞損傷狀態的患病組織本身(例如，用 于移植手術)等。例如，將有效量的通過本發明的方法制備的睫狀緣區干細胞或視網膜層特 異性神經元移植入需要移植的受試者，從而治療視網膜組織障礙導致的疾病。
[實施例]
[0244] W下通過參考實施例更詳細地說明本發明，所述實施例不被認為是限制性的。
[0245] 實施例1:由多能干細胞制備包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體
[0246] 將敲入 RAX: :GFP 的人 ES 細胞（來源于趾 ES-l;Nakano，T.等人 Cell Stem Cell 2012,10(6) ,771-785)根據 "Proc.化 tl. Acad. Sci. USA, 2006,103( 25) ,9554-9559"和 "Nat.Biotech. ,2007，25,681-686"中描述的方法培養。作為培養基，使用補充有20%KSR 化nockout Serum? Replacement; InvitrogenKO.lmM 2-琉基乙醇，2mM k谷氨酷胺，lx非 必需氨基酸和8ng/ml bFGF的DMEM/F12培養基(Sigma)。
[0247] 將上述培養的ES細胞單個分散在lYypLE Express(Invitrogen)中，并且使單個分 散的ES細胞懸浮在lOOiil無血清培養基中至非細胞粘附性96孔培養板（SUMIL0N球形板， SUM口0M0 BAKELITE C0.，LTD.)的每個孔中1.2X104個細胞，W允許快速形成團聚體，將其 在37°C，5%C02進行培養。然后使用的無血清培養基是作為補充有10%KSR、450iiM 1--硫 代甘油、lx化學成分確定的脂質濃縮物和Y27632的F-12培養基和IMDM培養基的1:1混 合物的無血清培養基。在自開始懸浮培養起的第6天W1.5nM的終濃度加入BMP4，并且繼續 懸浮培養。每3天將孔中一半量的培養基換成不含作用于BMP信號轉導途徑的物質的上述培 養基。
[0248] 在自懸浮培養開始起的第18天將運樣制得的包含視網膜組織的細胞團聚體在補 充有化M CHIR9902U作用于Wnt信號途徑的物質)和扣M S呪402(抑制FGF信號途徑的物質） 的無血清培養基中培養6天，即，到從懸浮培養開始起的第24天。然后所用的無血清培養基 是作為補充有1%N2補充劑（Invitrogen)的DMEM/F-12培養基的無血清培養基。
[0249] 將在自懸浮培養開始起第24天得到的細胞團聚體在不含作用于Wnt信號途徑的物 質和抑制FGF信號途徑的物質的含血清培養基(所述培養基是補充有10%胎牛血清、1%N2 補充劑、〇.5iiM視黃酸和lOOiiM牛橫酸的DMEM/F-12培養基）中在40%化條件下進一步懸浮培 養11天，即，至從懸浮培養開始起的第35天，并且在巧光顯微鏡下觀察得到的細胞團聚體。 圖1顯示了細胞團聚體（自懸浮培養開始起的第35天)的相差圖像(A)和GFP巧光圖像(B)。發 現在細胞團聚體中形成Rax基因表達陽性的神經視網膜和色素沉積的視網膜色素上皮，并 且在其邊緣部分形成了睫狀緣區樣結構（圖中箭頭）。
[0250] 實施例2:由多能干細胞制備包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體
[0251] 將通過實施例1所述的方法制備的單個分散的敲入RAX::GFP的人ES細胞懸浮在 lOOiil無血清培養基中至在非細胞粘附性96孔培養板(SUMIL0N球形板，SUmTOMO BA邸LITE CO.，LTD.)的每個孔中9 X 103個細胞，并且在37°C，5%C〇2懸浮培養。然后所用的無血清培養 基是通過向G-MEM培養基中加入20%KSR、0.1 mM 2-琉基乙醇、ImM丙酬酸、20測Y27632和化 M IWRle(抑制Wnt信號途徑的物質）而得到的無血清培養基。在懸浮培養過程中，在從懸浮 培養開始起第2天，加入每體積1/100的量的GFR Matrigel?(BD Biosciences)。在從懸浮培 養開始起第12天，加入每體積1/10的量的胎牛血清和lOOnM SAG(作用于化h信號途徑的物 質），并且進行懸浮培養，直至從懸浮培養開始起的第18天。
[0252] 將在自懸浮培養開始起第18天的包含視網膜組織的細胞團聚體在補充了化M CHIR9902U作用于Wnt信號途徑的物質）的無血清培養基中懸浮培養2天，即，直至從懸浮培 養開始起的第20天。然后所用的無血清培養基是作為補充了1%N2補充劑（Invitrogen)的 DMEM/F-12培養基的無血清培養基。
[0253] 將在自懸浮培養開始起第20天的細胞團聚體在不含作用于Wnt信號途徑的物質的 含血清培養基（作為補充了 10%胎牛血清、1%N2補充劑、0.5iiM視黃酸和lOOiiM牛橫酸的 DMEM/F-12培養基的培養基）中在40%化條件下進一步懸浮培養40天，即，直至從懸浮培養 開始起的第60天，并且在巧光顯微鏡下觀察得到的細胞團聚體。圖2顯示了細胞團聚體（自 懸浮培養開始起的第60天）的相差圖像(A)和GFP巧光圖像(B)。發現在細胞團聚體中形成 Rax基因表達陽性的神經視網膜和色素沉積的視網膜色素上皮，并且在其邊緣部分形成了 睫狀緣區樣結構（圖中箭頭）。
[0254] 實施例3:由多能干細胞制備包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體和標志物表達分 析
[0255] 將通過實施例1所述的方法制備的在自懸浮培養開始起的第24天的細胞團聚體在 不含作用于Wnt信號途徑的物質和抑制FGF信號途徑的物質的含血清培養基（作為補充了 10 %胎牛血清，1 %N2補充劑，0.5咖視黃酸，和lOOiiM牛橫酸的DMEM/F-12培養基的培養基） 中在40%化條件下進一步懸浮培養39天，即，直至自懸浮培養開始起的第63天，并且將在自 懸浮培養開始起的第63天得到的細胞團聚體用4%低聚甲醒固定，W制備冷凍切片。關于制 備的冷凍切片，進行下述的免疫染色：ChxlO(其是一種神經視網膜先祖細胞標志物）（圖 3A)，0txl (其是一種睫狀緣區標志物）（圖3B)，RdhlO(其是一種睫狀緣區標志物）（圖3C)， 化x(其是一種光感受器細胞標志物）（圖3D)，或化J1(其是一種神經細胞(包括神經節細胞） 的標志物）（圖3E)。發現在細胞團聚體中形成了化xlO陽性的（圖3A)、化XI陽性的（圖3B)和 R化10陽性的（圖3C)睫狀緣區樣結構（圖中箭頭），睫狀緣區樣結構（圖中箭頭)是Crx陰性的 (圖3D)和化J1陰性的（圖3E)。
[0256] 將由在自懸浮培養開始起第63天的細胞團聚體制備的上述冷凍切片針對SSEA-1 進行免疫染色。發現，在上述細胞團聚體中，SSEA-1在睫狀緣區樣結構中局部表達（圖3F)。 在SSEA-1陽性細胞中沒有觀察到色素沉積。
[0257] 從上述結果，發現在自懸浮培養開始起第63天在上述細胞團聚體中包含的睫狀緣 區樣結構中存在無色素沉積的化xlO陽性的、Otxl陽性的、R化10陽性的、Crx陰性的、Tujl陰 性的和SSEA-1陽性的細胞。
[0258] 實施例4:從包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體分離睫狀緣區樣結構
[0259] 將通過實施例1所述的方法制備的在自懸浮培養開始起第24天的細胞團聚體在不 含作用于Wnt信號途徑的物質和抑制FGF信號途徑的物質的含血清培養基(作為補充了 10% 胎牛血清、1 %N2補充劑、0.5咖視黃酸和lOOiiM牛橫酸的DMEM/F-12培養基的培養基）中在 40 %化條件下懸浮培養66天，即，直至從懸浮培養開始起的第90天。在用巧光立體顯微鏡觀 察下，通過使用解剖刀和綴子，從在自懸浮培養開始起的第90天得到的細胞團聚體上分別 切下Rax陽性的神經視網膜區和存在于神經視網膜和視網膜色素上皮的邊界部分的睫狀緣 區樣結構。
[0260] 將得到的神經視網膜區和睫狀緣區樣結構分別分散在包含木瓜蛋白酶的分散液 (神經細胞分散液，SUM口0M0 BA邸LITE)中，制備細胞懸浮液。在細胞存活的同時，將各細胞 懸浮液用巧光標記的抗-SSEA-1抗體(抗-SSEA1，切3綴合的；Chemicon)免疫染色，并且通過 巧光顯微鏡觀察。將表達的GFP的巧光用作Rax基因表達的指標，并且將在上述抗-SSEA-1抗 體中的切3的巧光用作SSEA-1表達的指標。結果顯示在圖4中。在上述從神經視網膜區制備 的細胞懸浮液中，Rax陽性的和SSEA-1陰性的細胞的比例為約80 %，Rax陽性的和SSEA-1陽 性的細胞的比例為約10%，Rax陰性的細胞為約10% (圖4A，B)。在從睫狀緣區樣結構制備的 上述細胞懸浮液中，Rax陽性的和SSEA-1陰性的細胞的比例為約30%，Rax陽性的和SSEA-1 陽性的細胞的比例為約50%，Rax陰性的細胞為約20% (圖4C，D)。發現可W通過手術從所述 細胞團聚體切下睫狀緣區樣結構而純化包含在前述細胞團聚體中的Rax陽性的和SSEA-1陽 性的細胞。
[0261] 實施例5:分析包含在含有睫狀緣區樣結構的細胞團聚體中的Rax陽性的和SSEA-1 陽性的細胞中的色素沉積
[0262] 通過與實施例4的方法類似的方法，在巧光立體顯微鏡的觀察下，使用解剖刀和綴 子，同時從在自懸浮培養開始起第90天和通過實施例4所述的方法制備的細胞團聚體上切 下視網膜色素上皮和睫狀緣區樣結構。
[0263] 將得到的視網膜色素上皮和睫狀緣區樣結構通過與實施例4的方法類似的方法分 散在包含木瓜蛋白酶的分散液中，W產生細胞懸浮液。在細胞存活時，將得到的細胞懸浮液 用巧光標記的抗-SSEA-1抗體(抗-SSEAl，Cy3綴合的；化emicon)免疫染色，并且通過巧光顯 微鏡觀察。結果顯示在圖5中。在SSEA-1陽性的（圖5A，箭頭)和Rax陽性的細胞（圖5B，箭頭） (圖5C，箭頭）中沒有觀察到色素沉積。
[0264] 實施例6:由包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體形成視網膜球體
[0265] 將通過實施例1的方法制備的在自懸浮培養開始起的第24天的細胞團聚體在不含 作用于Wnt信號途徑的物質和抑制FGF信號途徑的物質的含血清培養基(作為補充了 10%胎 牛血清、1 % N2補充劑、0.5測視黃酸和1 OOiiM牛橫酸的DMEM/F-12培養基的培養基）中在40 % 化條件下進一步懸浮培養39天，即，直至從懸浮培養開始起的第63天。將得到的在自懸浮培 養開始起的第63天的細胞團聚體通過與實施例4的方法類似的方法分散在包含木瓜蛋白酶 的分散液中，W產生細胞懸浮液。將包含在得到的細胞懸浮液中的細胞W lx 105個細胞/ml 的細胞密度在無血清培養基（其是補充了bFGF(20ng/ml)、EGF(20ng/ml)、肝素（5iig/ml)、 B27 (50倍稀釋）的DMEM/F-12培養基）中懸浮培養10天。結果，形成球形細胞團聚體(視網膜 球體）。發現在自懸浮培養開始起的第63天的上述細胞團聚體包含具有增殖能力的細胞。
[0266] 將得到的視網膜球體用4%低聚甲醒固定，使用GFP的表達作為指標，檢驗Rax基因 的表達，通過免疫染色檢驗化xlO和SSEA-1的表達。結果顯示在圖6中。發現形成前述視網膜 球體的細胞中約90 %是Rax陽性的（圖6A)和化X10陽性的（圖6B )，即，表達視網膜先祖細胞 標志物和神經視網膜先祖細胞標志物的細胞。上述視網膜球體包含約40%的Rax陽性的（圖 6C)和SSEA-1陽性的（圖6D)細胞。
[0267] 在上述培養物實例中，由在作為起始材料的上述細胞懸浮液中包含的1至約10個 細胞形成包含約50-500個細胞的視網膜球體。因此，由包含在上述細胞懸浮液中的1至約10 個細胞形成約20-200個Rax陽性的和SSEA-1陽性的細胞。發現，由上述包含睫狀緣區樣結構 的細胞團聚體得到的細胞的懸浮培養可W有效地產生Rax陽性的和SSEA-1陽性的細胞。
[0268] 實施例7:從由包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體分離的睫狀緣區樣結構形成視 網膜球體
[0269] 將通過實施例1所述的方法制備的在自懸浮培養開始起第24天的細胞團聚體在不 含作用于Wnt信號途徑的物質和抑制FGF信號途徑的物質的含血清培養基(作為補充了 10% 胎牛血清、1 %N2補充劑、0.5咖視黃酸和lOOiiM牛橫酸的DMEM/F-12培養基的培養基）中在 40%化條件下進一步懸浮培養46天，即，直至從懸浮培養開始起的第70天。在用巧光立體顯 微鏡觀察下，通過使用解剖刀和綴子，從在自懸浮培養開始起的第70天的細胞團聚體上分 別切下神經視網膜區和睫狀緣區樣結構。
[0270] 將得到的神經視網膜區和睫狀緣區樣結構通過與實施例4的方法類似的方法各自 分散在包含木瓜蛋白酶的分散液中，W產生細胞懸浮液。將包含在各細胞懸浮液中的細胞 W1000個細胞/孔(5xl03個細胞/ml)接種在用無血清培養基(其是補充了 bFGF(2化g/ml)、 EGF(20ng/ml)、肝素(5iig/ml)、B27(50-倍稀釋的）的DMEM/F-12培養基)低粘附性處理的平 底96孔培養皿（由Nunc制造）中，并且在37°C懸浮培養10天，W形成視網膜球體。發現所形成 的視網膜球體是Rax陽性的（圖7B)并且沒有色素沉積（圖7A)。形成的視網膜球體(原代視網 膜球體)的數目和尺寸(直徑)顯示在圖7C和D中。發現上述神經視網膜區和睫狀緣區樣結構 包含具有自我復制能力的細胞。與從神經視網膜區（NR)得到的細胞相比，從睫狀緣區樣結 構（CMZ)得到的細胞表現出更高的視網膜球體形成效率（圖7C)。發現與從神經視網膜區 (NR)得到的細胞相比，從睫狀緣區樣結構(CMZ)得到的細胞具有更大尺寸的形成的視網膜 球體（圖7D)。前述由睫狀緣區樣結構形成的視網膜球體包含Rax陽性的和SSEA-1陽性的細 胞。發現懸浮培養由從上述細胞團聚體分離的睫狀緣區樣結構得到的細胞可W有效地產生 Rax陽性的和SSEA-1陽性的細胞。
[0271] 制備由通過分散神經視網膜區得到的細胞形成的前述視網膜球體的細胞懸浮液， 和由通過分散睫狀緣區樣結構得到的細胞形成的上述視網膜球體的細胞懸浮液，并且通過 實施例6所述的方法培養，W形成次生性視網膜球體。形成的視網膜球體的數目和尺寸(直 徑）顯示在圖7E和F中。發現上述原代視網膜球體包含具有自我復制能力的細胞。與源自神 經視網膜區（NR)的細胞相比，源自睫狀緣區樣結構（CMZ)的細胞表現出更高的次生性視網 膜球體形成效率（圖7E)。發現，與從神經視網膜區(NR)得到的細胞相比，從睫狀緣區樣結構 (CMZ)得到的細胞具有更大尺寸的形成的次生性視網膜球體（圖7F)。由源自睫狀緣區樣結 構的細胞形成的上述次生性視網膜球體包含Rax陽性的和SSEA-1陽性的細胞。發現通過重 復上述視網膜球體形成培養可W擴增Rax陽性和SSEA-1陽性的細胞。
[0272] 實施例8:從由包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體分離的睫狀緣區樣結構收集 SSEA-1陽性的細胞
[0273] 將通過實施例1的方法制備的在自懸浮培養開始起的第24天的細胞團聚體在不含 作用于Wnt信號途徑的物質和抑制FGF信號途徑的物質的含血清培養基(作為補充了 10%胎 牛血清、1 % N2補充劑、0.5測視黃酸和1 OOiiM牛橫酸的DMEM/F-12培養基的培養基）中在40 % 化條件下進一步懸浮培養36天，即，直至從懸浮培養開始起的第60天。從自懸浮培養開始起 的第60天得到的細胞團聚體上切下睫狀緣區樣結構，通過與實施例4相似的方法分散在包 含木瓜蛋白酶的分散液中，W產生細胞懸浮液。在細胞存活時，將得到的細胞懸浮液用巧光 標記的抗-SSEA-1抗體(SSEA1-APC，由抓制備)免疫染色，并且通過細胞分選儀(ARIA2,由抓 制造)進行FACS分析。結果顯示在圖8中。發現包含在前述細胞懸浮液中的細胞中約50%是 Rax陽性的和SSEA-1陽性的（圖8A)。發現具有約50%的純度的Rax陽性的和SSEA-1陽性的細 胞可W通過從上述細胞團聚體上切下前述睫狀緣區樣結構而制備。
[0274] 使用細胞分選儀(ARIA2,由抓制造），可W從上述細胞懸浮液中分離Rax陽性的和 SSEA-1陽性的細胞（圖8A，Q2似及Rax陰性的和SSEA-1陽性的細胞（圖8A，Q4)。收集Rax陽性 的和SSEA-1陽性的細胞級分(級分1)與Rax陰性的和SSEA-1陽性的細胞級分(級分2)，并且 通過FACS分析。發現，級分1中包含的細胞中有87 %是Rax陽性的和SSEA-1陽性的（圖8B)，并 且級分2中包含的細胞中有82 %是Rax陽性的和SSEA-1陰性的（圖8C)。發現，可W通過從包 含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體收集前述睫狀緣區樣結構并且將其分散在其中，并從所得 到的細胞懸浮液中收集SSEA-1陽性細胞而制備具有約87%的純度的Rax陽性的和SSEA-1陽 性的細胞。
[0275] 實施例9:從由包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體分離的睫狀緣區樣結構收集 SSEA-1陽性細胞和由所收集的細胞形成視網膜球體
[0276] 通過按照實施例7所述的方法培養按照實施例8的方法用細胞分選儀分選的Rax陽 性的和SSEA-1陽性的細胞級分和Rax陽性的和SSEA-1陰性的細胞級分中的每種來形成視網 膜球體。所形成的視網膜球體是Rax陽性的（圖9B)，并且沒有色素沉積（圖9A)。形成的視網 膜球體的數目和尺寸(直徑）顯示在圖9C和D中。發現，與Rax陽性的和SSEA-1陰性的細胞級 分相比，由Rax陽性和SSEA-1陽性的細胞級分可更高的效率形成視網膜球體（圖9C)。發 現，與Rax陽性和SSEA-1陰性的細胞相比，由Rax陽性和SSEA-1陽性的細胞可W形成具有更 大尺寸的視網膜球體(圖9D)。此外，觀察到由Rax陽性和SSEA-1陽性的細胞形成的視網膜球 體包含80 % W上的Rax陽性和SSEA-1陽性的細胞。發現，由上述方法制備的Rax陽性和SSEA- 1陽性的細胞比Rax陽性和SSEA-1陰性的細胞包含更高數量的具有自我復制能力的細胞，并 且可W通過視網膜球體形成培養擴增Rax陽性和SSEA-1陽性的細胞。
[0277] 實施例10:通過加入ROCK抑制劑提高視網膜球體產生效率
[0278] 將通過實施例1的方法制備的在自懸浮培養開始起的第24天的細胞團聚體在不含 作用于Wnt信號途徑的物質和抑制FGF信號途徑的物質的含血清培養基(作為補充了 10%胎 牛血清、1 % N2補充劑、0.5測視黃酸和1 OOiiM牛橫酸的DMEM/F-12培養基的培養基）中在40 % 化條件下進一步懸浮培養39天，即，直至從懸浮培養開始起的第63天。將得到的在自懸浮培 養開始起的第63天的細胞團聚體通過與實施例4的方法類似的方法分散在包含木瓜蛋白酶 的分散液中，W產生細胞懸浮液。將包含在得到的細胞懸浮液中的細胞W lx 105個細胞/ml 的細胞密度在無血清培養基（其是補充了bFGF(20ng/ml)、EGF(20ng/ml)、肝素（5iig/ml)、 B27(50倍稀釋）的DMEM/F-12培養基）中在存在或不存在lOiiM Y-27632(ROCK抑制劑）的條件 下懸浮培養10天。結果，形成球形的細胞團聚體（視網膜球體）。在該情形中，在不存在Y- 27632的條件下，形成1300個視網膜球體，而在存在Y-27632的條件下形成1976個視網膜球 體。即，發現加入ROCK抑制劑提高了視網膜球體形成效率。
[0279] 實施例11:由視網膜球體產生光感受器細胞
[0280] 通過實施例7所述的方法，由通過實施例4所述的方法制備的睫狀緣區樣結構形成 原代視網膜球體和次生性視網膜球體。將得到的原代視網膜球體和次生性視網膜球體各自 接種在用聚-D-賴氨酸和層粘連蛋白包被的細胞培養皿中，在無血清培養基（作為補充了 bFGF(20ng/ml)、EGF(20ng/ml)、B27 (50-倍稀釋的）的DMEM/F-12培養基的培養基）中培養4 天，并且在含血清培養基(作為補充了 10%胎牛血清、B27、0.5iiM視黃酸aOOiiM牛橫酸和lOii 1歴?1'的0161/。-12培養基的培養基）中在40%化，5%0)2,37°(：的條件下培養10天。將得到 的細胞用低聚甲醒固定，并且觀察顯示Rax基因的表達的GFP巧光圖像和用針對Crx(其是一 種光感受器細胞標志物)的抗體的免疫染色圖像。結果顯示在圖10中。發現可W由上述原代 視網膜球體和次生性視網膜球體分化出Rax陽性（圖10A和C)和Crx陽性的（圖10B和D)光感 受器細胞。
[0281] 實施例12:由視網膜球體產生無長突細胞、神經節細胞
[0282] 通過實施例7所述的方法，由通過實施例4所述的方法制備的睫狀緣區樣結構形成 原代視網膜球體和次生性視網膜球體。將得到的次生性視網膜球體接種在用聚-D-賴氨酸 和層粘連蛋白包被的細胞培養皿中，在無血清培養基（作為補充了 bFGF( 20ng/ml)、EGF (20ng/ml)、B27 (50-倍稀釋的）的DMEM/F-12培養基的培養基）中培養2天，并且在含血清培 養基(作為補充了 10%胎牛血清、B27、0.5iiM視黃酸aOOiiM牛橫酸和lOiiM DAPT的DMEM/F-12 培養基的培養基）中在40%化，5%C02,37°C的條件下培養10天。將得到的細胞用低聚甲醒固 定，并且觀察顯示Rax基因的表達的GFP巧光圖像（圖11B)、用針對巧視網膜蛋白（其是一種 無長突細胞標志物）的抗體的免疫染色圖像（圖11A)和各自使用針對化x6與化JU其是神經 節細胞的共陽性標志物）的抗體的免疫染色圖像(圖11C和D)。結果顯示在圖11中。發現可W 由上述次生性視網膜球體分化出巧視網膜蛋白陽性的無長突細胞（圖11A，B)W及Pax6和 化J1陽性的神經節細胞(圖11C，D)。
[0283] 實施例13:從由SSEA1陽性細胞形成的視網膜球體產生光感受器細胞、無長突細胞 和神經節細胞
[0284] 通過由實施例7所述的方法培養按照實施例8所述的方法用細胞分選儀分選的Rax 陽性和SSEA-1陽性細胞級分，由通過實施例4所述的方法制備的睫狀緣區樣結構形成視網 膜球體。將得到的視網膜球體各自接種在用聚-D-賴氨酸和層粘連蛋白包被的細胞培養皿 中，在無血清培養基（作為補充了bFGF(20ng/ml)、EGF(20ng/ml)、B27 (50-倍稀釋的）的 DMEM/F-12培養基的培養基）中培養2天，并且在含血清培養基(作為補充了 10%胎牛血清、 B27、0.5礎視黃酸，lOOiiM牛橫酸和10咖DAPT的DMEM/F-12培養基的培養基）中在40%〇2， 5%C02,37°C的條件下培養10天。將得到的細胞用低聚甲醒固定，并且觀察顯示Rax基因的 表達的GFP巧光圖像(圖12B，F)和使用針對W下各項的抗體的免疫染色圖像:一種光感受器 細胞標志物，Crx(圖12A)，一種無長突細胞標志物，巧視網膜蛋白（圖12E)，作為神經節細胞 的共陽性標志物的化x6和化J1(圖12C和D)。結果顯示在圖12中。發現可W由上述視網膜球 體分化出Rax陽性和陽性光感受器細胞（圖12A，B，箭頭），巧視網膜蛋白陽性的無長突細 胞(圖12E，F，箭頭似及化x6與l\ijl陽性的神經節細胞(圖12C，D，箭頭）。
[0285] 實施例14:從由包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體分離的睫狀緣區樣結構收集 SSEA-1陽性細胞和由所收集的細胞形成視網膜球體
[0286] 將通過實施例1的方法制備的在自懸浮培養開始起的第24天的細胞團聚體在不含 作用于Wnt信號途徑的物質和抑制FGF信號途徑的物質的含血清培養基(作為補充了 10%胎 牛血清、1 % N2補充劑、0.5測視黃酸和1 OOiiM牛橫酸的DMEM/F-12培養基的培養基）中在40 % 化條件下進一步懸浮培養55天，即，直至從懸浮培養開始起的第79天。從得到的在自懸浮培 養開始起的第79天的細胞團聚體上切下睫狀緣區樣結構，并且通過與實施例4的方法類似 的方法分散在包含木瓜蛋白酶的分散液中，W產生細胞懸浮液。在細胞存活時，將得到的細 胞懸浮液(未分選的級分）用磁珠標記的抗-SSEA-1抗體（由Miltenyi Biotec制備)免疫染 色，并且用磁力細胞分離裝置(MACS,由Miltenyi Biotec制造川欠集SSEA-1陽性細胞級分和 SSEA-1陰性細胞級分。
[0287] 將得到的SSEA-1陽性細胞級分和SSEA-1陰性細胞級分各自通過實施例8所述的方 法通過FACS進行分析，并且發現包含在SSEA-1陽性細胞級分中的細胞有64 %是SSEA-1陽性 細胞，而包含在SSEA-1陰性細胞級分中的細胞有5 %是SSEA-1陽性細胞。發現從包含睫狀緣 區樣結構的細胞團聚體收集前述睫狀緣區樣結構，并且將它們分散，然后從得到的細胞懸 浮液收集SSEA-1陽性細胞級分，能夠導致產生具有約64%的純度的SSEA-1陽性細胞。
[0288] 通過實施例7所述的方法，培養前述未分選的級分、SSEA-1陽性細胞級分和SSEA-1 陰性細胞級分，形成視網膜球體。所形成的視網膜球體是Rax陽性的（圖13B)，并且無色素沉 積（圖13A)。形成的視網膜球體的數目顯示在圖13C中。發現，與由未分選的級分形成的視網 膜球體的數目（圖13C，"未分選的"）相比，由SSEA-1陰性細胞級分形成的視網膜球體的數目 較少（圖13C，"SSEAr")，由SSEA-1陽性細胞級分形成的視網膜球體的數目較高（圖13C， "SSEA1"'）。發現，與由SSEA-1陰性細胞級分形成的視網膜球體相比，由SSEA-1陽性細胞級 分形成的視網膜球體具有更大的尺寸。觀察到，由SEA-1陽性細胞級分形成的視網膜球體包 含80%W上的Rax陽性和SSEA-1陽性細胞。
[0289] 發現，與SSEA-1陰性細胞級分相比，由上述方法產生的SSEA-1陽性細胞級分包含 更高數目的具有自我復制能力的細胞。
[0290] 本申請基于在日本提交的專利申請號2014-006464(申請日：2014年1月17日），所 述申請的內容完整地結合于此。
[0巧1][工業實用性]
[0292]根據本發明，可W高純度有效地制備具有分化成視網膜細胞的潛能和自我復制能 力的組織干細胞。
【主權項】
1. 用于制備由多能干細胞誘導分化的睫狀緣區干細胞的方法，其包括下述步驟（1)或 步驟(2)或兩者： (1) 懸浮培養獲得自由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體的細 胞由此獲得視網膜球體的步驟;和 (2) 從獲得自由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體的細胞收集 階段特異性胚胎抗原1陽性細胞的步驟。2. 根據權利要求1所述的方法，其中進行步驟（1)，并且其中所述"獲得自由多能干細胞 誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體的細胞"是通過下述方式獲得的細胞： 分散由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體，或 分散分離自所述細胞團聚體的睫狀緣區樣結構。3. 根據權利要求1所述的方法，其中進行步驟(2)，并且其中所述"獲得自由多能干細胞 誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體的細胞"是通過下述方式獲得的細胞： 分散由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體，或 分散分離自所述細胞團聚體的睫狀緣區樣結構。4. 根據權利要求1所述的方法，其中進行步驟（1)，接著進行步驟(2)，并且其中步驟（1) 中"獲得自由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體的細胞"是通過下 述方式獲得的細胞： 分散由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體，或 分散分離自所述細胞團聚體的睫狀緣區樣結構;并且 步驟(2)中"獲得自由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體的細 胞"是通過分散步驟(1)中獲得的視網膜球體獲得的細胞。5. 根據權利要求1所述的方法，其中進行步驟(2)，接著進行步驟（1)，并且其中步驟(2) 中"獲得自由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體的細胞"是通過下 述方式獲得的細胞： 分散由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體，或 分散分離自所述細胞團聚體的睫狀緣區樣結構;并且 步驟（1)中"獲得自由多能干細胞誘導分化的包含睫狀緣區樣結構的細胞團聚體的細 胞"是通過分散步驟(2)中收集的細胞獲得的細胞。6. 根據權利要求1、3、4和5中任一項所述的方法，其中所述階段特異性胚胎抗原-1陽性 細胞還是Rax陽性的。7. 根據權利要求1、3、4、5和6中任一項所述的方法，其中所述階段特異性胚胎抗原-1陽 性細胞是無色素沉著的。8. 根據權利要求1、2、4和5中任一項所述的方法，其中步驟（1)中的懸浮培養在無血清 培養基或含血清培養基中進行，所述無血清培養基或含血清培養基各自含有選自由下述組 成的組的一種或多種物質：作用于FGF信號轉導途徑的物質和作用于EGF信號轉導途徑的物 質。9. 根據權利要求8所述的方法，其中所述無血清的培養基或含血清培養基進一步包含 ROCK抑制劑。10. 根據權利要求1、2、4、5、8和9中任一項所述的方法，其中所述視網膜球體是無色素 沉著的。11. 根據權利要求1-10中任一項所述的方法，其中所述多能干細胞是靈長類動物多能 干細胞。12. 根據權利要求1-11中任一項所述的方法，其中所述多能干細胞是人多能干細胞。13. 制備視網膜層特異性神經元的方法，所述方法包括下述步驟:在存在一種或多種選 自由Notch信號抑制物質、類視黃醇和牛磺酸組成的組的物質的情況下，培養通過根據權利 要求1-12中任一項所述的方法獲得的睫狀緣區干細胞。14. 用于由視網膜組織障礙導致的疾病的治療劑，所述治療劑包含通過根據權利要求 1-13中任一項所述的方法制備的睫狀緣區干細胞或視網膜層特異性神經元。15. 用于治療由視網膜組織障礙導致的疾病的方法，所述方法包括將有效量的通過根 據權利要求1-13中任一項所述的方法制備的睫狀緣區干細胞或視網膜層特異性神經元移 植到需要所述移植的受試者中。16. 通過根據權利要求1-13中任一項所述的方法制備的睫狀緣區干細胞或視網膜層特 異性神經元，其用于治療由視網膜組織障礙導致的疾病。17. 用于評價毒性或藥效的試劑，所述試劑包含通過根據權利要求1-13中任一項所述 的方法制備的睫狀緣區干細胞或視網膜層特異性神經元。18. 評價測試物質的毒性或藥效的方法，所述方法包括使通過根據權利要求1-13中任 一項所述的方法制備的睫狀緣區干細胞或視網膜層特異性神經元與所述物質接觸，并且測 定所述物質對所述細胞的影響。
【文檔編號】C12N5/074GK106062182SQ201480076631
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2014年10月16日
【發明人】桑原篤, 笹井芳樹
【申請人】住友化學株式會社, 國立研究開發法人理化學研究所