用于純化多糖的新的下游方法
【專利摘要】本發明涉及用于純化細菌多糖的新方法。其是用于從腦膜炎奈瑟茵(Neisseria meningitidis)血清組C(Men?C)多糖中去除雜質的高效且可擴展的方法，所述多糖能夠以衍生化形式原樣使用或與其他分子相連接以用于制備疫苗(更特別地，針對腦膜炎奈瑟茵感染的綴合物疫苗)。
【專利說明】
用于純化多糖的新的下游方法
技術領域
[0001]本發明設及用于純化腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)多糖的快速方法。 更具體地，本發明設及制備腦膜炎奈瑟菌血清組C型(N.meningitidis serogroup typeC， MenC)多糖的方法，所述多糖能夠原樣使用或能夠被衍生化或與其他血清組相組合W制備 針對腦膜炎奈瑟菌的疫苗。
【背景技術】
[0002] 多糖(尤其是抗原性多糖)被用于制備疫苗。含有一種、兩種或更多種多糖及其綴 合物的單價、二價和多價疫苗市售可得，用于預防由多種微生物（例如肺炎鏈球菌 (Sheptococcus pneumoniae)、流感嗜血桿菌（Haemophilus inf luenzae)和腦膜炎奈瑟 菌）引起的某些疾病或感染，并且已證明在預防各疾病中有顯著程度的價值。引進疫苗沛兒 (Prevenar)后數年間收集的監測數據已清楚地證明，美國嬰兒中的侵襲性肺炎球菌疾病如 所預期地降低。盡管進行了若干關于運些多糖及綴合物的研究，但持續性研究證明，在行業 中總是存在改善該多糖產率W及質量(純度)的需求。
[0003] 腦膜炎被認為是全球性的威脅，并且該疾病負擔仍然保持在公共健康的首要位 置。腦膜炎的臨床定義為腦膜(腦的膜)的炎癥。如未治療，該疾病可導致致命性結果。已經 確定了腦膜炎奈瑟菌的總共十=個血清組，并且在運十=個血清組中的六個血清組(A、B、 C、W135、X和Y)為引發全球性的感染主要原因。腦膜炎奈瑟菌具有廣泛范圍的臨床表現，范 圍從短暫的輕度喉痛到致命性的腦膜炎或腦膜炎球菌敗血癥。腦膜炎和敗血癥為該疾病最 常見的表現。
[0004] 從許多研究發現中收集的證據限定了多糖綴合物疫苗的免疫原性方面。此外，有 研究論文和專利描述了Men C芙膜多糖的生產和純化，但其中沒有一篇限定了穩健、可擴展 且可重復的時間流程(time line)極度縮短的純化方法。
[0005] 純化Men C的生產是與載體蛋白質的有效綴合及其作為綴合物疫苗開發的首要需 求。Men C的培養和純化的成本通常很高，并且因為其設及一系列生產和純化步驟而設及較 長的工作時間。多糖生產中一個或更多個步驟的改善將為整體的綴合物疫苗生產帶來顯著 變化，并因此使該方法變得相對成本有效。
[0006] 然而，盡管關于運些多糖有幾項研究已在進行，總是存在為了生產高質量疫苗而 改善該多糖產率和質量/純度的需求。
[0007] 有一些專利描述了用于純化Men-c多糖的方法。描述于美國專利no7,491，517，B2 中的用于WCTAB沉淀Men-C多糖的現有技術已被發現設及在4°C解育過夜。此外，去除污染 物需要使用高成本的酶蛋白酶K。除此W外，該方法還需要用于純化Men-C多糖的凝膠過濾。 所述整個過程需要大量時間用于純化，并且該方法也因酶的使用變得成本很高。
[000引另外，專利申請No.W0 2011/148382 A1描述了制備純芙膜多糖的方法，此方法使 用帶有醇的憐酸侶用于純化流感嗜血桿菌b、腦膜炎奈瑟菌(例如血清組A、C、Y、W-135)的芙 膜多糖和其他產自革蘭氏陰性和革蘭氏陽性微生物的類似芙膜多糖。所述已發表的現有技 術公開的用于多糖純化的時間為16-20小時。
[0009] 另一個專利EP 0658118B1描述了平均時間為16小時的血清組C腦膜炎球菌多糖 (Group C Meningococcal化lysaccha;ride，GCMP)的0-脫乙酷化方法。該方法也要求大量 時間用于純化。
[0010] 目前，用于生產和純化MenC多糖的多種方法都占用相對長的培養和純化時間，并 且也設及使用高成本的酶。盡管運些種類的方法產出純多糖，但它們在按比例擴大(scale- up) 期間會 同時提高生產 成本。
[0011] 此外，上述公開的現有技術教導的方法在低溫中更加高效，從而需要受控的環境， 導致研究和生產中的額外成本。
[0012]發明目的
[0013] 因此，本發明的主要目的是提供用于純化Men C多糖的新方法。
[0014] 本發明的另一目的是提供用于純化Men C多糖同時在非常短的時間內通過簡單、 高效、改進且商業上可擴展的方法清除雜質的快速方法。
[0015] 然而本發明的另一個目的是生產達到相關W冊規格的高質量多糖。
[0016] 發明概述
[0017] 本發明設及用于純化Men C多糖的方法。所述方法描述了新的、迅速、成本有效且 可擴展的方法，其中Men C多糖W顯著縮短的時間純化。
[0018] 本發明所述方法設及選擇免疫活性的細菌菌株，制備用于繁殖所述免疫活性菌株 的培養基，W及接種在甘油膽液培養物中的所選擇的細菌菌株，W及在預設的溫度下W預 設的每分鐘轉速(revolution per minute，rpm)解育最佳時間。所選擇的細菌菌株在發酵 罐中在優化的培養基上培養，并且所述方法繼續將發酵收獲物離屯、W清除發酵液 (fermen化tionbrothJB)中的細胞碎片，隨后通過利用分子量截留膜超濾將FB濃縮。
[0019] 隨后，在高溫下在高濃度堿性溶液存在下，將經超濾濃縮的上清液或經處理的FB 脫乙酷化。使經脫乙酷的粗制多糖經受通過正切流動過濾(Tangential Flow Filhation, TFF)的緩沖液交換。通過疏水相互作用色譜法（hydrophobic interaction chromatography，HIC)將經滲濾脫乙酷化的粗制多糖進一步純化，隨后通過滲濾和濃縮W 獲得最終純化的多糖。特別相關的是，根據本發明的方法包括用堿性溶液處理濃縮的提取 物和/或分離的細菌細胞。除了提取CPS，該堿提取還引起N-乙酷基的脫乙酷化。可通過調整 反應條件使該脫乙酷化的程度變化。隨后從細胞組分中分離所提取的CPSW獲得CPS(優選 通過色譜分離）。
[0020] 該方法展現出優于現有技術的一些優勢，例如提供了制備Men C多糖的新的且快 速的方法。該方法因其降低了步驟總數目且需要單次色譜篩選，所W是成本有效的。另一個 優勢是該方法為整體可擴展的。
[0021] 附圖簡述
[0022] 圖-1描述了用于MenC-PS純化和回收的工藝流程(process flow)。
[0023] 圖-2描述了MenC斗S的HPLC色譜圖。
[0024] 圖-3描述了MenC斗S的NMR譜。
[00劇發明詳述
[0026]如圖1所示，本發明公開了兩個步驟，其已經被優化W使得能夠在更短時間內純化 MenC多糖（MenC polysaccharide，MenC-PS)。
[0027]將細菌多糖的菌株接種于含有細菌生長所需的合適培養基的發酵罐中。在達到最 大光密度后(范圍為8至10,其說明大量的細菌生長），通過添加預先確定濃度的甲醒將其終 止，并獲得所產生的FB。隨后將FB高速離屯、W清除FB中的細胞碎片，隨后利用分子量截留膜 滲濾并濃縮。
[002引將經滲濾和濃縮的具有粗制多糖的FB用化0H在高溫(例如高達80°C )下處理W脫 乙酷化。將粗制多糖用聚酸諷（polyether sulfone，陽S)膜，用milliQ水(milliQ water， MQW)，隨后通過化is HCl緩沖液(pH7.4±0.1)進行濃縮和滲濾。在滲濾后將粗制多糖濃縮 并W 0.22皿濾器過濾。
[0029] 將脫乙酷化的粗制多糖通過疏水相互作用色譜法化1C)技術進一步純化。
[0030] 基于極性差異將混合物中兩種或更多種組分分離是本領域技術人員公知的。例 如，使用疏水相互作用色譜，具有相對較大疏水性的化合物相對于更加親水的化合物在柱 上保留時間更長。相反，使用親水相互作用色譜，親水化合物相對于更疏水的化合物保留在 柱上的時間更長。連續使用運兩種方法允許將相對于目標化合物極性更弱和極性更強的兩 類雜質除去。
[0031] 可將存在于堿性提取試劑中的所提取的WS通過色譜法從來自于細胞組分的雜質 中分離。色譜分離方法的非限制性實例是離子交換（陽離子或陰離子）、親水相互作用、疏水 相互作用或凝膠滲透色譜法。更優選為在苯基瓊脂糖凝膠(phenyl S邱harose)上的疏水相 互作用色譜法化1C)，其會從堿性提取物中除去大多數高分子量、紫外活性的(uv-active) 污染物。芙膜多糖從一開始會被洗脫，而更疏水的蛋白質和核酸會被保留。本發明中的優選 方法是疏水相互作用色譜法。
[0032] 對多糖進行進一步的濃縮和滲濾W促進蛋白質和其他雜質的去除，并且隨后將多 糖樣品用MQW洗涂。
[0033] 隨后進行無菌過濾W獲得圖2和圖3所描述的純化Men C多糖。
[0034] 可從表1中方便地理解W上所使用操作的確證，表1清楚地示出了所純化多糖的規 格滿足WHO標準。
[00對表-1: W下示出所純化的Men-C多糖規格符合W冊規范 [00361
[0037]鑒于本發明的特征化allmark)為新的、迅速且可擴展的純化工藝方案，其可于6± 1小時內完成并且如此生產的PS符合W冊所設標準，因而特別感興趣的觀察結果是純化Men C多糖所需時間顯著少于現有技術中所公開的時間。
[0038] 分析操作：
[0039] 持續監測在不同步驟中所獲得的多糖并分析其純度和產率。已經報道了不同的分 析操作，但優選方案總結如下：
[0040] 通過比色法確定MenC-PS的總唾液酸。該測定基于在100°C下，在鹽酸和銅（II)離 子存在下，唾液酸與間苯二酪反應30分鐘;運導致形成藍紫色絡合物，其表現出在564nm的 強吸光度。該總唾液酸濃度通過使用一系列唾液酸標準所獲得的校準曲線確定 [(Svenne;rholm，1957)]。脂多糖（lipopolysaccha;ride，LPS)使用緊湊且簡單的 EndOSafe&'-PTS?設備確定。蛋白質雜質通過Lowry方法[化OW巧等，1951)]，利用牛血清白 蛋白作為標準并記錄75化m吸光度來確定。核酸(nucleic acids，NA)在260皿評估，并且假 定吸光度為1. 〇A = 50iig/mL來計算該量[(化asch，1990)]。
[0041 ] 化bPRP的相對平均分子大小（Mw)通過利用高效液相色譜化igh-peWormance liquid chromatography，冊LC)來確定（Alliance，Waters)。所使用的柱為PWXレ4000和 PWXkSOOO聯用（Tosoh Bioscience)。此外，一系列f5kD至800kD的短梗霉聚糖（pullulan， Shodex)用作MenC-PS的標準。利用0.1 M硝酸鋼W30分鐘的運行時間、1ml/分鐘的流量進行 該HPLC。通過iH-NMR譜驗證MenC-PS的身份。NMR產生磁敏感的原子核(例如1h)譜。
[0042] 通過與針對每種多糖的參考抗血清組合，從血清學上確定MenC-PS。根據W冊規格 [胖冊，2004]，基于干重確定純度并表征多糖，先將16此斗5凍干并隨后檢測。水分含量被如 此減除，從而獲得精確的干重。凍干塊狀物的水分含量通過來自于Perkin Elmer的熱重分 析儀（Thermo Gravimehic Analyzer，TGA)確定。MenC-PS的分析結果在表-1中給出，并且 其符合WHO的規定。
[0043] 所述Men C多糖可用于制備多糖-蛋白質綴合物疫苗。
[0044] 如上所詳述的本發明多個方面現通過一些非限制性實施例來舉例說明。
[0045] 實施例-1
[0046] 利用陰離子去垢劑Wtris緩沖液和疏水相互作用色譜法化1C)進行多糖純化：
[0047] 經滲濾和濃縮的具有粗制多糖的FB用陰離子去垢劑（例如濃度為0.3 %至0.6 % (w/v)的脫氧膽酸鋼)處理并在50°C至60°C下解育1小時。隨后將其冷卻至低于40°C，隨后將 粗制多糖用0.1m2的聚酸諷(陽S)膜，用6至8倍體積的milliQ水(MQW)濃縮并滲濾。
[004引隨后將粗制多糖用0.5M氨氧化鋼(化0H)在50°C下進行脫乙酷化10小時。隨后將其 冷卻至低于40°C，隨后將粗制多糖同時用6至8倍體積的MQW和20mM Tris HC1緩沖液，利用 0.1 m2的PES膜滲濾并濃縮。隨后該多糖通過疏水相互作用色譜法化1C)(例如苯基瓊脂糖凝 膠6快流速(Fast Flow))進一步純化。最后，將純化的多糖用0.1m2的PES膜、用6至8倍體積 的MQW進行濃縮和滲濾。相應地，W0.22皿濾器進行無菌過濾，并將最終純化的多糖儲存于- 20°C。利用上述方法純化多糖(包括HIC色譜法)所用的總時間為16至18小時。
[0049] 實施例-2:
[0050] 利用陰離子去垢劑W肥陽S(4-(2-徑基乙基)-1-贓嗦乙橫酸)緩沖液 [0化1]和疏水相互作用色譜法化1C)進行多糖純化：
[0052]經滲濾和濃縮的具有粗制多糖的FB用陰離子去垢劑處理（例如濃度為0.3%至 0.6%(w/v)的脫氧膽酸鋼)并在50°C至60°C下解育1小時。隨后將其冷卻至低于40°C，隨后 將粗制多糖用0.W的聚酸諷(陽S)膜，用6至8倍體積的MQW濃縮并滲濾。
[0053] 隨后將粗制多糖用0.5M氨氧化鋼(化0H)在50°C下進行脫乙酷化10小時。隨后將其 冷卻至低于40°C，隨后將粗制多糖同時用6至8倍體積的MQW和含有3M化C1的20mM肥PES緩 沖液，利用0.1m2的PES膜滲濾并濃縮。隨后該多糖通過疏水相互作用色譜法化1C)(例如苯 基瓊脂糖凝膠6快流速)進一步純化。將純化的多糖用0.1m2的PES膜，用6至8倍體積的MQW進 行濃縮和滲濾。隨后，用0.22WI1濾器進行無菌過濾，并將最終純化的多糖儲存于-20°C。利用 上述方法純化多糖(包括HIC色譜法)所用的總時間為16至18小時。
[0054] 實施例-3:
[0055] 利用氨氧化鋼W皿PES(4-(2-^乙基)-1-贓嗦乙橫酸）緩沖液和疏水相互作用色 譜法化1C)進行多糖純化：
[0056] 經滲濾和濃縮的具有粗制多糖的FB用0.8M NaOH在80°C下進行脫乙酷化6小時。隨 后將其冷卻至低于40°C，隨后將粗制多糖同時用6至8倍體積的MQW和含有3M化C1的20mM 肥PES，利用0.1 m2的PES膜滲濾并濃縮。隨后該多糖通過疏水相互作用色譜法化IC)(例如苯 基瓊脂糖凝膠6快流速)進一步純化。將純化的多糖用0.1m2的PES膜，用6至8倍體積的MQW進 行濃縮和滲濾。隨后，W0.22WI1濾器進行無菌過濾，并將最終純化的多糖儲存于-20°C。利用 上述方法純化多糖(包括HIC色譜法)所用的總時間為10至12小時。此外，用上文中所述方法 部分地純化多糖。該方法可需要幾個更多的步驟W完成多糖純化，并且可能不是成本有效 的方法。
[0057] 實施例-4:
[005引利用氨氧化鋼WTris緩沖液和疏水相互作用色譜法化1C)進行多糖純化：
[0059] 經滲濾和濃縮的具有粗制多糖的FB用0.8M NaOH在80°C下進行脫乙酷化6小時。隨 后使其冷卻至低于40°C，隨后將粗制多糖同時用6至8倍體積的MQW和20mM Tris HCI緩沖 液，利用0.1m2的PES膜滲濾并濃縮。隨后該多糖通過疏水相互作用色譜法化1C)(例如苯基 瓊脂糖凝膠6快流速)進一步純化。將純化的多糖用0.1m2的PES膜，用6至8倍體積的MQW進行 濃縮和滲濾。相應地，用0.22WI1濾器進行無菌過濾，并將最終純化的多糖儲存于-20°C。利用 上述方法純化多糖(包括HIC色譜法)所用的總時間為10至12小時。此外，用上文中所述方法 部分地純化多糖。該方法可需要幾個更多的步驟W完成多糖純化，并且可能不是成本有效 的方法。
[0060] 實施例-5:
[0061] 利用氨氧化鋼WTris緩沖液和疏水相互作用色譜法化1C)進行多糖純化：
[0062] 經滲濾和濃縮的具有粗制多糖的FB用1M化0H在75±5°C下進行脫乙酷化2小時。 隨后將脫乙酷化的多糖冷卻至低于40°C的溫度。冷卻之后，將粗制經脫乙酷化多糖用 lOOKDa的PES膜（0.1m2)，用20至25倍體積的MQW、隨后8至10倍體積的Tris HC1緩沖液 (pH7.4±0.1)進行濃縮和滲濾。隨后，用0.22皿的陽S膜(0.1 m2)進行無菌過濾。
[0063] 將經滲濾脫乙酷化的多糖W疏水相互作用色譜法化1C)，通過用苯基瓊脂糖6快流 速(Fast Flow,FF)填裝的XK-16柱，利用色譜系統進一步純化。將該柱用含有20%硫酸錠的 20mM Tris HC1緩沖液(pH7.4±0.1)平衡。該材料W60cm/小時的速度加載，并收集流經的 含有純化多糖的流。最后，用20mM Tris肥1緩沖液(pH 7.4±0)將柱再生，并在20%的乙醇 中保存W備用。將純化的多糖用1 OOKDa的PES膜(0.1 m2)，用6至8倍體積的MQW進行濃縮和滲 濾，并W0.22WI1濾器進行無菌過濾，并將最終純化的多糖儲存于-20°C。純化多糖所用的總 時間為6 ± 1小時，并且該PS質量達到W冊規格要求。
【主權項】
1. 用于純化Men c-多糖的方法，其中所述方法包括以下步驟： (a) 將發酵收獲物離心以使發酵液澄清； (b) 通過超濾濃縮發酵上清液； (c) 脫乙酰化并在高溫下孵育步驟(b)的所述經濃縮上清液； (d) 收集步驟(c)的上清液，并使其經受滲濾和濃縮； (e) 通過色譜法純化步驟(d)的經滲濾上清液； (f) 滲濾并濃縮以獲得純化的多糖； (g) 對所述純化的多糖進行無菌過濾； 其中所述純化方法在6 ± 1小時內迅速完成。2. 如權利要求1(a)所述的方法，其中發酵收獲物的所述離心以4500 Xg至5000 Xg進 行。3. 如權利要求1(b)所述的方法，其中所述超濾通過lOOKDa分子截留膜進行。4. 如權利要求1(c)所述的方法，其中所述脫乙酰化用濃度為1至1.5M的NaOH溶液進行。5. 如權利要求1(c)所述的方法，其中所述溫度為70°C至80°C。6. 如權利要求1(c)所述的方法，其中用于脫乙酰化的總孵育時間為1小時30分鐘至2小 時30分鐘。7. 如權利要求1(d)所述的方法，其中脫乙酰化之后的所述滲濾用Mili-Q水進行20至25 次，隨后用25mM Tris HC1緩沖液進行8至10次。8. 如權利要求1(e)所述的方法，其中所述色譜法為苯基瓊脂糖凝膠6快流速疏水相互 作用色譜法(HIC)。9. 如權利要求1 (f)所述的方法，其中所述滲濾和濃縮用lOOKDa PES膜(0. lm2)，用6至8 倍體積的Mill i-Q水進行。10. 如權利要求1 (g)所述的方法，其中所述無菌過濾用〇. 22μπι PES濾膜進行。
【文檔編號】C08B37/00GK106062006SQ201580010062
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2015年2月24日
【發明人】達溫德·吉爾, 馬諾伊·庫馬爾·奇卡拉, 桑迪普·夏爾馬, 薩爾馬德·哈尼夫, 尼拉伊·喬希
【申請人】默沙東和惠康基金會合資的希勒曼實驗室私人有限公司