3’,5’?環二腺苷酸包合物及其制造方法
【專利摘要】以往，3',5'?環二腺苷酸僅作為冷凍干燥品來提供，通過本發明得到冷凍干燥品以外的固體以及其制造方法。通過在3',5'?環二腺苷酸水溶液中添加酸，使pH降低至pH1～3的工序，可得到3',5'?環二腺苷酸包合物。該制造方法及其簡便，無需特殊的儀器等。
【專利說明】3'，5'-環二腺昔酸包合物及其制造方法 【技術領域】
[0001] 本發明設及作為輔助劑有用的物質3'，5'-環二腺巧酸包合物，W及其制造方法。 【【背景技術】】
[0002] 3'，5'-環二腺巧酸是作為細菌的第二信使被發現的物質。近年來有該物質可誘導 1型干擾素的報道等，作為醫藥品的利用被受期待(非專利文獻1)。 目前，作為3'，5'-環二腺巧酸的制造方法，已知有化學合成法(非專利文獻2、3)，或者 利用來源于芽抱桿菌屬(Bacillus屬)或鏈球菌屬(Streptococcus屬)等的二腺巧酸環化酶 的酶合成法(非專利文獻4、5)，并W冷凍干燥品的形式被提供。 【現有技術文獻】 【非專利文獻】
[0003] 【非專利文獻 l】Science, 328,1703-1705(2010) 【非專利文獻 2】SYNT 肥 SIS，24，4230-4236 (2006) 【非專利文獻3】Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids,32,1-16(2013) 【非專利文獻4】Molecular Cell ,30，167-178(2008) 【非專利文獻5】Nagoya J.Med.Sci. ,73,49-57(2011) 【
【發明內容】
】 【發明所要解決的問題】
[0004] W往3'，5'-環二腺巧酸是作為冷凍干燥品被提供的，冷凍干燥品W外的制備品尚 未已知。但是，冷凍干燥品在其制造過程中需要冷凍干燥，為大量生產而擴大規模自然也存 在限制。 因此，本發明的課題在于，在不使用特殊的裝置和工序的情況下，提供與冷凍干燥品不 同的嶄新的3 '，5 環二腺巧酸的制備品。 【解決問題的技術手段】
[0005] 本發明的發明人等針對與冷凍干燥品不同的3'，5'-環二腺巧酸的制備品進行了 研究。結果新發現，通過在3'，5'-環二腺巧酸水溶液中添加酸使P郵華低至pHl~3運種極其 簡便的方法，可制造與冷凍干燥品具有完全不同的物理性質的3 '，5 環二腺巧酸包合物。 【發明的效果】
[0006] 本發明提供一種與W往的冷凍干燥品完全不同的3'，5'-環二腺巧酸包合物。本發 明的包合物是結晶性物質，操作簡便(例如，無吸濕性且穩定性、溶解性優異等）。另外，本發 明的3 '，5 環二腺巧酸包合物的制造方法不需要制備所需的特殊裝置或者工序，可有效地 大量生產3'，5'-環二腺巧酸。 【【附圖說明】】
[0007] 【圖1】圖1為3'，5'-環二腺巧酸包合物(非結晶性)照片。 【圖2】圖2為3'，5'-環二腺巧酸鋼鹽的冷凍干燥品照片。 【圖3】圖3為3'，5'-環二腺巧酸錠鹽的冷凍干燥品照片。 【圖4】圖4為3'，5'-環二腺巧酸包合物(非結晶性)的熱重測定/差示熱分析結果。 【圖5】圖5為3'，5'-環二腺巧酸鋼鹽的冷凍干燥品的熱重測定/差示熱分析結果。 【圖6】圖6為3'，5'-環二腺巧酸錠鹽的冷凍干燥品的熱重測定/差示熱分析結果。 【圖7】圖7為3'，5'-環二腺巧酸包合物的核磁共振波譜(1?。 【圖8】圖8為3'，5'-環二腺巧酸包合物的核磁共振波譜(i3C)。 【圖9】圖9為3'，5'-環二腺巧酸包合物的核磁共振波譜(3中）。 【圖10】圖10為3 '，5 環二腺巧酸包合物的紅外線吸收光譜。 【圖11】圖11為3'，5'-環二腺巧酸鋼鹽的冷凍干燥品的紅外線吸收光譜。 【圖12】圖12為3'，5'-環二腺巧酸錠鹽的冷凍干燥品的紅外線吸收光譜。 【圖13】圖13為3'，5'-環二腺巧酸包合物(結晶性)照片。 【圖14】圖14為3'，5'-環二腺巧酸包合物(結晶性)的熱重測定/差示熱分析結果。 【圖15】圖15為3'，5'-環二腺巧酸包合物(結晶性)的X射線衍射光譜。 【【具體實施方式】】
[000引本發明提供由W下結構是所示的3'，5'-環二腺巧酸包合物。
[0009] [化學式1]
[0010] 本發明中提到的包合物是指，化合物和溶劑通過弱的相互作用而形成復合體等， 在固化中溶劑起到輔助作用的狀態的固體物，對于包合的形態與固體的結構沒有限制。特 別是，在本發明中使用水作為溶劑，因此在沒有特殊記載的情況下，本發明的包合物是指與 水的包合物。此外，本發明的包合物包括結晶性物質W及非結晶性物質。
[0011] 本發明的3 '，5 環二腺巧酸包合物可通過在3 '，5 環二腺巧酸水溶液中添加酸 使抑降低至抑1~3而得到。
[0012] 為獲得本發明的包合物所利用的3'，5'-環二腺巧酸可通過酶合成法或者化學合 成法等已知的方法合成，優選通過酶合成法的合成的物質。在進行酶合成法時，遵循已知的 方法即可，例如，可利用非專利文獻4、5中記載的方法。反應后，在反應液中生成的3'，5'-環 二腺巧酸可通過使用了活性炭或者離子交換樹脂等的通常的色譜處理法進行分離純化。
[0013] 為了獲得本發明的包合物，在3'，5'-環二腺巧酸水溶液中添加酸，使抑降低至抑1 ~3，優選降低至pHl. 5~2.0即可。作為所使用的酸，可調整到上述pH的酸即可，具體可舉例 為，鹽酸、硫酸、硝酸等無機酸。此外，為了防止因加酸過快而導致的非結晶化或者結晶急劇 析出，優選緩慢添加。
[0014] 另外，包合物的獲得率低時，也可通過對上述包合物的濾液進反復進行數次相同 的處理而再次獲得包合物。
[0015] 此外，本發明的包合物可按照含有W下工序的方法獲得：（1)在3'，5'-環二腺巧酸 水溶液中添加酸，使抑降低至抑1~3; (2)將該3 '，5 '-環二腺巧酸水溶液加熱至50~70°C ; (3)將該3'，5'-環二腺巧酸水溶液冷卻至1~10°C。另外，（1)(2)工序、（2)(3)工序可同時進 行。另外，也可按照由W下工序構成的方法獲得：（1)在被稀釋的3'，5'-環二腺巧酸水溶液 中添加酸，使P啡華低至1~3; (2)將調整pH后的該3'，5'-環二腺巧酸水溶液加熱至50~70 °C; (3)將該3'，5'-環二腺巧酸水溶液冷卻至1~10°C。為了更可靠地獲得包合物，優選緩慢 進行(3)的冷卻。具體地，優選在溫度梯度為-3~-irCAr的條件下進行冷卻。
[0016] 對于由上述制造方法得到的3'，5'-環二腺巧酸包合物，在過濾后使其在室溫（25 °C)~70°C下干燥1~10小時，即可得到產品。對于本發明的包合物，通過在干燥時的溫度為 室溫(25°C)~40°C的低溫下干燥，可得到結晶性物質，在40~70°C的高溫條件下干燥，可得 到非結晶性物質。具體地，對于本發明的包合物，通過在干燥時的溫度為室溫(25°C)W上~ 小于40°C的低溫下干燥，可得到結晶性物質，在40W上~70°CW下的高溫條件下干燥，可得 到非結晶性物質。另外，對于得到的包合物，可W在過濾后干燥前利用乙醇適當清洗。在干 燥時，可適當地利用減壓干燥法。
[0017] 通過運樣的方法得到的本發明的3'，5'-環二腺巧酸包合物，在采用高效液相色譜 法進行純度檢驗時，具有97% W上，更優選為99% W上的純度，且具有W下的物理性質。此 夕h下述的物理性質中，沒有特別限定的記載的情況下，表示結晶性物質、非結晶性物質雙 方共有的性質。
[001引（1)水分含量 對于本發明的3'，5環二腺巧酸包合物，雖然會因干燥程度而有所不同，但通過熱重 測定/差示熱分析(TG/DTA)裝置測定時的水分在3.5~17%的范圍內。即，本發明的3'，5'- 環二腺巧酸包合物中，相對于1分子的3'，5'-環二腺巧酸鍵合或者附著有1~7分子的水分 子，更具體地，鍵合或者附著有1.1~6.1分子的水分子。
[0019] (2)熱分析 本發明的3'，5'-環二腺巧酸包合物通過熱重測定/差示熱分析(TG/DTA)裝置(升溫速 度5°C/分鐘)進行分析時，包合物為結晶性物質時在193°C附近具有吸熱峰，為非結晶性物 質時在220°C附近具有吸熱峰。
[0020] (3)形狀 本發明的3'，5'-環二腺巧酸包合物的形狀呈針狀。
[0021] (4)紅外線吸收光譜 本發明的3'，5'-環二腺巧酸包合物（非結晶性）在測定紅外線吸收光譜時，在3087、 1686、1604、1504、1473、1415、1328、1213(cm-i)附近具有特征峰。
[0022] 此外，在紅外線吸收光譜測定中，一般存在包含小于2(cnfi)的誤差范圍的情況，因 此除了上述數值與紅外線吸收光譜的峰位置完全一致的包合物W外，峰值在小于2cnfi的誤 差內一致的包合物也包括在本發明的3 '，5 環二腺巧酸包合物中。例如，在測定紅外線吸 收光譜時，在 3087±1.9、1686±1.9、1604±1.9、1504±1.9、1473±1.9、1415±1.9、1328± 1.9、1213±1.9(cnfi)具有特征峰。
[0023] (5)粉末X射線分析 特別是，本發明的3'，5'-環二腺巧酸包合物為結晶性物質時，本發明的包合物在粉末X 射線分析中具有特征峰。例如，采用使用了 Cu-Ka射線的粉末X射線衍射裝置對本發明的包 合物進行分析時，如后述實施例所示，在衍射角（20)9.2、10.2、10.9、11.1、13.7、15.2、 19.0、20.6、22.4、23.1、24.3、26.6、26.8(°)附近、其中特別是衍射角（2目）9.2、15.2、19.0、 20.6、26.8 n附近具有特征峰。
[0024] 此外，通常粉末X射線衍射的衍射角（20)存在包含小于5%的誤差范圍的情況，因 此，除了粉末X射線衍射中的峰的衍射角完全一致的包合物W外，峰的衍射角在小于5%的 誤差內一致的包合物也包括在本發明的3'，5'-環二腺巧酸包合物中。例如，在粉末X射線衍 射中，在衍射角(2目)9.2±0.45、10.2±0.50、10.9±0.54、11.1±0.55、13.7±0.68、15.2± 0.75、19.0±0.94、20.6±1.02、22.4±1.11、23.1±1.15、24.3±1.21、26.6±1.32、26.8± 1.33(° )，特別是，衍射角（2目）9.2±0.45、15.2±0.75、19.0±0.94、20.6±1.02、26.8± 1.33(°)具有特征峰。 包合物為非結晶性物質時，在粉末X射線衍射中不出現明顯的峰。 【實施例】
[0025] W下通過實施例具體地說明本發明，但本發明并不限定于此。 (實施例1)3'，5'-環二腺巧酸包合物(非結晶性)的制造 按照公知方法合成3 '，5 環二腺巧酸，進行純化。 將純化得到的0D257為709的3'，5'-環二腺巧酸溶液（141mL)用水稀釋成0D化7為20。邊 攬拌邊緩慢添加1N的鹽酸溶液，將pH調至P化.8。結果，水溶液中析出白色固體。
[0026] 為了更有效率地得到包合物，利用程控培養器將該溶液加熱至60°C。之后，在溫度 梯度-4°CAr條件下，冷卻至液溫為呈4°C。將析出物利用玻璃過濾器(17G3)過濾，得到白色 固體。將該白色固體在60°C下干燥6小時，得到了包合物(非結晶性)2.169g。
[0027] (參考例)3'，5'-環二腺巧酸的冷凍干燥品的制造 將1 g酶合成的3 '，5 ' -環二腺巧酸在20mL的水中懸浮后，用1N化0H溶液將pH調成 抑7.0，或者用5 %氨水調成抑7.4，溶解懸浮的3 '，5 環二腺巧酸。 將溶解得到的3'，5'-環二腺巧酸溶液用水進一步稀釋成35mL，利用冷凍干燥機進行冷 凍干燥，得到了 3 '，5 環二腺巧酸鋼鹽或者錠鹽的冷凍干燥品。
[002引（實施例2)3'，5'-環二腺巧酸包合物(非結晶性)的物理性質 對上述實施例1中制備的3'，5環二腺巧酸包合物進行儀器分析，結果如下所示。 (儀器分析） (A)純度檢驗 采用高效液相色譜法分析實施例1中得到的3'，5'-環二腺巧酸包合物的純度。結果， 3'，5'-環二腺巧酸的純度為99.8%。另外，高效液相色譜法是在W下條件下進行的。 (條件） 柱:Hy化OS曲ere C18(YMC社制） 洗脫液:0.1M TEA-P(p冊.0) 檢測方法:在UV260nm下檢測 [0029] (B)形狀 3'，5'-環二腺巧酸包合物的代表性照片示于圖1。如圖1所示，3'，5'-環二腺巧酸包合 物的形狀為針狀。 另外，3'，5'-環二腺巧酸鋼鹽W及3'，5'-環二腺巧酸錠鹽的冷凍干燥品的照片如圖2、 3所示，形狀與包合物完全不同。
[0030] (C)水分 利用熱重測定/差示熱分析(TG/DTA)裝置(升溫速度5X7分鐘)進行分析，對于本發明 的3 '，5 環二腺巧酸包合物中的水分，再干燥前的包合物為8.7~9.5%，采用100°C減壓干 燥進行再干燥后的包合物為3.5~3.6%，將再干燥的包合物在室溫、濕度40~50%下放置 一晚后的包合物為10.3 %，將再干燥的包合物在溫度30°C、濕度70 %下放置一晚后的包合 物為15.0%，在20°C下進行2小時真空干燥的包合物為17.0%。 良P，通過計算可知，根據干燥程度，本發明的3'，5環二腺巧酸包合物中，相對于1分子 的3'，5'-環二腺巧酸分別鍵合或者附著有1.1~6.1分子的水分子。
[0031] 此外，對3'，5'-環二腺巧酸鋼鹽的冷凍干燥品、3'，5'-環二腺巧酸錠鹽的冷凍干 燥品同樣進行熱重測定，對于再干燥前的測定值，鋼鹽的冷凍干燥品含有16~17%的水分、 錠鹽的冷凍干燥品含有13~15%的水分。
[0032] (D)差示掃描量熱分析 利用熱重測定/差示熱分析(TG/DTA)裝置(升溫速度5X7分鐘)進行分析，本發明的3'， 5 '-環二腺巧酸包合物在220°C附近顯示有特征的吸熱峰（圖4)。 與此相對，3'，5'-環二腺巧酸鋼鹽的冷凍干燥品在267°C附近顯示吸熱峰（圖5)、錠鹽 的冷凍干燥品在228~229°C附近顯示吸熱峰（圖6)。
[0033] (E)核磁共振波譜 在本發明的3'，5'-環二腺巧酸包合物中添加6N NaO田容液化L使之溶解，利用重水稀釋 至濃度為6mg/0.6ml，進行核磁共振光譜測定(1山1化、3中）。將測定結果分別示于圖7~9。
[0034] 結果，本發明的3 '，5 ' -環二腺巧酸包合物在1h時于8.37、7.96、6.08、4.98-5.02、 4.86、4.51-4.55、4.17 (郵 m)附近具有峰。另外，在"C 時于157.9、155.4、150.0、141.6、 121.3、93.1、82.8、76.7、73.3、65.2(99111)附近具有峰。在3中時，于-0.91(99111)附近具有峰。
[0035] (F)紅外線吸收光譜 對本發明的3'，5'-環二腺巧酸包合物、3'，5'-環二腺巧酸鋼鹽的冷凍干燥品、3'，5'- 環二腺巧酸錠鹽的冷凍干燥品，利用傅立葉變換紅外分光光度計Spectrum One (Perkin Elmer)，采用ATR(Attenuated Total Ref lec1:ance，衰減全反射)法測定紅外線吸收光譜。
[0036] 將各個包合物中觀察到的峰（cnfi)值示于表1。另外，將本發明的3'，5'-環二腺巧 酸包合物、3'，5'-環二腺巧酸鋼鹽的冷凍干燥品、3'，5'-環二腺巧酸錠鹽的紅外線吸收光 譜分別示于圖10~12。
[0037] 結果，本發明的3'，5'-環二腺巧酸包合物在3087、1686、1604、1504、1473、1415、 1328、1213 (cnfi)附近具有特征峰。
[003引【表1】
[0039] (G)粉末X射線衍射 對本發明的3'，5'-環二腺巧酸包合物，在下述的測定條件下測定X射線衍射光譜。
[0040] (測定條件） 革己:化 X射線管電流:40mA X射線管電壓:45kV 掃描范圍：20 = 4.0~40.0。 預處理:利用瑪瑤制研鉢粉碎
[0041] 測定結果，在X射線衍射光譜的圖形中未觀察到明顯的峰，表明本包合物為非結晶 性。
[0042] (實施例3)
[1 ] 3 '，5 ' -環二腺巧酸包合物的制造（1) 通過已知的方法利用酶合成3'，5'-環二腺巧酸，進行純化。將純化得到的0D257為473 的3'，5'-環二腺巧酸溶液(280mL)用水稀釋至0D257為40。邊攬拌邊添加2N鹽酸溶液，將pH 調至P化.8。結果，水溶液中析出白色固體。
[0043] 為了更有效率地獲得包合物，利用程控培養器將該溶液加熱至50°C。之后，在溫度 梯度-3°C/hr下，冷卻至液溫為4°C，使固體析出。將析出物通過玻璃過濾器（17G3)過濾，得 到白色固體。將該白色固體在室溫下真空干燥，得到3'，5'-環二腺巧酸包合物。
[0044] [2]3'，5'-環二腺巧酸包合物的制造(2) 通過已知的方法利用酶合成3'，5'-環二腺巧酸，進行純化。將純化得到的0D257為758 的3'，5'-環二腺巧酸溶液(400mL)用水稀釋至0D257為40。為了更有效率地獲得包合物，利 用程控培養器將該溶液加熱至50°C，邊攬拌邊添加2N鹽酸溶液，將抑調至P化.8。
[0045] 之后，在溫度梯度-4/hr下冷卻至液溫為4°C，使固體析出。將析出物通過玻璃過濾 器（17G3)過濾，得到白色固體。將該白色固體在室溫下真空干燥，得到3'，5'-環二腺巧酸包 合物8.5g。
[0046] (實施例4)3'，5'-環二腺巧酸包合物(結晶性)的物理性質 化)形狀 將上述實施例3中制備的3'，5'-環二腺巧酸包合物(結晶性)照片示于圖13。如圖13所 示，3 '，5 環二腺巧酸包合物(結晶性)的形狀為針狀。 (I) 差示掃描量熱分析 利用熱重測定/差示熱分析(TG/DTA)裝置(升溫速度5X7分鐘)進行分析，本發明的3'， 5'-環二腺巧酸包合物在193°C附近顯示有特征的吸熱峰（圖14)。 (J) 水分 利用熱重測定/差示熱分析(TG/DTA)裝置(升溫速度fTC/分鐘)進行分析，將本發明的 3'，5'-環二腺巧酸包合物中的水分在溫度20°C的條件下真空干燥2小時后的水分含量為 17.0%。
[0047] (K)粉末X射線衍射 按照與(G)相同的測定條件對本發明的3'，5'-環二腺巧酸包合物測定X射線衍光譜。 [004引結果，如圖15W及表2所示，本發明的3'，5'-環二腺巧酸包合物在衍射角(20)9.2、 10.2、10.9、11.1、13.7、15.2、19.0、20.6、22.4、23.1、24.3、26.6、26.8(°)附近顯示特征峰。 [0049]另外，從X射線衍射光譜的圖形中判斷出，本實施例中得到的3'，5'-環二腺巧酸包 合物為結晶性物質。 「00501 r^9l Luud i J u;乳殷僧避
利用高效液相色譜法分析3'，5'-環二腺巧酸包合物(結晶性)的純度。結果，3'，5'-環 二腺巧酸的純度為99.7%。另外，高效液相色譜法的條件與實施例1相同。
【主權項】
1. 一種3'，5'_環二腺苷酸包合物的制造方法，其特征在于，包括以下工序： 在3 '，5 環二腺苷酸的水溶液中添加酸，使pH降低至pHl~3。2. -種3'，5'_環二腺苷酸包合物的制造方法，其特征在于，包括以下（1)~(3)的工序： (1) 在3 '，5 ' -環二腺苷酸水溶液中添加酸，使pH降低至pHl~3; (2) 將3 '，5 環二腺苷酸水溶液加熱至50~70°C ;以及 (3) 將3 '，5 ' -環二腺苷酸冷卻至1~10 °C。3. -種3 '，5 環二腺苷酸包合物，其特征在于，相對于1分子的3 '，5 環二腺苷酸，鍵 合或者附著有1~7分子的水分子。4. 如權利要求3所述的3 '，5 環二腺苷酸包合物，其特征在于，高效液相色譜中的純度 為97%以上。5. 如權利要求3或4所述的3 '，5 環二腺苷酸包合物，其特征在于，高效液相色譜中的 純度為99%以上。6. 如權利要求3至5中任一項所述的3 '，5 環二腺苷酸包合物，其特征在于，所述包合 物為結晶。7. 如權利要求6所述的3 '，5 環二腺苷酸包合物，其特征在于，在粉末X射線分析中，在 衍射角2Θ為9.2°、15.2°、19.0°、20.6°、26.8°附近顯示有特征峰。
【文檔編號】C07H1/00GK106061989SQ201580012339
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2015年3月12日 公開號201580012339.6, CN 106061989 A, CN 106061989A, CN 201580012339, CN-A-106061989, CN106061989 A, CN106061989A, CN201580012339, CN201580012339.6, PCT/2015/57386, PCT/JP/15/057386, PCT/JP/15/57386, PCT/JP/2015/057386, PCT/JP/2015/57386, PCT/JP15/057386, PCT/JP15/57386, PCT/JP15057386, PCT/JP1557386, PCT/JP2015/057386, PCT/JP2015/57386, PCT/JP2015057386, PCT/JP201557386
【發明人】田中壽基, 石毛和也
【申請人】雅瑪山醬油株式會社