檢測馬鈴薯s病毒的成套試劑及其在利用數字pcr檢測馬鈴薯s病毒中的應用
【專利摘要】本發明公開了檢測馬鈴薯S病毒的成套試劑及其在利用數字PCR檢測馬鈴薯S病毒中的應用。本發明公開的檢測馬鈴薯S病毒的成套試劑，由名稱為X1的引物對和名稱為PVS?p的探針組成；X1由PVS?f和PVS?r組成；PVS?f是序列表中序列1所示的單鏈DNA；PVS?r是序列表中序列2所示的單鏈DNA；PVS?p的序列為序列表中序列3，PVS?p的5'端由FAM標記，3'端由TAMRA標記。實驗證明，本發明的檢測馬鈴薯S病毒的成套試劑可用于特異性數字PCR，并且特異性好、靈敏度高(靈敏度可達15拷貝/μL)，適用于潛隱病癥和病毒含量低的樣品中PVS的檢測。
【專利說明】
檢測馬鈴善s病毒的成套試劑及其在利用數字PCR檢測馬鈴善 S病毒中的應用
技術領域
[0001] 本發明設及生物技術領域中檢測馬鈴馨S病毒的成套試劑及其在利用數字PCR檢 測馬鈴馨S病毒中的應用。
【背景技術】
[0002] 馬鈴馨S病毒病(potato virus S，PVS)是馬鈴馨的主要病毒病之一，我國馬鈴馨 種植區普遍發生，且危害較嚴重。PVS單獨侵染一般不表現癥狀，但可導致馬鈴馨減產10 % - 20 %，與其他病毒混合侵染，可減產20 % -30 % dPVS易通過汁液傳播，接觸傳染是自然傳播 的主要途徑，也可通過曬蟲進行非持久性傳播。感染PVS病毒的馬鈴馨植株常產生小塊莖， 并通過塊莖無性繁殖進行世代積累和傳遞，致使塊莖種性變劣，產量不斷下降。
[0003] 由于馬鈴馨S病毒病癥潛隱難W辨認，同時在種馨脫毒過程中脫毒率通常較低。為 保證種馨質量，要求在脫毒種馨生產中要有嚴格的檢測。目前，針對PVS主要采用指示植物 和酶聯免疫法化LISA)等方法進行檢測，ELISA雖然可W在短時間內檢測大量樣品，但該方 法存在標準陽性對照較難獲得，相對費用低的抗血清種類不全，檢測靈敏度低及整個實驗 操作流程較復雜等因素的限制。RT-PCR技術相對于血清檢測法不用制備抗體，而且省時又 省力，已經用于PVS的檢測，但對病毒濃度低的樣品（如初皮部樣品和休眠未出芽或自然老 的塊莖)卻不足W做出可靠的診斷。
[0004] 數字PCR(Digital-PCR)是一種新型的PCR檢測方法，其基本原理是通過將微量樣 品進行大倍數稀釋和分液，直至每個樣品中所含有的待測分子數不超過1個，再將所有樣品 在相同條件下進行PCR擴增，有PCR擴增巧光信號記為1，無巧光信號記為0,有巧光信號的反 應單元中至少包含一個拷貝的目標分子，針對反應結果采用泊松分布（Poisson distribution)公式，便可計算出樣本的最初拷貝數或濃度。
【發明內容】
[0005] 本發明所要解決的技術問題是如何檢測馬鈴馨S病毒。
[0006] 為解決上述技術問題，本發明首先提供了檢測馬鈴馨S病毒的成套試劑。
[0007] 本發明所提供的檢測馬鈴馨S病毒的成套試劑，由名稱為XI的引物對和名稱為 PVS-P的探針組成;所述XI由PVS-f和PVS-r組成；
[000引所述PVS-f是如下al)至曰4)中的任一種單鏈DNA:
[0009] al)序列表中序列1所示的單鏈DNA;
[0010] a2)在al)的5/端和/或y端添加一個或幾個核巧酸得到的單鏈DNA;
[001。 曰3)與al)或曰2)限定的單鏈DNA具有85 % W上的同一性的單鏈DNA;
[001^日4化嚴格條件下與al)或日2)限定的單鏈DNA雜交的單鏈DNA;
[OOU] 所述PVS-r是如下bl)至b4)中的任一種單鏈DNA:
[0014] bl)序列表中序列2所示的單鏈DNA;
[0015] b2)在bl)的5/端和/或y端添加一個或幾個核巧酸得到的單鏈DM;
[0016] b3)與bl)或b2)限定的單鏈DM具有85% W上的同一性的單鏈DM;
[0017] b4化嚴格條件下與bl)或b2)限定的單鏈DNA雜交的單鏈DNA;
[0018] 所述PVS-P的序列為如下cl)至c4)中的任一種序列：
[0019] cl)序列表中序列3的序列；
[0020] c2)在cl)的5/端和/或y端添加一個或幾個核巧酸得到的序列；
[0021] c3)與cl)或c2)限定的序列具有85% W上的同一性的序列；
[0022] c4)在嚴格條件下與cl)或c2)限定的序列雜交的序列。
[0023] 上述成套試劑中，曰2)所述在al)的5/端和/或3/端添加一個或幾個核巧酸得到的 單鏈DNA為在序列1所示的單鏈DNA的5/端和/或3/端添加一至十個核巧酸得到的單鏈DNA。 b2)所述在bl)的5/端和/或y端添加一個或幾個核巧酸得到的單鏈DNA為在序列2所示的單 鏈DNA的5/端和/或y端添加一至十個核巧酸得到的單鏈DNAdc2)所述在cl)的5/端和/或y 端添加一個或幾個核巧酸得到的序列為在序列3所示的序列的5/端和/或3/端添加一至十 個核巧酸得到的序列。
[0024] 運里使用的術語"同一性"指與天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括與本發 明的序列1、序列2或序列3所示的核巧酸序列具有85%或更高，或90%或更高，或95%或更 高同一性的核巧酸序列。同一性可W用肉眼或計算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個 或多個序列之間的同一性可W用百分比（％ )表示，其可W用來評價相關序列之間的同一 性。
[0025] 上述成套試劑中，所述嚴格條件是在2XSSC，0.1%SDS的溶液中，在68°C下雜交并 洗膜2次，每次5min，又于0.5 X SSC，0.1 % SDS的溶液中，在68 °C下雜交并洗膜2次，每次 15min;或，0.1 X SS陽(或0.1 X SSC)、0.1 % SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。
[0026] 上述85% W上同一性，可為85%、90%或95% W上的同一性。
[0027] 上述成套試劑中，所述PVS-P的兩端可被巧光染料標記。具體可為:所述PVS-P的5' 端由FAM標記，和/或，所述PVS-p的3 '端由TAMRA標記。
[0028] 上述成套試劑中，所述PVS-f、所述PVS-r和所述PVS-p均可獨立包裝。所述PVS-f和 所述PVS-r的摩爾比可為1:1。
[0029] 為解決上述技術問題，本發明還提供了檢測馬鈴馨S病毒的引物對。
[0030] 本發明所提供的檢測馬鈴馨S病毒的引物對，為所述XI。
[0031] 所述XI的兩條單鏈DNA可獨立包裝。其中，所述PVS-f、所述PVS-r和所述PVS-p的摩 爾比可為2:2:1。
[0032] 為解決上述技術問題，本發明還提供了檢測馬鈴馨S病毒的系統。
[0033] 本發明所提供的檢測馬鈴馨S病毒的系統，包括所述成套試劑或所述引物對。
[0034] 上述系統，還可包括進行RNA逆轉錄和/或數字PCR檢測馬鈴馨S病毒所需的試劑和 儀器。具體來說，檢測馬鈴馨S病毒的系統可包括所述成套試劑W及進行RNA逆轉錄和/或數 字PCR所需要的其它試劑和儀器。
[0035] 所述系統具體可由所述成套試劑和Ml組成，所述Ml為Mia和/或mb,所述Mia為進 行RNA逆轉錄所需的試劑和/或儀器，所述mb進行數字PCR所需的試劑和/或儀器。
[0036] 所述成套試劑中的各單鏈DNAW及進行RNA逆轉錄所需要的其它試劑、進行數字 PCR所需要的其它試劑均可獨立包裝。
[0037] 進行RNA逆轉錄所需要的其它試劑可為化kara公司的逆轉錄試劑盒中試劑。
[0038] 進行數字PCR所需要的其它試劑可為數字PCR擴增SuperMix、數字PCR微滴生成卡 和微滴生成用油。數字PCR擴增S叫erMix、數字PCR微滴生成卡和微滴生成用油均可為Bio- Rad產品。進行數字PCR所需要的儀器可為數字PCR反應系統，如Bio-Rad數字PCR反應系統 (Bio-Rad QX200)。
[0039] 為解決上述技術問題，本發明還提供了下述任一方法：
[0040] 1)所述成套試劑的制備方法，包括將所述成套試劑中各單鏈DNA獨立包裝；
[0041] 2)所述引物對的制備方法，包括將所述引物對中兩條單鏈DNA獨立包裝；
[0042] 3)所述系統的制備方法，包括將所述成套試劑中各單鏈DNA獨立包裝。
[0043] 為解決上述技術問題，本發明還提供了檢測馬鈴馨S病毒的方法。
[0044] 本發明所提供的檢測馬鈴馨S病毒的方法，包括A1)或A2):
[0045] A1)利用所述成套試劑對待測樣品進行數字PCR，根據反應結果中擴增微滴的有無 確定所述待測樣品是否為馬鈴馨S病毒或是否含有馬鈴馨S病毒：如有擴增微滴，所述待測 樣品為或候選為馬鈴馨S病毒或所述待測樣品含有或候選含有馬鈴馨S病毒；如無擴增微 滴，所述待測樣品不為或候選不為馬鈴馨S病毒或所述待測樣品不含有或候選不含有馬鈴 馨S病毒；
[0046] A2)利用所述XI中對待測樣品進行PCR擴增，根據擴增產物的有無確定所述待測樣 品是否為馬鈴馨S病毒或是否含有馬鈴馨S病毒。
[0047] 上述檢測馬鈴馨S病毒的方法中，進行所述數字PCR的體系包括：數字PCR擴增 SuperMix、所述PVS-f、所述PVS-r、所述PVS-p和所述待測樣品。所述體系中所述PVS-f、所述 PVS-r和所述PVS-P的摩爾比可為2:2:1。
[004引所述體系可為體系1或體系2。所述體系1可為:2 X數字PCR擴增SuperMix 1化L，所 述PVS-f (所述PVS-f在所述體系1中的濃度可為0.4-0.5測，所述PVS-r (所述PVS-r在所述體 系1中的濃度可為0.4-0.5測，所述PVS-P (所述PVS-P在所述體系1中的濃度可為0.2-0. 所述待測樣品，超純水補至20化。所述體系2可為向所述體系1中加入70化的數字PCR反應用 油得到的體系。2 X數字PCR擴增SuperMix和數字PCR反應用油均可為Bio-Rad產品。
[0049] 上述檢測馬鈴馨S病毒的方法中，進行所述數字PCR和所述PCR擴增的退火溫度均 可為58°C。進行所述數字PCR和所述PCR擴增的退火條件具體均可為58°C60s。
[0050] 所述數字PCR的擴增程序可為:50°C熱激活5min;95°C預變性5min;40個循環:95°C 變性15s，58°C退火及延伸60s。
[0051 ] 所述數字PCR的擴增具體可在數字PCR反應系統中進行，如Bio-Rad數字PCR反應系 統(Bio-Rad QX200)。
[0052] 上述檢測馬鈴馨S病毒的方法中，所述擴增微滴可為被進行數字PCR所需要的儀器 判定為陽性微滴的微滴。
[0053] 為解決上述技術問題，本發明還提供了所述成套試劑，所述引物對，或所述系統的 下述al)-a4)任一種中的應用：
[0054] al)在檢測馬鈴馨S病毒中的應用；
[0055] a2)在制備檢測馬鈴馨S病毒產品中的應用；
[0056] a3)在利用數字PCR檢測馬鈴馨S病毒中的應用；
[0057] a4)在制備利用數字PCR檢測馬鈴馨S病毒產品中的應用。
[0058] 本發明針對馬鈴馨S病毒設計檢測馬鈴馨S病毒的成套試劑，包括擴增引物和探 針，該成套試劑可用于特異性數字PCR，本發明并基于該成套試劑建立了馬鈴馨S病毒的數 字PCR檢測方法，該方法可對馬鈴馨S病毒進行定性檢測。通過實驗證明：本發明的檢測馬鈴 馨S病毒的成套試劑特異性好(可從馬鈴馨S病毒、馬鈴馨X病毒、馬鈴馨Y病毒、黃瓜花葉病 毒和煙草花葉病毒中特異鑒定出馬鈴馨S病毒）、靈敏度高(靈敏度可達15拷貝/化），適用于 潛隱病癥和病毒含量低的樣品中PVS的檢測。
【附圖說明】
[0059] 圖1為檢測馬鈴馨S病毒的成套試劑數字PCR特異性檢測結果。其中，B03:馬鈴馨S 病毒(PVS);C03、D03:馬鈴馨X病毒(PVX);E03、F03:馬鈴馨Y病毒(PVY);G03、朋3:煙草花葉 病毒(TMV) ;A04、B04:黃瓜花葉病毒(CMV) ;C04:陰性對照(NC) ;D04:空白對照(BC)。
[0060] 圖2為檢測馬鈴馨S病毒的成套試劑數字PCR靈敏度檢測結果。其中，E04、F04:l〇-2; G04、H04: 10-3;A05、B05: 10-4;C05、D05: 10-5;E05、F05: 10-6;G05、朋5: 10-7;A06、B06:陰性對 照(NC); C06、D06:空白對照(BC)。
【具體實施方式】
[0061] 下面結合【具體實施方式】對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡 明本發明，而不是為了限制本發明的范圍。
[0062] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。
[0063] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0064] 下述實施例中的實時巧光一步RT-PCR試劑盒One Step PrimeScript? RT-PCR Kit(Perfect Real Time)是hkara公司的產品，產品目錄號為RR064A。
[0065] 下述實施例中的馬鈴馨S病毒(Potato Virus S)在文獻"田永蕾，張永江，劉冬梅， 劉梅，馬占鴻，李明福，陳洪俊.馬鈴馨病毒疫情調查及馬鈴馨S病毒的檢測鑒定[J].安徽農 業科學，2009，37 (3): 1001-1002中公開過，公眾可從
【申請人】處獲得。
[0066] 下述實施例中的馬鈴馨X病毒(Potato Virus X)在文獻"魏梅生，劉洪義，李桂芬， 陳燕芳.馬鈴馨X病毒和馬鈴馨Y病毒膠體金免疫層析試紙條的研制[J].植物保護，2006，32 (6): 139-141中公開過，公眾可從
【申請人】處獲得。
[0067] 下述實施例中的馬鈴馨Y病毒(Potato Virus Y)在文獻"魏梅生，劉洪義，李桂芬， 陳燕芳.馬鈴馨X病毒和馬鈴馨Y病毒膠體金免疫層析試紙條的研制[J].植物保護，2006，32 (6): 139-141中公開過，公眾可從
【申請人】處獲得。
[0068] 下述實施例中的煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus)在文獻"張永江，馬榮群， 辛言言，黃粵.煙草花葉病毒屬條形碼鑒定方法的建立[J].湖北農業科學，2015,54(11): 2624-2627中公開過，公眾可從
【申請人】處獲得。
[0069] 下述實施例中的黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus)在文獻"李桂芬，朱水 芳，周群，施宗偉，張永江，李明福.侵染紫松果菊的黃瓜花葉病毒分離物鑒定[J].植物保護 2007，33 (1) 54-56中公開過，公眾可從
【申請人】處獲得。
[0070] 實施例1、檢測馬鈴馨S病毒的成套試劑的制備
[0071] 檢測馬鈴馨S病毒的成套試劑由引物對XI和探針PVS-P組成，引物對XI由正向引物 PVS-f(5'-CTCAC AATGC CCACA AGAGT ATG-3'（序列表中序列 1))和反向引物口￥5寸（5'- TCCCT CCAGT GTACT CAACA TTAG-3'（序列表中序列2))組成；探針PVS-p(5'-FAM-ACAAG TCGAA CAGAA ATGAG CGATT GGCC-TAMRA-3'）的序列如序列表中序列3所示，探針PVS-p的5' 端由FAM標記，3 '端由TAMRA標記。
[0072] 檢測馬鈴馨S病毒的成套試劑中的PVS-f、PVS-r與PVS-P分別獨立包裝，引物對XI 中PVS-f與PVS-r的摩爾比為1:1。
[0073] 實施例2、馬鈴馨S病毒數字PCR檢測方法的建立
[0074] 1、實驗材料
[007引本實施例中使用的馬鈴馨S病毒(PVS)、馬鈴馨X病毒(PVX)、馬鈴馨Y病毒(PVY)、煙 草花葉病毒(TMV)和黃瓜花葉病毒(CMV)均由中國檢驗檢疫科學研究院提供。反轉錄試劑盒 PrimeScript? RT reagent Kit(Perfect Real Time)為hkara公司產品，RR037A;數字PCR 相關反應試劑耗材為美國Bio-Rad公司產品，包括SuperMix、數字PCR微滴生成卡(Droplet Generator Cartridge微滴生成卡）和數字PCR反應用油；Bio-Rad數字PCR反應系統（Bio- Rad QX200) 為美國Bio-Rad 公司產品 ，包括 PCR 儀、 Droplet Generator 微滴生成器與 Droplet Reader微滴讀取儀。
[0076] 2、樣品總RNA提取
[0077] 參照試劑盒操作（植物總RNA提取試劑盒，天根生物科技有限公司，貨號為DP432) 分別提取感染了馬鈴馨S病毒的馬鈴馨葉片、感染了馬鈴馨X病毒的馬鈴馨葉片、感染了馬 鈴馨Y病毒的馬鈴馨葉片、感染了煙草花葉病毒的煙草葉片及感染了黃瓜花葉病毒的黃瓜 葉片的總RNA。
[007引 3、數字PCR擴增反應
[0079] (1)逆轉錄反應按照逆轉錄試劑盒操作說明，單引物反應采用反向引物PVS-r將樣 品RNA逆轉錄成cDNA;
[0080] (2)數字PCR體系的配置:Bio-Rad數字PCR平臺反應體系總體積為20化，組分包括 數字PCR擴增S叩erMix、上下游引物W及探針和模板cDNAd20化數字PCR體系為：2X SuperMix 10化，實施例1的PVS-f及PVS-r(濃度均為10山〇各化L，實施例1的探針PVS-p(10ii M)0.扣L，步驟（1)的模板cDNA化L，超純水補至20化;設置陰性對照與空白對照，陰性對照 中的模板用健康馬鈴馨RNA替換，空白對照中的模板用RNase化ee d出0替換；
[0081 ] (3)體系配置完成后，將反應體系轉移至化oplet Generator Cartridge微滴生成 卡的體系加樣孔中，并在反應用油加樣孔中加入70化的數字PCR反應用油，在加樣過程中， 應避免在孔底產生氣泡；
[0082] (4)加樣完成后，將微滴生成卡轉移至化oplet Generator微滴生成器中，啟動儀 器；
[0083] (5)微滴生成結束后，將生成完成后的微滴體系轉移至96孔板中，封膜；
[0084] (6)將96孔板置于PCR儀中，PCR擴增程序為50°C熱激活5min;95°C預變性5min;40 個循環：95°C變性15s，58°C退火及延伸60s。擴增結束后，將96孔板取出，置于化oplet Reader微滴讀取儀中進行微滴巧光讀取；
[0085] (7)通過FAM單通道巧光收集單個微滴巧光信號，巧光采集后，通過分析熱點圖確 定巧光闊值限W確定陰性微滴和陽性微滴；
[0086] (8)結果判斷：反應結束后，根據不同病毒是否產生陽性微滴判斷檢測馬鈴馨S病 毒的成套試劑的特異性;根據不同梯度稀釋樣品擴增是否產生的陽性微滴數判斷檢測馬鈴 馨S病毒的成套試劑的靈敏度。
[0087] 實施例3、檢測馬鈴馨S病毒的成套試劑的特異性檢測 [008引 1、RNA的提取
[0089] 參照實施例2的步驟2中的RNA的提取方法，分別提取了感染了馬鈴馨S病毒的馬鈴 馨葉片、感染了馬鈴馨X病毒的馬鈴馨葉片、感染了馬鈴馨Y病毒的馬鈴馨葉片、感染了煙草 花葉病毒的煙草葉片及感染了黃瓜花葉病毒的黃瓜葉片的總RNA。
[0090] 2、數字PCR擴增
[0091] 分別W步驟1獲得的各總RNA為模板，同時設置陰性對照(NC)和空白對照(BC);按 照實施例2的步驟3的數字PCR擴增反應方法進行數字PCR擴增。
[0092] 3、結果分析
[0093] 數字PCR特異性結果如圖1所示。從圖1中可W看出，只有馬鈴馨S病毒樣品存在陽 性微滴，其它對照病毒樣品、陰性對照和空白對照均無陽性微滴，此時判定為陽性微滴的的 巧光闊值限為1600,低于1600的微滴儀器判斷為陰性，高于1600的微滴儀器判斷為陽性;說 明本發明的檢測馬鈴馨S病毒的成套試劑的特異性高。
[0094] 實施例4、檢測馬鈴馨S病毒的成套試劑的靈敏度檢測
[00M] 1、RNA的提取及梯度稀釋模板制備
[0096] 參照實施例2的步驟2中的RNA的提取方法，從感染了馬鈴馨S病毒的馬鈴馨葉片中 提取總RNA，將總RNA進行10*\1〇-1、1〇-2、1〇-3、1〇-4、1〇- 5、1〇-6和1〇-7稀釋后用作模板進行靈敏 度檢測。
[0097] 2、數字PCR擴增
[009引分別W步驟1獲得的10-2、10-3、10-4、10- 5、10-哺10-7稀釋度的3酷為模板，同時設置 陰性對照(NC)和空白對照(BC);按照實施例2的步驟3的數字PCR擴增反應方法進行數字PCR 擴增。
[0099] 3、結果分析
[0100] 數字PCR靈敏度結果如圖2所示。從圖2中可W看出，1〇-2、1〇-哺1〇-4梯度稀釋的反 應體系中均存在陽性微滴，i(T5、i(r哺1(T7梯度稀釋的反應體系中無陽性微滴，此時判定為 陽性微滴的的巧光闊值限為1600,低于1600的微滴儀器判斷為陰性，高于1600的微滴儀器 判斷為陽性，1〇-2、1〇-3、1〇-4、1〇-5、1〇-哺1〇- 7梯度稀釋的反應體系中模板拷貝數分別為1500 拷貝/化、150拷貝/化、15拷貝/化、1.5拷貝/化、0.15拷貝/化和0.015拷貝/化，表明，本發明 的檢測馬鈴馨S病毒的成套試劑的靈敏度為15拷貝AiL。
【主權項】
1. 檢測馬鈴薯S病毒的成套試劑，由名稱為XI的引物對和名稱為PVS-P的探針組成;所 述XI由PVS-f和PVS-r組成； 所述PVS-f是如下a 1)至a4)中的任一種單鏈DNA: al)序列表中序列1所示的單鏈DNA; a2)在al)的5'端和/或3'端添加一個或幾個核苷酸得到的單鏈DNA; a3)與al)或a2)限定的單鏈DNA具有85 %以上的同一性的單鏈DNA; a4)在嚴格條件下與a 1)或a2)限定的單鏈DNA雜交的單鏈DNA; 所述PVS-r是如下b 1)至b4)中的任一種單鏈DNA: b 1)序列表中序列2所示的單鏈DNA; b2)在bl)的5'端和/或3'端添加一個或幾個核苷酸得到的單鏈DNA; b3)與b 1)或b2)限定的單鏈DNA具有85 %以上的同一性的單鏈DNA; b4)在嚴格條件下與bl)或b2)限定的單鏈DNA雜交的單鏈DNA; 所述PVS-p的序列為如下cl)至c4)中的任一種序列： cl)序列表中序列3的序列； c2)在cl)的5'端和/或3'端添加一個或幾個核苷酸得到的序列； c3)與cl)或c2)限定的序列具有85%以上的同一性的序列； c4)在嚴格條件下與cl)或c2)限定的序列雜交的序列。2. 根據權利要求1所述的成套試劑，其特征在于:所述PVS-p的兩端被熒光染料標記。3. 根據權利要求1或2所述的成套試劑，其特征在于:所述PVS-p的5'端由FAM標記，和/ 或，所述PVS-p的3 '端由TAMRA標記。4. 檢測馬鈴薯S病毒的引物對，為權利要求1中所述XI。5. 檢測馬鈴薯S病毒的系統，包括權利要求1-3中任一所述成套試劑或權利要求4所述 引物對。6. 根據權利要求5所述的系統，其特征在于:所述系統由權利要求1-3中任一所述成套 試劑和Ml組成，所述Ml為Mia和/或Mlb，所述Mia為進行RNA逆轉錄所需的試劑和/或儀器，所 述Mlb進行數字PCR所需的試劑和/或儀器。7. 下述任一方法： 1) 權利要求1-3中任一所述成套試劑的制備方法，包括將所述成套試劑中各單鏈DNA獨 立包裝； 2) 權利要求4所述引物對的制備方法，包括將所述引物對中兩條單鏈DNA獨立包 3) 權利要求5或6所述系統的制備方法，包括將權利要求1-3中任一所述成套試劑中各 單鏈DNA獨立包裝。8. 檢測馬鈴薯S病毒的方法，包括A1)或A2): A1)利用權利要求1-3中任一所述成套試劑對待測樣品進行數字PCR，根據擴增微滴的 有無確定所述待測樣品是否為馬鈴薯S病毒或是否含有馬鈴薯S病毒：如有擴增微滴，所述 待測樣品為或候選為馬鈴薯S病毒或所述待測樣品含有或候選含有馬鈴薯S病毒;如無擴增 微滴，所述待測樣品不為或候選不為馬鈴薯S病毒或所述待測樣品不含有或候選不含有馬 鈴薯S病毒； A2)利用權利要求1所述XI中對待測樣品進行PCR擴增，根據擴增產物的有無確定所述 待測樣品是否為馬鈴薯S病毒或是否含有馬鈴薯S病毒。9. 根據權利要求8所述的方法，其特征在于:進行所述數字PCR和所述PCR擴增的退火溫 度均為58°C。10. 權利要求1-3中任一所述成套試劑，權利要求4所述引物對，或權利要求5或6所述系 統的下述al)_a4)任一種中的應用： al)在檢測馬鈴薯S病毒中的應用； a2)在制備檢測馬鈴薯S病毒產品中的應用； a3)在利用數字PCR檢測馬鈴薯S病毒中的應用； a4)在制備利用數字PCR檢測馬鈴薯S病毒產品中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK106048099SQ201610697225
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月19日
【發明人】張永江, 黃潔芳, 朱鵬宇, 付偉, 王晨光
【申請人】中國檢驗檢疫科學研究院, 中華人民共和國吳江出入境檢驗檢疫局