一種同時檢測四種呼吸道病毒的rt?pcr方法所用的四對上下游引物的制作方法
【專利摘要】一種同時檢測四種呼吸道病毒的RT?PCR方法所用的四對上下游引物，屬于生物工程技術領域。本發明結合無錫地區常見呼吸道病毒的流行特性，為建立一種能同時檢測甲型流感病毒（FluA）、乙型流感病毒（FluB）、副流感病毒Ⅰ型（PIVⅠ）和副流感病毒Ⅲ型（PIVⅢ）四種呼吸道病毒的多重PCR方法，提供四對上下游引物。該方法可以在一個反應體系中檢測多種病毒，簡化了實驗過程，縮短了實驗時間，降低了實驗成本，提高了檢測效率。
【專利說明】
-種同時檢測四種呼吸道病毒的RT-PCR方法所用的四對上下 游引物
技術領域
[0001] -種同時檢測四種呼吸道病毒的RT-PCR方法所用的四對上下游引物，屬于生物工 程技術領域。
【背景技術】
[0002] 呼吸道疾病包括上、下呼吸道急、慢性感染，呼吸道變態反應性疾病等。其中急性 呼吸道感染最為常見，由急性呼吸道感染所引起的患者常表現為咳嗽、發熱、四肢酸痛、流 涕、鼻塞、呼吸困難等癥狀。能夠引起急性呼吸道感染的病原體種類繁多，包括細菌、病毒、 支原體、衣原體和真菌等，據統計，引起急性呼吸道感染80%W上是病毒性感染。
[0003] 目前，呼吸道病毒的實驗室診斷主要包括病毒分離，血清學診斷，直接巧光抗體檢 測W及核酸檢測等方法。雖然病毒分離培養是呼吸道病毒感染診斷的"金標準"，但該方法 對設備技術的要求較高，耗時耗力，不能應用于臨床早期診斷和疫情的快速處置。血清學診 斷則需采集急性期、恢復期的患者血液標本，只能起到回顧性診斷的作用，也不能應用于臨 床早期診斷W及疫情的快速處置。直接巧光抗體檢測雖然能在較短的時間內獲得結果，但 特異性和靈敏度較低，判斷具有一定的主觀性，人力成本高。近年來，隨著分子生物學技術 的不斷發展核酸檢測已廣泛應用于臨床病原學診斷，在普通PCR的基礎上建立起來了多重 PCR核酸檢測方法，該方法可W在一個反應體系中檢測多種病毒，簡化了實驗過程，縮短了 實驗時間，降低了實驗成本，提高了檢測效率。
[0004] 對于RT-PCR產物的檢測方法主要有傳統的瓊脂糖凝膠電泳和毛細管電泳。瓊脂糖 凝膠電泳是W瓊脂或者瓊脂糖為支持介質的一種電泳方法，需要人工配制凝膠，重復性差， 且對操作人員要求較高且耗時較長。而毛細管電泳分析，具有分辨率高、快速、需樣量少、自 動等優點。
[0005] 基于此，本發明結合無錫地區常見呼吸道病毒的流行特性，建立一種能同時檢測 甲型流感病毒(FluA)、乙型流感病毒(FluB)、副流感病毒I型(PIVI)和副流感病毒虹型(PIV 虹）四種呼吸道病毒的多重PCR方法。
【發明內容】
[0006] 本發明目的是提供一種同時檢測四種呼吸道病毒的RT-PCR方法，及其所用的四對 上下游引物。建立起來了多重PCR核酸檢測方法，該方法可W在一個反應體系中檢測多種病 毒，簡化了實驗過程，縮短了實驗時間，降低了實驗成本，提高了檢測效率。
[0007] 本發明的技術方案:一種同時檢測四種呼吸道病毒的RT-PCR方法所用的四對上下 游引物； 引物設計:分別設計針對尸1^、尸1118、口1^和口1￥虹基因組保守區的4對引物如下：
設計的單一引物對病原的目標片段分別都能擴增出來的前提下，分別將四種引物的各 對上下游引物(4化M)按體積比1:1混合，再將引物FluA: FluB: PRI: PIV虹按體積比1:3:2: 2混合，混合后的引物作為本發明的使用引物;所述引物由上海生工生物工程股份有限公司 制備； 提取呼吸道標本的總核酸(DNA&RNA); PCR檢測的反應體系為25化，包括化zyme Mix 1化，5 X buffer化L，dNTP 1化，混合后 的引物化L，待檢模版5yL，水補充至25yL，待檢模板為從呼吸道標本中提取的總核酸， Enzyme Mix、dNTP和5 X buffer為QIAGEN OneStep RT-PCR Kit試劑盒提供； PCR檢測的反應程序為:50°C 30min;95°C 15min;94°C 變性30sec，50°C 退火30sec， 72°C 延伸lmin，35個循環；72°C lOmin。
[000引本發明的有益效果:本發明建立了一種能同時檢測甲型流感病毒(FluA)、乙型流 感病毒(FluB)、副流感病毒I型(PIVI)和副流感病毒虹型(PIV虹）的RT-PCR方法所用的四對 上下游引物。該方法可W在一個反應體系中檢測多種病毒，簡化了實驗過程，縮短了實驗時 間，降低了實驗成本，提高了檢測效率。
【附圖說明】
[0009]圖1所得PCR產物用QIAxcel全自動毛細管電泳系統分析所得電泳圖譜。M:Marker; 1:FluA+FluB+PIVI; 2:FluA+FluB+PIV虹；3:FluA+PIVI+PIV虹；4: FluB+PIVI+PIV虹；5: FluA+Fl地+PIVI+PIV虹；N:陰性對照。 【具體實施方式】 [0010] 實施例1 1、引物設計:分別設計針對尸1^、尸1118、口1^和口1￥虹基因組保守區的四對引物如下：
在設計的單一引物對病原的目標片段分別都能擴增出來的前提下，分別將四種引物的 各對上下游引物(4化M)按體積比1:1混合，再將引物FluA: FluB: PIVI: PIV虹按體積比1:3: 2:2混合，混合后的引物作為本發明的使用引物； 2、 提取呼吸道標本的總核酸(DNA&RNA); 3、 PCR檢測的反應體系為25化，包括化巧me Mix 1化，5 X buffer化L，dNTP 1化，混合 后的引物化L，待檢模版5yL，水補充至25yL，待檢模板為從呼吸道標本中提取的總核酸； Enzyme Mix、dNTP和5 X buffer為QIAGEN OneStep RT-PCR Kit試劑盒提供； 4、 PCR檢測的反應程序為50°C 30min;95°C 15min;94°C 變性30sec，50°C 退火30sec， 72°C 延伸lmin，35個循環；72°C lOmin; 5、 所得PCR產物用QIAxcel全自動毛細管電泳系統分析，所得電泳圖譜如圖1所示。
【主權項】
1. 一種同時檢測四種呼吸道病毒的RT-PCR方法所用的四對上下游引物，其特征在于： 引物設計:分別設計針對FluA、FluB、PIVI和PIVm基因組保守區的四對引物如下： PIVI上游引物：5'-CCGGTAATTT CTCATACCTA TG-3'， PIVI下游引物:5'-CCTTGGAGCG GAGTTGTTAA G-3'，產物大小:317bp; PlVm上游引物：5'-CTCGAGGTTG TCAGGATATA G-3'， PlVm下游引物:5'-CTTTGGGAGT TGAACACAGT T-3'，產物大小：189bp; FluA上游引物：5 ' -TTCTAACCGA GGTCGAAACG-3 '， FluA下游引物：5'-ACAAAGCGTC TACGCTGCAG-3'，產物大小：230bp; FluB上游引物：5 ' -GGGACATGAA CAACAAAGAT GC-3 '， FluB下游引物：5'-TGTCAGCTAT TATGGAGCTG-3'，產物大小：425bp; 在設計的單一引物對病原的目標片段分別都能擴增出來，分別將四種引物的各對40μΜ 的上下游引物按體積比1:1混合，再將引物FluA:FluB: PIVI: PlVm按體積比1:3:2:2混合， 混合后的引物作為本發明的使用引物； 提取呼吸道標本的總核酸DNA&RNA; PCR檢測的反應體系為25yL，包括Enzyme Mix lyL，5 X buffer 6yL，dNTP lyL，混合后 的引物4tiL，待檢模版5tiL，水補充至25tiL，待檢模板為從呼吸道標本中提取的總核酸， Enzyme Mix、dNTP和5 X buffer為QIAGEN OneStep RT-PCR Kit試劑盒提供； PCR檢測的反應程序為：50°C 30min;95°C 15min;94°C 變性30sec，50°C 退火30sec， 72°C 延伸lmin，35個循環;72°C lOmin。
【文檔編號】C12Q1/70GK106048096SQ201610671979
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月16日 公開號201610671979.4, CN 106048096 A, CN 106048096A, CN 201610671979, CN-A-106048096, CN106048096 A, CN106048096A, CN201610671979, CN201610671979.4
【發明人】馬廣源, 凌霞, 肖勇, 鮑靜, 王若瀾, 季亞勇, 吳家林
【申請人】無錫市疾病預防控制中心