檢測登革病毒成熟miRNA的成套引物與方法

檢測登革病毒成熟miRNA的成套引物與方法
【專利摘要】本發明公開了檢測登革病毒成熟miRNA的成套引物與方法。本發明公開的檢測登革病毒成熟miRNA的成套引物由序列表中序列1所示的單鏈DNA、序列2所示的單鏈DNA與序列3所示的單鏈DNA組成。實驗證明，本發明的檢測登革病毒成熟miRNA的成套引物靈敏度高，可達1×10?4μM，特異性好，特異性可達100％，重復性好，能夠從分子量比較小的RNA樣本中穩定而快速、高通量的定量登革病毒成熟miRNA。
【專利說明】
檢測登革病毒成熟mi RNA的成套引物與方法
技術領域
[0001] 本發明設及生物技術領域中檢測登革病毒成熟miRNA的成套引物與方法。
【背景技術】
[0002] miRNA在包括病毒在內的多種生物體內發揮多種重要而關鍵的調控作用。植物、脊 椎動物和無脊椎動物通過表達相關miRNA調控入侵其體內病毒的相應基因表達而發揮祀向 應答和清除病毒的作用。現在已知病毒可用其自身的miRNA來祀向調節其自身的基因表達 來逃避宿主的免疫系統監視和清除，運也是病毒潛伏的重要機制。例如，人類瘤疹病毒第四 型化pstein-Barr virus,邸V)編碼的miR-BART5能夠祀向調節宿主細胞中受P53調節的促 調亡基因 PUMA的表達。上述研究結果表明，病毒入侵宿主后，病毒編碼的miRNA與宿主編碼 的miRNA可能存在W下相互作用方式:宿主的miRNA調節自身基因表達，并且宿主的miRNA祀 向調節病毒基因表達，是其抵抗和清除入侵病毒的機制;病毒的miRNA調節其自身基因的表 達，并且還能調節宿主特定的基因，是病毒逃逸宿主免疫監視和免疫應答的機制。上述 miRNA調控基因表達的相互作用機制可能是病毒與其宿主在漫長的進化過程中形成的。此 夕h病毒miRNA傾向于調控宿主特定的基因表達，W利于其自身的復制和存活，而被病毒 miRNA祀向調控的運些特定的宿主基因往往是參與宿主免疫識別和應答，細胞調亡、細胞周 期或細胞分化;組織生長，組織修復(如纖維化)和血管生成等關鍵過程的基因。而運可能是 不同種屬的病毒共用的寄生于宿主細胞內并維持其自身存活和復制的機制。
[0003] 目前可通過直接法或者間接法檢測miRNA,直接法如巧光法、比色法、電學法。雖然 運些方法能夠減小樣本的檢測差異，但是運些方法靈敏度較低而且在同源miRNA家族中區 分度也較低，因此存在一定的局限性。間接的檢測方法主要包括免疫印跡、基因忍片和RT- PCR，雖然被廣泛應用，但是免疫印跡和基因忍片是半定量，而且靈敏度比較低，需要大量的 起始RNA。基因忍片檢測miRNA具有高通量的優勢和絕對定量的潛能，雖然用恒溫的方法檢 測miRNA獲得了一些成功，但是耗費人力巨大。近來研究表明，實時巧光定量PCR(qRT-PCR) 具有更高的靈敏度和特異度。雖然qRT-PCR在RNA定量方面具有當前最高的靈敏度和擴增效 率，而基于化qMan探針的qRT-PCR由于能高效特異的檢測miRNA而被廣泛應用，但是由于額 外的探針水解作用，TaqMan探針法不能和快速的熱循環法相適應來快速的檢測miRNA。更重 要的是，TaqMan探針法不能用于篩選潛在的miRNA，對新的miRNA來說，新探針的設計不僅花 費巨大，而且也存在技術難題，面臨很多實際困難。雖然采用巧光探針檢測miRNA較為靈敏， 但是實驗步驟復雜，動態檢測范圍有限且檢測同源miRNA的特異度較低。此外，目前較為認 可的基于化qMan探針的檢測方法是用通用或普通的反轉錄引物和巧光探針擴增和檢測多 重miRNA。但是在運些方法中，qRT-PCR的特異度只能通過上游引物來實現，而不能夠完全區 分同源miRNA，因此特異度較低。

【發明內容】

[0004] 本發明所要解決的技術問題是如何快速檢測登革病毒成熟miRNA。
[0005] 為解決上述技術問題，本發明首先提供了檢測登革病毒成熟miRNA的成套引物。
[0006] 本發明提供的檢測登革病毒成熟miRNA的成套引物，由名稱為DENV-I-RT-7的單鏈 DNA、名稱為DENV-I-F-18的單鏈DNA和名稱為DENV-I-R-9的單鏈DNA組成，所述DENV-I-F-18 是如下al)至曰4)中的任一種單鏈DNA:
[0007] al)序列表中序列1所示的單鏈DNA;
[000引 a2)在al)的5/端和/或y端添加一個或幾個核巧酸得到的單鏈DNA;
[0009] a3)與al)或曰2)限定的單鏈DNA具有85 % W上的同一性的單鏈DNA;
[0010]日4化嚴格條件下與al)或日2)限定的單鏈DNA雜交的單鏈DNA;
[0011] 所述DENV-I-R-9是如下bl)至b4)中的任一種單鏈DNA:
[001^ bl)序列表中序列2所示的單鏈DNA;
[0013] b2)在bl)的5/端和/或y端添加一個或幾個核巧酸得到的單鏈DNA;
[0014] b3)與bl)或b2)限定的單鏈DNA具有85%W上的同一性的單鏈DNA;
[001引b4化嚴格條件下與bl)或b2)限定的單鏈DNA雜交的單鏈DNA;
[0016] 所述DENV-I-RT-7是如下cl)至c4)中的任一種單鏈DNA:
[0017] cl)序列表中序列3所示的單鏈DNA;
[0018] c2)在cl)的5/端和/或y端添加一個或幾個核巧酸得到的單鏈DNA;
[0019] c3)與C1)或c2)限定的單鏈DNA具有85 % W上的同一性的單鏈DNA;
[0020] c4)在嚴格條件下與cl)或c2)限定的單鏈DNA雜交的單鏈DNA。
[0021] 上述成套引物中，曰2)所述在al)的5/端和/或3/端添加一個或幾個核巧酸得到的 單鏈DNA為在序列1所示的單鏈DNA的5/端和/或3/端添加一至十個核巧酸得到的單鏈DNA。 b2)所述在bl)的5/端和/或y端添加一個或幾個核巧酸得到的單鏈DNA為在序列2所示的單 鏈DNA的5/端和/或y端添加一至十個核巧酸得到的單鏈DNAdc2)所述在cl)的5/端和/或y 端添加一個或幾個核巧酸得到的單鏈DNA為在序列1所示的單鏈DM的5/端和/或3/端添加 一至十個核巧酸得到的單鏈DNA。
[0022] 運里使用的術語"同一性"指與天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括與本發 明的編碼序列1、序列2或序列3所示的核巧酸序列具有85 %或更高，或90 %或更高，或95 % 或更高同一性的核巧酸序列。同一性可W用肉眼或計算機軟件進行評價。使用計算機軟件， 兩個或多個序列之間的同一性可W用百分比（％)表示，其可W用來評價相關序列之間的同 一性。
[0023] 上述成套引物中，所述嚴格條件是在2XSSC，0.1%SDS的溶液中，在68°C下雜交并 洗膜2次，每次5min，又于0.5 X SSC，0.1 % SDS的溶液中，在68 °C下雜交并洗膜2次，每次 15min;或，0.1 X SS陽(或0.1 X SSC)、0.1 % SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。
[0024] 上述85% W上同一性，可為85%、90%或95% W上的同一性。
[0025] 為解決上述技術問題，本發明還提供了檢測登革病毒成熟miRNA的引物對。
[0026] 本發明提供的檢測登革病毒成熟miRNA的引物對，由所述DENV-I-F-18和所述 DENV-I-R-9 組成。
[0027] 為解決上述技術問題，本發明還提供了檢測登革病毒成熟miRNA的系統。
[0028] 本發明提供的檢測登革病毒成熟miRNA的系統，包括所述成套引物或所述引物對。
[0029] 上述檢測登革病毒成熟miRNA的系統，還可包括進行RNA逆轉錄和/或巧光定量PCR 檢測登革病毒成熟miRNA所需的試劑和儀器。具體來說，檢測登革病毒成熟miRNA的系統可 包括所述成套引物或所述引物對W及進行RNA逆轉錄和/或巧光定量PCR所需要的其它試劑 和儀器。
[0030] 上述系統可由所述成套引物或所述引物對與Ml組成，所述Ml為Mia和/或mb,所述 Mia為進行RNA逆轉錄所需的試劑和/或儀器，所述Mlb進行巧光定量PCR所需的試劑和/或儀 器。
[0031] 所述成套引物和所述引物對中的各單鏈DNAW及進行RNA逆轉錄所需要的其它試 劑、進行巧光定量PCR所需要的其它試劑均可獨立包裝。
[0032] 進行RNA逆轉錄所需要的其它試劑可包括廣州市銳博生物科技有限公司的逆轉錄 試劑盒，如該試劑盒中的2.5XReverse hanscription Mix。
[0033] 進行巧光定量PCR所需要的其它試劑可包括廣州市銳博生物科技有限公司的qPCR 擴增試劑盒，如該試劑盒中的2 XSYBR Green Mix。進行巧光定量PCR所需要的儀器可為巧 光定量PCR儀，如羅氏Li曲t cycler480巧光定量PCR儀。
[0034] 為解決上述技術問題，本發明還提供了所述成套引物的制備方法。
[0035] 本發明提供的所述成套引物的制備方法，包括將所述成套引物中各單鏈DNA獨立 包裝。
[0036] 為解決上述技術問題，本發明還提供了所述引物對的制備方法。
[0037] 本發明提供的所述引物對的制備方法，包括將所述引物對中兩條單鏈DNA獨立包 裝。
[0038] 為解決上述技術問題，本發明還提供了所述系統的制備方法。
[0039] 本發明提供的所述系統的制備方法，包括將所述成套引物中各單鏈DNA獨立包裝。
[0040] 為解決上述技術問題，本發明還提供了檢測登革病毒成熟miRNA的方法。
[0041] 本發明提供的檢測登革病毒成熟miRNA的方法，包括：
[0042] 1)在逆轉錄體系中對待測RNA樣品進行逆轉錄，得到逆轉錄產物;所述逆轉錄體系 中含有所述成套引物中序列3所示的單鏈DNA;
[0043] 2)下述 21)或 22):
[0044] 21)利用所述成套引物中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA對所述逆轉錄產物進 行巧光定量PCR，根據Ct值確定所述待測樣品是否為登革病毒成熟miRNA或是否含有登革病 毒成熟miRNA;
[0045] 22)利用權利要求1所述成套引物中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA對所述逆轉 錄產物進行PCR擴增，根據擴增產物的有無確定所述待測樣品是否為登革病毒成熟miRNA或 是否含有登革病毒成熟miRNA。
[0046] 上述方法中，所述進行巧光定量PCR和所述PCR擴增的退火溫度均可為60°C。
[0047] 上述方法中，所述逆轉錄體系中序列3所示的單鏈DNA的濃度可為扣M。所述逆轉錄 體系具體可包括:RNA、序列3所示的單鏈DNA、2.5 XReverse lYanscription Mix和RNase- 打ee出0化L。進行逆轉錄的溫度可為42°C，時間可為60min。
[0048] 上述方法中，進行巧光定量PCR的體系中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA的濃度 均可為扣M。進行巧光定量PCR的體系中可包括:2XSYBR Green Mix、所述逆轉錄產物、序列 1和序列2所示的兩條單鏈DNA和d地2〇。
[0049] 上述方法中，進行巧光定量PCR的反應條件具體可為：95°C5min; 95°C 10s，60°C 10s，72 °C 10s，45個循環；95 °C 5s，65 °C Imin，97 °C，continus。
[0050] 上述方法中，進行巧光定量PCR可在巧光定量PCR儀上進行，如羅氏Light cycler480巧光定量PCR儀。
[0051] 在本發明的一個實施例中，將巧光定量PCR的Ct值為35作為檢測待測RNA樣品是否 含有或是否為登革病毒成熟miRNA的判定標準:如所述待測RNA樣品的Ct值<35，則所述待測 RNA樣品含有或候選含有登革病毒成熟miRNA，或所述待測RNA樣品為或候選為登革病毒成 熟miRNA;如所述待測RNA樣品的Ct值> 35，則所述待測RNA樣品不含有或候選不含有登革病 毒成熟miRNA,或所述待測RNA樣品不為或候選不為登革病毒成熟miRNA。
[0052] 為解決上述技術問題，本發明還提供了所述成套引物，所述引物對，或所述系統的 下述al)或曰2)的應用：
[0053] al)在檢測登革病毒成熟miRNA中的應用；
[0054] a2)在制備檢測登革病毒成熟miRNA產品中的應用。
[0055] 本發明的成套引物可應用于利用半巢式PCR對登革病毒成熟miRNA的檢測。
[0056] 實驗證明，本發明的成套引物靈敏度高，可達IX 1(TVM，特異性好，特異性可達 100%，重復性好。本發明方法不需要對反應條件進行優化能夠快速擴增，本方法之所W能 夠快速擴增，是因為半巢式介導的擴增片段比較短，而且SYBR Green I不需要對探針進行 水解而快速收集巧光信號。本研究不需要對miRNA預擴增就可W檢測較低濃度的總RNA和從 血清中分離的總RNA樣本。W前，220-450個堿基的miRNA大分子需要同時進行逆轉錄再應用 于研究大樣本RNA的miRNA表達的研究。因為每個miRNA需要較低濃度的RT寡核巧酸片段，在 實時PCR之前還要進行預擴增，尤其是總RNA樣本低于350ng時。而且使用本研究方法可W降 低樣本量和試劑的成本，并且能夠定量miRNA。因此，本研究方法能夠從分子量比較小的RNA 樣本中穩定而快速、高通量的定量miRNA的表達。使用本研究方法可W降低樣本量和試劑的 成本，并且能夠定量m i RNA。因此，本研究方法能夠從分子量比較小的RNA樣本中穩定而快 速、高通量的定量登革病毒成熟miRNA。
【附圖說明】
[0057] 圖1為檢測登革病毒成熟miRNA的成套引物靈敏度的擴增曲線。其中，1-9分別為濃 度為1、1 X 1〇-1、1 X 1〇-2、1 X 1〇-3、1 X 1〇-4、1 X 1〇-5、1 X 1〇-6、1 X 1〇-7 和1 X 1〇-8咖的 miRNA 溶 液。
[0化引圖2為組5的標準曲線。
[0化9]圖3為本發明的半巢式PCR檢測登革病毒的miRNA原理。
【具體實施方式】
[0060]下面結合【具體實施方式】對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡 明本發明，而不是為了限制本發明的范圍。
[0061 ]下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。
[0062] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0063] 實施例1、檢測登革病毒成熟miRNA的成套引物的制備
[0064] 檢測登革病毒成熟miRNA的成套引物，由檢測登革病毒成熟miRNA的引物對與序列 3所示的單鏈DNA( DENV-I-RT-7)組成。
[0065] 檢測登革病毒成熟miRNA的引物對由序列表中序列1所示的單鏈DNA(DENV-I-F- 18)與序列2所示的單鏈DM (DENV-I-R-9)組成，其中各單鏈DM均獨立包裝，摩爾比為1:1。
[0066] 檢測登革病毒成熟miRNA的成套引物中的各單鏈均獨立包裝，序列如下：
[0067] DENV-1-RT-7:5 ' -GCTCAGACAGAAGUCACACTGAGCGGCTTAA-3 '（序列 3) (DENV-1-RT-7 為莖環引物，具體詳見圖3中莖環引物）
[006引 DENV-I-F-18:5 ' -ACACTCCAGCTGGGTAGAAGTCAGGCCGGATT-3 '（序列 1)
[0069] DENV-I-R-9:5'-CTTCTGTCTGGCTTAATC-3'（序列2)
[0070] 實施例2、利用檢測登革病毒成熟miRNA的成套引物檢測登革病毒成熟miRNA
[0071] -、檢測登革病毒成熟miRNA的方法
[0072] 1、血清標本中RNA的提取
[0073] 采用北京天恩澤基因科技有限公司的RNA提取試劑盒進行，具體方法如下：
[0074] (1)采集登革病毒陽性感染者全血室溫靜置1小時；
[00巧](2)2000g離屯、15分鐘，分離血清；
[0076] (3)吸取20化L的血清，加入8(K)化的Trizol(變性溶液），滿旋震蕩混勻；
[0077] (4)將樣本放在冰上5分鐘；
[0078] (5)每個樣本加入16化L的氯仿并滿旋，得到分離相的溶液；
[0079] (6)將樣本放在冰上2分鐘；
[0080] (7)使用微型離屯、機12000g，4度離屯、20分鐘去分離相；
[0081] (8)在一個新的管子里加入化L的糖原，將上層水相40化L轉移到新的管中，然后加 入48化L的異丙醇(沉淀物)混勻；
[0082] (9)置于-20度，放置2個小時；
[0083] (10)沉淀 RNA，12000g，4 度離屯、20 分鐘；
[0084] (11)輕輕移出上清液，用lmL75 %的乙醇沖洗沉淀物；
[00化](12)8000g，4度離屯、分鐘；
[0086] (13)移出上清液，用無水乙醇洗脫沉淀；
[0087] (14)12000g，4度再次離屯、5分鐘；
[0088] (15)移出上清液，干燥RNA沉淀；
[0089] (16)用20化的無 RNA酶水溶解沉淀，得到RNA溶液。
[0090] 2、RNA逆轉錄成miRNA的產物
[0091] 采用廣州市銳博生物科技有限公司的逆轉錄試劑盒進行，具體方法如下：
[0092] RNA逆轉錄成miRNA的反應體系見表1。
[0093] 表UmiRNA RT反應體系
[0094]
[0095]
[0096] 將W上體系混勻后，瞬時離屯、，RT反應程序為:42°C60min，70°C10miruRT反應結束 后，快速置于冰上冷卻，得到RT反應產物。
[0097] 3、miRNA 的 qPCR 反應體系
[0098] 采用廣州市銳博生物科技有限公司的qPCR擴增試劑盒進行，具體方法如下：
[0099] 按照表2配置qPCR反應體系，反應程序按照羅氏Li曲t cycler480巧光定量PCR儀 自帶的SYBR Green I程序進行擴增。
[0100] 條件如下：95。[5111111;95。(：103,60。(：103,72。(：103,45個循環；95。[53,65。(：1111111，97 °C , continus.上機進行檢測。
[0101] 表2、miRNA qPCR反應體系
[01091
[0103] 二、檢測登革病毒成熟miRNA的成套引物的靈敏度
[0104] 為了檢測登革病毒成熟miRNA的成套引物的靈敏度，將由廣州市銳博生物科技有 限公司合成的登革病毒成熟miRNA(序列表中序列4 (5 ' -UAGAAGUCAGGCCGGAUUAAGCC-3 '））用 無 RNase的去離子水進行稀釋，得到濃度為1測的miRNA溶液，然后按10^1做倍比稀釋，分別得 到濃度為1 X 10-1、1 X 10-2、1 X 10-3、1 X 10-4、1 X 10-5、1 X 10-6、1 X 10-7 和1 X 1〇-8測的 miRNA 溶液。按照步驟一中2和3的方法，將RNA溶液分別替換為上述不同濃度的miRNA溶液，檢測登 革病毒成熟miRNA的成套引物的靈敏度。實驗重復=次，結果取平均值(表3和圖1)。
[0105] 表3、檢測登革病毒成熟miRNA的成套引物的靈敏度結果
[0106]
[0107]
[0108] 各濃度下得到的Ct值如表3所示，擴增曲線如圖1所示，取miRNA溶液濃度值的log 值為橫坐標，Ct值為縱坐標，分別利用下述7組數據做標準曲線：
[0109] 組1:濃度為1、1 X 1〇-1、1 X 1〇-2、1X 1〇-3、1X 1〇-4、1X 1〇-5、1X 1〇-6、1X 1〇-7 和1 X 1〇-8的miRNA溶液及其ct值；
[0110] 組2 :濃度為1、1 X 10-1、1 X 10-2、1 X 10-3、1 X 10-4、1 X 10-5、1 X 10-6和1 X 10-7的 miRNA溶液及其Ct值；
[0111] 組3:濃度為1、1 X 10-1、1 X 10-2、1 X 10-3、1 X 10-4、1 X 10-5和1 X 10-6的miRNA 溶液及 其Ct值；
[0112] 組4:濃度為1、1 X 1〇-1、1 X 1〇-2、1 X 1〇-3、1 X 1〇-4和 1 X 1〇-5的miRNA 溶液及其Ct值；
[0113] 組5:濃度為1、1 X 1〇-1、1 X 1〇-2、1 X 1〇-3和1 X 1〇-4的 miRNA 溶液及其 Ct值；
[0114] 組6:濃度為1、1 X 10-1、1 X 10-2和 1 X 10-3 的miRNA 溶液及其Ct 值；
[0115] 組7:濃度為1、1 X 1(T1和1 X 1(T2的miRNA溶液及其Ct值。
[0116] 結果發現，組5、組6和組7的miRNA溶液濃度值的log值與Ct值均呈良好的線性關 系，組1-組4的miRNA溶液濃度值的log值與Ct值均不呈良好的線性關系。組5的標準曲線如 圖2所示，表明檢測登革病毒成熟miRNA的成套引物的可W檢測到的登革病毒成熟miRNA的 濃度為1 X ICTVm，即檢測登革病毒成熟miRNA的成套引物的靈敏度為1 X
[0117] S、檢測登革病毒成熟miRNA的成套引物的特異性
[0118] 為了檢測登革病毒成熟miRNA的成套引物的特異性，選取五份經巧光定量PCR驗證 為登革I型感染者的RNA(樣品編號為1-5)，按照年齡、性別分別配比挑選五份健康人群的 RNA(樣品編號為6-10)，按照步驟一中2的方法進行逆轉錄，然后按照步驟一中3的方法進行 qPCR檢測，實驗重復五次。結果顯示:五份經巧光定量P邸驗證為登革I型感染者的RNA經半 巢式qRT-PCR檢測時的Ct值分別為32.64、33.60、31.73、31.20、和32.62，均<35，五份經巧光 定量PCR驗證為登革陰性的對照組(健康人群）的Ct值分別為40、40、38、40和35，Ct值均> 35，將Ct值為35作為檢測待測樣本是否含有登革病毒成熟miRNA的判定標準:如待測樣本的 Ct值<35，則該待測樣本含有登革病毒成熟miRNA(即陽性），如待測樣本的Ct值>35，則該待 測樣本不含有登革病毒成熟miRNA(即陰性）。結果詳見表4,表明，按照該判定標準檢測登革 病毒成熟miRNA的成套引物的特異性為100%。
[0119] 表4、檢測登革病毒成熟miRNA的成套引物的特異性檢測結果
[0120]
[0121] 注釋:+代表陽性，一代表陰性 0122
[0122] 四、檢測登革病毒成熟miRNA的成套引物的重復性
[0123] 選取同一登革病毒感染者的5份RNA樣本和5份分別來源于5個登革病毒感染者的 RNA樣本，稀釋至同一濃度，利用檢測登革病毒成熟miRNA的成套引物按照步驟一中2和3的 方法進行檢測，檢測結果如表5所示，同一樣品內相對標準偏差(RSD)為0.05% (Ct值的均數 值是23.218，標準差是0.013)，樣品間的相對標準偏差（RSD)為0.15 % (Ct值的均數值是 21.104,標準差是0.032)，總體樣品的相對標準偏差(RSD)為5% (Ct值的均數值是22.16,標 準差是1.114)。重復性實驗表明，在同一樣品內和不同樣品間，利用檢測登革病毒成熟 miRNA的成套引物檢測登革病毒成熟miRNA的重復性較好。
[0124] 表5、檢測登革病毒成熟miRNA的成套引物的重復性
[0125]
【主權項】
1. 檢測登革病毒成熟miRNA的成套引物，由名稱為DENV-I-RT-7的單鏈DNA、名稱為 DENV-I-F-18的單鏈DNA和名稱為DENV-I-R-9的單鏈DNA組成，所述DENV-I-F-18是如下al) 至a4)中的任一種單鏈DNA: al)序列表中序列1所示的單鏈DNA; a2)在al)的5'端和/或3'端添加一個或幾個核苷酸得到的單鏈DNA; a3)與al)或a2)限定的單鏈DNA具有85 %以上的同一性的單鏈DNA; a4)在嚴格條件下與a 1)或a2)限定的單鏈DNA雜交的單鏈DNA; 所述DENV-I-R-9是如下bl)至b4)中的任一種單鏈DNA: b 1)序列表中序列2所示的單鏈DNA; b2)在bl)的5'端和/或3'端添加一個或幾個核苷酸得到的單鏈DNA; b3)與b 1)或b2)限定的單鏈DNA具有85 %以上的同一性的單鏈DNA; b4)在嚴格條件下與bl)或b2)限定的單鏈DNA雜交的單鏈DNA; 所述DENV-I-RT-7是如下cl)至c4)中的任一種單鏈DNA: cl)序列表中序列3所示的單鏈DNA; c2)在c 1)的5'端和/或3'端添加一個或幾個核苷酸得到的單鏈DNA; c3)與c 1)或c2)限定的單鏈DNA具有85 %以上的同一性的單鏈DNA; c4)在嚴格條件下與cl)或c2)限定的單鏈DNA雜交的單鏈DNA。2. 檢測登革病毒成熟miRNA的引物對，由權利要求1中所述DENV-I-F-18和所述DENV-I-R_9組成。3. 檢測登革病毒成熟miRNA的系統，包括權利要求1所述成套引物或權利要求2所述引 物對。4. 根據權利要求3所述的系統，其特征在于:所述系統由權利要求1所述成套引物和Ml 組成，所述Μ1為Ml a和/或Μ1 b，所述Μ1 a為進行RNA逆轉錄所需的試劑和/或儀器，所述Μ1 b進 行熒光定量PCR所需的試劑和/或儀器。5. 權利要求1所述成套引物的制備方法，包括將所述成套引物中各單鏈DNA獨立包裝。6. 權利要求2所述引物對的制備方法，包括將所述引物對中兩條單鏈DNA獨立包裝。7. 權利要求3或4所述系統的制備方法，包括將權利要求1所述成套引物中各單鏈DNA獨 立包裝。8. 檢測登革病毒成熟miRNA的方法，包括： 1) 在逆轉錄體系中對待測RNA樣品進行逆轉錄，得到逆轉錄產物;所述逆轉錄體系中含 有權利要求1所述成套引物中序列3所示的單鏈DNA; 2) 下述21)或22): 21) 利用權利要求1所述成套引物中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA對所述逆轉錄產 物進行熒光定量PCR，根據Ct值確定所述待測樣品是否為登革病毒成熟miRNA或是否含有登 革病毒成熟miRNA; 22) 利用權利要求1所述成套引物中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA對所述逆轉錄產 物進行PCR擴增，根據擴增產物的有無確定所述待測樣品是否為登革病毒成熟miRNA或是否 含有登革病毒成熟miRNA。9. 根據權利要求8所述的方法，其特征在于:所述進行熒光定量PCR和所述PCR擴增的退 火溫度均為60 °C。10.權利要求1所述成套引物，權利要求2所述引物對，或權利要求3或4所述系統的下述 al)或a2)的應用： al)在檢測登革病毒成熟miRNA中的應用； a2)在制備檢測登革病毒成熟miRNA產品中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK106048091SQ201610602108
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月28日 公開號201610602108.7, CN 106048091 A, CN 106048091A, CN 201610602108, CN-A-106048091, CN106048091 A, CN106048091A, CN201610602108, CN201610602108.7
【發明人】滕娟, 李文, 潘林奇, 何聲梅, 周文雄, 陳莉, 陳麗, 李曉杰, 王茂, 談波
【申請人】海南國際旅行衛生保健中心