檢測水稻廣譜抗稻瘟病基因Pike的分子標記及其應用
【專利摘要】本發明公開了檢測水稻廣譜抗稻瘟病基因Pike的分子標記及其應用，屬于分子生物學領域。本發明公開的分子標記為包含DNA片段1、2、3、4、6的分子標記CP?G1328C，包含DNA片段1、2、4、5、6的分子標記CP?G1328T，包含DNA片段1、2、4、6、7的分子標記CP?G1328G’，DNA片段1?7的序列分別如SEQ ID NO.1?7所示。擴增這些分子標記的引物包括Pik?F、Pik?R、G?F、C?R、T?R、G’?R，各引物序列分別如SEQ ID NO.8?13所示。本發明的分子標記或引物可用于水稻抗稻瘟病基因Pike等位基因類型鑒別、種質資源篩選和分子標記輔助選擇育種。
【專利說明】
檢測水稻廣譜抗稻痘病基因 P i ke的分子標巧及其應用
技術領域
[0001] 本發明屬于分子生物學領域，設及檢測水稻廣譜抗稻攝病基因 Pike的分子標記及 其應用。
【背景技術】
[0002] 稻攝病（Ma即aporthe OiTzae)是水稻（0;ryza sativa L.)的重要病害之一，全世 界每年約有10%-30%的水稻產量由于稻攝病菌的入侵而遭受損失。生產實踐表明，利用抗 稻攝病基因培育水稻抗病新品種是目前防治稻攝病最經濟、有效的方法。隨著對水稻抗稻 攝病分子機制的研究，目前已經有20多個抗稻攝病基因被克隆，其中Pike位于水稻第11號 染色體長臂末端，是抗性位點P化上的新等位基因，該基因從釉稻品系湘早143(湖南省水稻 研究所）中克隆，接種鑒定發現該基因對水稻稻攝病具有廣譜持久抗性，通過MS(分子標記 輔助選擇)等手段將該基因導入到R287、日本晴等優質水稻品系中發現，該基因能大幅提高 水稻品系的稻攝病抗性。故而，P化e在水稻的抗病育種中具有很高的應用價值。
[0003] 在水稻基因組中，抗病基因 Pike的稻攝病抗性由兩個相鄰的NBS-LRR類基因 Pike- 1和Pike-2共同決定，利用多序列比對軟件DNAMAN8.0將Pike編碼區序列與其他6個P化等位 基因（Pik、P化h、Pikm、P化9、？143、？11)相比較，發現在？11?5-1。0臟序列的第1328位存在著 一個Pike特異性的SNP位點G1328C。在Pike中該SNP位點對應的核巧酸為G，對應的氨基酸為 色氨酸(W)，而在其他6個已克隆的等位基因（P化、Pi化、Pikm、P化口、？143、？11)中該5肥位點 對應的核巧酸為C，編碼氨基酸為絲氨酸(S)，故而通過檢測SNP位點G1328C對應的核巧酸類 型能有效區分Pike和其他6個已克隆的P化等位基因。然而，通過研究發現自然界中SNP位點 G1328C對應的核巧酸類型并非只存在G、C兩種類型，且現有分子標記不能對SNP位點G1328C 對應的其他核巧酸的類型進行有效檢測。
【發明內容】
[0004] 本發明隨機選取了日本晴、岳泰B、芒恢等雜交稻骨干親本材料并對Pike-1等位基 因的部分核巧酸序列進行了測序分析，發現根據Pike-1中SNP位點C1328C對應的核巧酸類 型及其側翼區序列可W將自然界中Pike的等位變異劃分為4種類型（6-*796、(：-*796、1'- type、G'-type)，且序列比對發現同種類型中Pike等位基因的核巧酸序列相似度較高，而不 同類型之間的核巧酸序列相似度較低。同時本發明根據此序列分析結果，利用SNP位點 G1328C對應的核巧酸及SNP位點側翼區核巧酸序列開發出了3個特異性檢測Pike的共顯性 分子標記，運些共顯性分子標記對抗稻攝病基因 Pike的檢測具有特異性，同時能有效區分 Pike位點4種類型的等位變異。與前人開發的特異性檢測Pike的dCAPS標記d-G1328C相比， 該共顯性標記具有檢測成本低廉、操作簡單、應用范圍廣的特點。同時，由于運3個分子標記 位于Pike的內部，在MAS育種中，運些分子標記與抗病基因 Pike共分離，和Pike連鎖性分子 標記RM224的檢測結果相比，運些標記對Pike的檢測結果更為準確、可靠。
[0005] 本發明的目的在于提供3個檢測水稻廣譜抗稻攝病基因 Pike的分子標記。本發明 的目的還在于提供擴增所述分子標記的引物，w及所述分子標記或引物的應用。
[0006] 本發明的目的通過下述技術方案實現：
[0007] 本發明隨機選取了包括93-11、岳泰B在內的12份雜交稻育種骨干親本，并對運些 材料中的Pike-1等位基因編碼區1168bp-1828bp使用引物組合Pik-F和TG-R(表1)進行了 RCR擴增、克隆、測序。經過PCR擴增，從培矮645、1?287、8331113^3、嘉814和麗江新團黑谷5份 材料中獲得了長度為661bp的DNA片段，序列比對發現，運5份測序材料及Pik-l、Pi化-1、 Pikm-l、Pikp-l、Piks-l和Pil-5C在該區域與Pike-1的序列相似度達到了99% W上，但在 SNP位點G1328C處，該5份材料與Pikm-1、P化S-1、Pil-l、Pik-l、Pikp-l、PiWi-l 中的核巧酸 一致，全部為堿基C(圖1);從93-11、岳泰B、IR6、黃華占及合豐粘5份材料中獲得了長度為 640bp的DNA片段，序列比對發現，運5份材料與Pike-1在該區域的序列相似度僅為77.6%- 78 %，但與Pik-Nip(日本晴中P化等位基因）的相似度達到了99%，在SNP位點G1328C處，該5 份材料與Pik-Nip中的核巧酸一致，全部為堿基T;從福恢838和芒恢中獲得了長度為670bp 的DNA片段，運2份材料與Pike-1在該區域的序列相似度僅為73.5%，與Pik-Nip的相似度為 73.8%，雖然在G1328C處，來自于運2份材料的等位基因與Pike-1相同（圖1)，但是在SNP位 點附近其核巧酸序列與Pike相似度較低。
[0008] 為后續描述方便，本發明根據上述序列分析結果將Pik位點的等位變異劃分為4種 類型：1 )G-type: SNP位點G1328C對應的堿基為G，如：Pike; 2)C-type: SNP位點G1328C對應的 堿基為C，如:Pikm-1、P化S-1、Pi 1-1、Pik-l、Pikp-l、P化h-1及來源于培矮64S等5份材料的 P化等位基因；3)T-type: SNP位點G1328C對應的堿基為T，如Pik-Nip及來源于93-11等5份材 料的P化等位基因；4)G'-type:雖然SNP位點G1328C對應的堿基為G，但是核巧酸序列與Pike 的相似度較低，如來源于芒恢和福恢838中的P化等位基因（圖1)。
[0009] 本發明根據上述序列分析結果及SNP位點G1328C對應的核巧酸類型，開發出3個能 夠特異性檢測水稻抗稻攝病基因 Pike的共顯性分子標記CP-G1328C、CP-G1328T、CP- G1328G'。其中，分子標記CP-G1328C是使用引物組合Pik-F、Pik-R、G-F和C-R從水稻基因組 中擴增出來的DNA片段，其包含了 DNA片段1、DNA片段2、DNA片段3、DNA片段4和DNA片段6，該 分子標記在Pike(G-type)與C-type等位基因間表現為共顯性;分子標記CP-G1328T是使用 引物組合Pik-F、P化-R、G-F和T-R從水稻基因組中擴增出來的DNA片段，其包含了 DNA片段1、 DNA片段2、DNA片段4、DNA片段5和DNA片段6,該分子標記在Pike(G-type)與T-type等位基因 間表現為共顯性;分子標記CP-G1328G'是使用引物組合Pik-F、Pik-R、G-F和G '-R從水稻基 因組中擴增出來的DNA片段，其包含了 DNA片段1、DNA片段2、DNA片段4、DNA片段6和DNA片段 7,該分子標記在Pike(G-type)與G'-type等位基因間表現為共顯性。DNA片段1-7的序列分 別如沈Q ID NO. 1-7所示。
[0010]擴增上述共顯性分子標記包含的片段所使用的引物序列如下：
[0011] Pik-F:5 '-GAAGAATGGGAAGTCATCAGA-3 '；
[0012] Pik-R:5'-ACCTTCTGCTGCTTTCTCTTC-3'；
[0013] G-F:5 '-GATCTAGATAATAATGATGCTTTGTG-3 '；
[0014] C-R:5 '-GCTATCCTCCAAGACATCGA-3 '；
[0015] T-R:5 '-CTTGCTACCTTGTCACACAACA-3 '；
[0016] G'-R:5 '-AGACCTCTCTATTGTACTGT-3 '。
[0017] 上述共顯性標記或引物在水稻抗稻攝病基因 Pike等位基因類型鑒別、種質資源篩 選及分子標記輔助選擇育種中的應用。
[0018] 對于共顯性分子標記CP-G1328C、標記CP-G1328T和標記CP-G1328G'，無論何種類 型的等位基因存在，兩個外部引物Pik-F和Pik-R都會擴增出一條共有片段，其中G-type和 C-type等位基因的共有片段長為558bp，T-type和G'-type等位基因的共有片段長度分別為 549bp和576bp。對于分子標記CP-G1328C，當G-type等位基因存在時，引物組合G-F和Pik-R 會擴增出G-type等位基因特異性片段，該片段長度為423bp;而當C-type等位基因存在時， 引物組合Pik-F和C-R會擴增出一條長度為179bp的C-type等位基因特有片段。雖然使用該 標記檢測4種等位基因時擴增的DNA片段長度存在差異，但是在使用低濃度瓊脂糖凝膠對擴 增產物進行檢測時，該分子標記只能在G-type和C-type兩種類型的等位基因之間表現出共 顯性。
[0019] 其次是共顯性分子標記CP-G1328T，當G-type等位基因存在時，引物組合G-F和 P化-R會擴增出條長度為423bp的G-type等位基因特異性片段，而對于C-type等位基因則沒 有特異性的片段被擴增出來。對于T-type等位基因，引物組合Pik-F和T-R會擴增出一條 182bp的T-type等位基因特異性片段。在實際應用中，分子標記CP-G1328T僅會在G-type和 T-type等位基因間表現出共顯性。
[0020] 對于第3個共顯性分子標記CP-G1328G'，該標記在G-type和c-type等位基因中所 能擴增出的DNA片段和分子標記CP-G1328T完全一致。但是當G'-type等位基因存在時，引物 組合G'-R和Pik-F能擴增出一條G'-type等位基因特異性的DNA片段，該DNA片段長度為 19化P。故而，在實際應用中，分子標記CP-G1328G'僅能在Pike (G-type)和G'-type等位基因 之間表現出共顯性，而在其他組合間表現出顯性。
[0021] 雖然上述3個分子標記是依據同一個SNP位點及其側翼區所開發的，都能有效的檢 ^UPike(G-type)，但是其在Pike不同等位基因類型間的表現不同，故而在實際應用中需根 據水稻材料中所含Pike等位基因的類型進行選擇。
[0022] 本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果:本發明的共顯性分子標記引物能 夠特異性的對水稻基因組DNA進行標記鑒定，檢測水稻材料基因組DNA中廣譜抗稻攝病基因 Pike的存在狀態（純合或雜合），檢測準確性高，與傳統的酶切、測序及抗病鑒定等方法相 比，具有成本低廉、耗時少、操作簡單的優點。
【附圖說明】
[0023] 圖1 SNP位點G1328C附近核巧酸序列比對結果圖。Mk-l、P化h-1、Pikm-l、Pikp-l、 P化s-l、Pil-5C為已克隆6個Pike-1的等位基因。SNP位點G1328切日黑色方框所示。
[0024] 圖2檢測Pike等位基因類型的分子標記開發原理圖。
[0025] 圖3檢測共顯性分子標記設計結果的瓊脂糖凝膠電泳圖。a:共顯性分子標記CP- G1328C的檢測結果；b :共顯性分子標記CP-G1328T的檢測結果；C :共顯性分子標記CP- G1328G' 的檢測結果；d: dCAPS標記d-G1328C的檢測結果。M:DL2000(hKaRa，Ja噸an); 1:湘 早143(Pike);2:I拙Lkm(Pik-m);3:I拙Lk-ka(Pik);4:I拙Lks-F5(Pik-s);5:IRBLl-CL (Pi 1);6:1邸Lkp-K60(Pik-p); 7: IRBUdi-K3(Pik-h); 8:麗江新團黑谷；9:日本晴；10:培矮 645;11:福恢838;12:岳泰8;13:136;14:8日3111日113;15:嘉814;16:合豐粘；17:芒恢；18: R287〇
[0026] 圖4分子標記檢測水稻育種株系基因型的電泳圖。a分子標記RM224對14份育種株 系基因型檢測的電泳圖;b分子標記CP-G1328C對14份育種株系基因型檢測的瓊脂糖凝膠電 泳圖。圖中由左至右，M:分子量標記DL2000 (TaKaRa Japan); 1:湘早143 (Pike供體）；2 : R287;3:75-1-127;4:B505;5-18:皿1-HD14。
【具體實施方式】
[0027] 下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限 于此。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
[0028] 本發明利用水稻廣譜抗稻攝病基因 Pike、Pil、Pik、Piks、Pikm、Pikp、Pildi及部分 材料中Pike-1同源序列在編碼區1328位及其側翼區的核巧酸序列差異（圖1)，針對SNP位點 G1328C設計出3個特異性檢測Pike (G-type)的分子標記，每個分子標記包含了 5個DNA片段， 其中分子標記CP1-G1328C包含了 DNA片段1、DNA片段2、DNA片段3、DNA片段4和DNA片段6;分 子標記CP-G1328T包含了 DNA片段1、DNA片段2、DNA片段4、DNA片段5和DNA片段6;分子標記 CP-G1328G'包含了 DNA片段1、DNA片段2、DNA片段4、DNA片段6和DNA片段7。相關DNA片段序列 如下：
[00巧]DNA片段1的序列(G-type和C-type的共有DNA片段，長度558bp，沈Q ID N0.1)，
[0030] DM片段2的序列（P化e(G-type)特有片段，長度423bp，沈Q ID N0.2)，
[0031] DM片段3的序列（C-type特有片段，長度179bp，沈Q ID NO.3)，
[0032] DNA片段4的序列（T-type特有片段，長度549bp，沈Q ID N0.4)，
[0033] DNA片段5的序列(T-type特有片段，長度182bp，沈Q ID NO.5)，
[0034] DNA片段6的序列(G'-type特有片段，長度57化p，沈Q ID N0.6)，
[0035] DNA片段7的序列(G，-type特有片段，長度192bp，沈Q ID NO.7)。
[0036] 根據圖2中所示的標記開發原理，依據編碼區1328位核巧酸類型及SNP位點側翼區 序列差異，設計了特異性檢測Pike的分子標記的引物(表1)。
[0037] 表1本發明中所使用的引物序列及功能信息
[00；3 引
[0039] 實施例1共顯性分子標記在區分Pike及其他類型等位基因中的應用
[0040] 本發明使用Pike的供體材料湘早143,含有Pike等位基因的6個單基因系：IRBLkm- Ts(Pikm)、IRB化-Ka(Pik)、IRB化s-F5(Piks)、IRBL1-化（Pi 1)、IRBLkp-K60(P化P)、IRBUdi- K3(Pi化），10個目標區段已測序水稻品系（圖1):麗江新團黑谷、培矮64S、福恢838、岳泰B、 IR6、Basmatis、嘉814、合豐粘、芒恢、R287及日本晴（T-type)，對本發明中的分子標記開發 結果進行驗證，同時使用dCAI^標記d-Gl 328C作為對照。
[0041] 利用CTAB法提取上述水稻材料的基因組DNA，將擴增每個分子標記所含DNA片段的 4條引物（CP-G1328C:Pik-F、Pik-R、G-F、C-R;CP-G1328T:Pik-F、Pik-R、G-F、T-R;CP- G1328G'：P化-F、P化-R、G-F、G'-R)分別等量混合，而后將混勻后的引物作為PCR擴增體系中 的引物，對上述材料的基因組DNA進行PCR擴增，PCR擴增使用2XES Taq Master Mix (CWBI0，Beijing,化 ina)，擴增條件為：94°C5min 預變性后，94°C45s、50°C45 巧日 72°C45s 連 續30個循環；隨后72°(：10111111，41：5111111。？〇?產物使用2%的瓊脂糖凝膠進行檢測，檢測結果 見圖3。
[0042] 從圖3可W看出，對于共顯性分子標記CP-G1328C、標記CP-G1328T和標記CP- G1328G'，無論是何種類型的等位基因存在，都會擴增出一條DNA片段，其中G-type(泳道編 號1)和C-type (泳道編號2-8，10、14、15、18)等位基因的DNA片段長為558bp，T-type (泳道編 號9、12、13、16)和6'-*796(泳道編號11、17)等位基因的共有片段長度分別為54機9和 576bp〇
[0043] 對于共顯性標記CP-G1328C，在含有等位基因 Pike(G-type)的材料湘早143中，該 共顯性標記能夠擴增1條Pike(G-type)特有片段(423bp);在含有C-type等位基因的材料 中，能夠擴增1條C-type等位基因特有片段（179bp)(圖3a)。故而該標記在Pike(G-type)和 C-type等位基因之間表現為共顯性。
[0044] 對于共顯性標記CP-G1328T，在含有等位基因 Pike(G-type)的材料湘早143中，該 共顯性標記能夠擴增1條Pike(G-type)特有片段(423bp);在含有T-type等位基因的材料 中，能夠擴增1條T-type等位基因特有片段（182bp)(圖3b)。故而該標記在Pike (G-type)和 T-type等位基因之間表現為共顯性。
[0045] 對于共顯性標記CP-G1328G'，在含有等位基因 Pike(G-type)的材料湘早143中，該 共顯性標記能夠擴增1條Pike (G-type)特有片段(423bp);在含有G'-type等位基因的材料 中，能夠擴增1條G ' -type等位基因特有片段（192bp)(圖3c)。故而該標記在Pike (G-type)和 G'-type等位基因之間表現為共顯性。
[0046] 上述結果表明，運些新開發的共顯性分子標記除了可W對Pike和其他已克隆的6 個等位基因（Pil、P化、Pikm、P化s、Pikp、Pi化)進行有效區分，還能有效區分4種不同類型的 Pike-1等位變異，與dCAPS標記d-G1328C(圖3d)相比，運3個分子標記的應用范圍更廣且操 作更為簡單。
[0047] 實施例2共顯性分子標記在種質資源篩選中的應用
[0048] 本發明中分子標記的另一功能是從稻種資源中篩選含有Pike的抗原材料，為驗證 該功能，本發明隨機選取了 320份水稻品系，對本發明中的分子標記CP-G1328C、CP-G1328T 和CP-G1328G'的功能進行了驗證。通過分子標記檢測，在320份材料中，共發現含有G-type 等位基因的材料1份，含有C-type等位基因的材料129份，含有T-type等位基因的材料131 份，含有G ' -type等位基因的材料59份。
[0049] 由于酶切是檢測SNP位點的最有效方法之一，dCAPS標記d-G1328C被用來檢驗本發 明中的分子標記對320份材料SNP位點G1328C檢測的準確性，結果表明本發明的分子標記對 上述材料的檢測結果正確。由于d-G1328C在含有T-type和G'-type等位基因的材料中不能 有效擴增，本發明隨機選取了 13份T-type和6份G'-type水稻品系進行了測序，測序結果證 實了本發明中分子標記對上述材料的檢測結果正確。
[0050] 由于本發明中分子標記為特異性檢測Pike的共顯性分子標記，為了驗證標記對 Pike檢測的特異性，本發明對篩選出的含有G-type等位基因材料898B中的Pike-1使用3對 擴增片段具有重疊的引物對化6-巧、邸-11?，邸-2。、邸-21?，邸-3。、邸-310(表1)進行了？〇?擴 增、測序，并將測序結果與Pike的核巧酸序列進行比較，結果發現，水稻品系898B中確實含 有廣譜抗稻攝病基因 Pike。
[0051] 上述結果表明，本發明中的分子標記能夠特異性的檢測Pike,同時本發明中的分 子標記能夠有效區分PA位點4種不同類型(G-type、C-type、T-type、G '-type)的等位基因， 且擴增條帶清晰明亮、檢測方法簡單，故而能夠有效應用在水稻的抗病育種中。
[0052] 實施例3共顯性分子標記在分子標記輔助選擇育種中的應用
[0053] 本發明選取了由湘早143(Pike抗原)衍生的14份水稻育種株系HD1-HD14,對本發 明中的分子標記在抗病育種中的功能進行了驗證。首先使用與Pike緊密連鎖的分子標記 RM224對育種株系進行檢測，檢測結果表明14個育種株系中都含有Pike(圖4曰）。但使用本發 明中的分子標記CP-G1328C鑒定發現，育種株系皿5、皿12、皿13、皿14中無廣譜抗稻攝病基 因 Pike(圖4b)。為了驗證兩個標記的檢測結果，在湖北恩施采用自然誘發法對R287、湘早 143及育種株系HD1-HD14進行了稻攝病抗性評估(表2)，對比分子標記檢測結果發現，本發 明中分子標記所檢測的基因型結果與抗性鑒定表型結果相符合。此結果表明，相對于Pike 連鎖性的分子標記RM224,本發明中的分子標記對Pike的鑒定結果更為準確。
[0054]表2水稻育種株系稻攝病抗性評估及分子標記檢測結果
[0化5]
[0056] R:抗病;MR:中抗;MS:中感;S:感病。V'Pike檢測陽性；Pike檢測陰性。
[0057]上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 檢測水稻廣譜抗稻瘟病基因 Pik的分子標記，其特征在于：為〇?-61328(：、〇?-G1328T、CP-G1328G' ；其中，分子標記CP-G1328C包含了DNA片段 1、DNA片段2、DNA片段3、DNA 片段4、DNA片段6;分子標記CP-G1328T包含了 DNA片段1、DNA片段2、DNA片段4、DNA片段5、 DNA片段6;分子標記CP-G1328G '包含了DNA片段1、DNA片段2、DNA片段4、DNA片段6、DNA片段 7;DNA片段1-7的核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 1-7所示。2. 擴增權利要求1所述的分子標記的引物，其特征在于:為Pi k-F、P ik-R、G-F、C-R、T-R、 G'-R，各引物序列如下： Pik-F:5，-GAAGAATGGGAAGTCATCAGA-3，； Pik-R:5 '-ACCTTCTGCTGCTTTCTCTTC-3 '； G-F:5 '-GATCTAGATAATAATGATGCTTTGTG-3 '； C-R:5 '-GCTATCCTCCAAGACATCGA-3 '； T-R:5 '-CTTGCTACCTTGTCACACAACA-3 '； G '-R:5 '-AGACCTCTCTATTGTACTGT-3 '； 其中，引物組合Pik-F、Pik-R、G-F和C-R用于擴增分子標記CP-G1328C，引物組合Pik-F、 Pik-R、G-F和T-R用于擴增分子標記CP-G1328T，引物組合Pik-F、Pik-R、G-F和G'-R用于擴增 分子標記CP-G1328G'。3. 權利要求1所述的分子標記或權利要求2所述的引物在水稻抗稻瘟病基因 Pi如等位 基因類型鑒別、種質資源篩選、分子標記輔助選擇育種中的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK106048069SQ201610674761
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月16日 公開號201610674761.4, CN 106048069 A, CN 106048069A, CN 201610674761, CN-A-106048069, CN106048069 A, CN106048069A, CN201610674761, CN201610674761.4
【發明人】章志宏, 何永剛, 孟芬, 張利攀
【申請人】武漢大學