Sfrp4基因啟動子甲基化檢測的引物和檢測方法
【專利摘要】本發明公開了SFRP4基因啟動子區多CG位點甲基化檢測的引物和方法包括：(1)擴增SFRP4基因啟動子區的正、反向兼并引物SEQ NO 1和SEQ NO 2；(2)上述引物擴增的目標序列包括至少5個CG位點；(3)針對石蠟切片DNA片段化嚴重，而亞硫酸氫鹽修飾飽和狀態下仍呈現有效模板濃度低的問題，將Touch?down PCR擴增和Sanger測序相結合，可顯著提高檢測靈敏度。本發明具有特異性高，準確度高以及低污染風險等優點，可檢測腫瘤患者手術石蠟切片SFRP4基因啟動子區多個CG位點甲基化，結果可指導醫生進行相關疾病的預后評估。
【專利說明】
SFRP4基因啟動子甲基化檢測的引物和檢測方法
技術領域
[0001] 本發明屬生命科學和生物技術領域，是一種檢測SFRP4基因啟動子甲基化狀態的 引物和檢測方法。
【背景技術】
[0002] SFRPs(Secreted Frizzled-related Proteins)為分泌型蛋白質，全稱為分泌型 卷曲相關蛋白，該家族成員SFRP1-5-樣，大約由300多個氨基酸組成，含有一個信號膚、氨 基端附近的CRD區域、一個親水簇基端。CRD區域大約由110個氨基酸殘基組成，該區域內含 有10個高度保守的半脫氨酸，與化izzled胞外CRD區域有30-40%的同源性。作為分泌型蛋 白質，SFRPs均無 Frizz led的7次跨膜區域(Frizz led即通該區域被固定在細胞膜上），主要 位于細胞膜表面或基質中。由于沒有跨膜區域，因此SFRP4無法進行Wnt信號向細胞內的轉 導過程。研究者采用巧光標記4.1化的含有SFRP4編碼序列的基因組片斷進行原位雜交，顯 示人類SFRP基因位于8p21。在對其它生物的檢測中，他們發現SFRP4基因存在于猴、豬、贍蛛 等，而在果蛹、酵母等生物沒有檢出。結果提示SFRP4在脊椎動物高度保守，無脊椎動物卻不 存在該基因。SFRP4在胚胎發育過程中的表達具有獨特時空特點，且其表達亦具有組織特異 性，于屯、臟、腎臟、腸道及腦部表達較多。
[0003] 近年的研究發現，SFRP4基因啟動子區的高甲基化導致基因沉默可能與多種腫瘤 的發生有關，在結腸癌、宮頸腺癌、子宮頸癌、膜腺癌、大腸癌、間皮瘤、食管鱗癌、責口腺癌 等腫瘤中都發現了 SFRP4基因啟動子區的高甲基化。國外有相關文獻報道在宮頸癌化La化d 和化Ski細胞中存在SFRP4的表達缺失，SFRP4在化La化d和化Ski細胞中高度甲基化。
[0004] 對侵襲性乳腺癌中SFRP4的表達情況進行研究，發現80 %的病例存在SFRP4表達消 失。研究者在對結腸癌的研究中發現SFRP1、2、3、4存在啟動子高度甲基化。原發性結直腸癌 甲基化頻率82 %，76 %患者SFRP4表達下調，研究顯示SFRP4表達下調主要由于其啟動子甲 基化所致。其他一些學者在另外一些原發性腫瘤中亦檢測出SFRP4甲基化及表達消失，包括 卵巢癌、食管癌、前列腺癌、肺癌。研究者在進一步的研究中發現結直腸癌癌前病變、腺瘤也 存在SFRP4甲基化和表達下調。此外由于瘤旁組織亦存在表達減少，提示SFRP4表達被抑制 發生在一定的粘膜區域內而不是單個細胞。所有運些研究顯示，SFRP4基因突變在腫瘤中并 不常見。而SFRP4在多種腫瘤中則存在較高頻率的甲基化及表達下調。研究顯示SFRP4在乳 腺癌中表達下調，與腫瘤的侵襲有關，SFRP4表達多的淋己結轉移少，與不良預后相關。研究 者也發現:SFRP4表達消失是原發性乳腺癌早期事件，多變量分析證實腫瘤分期與SFRP4表 達相關性，SFRP4表達消失在乳腺癌早期階段與不良預后相關。因此，SFRP4表達在乳腺癌常 見且可被作為一種新的預后標志物在乳腺癌的早期階段。
[000引目前對于SFRP4啟動子甲基化檢測的常規方法有：甲基化特異性PCR(MSP)、亞硫酸 氨鹽焦憐酸測序、甲基化敏感性高分辨率烙解曲線分析(MS-HRM)，甲基化特異性PCR(MS- PCR)等。其中MSP法是使用PCR擴增檢測來判斷樣本是否存在甲基化，該法實用且普遍，但假 陽性較高，穩定性較差;亞硫酸氨鹽焦憐酸測序因其操作繁瑣，因此不適合大批量檢測;MS- HRM是通過將單堿基序列的差異轉變成烙解曲線的差異，從而判斷是否存在甲基化，運種方 法對儀器的要求頗高，需要帶HRM模塊的巧光定量PCR儀，同時該法只能分析檢測片段整體 甲基化狀態，而不能明確每個CG位點的甲基化狀態;MS-PCR是基于PCR開發的技術，主要是 在檢測中加入了 TaqMan探針，從而保證了較高的靈敏度和準確度，但其對于多個甲基化位 點的檢測，也只能做到整體化分析，同時探針成本較高，因此該法較適用于少數位點大量樣 本檢測。
[0006] 本發明采用Touch-down PCR擴增和Sanger測序法SFRP4啟動子甲基化檢測，針對 石蠟切片DNA片段化嚴重，在造成亞硫酸氨鹽處理飽和的情況下，仍出現的有效模板濃度很 低的情況，Touch-down PCR擴增可確保正、反向擴增引物與樣本DNA模板的結合發生在最互 補的序列之間，當退火溫度降低到非特異性擴增發生的水平時，特異性擴增產物在此時已 經有一個幾何數的起始優勢，豐度較高，在剩余的擴增反應中，特異性擴增產物與非特異擴 增產物產生競爭，但是因非特異性擴增產物豐度較低，特異性擴增產物始終優先擴增，從而 產生單一的占主導地位的特異性擴增產物。而Sanger測序法是檢測基因突變的金標準，檢 測結果準確性高，并且很大程度上地節省了檢測成本。
[0007] 由于DNA序列在經亞硫酸鹽處理后，其部分C堿基會轉變為T，導致序列區域內CG含 量和TM值發生較大程度的變異，進而影響常規引物設計軟件在其序列上獲得理想的引物序 列。因此，本發明中PCR采用的擴增引物W及測序引物均為自行設計，其中測序引物使用兼 并堿基，從而使得陰性、陽性都可在同一體系擴增。同時，擴增引物的使用比例經過多次優 化實驗，相對于其它文獻和軟件設計的引物具備了更加理想的擴增效率。
[0008] 因此，本發明的檢測方法具備了檢測出率高，檢測穩定性好，準確度高W及低污染 風險等優勢。檢測結果將有助于預見相關腫瘤疾病的早期，同時具有潛在的指導臨床醫生 個體化治療的作用。
【發明內容】
[0009] 為解決上述技術問題，本發明采用的一個技術方案是:設計用于檢測SFRP4基因啟 動子甲基化的引物，包括一對特異性擴增兼并引物SEQ NO 1和SEQ NO 2,其序列為：
[0010] 沈Q NO 1:5 '-CGGAGTTCGGGATTGGAGTTGTT-3 '；
[0011] 沈Q NO 2:5 '-CTTCCTACCACCCTCATCTTTCGCTA-3 '；
[0012] 所述沈Q NO 1和沈Q NO 2也可作為測序引物。
[0013] 本發明提供的另一個技術方案是：用于檢測SFRP4基因啟動子甲基化的方法，包 括：
[0014] (1)提取樣本中的DNA;
[0015] (2)將步驟(1)中提取的DNA進行亞硫酸氨鹽處理；
[0016] (3似步驟(2)中的DNA作為模板，使用SEQ NO巧日SEQ NO 2擴增SFRP4基因片段，獲 得PCR擴增產物；
[0017] (4)對步驟(3)中獲得的產物測序；
[0018] (5)根據步驟(4)的測序結果，得到序列CG位點的甲基化結果；
[0019]其中，PCR擴增反應條件為:第一階段，92-97 °C預變性5-15min;第二階段，變性溫 度92-97°C30sec，退火溫度62-66°C90sec，延伸溫度72°C30sec，循環12-18次，每循環一次， 所述退火溫度降低0.5°C ;第=階段，變性溫度92-97°C30sec，退火溫度53-57°C30sec，延伸 溫度72°C30sec，循環24-34次;第四階段，72°C10min;第五階段，擴增反應結束，擴增產物在 4°C下保存。
[0020] 所述的測序為Sanger測序，測序引物為：
[0021] 沈Q NO 1:5 '-CGGAGTTCGGGATTGGAGTTGTT-3 '；
[0022] 沈Q NO 2:5'-CTTCCTACCACCCTCATCTTTCGCTA-3'；
[0023] 該方法檢測的樣本為石蠟切片樣本、全血樣本、新鮮組織樣本或細胞系樣本。
[0024] 更進一步地，本發明提供一種用于檢測SFRP4基因啟動子甲基化的試劑盒的技術 方案，包括亞硫酸鹽修飾、PCR擴增試劑W及Sanger測序試劑、陽性對照品、陰性對照品，其 中：
[00巧](1)亞硫酸鹽處理試劑包括：Bisulfite Mix、腳ase free wate;r、DNA Protect Buffer；
[00%] (2)PCR擴增試劑：10沖CR Buffer、2mM dNTP、5*Q Solution Buffer、5U/ul Taq 酶、lOuM擴增引物(SEQ NOl、沈Q NO 2)W及滅菌水；
[0027] (3)酶純化試劑:EX0I、CIP;
[002引（4)測序試劑:Bigdye Terminator V3.1、無水乙醇、EDTA、及測序引物（SEQ NO 1、 沈Q NO 2)。
[0029] 其中，陽性對照品為經過所有胞喀晚甲基化修飾的全甲基化正常人群血液基因組 DNA，陰性對照品為正常人群血液基因組DNA。
[0030] 本發明采用Touch-down PCR擴增和Sanger測序法SFRP4啟動子甲基化檢測，針對 石蠟切片DNA片段化嚴重，在造成亞硫酸氨鹽處理飽和的情況下，仍出現的有效模板濃度很 低的情況，Touch-down PCR擴增可確保正、反向擴增引物與樣本DNA模板的結合發生在最互 補的序列之間，當退火溫度降低到非特異性擴增發生的水平時，特異性擴增產物在此時已 經有一個幾何數的起始優勢，豐度較高，在剩余的擴增反應中，特異性擴增產物與非特異擴 增產物產生競爭，但是因非特異性擴增產物豐度較低，特異性擴增產物始終優先擴增，從而 產生單一的占主導地位的特異性擴增產物。而Sanger測序法是檢測基因突變的金標準，檢 測結果準確性高，并且很大程度上地節省了檢測成本。
[0031] 由于DNA序列在經亞硫酸鹽處理后，其部分C堿基會轉變為T，導致序列區域內CG含 量和TM值發生較大程度的變異，進而影響常規引物設計軟件在其序列上獲得理想的引物序 列。因此，本發明中PCR采用的擴增引物W及測序引物均為自行設計，其中測序引物使用兼 并堿基，從而使得陰性、陽性都可在同一體系擴增。同時，擴增引物的使用比例經過多次優 化實驗，相對于其它文獻和軟件設計的引物具備了更加理想的擴增效率。
[0032] 因此，本發明的檢測方法具備了檢測出率高，檢測穩定性好，準確度高W及低污染 風險等優勢。檢測結果將有助于預見相關腫瘤疾病的早期，同時具有潛在的指導臨床醫生 個體化治療的作用。
【附圖說明】
[0033] 圖1是本發明的檢測基因甲基化的方法檢測標準序列，（A)圖為陰性標準序列，（B) 圖為陽性標準序列。
[0034] 圖2是本發明的檢測基因甲基化的方法一較佳實施例中陰性檢測的結果圖（A)和 陽性結果的圖（B)。
【具體實施方式】
[0035] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應當注意的是，實施例中未說明的常規 條件和方法，通常按照所屬領域實驗人員常規采用方法:譬如，奧斯柏和金斯頓主編的《精 編分子生物學實驗指南》第四版，或者按照制造廠商所建議的步驟和條件。
[0036] 實施例1
[0037] SFRP4基因啟動子區CG島甲基化檢測試劑盒包括一對特異性兼并引物SEQ NO 1和 SEQ NO 2,同時，此引物為測序引物，其堿基序列如下所示：
[0038] 沈Q NO 1:5 '-CGGAGTTCGGGATTGGAGTTGTT-3 '；
[0039] 沈Q NO 2:5 '-CTTCCTACCACCCTCATCTTTCGCTA-3 '；
[0040] SFRP4基因啟動子區CG島甲基化檢測試劑盒還包括如下試劑：
[0041 ] (1)亞硫酸鹽處理試劑：Bisulfite Mix、R化se free wate;r、DNA Protect Buffer；
[0042] (2)PCR擴增試劑：10沖CR Buffer、2mM dNTP、5*Q Solution Buffer、5U/ul Taq 酶、lOuM擴增引物(SEQ NOl、沈Q NO 2)W及滅菌水；
[0043] (3)酶純化試劑:EX0I，CIP;
[0044] (4)測序試劑:Bigdye Terminator V3.1，無水乙醇，EDTA，及測序引物（SEQ NO 1， 沈Q NO 2)。
[0045] (5)陽性質控品：已確定的SFRP4基因啟動子區CG島甲基化的DM。陰性質控品：已 確定的SFRP4基因啟動子區CG島無甲基化的DNA。空白對照品：滅菌水。
[0046] 實施例2
[0047] DNA提取試劑和方式。
[004引取石蠟切片（5-10皿厚，1 X lcm2大小)5-則長，將石蠟包埋組織收集到1.5mL離屯、管 內，短暫離屯、；加入ImL組織透明液，充分振蕩，13200rpm離屯、Imin，移除上清液;加入0.5mL 組織透明液，充分振蕩，13200巧m離屯、Imin，移除上清液；加入ImL乙醇（96-100 % )，劇烈振 蕩，13200巧m室溫離屯、2min，移除上清液;打開蓋子，室溫（15-25°C)或金屬浴37°C解育直到 剩余乙醇完全揮發;取18化L Buffer A化對管內組織進行吹吸重懸，然后加入20化蛋白酶 K，再次振蕩;將含有混合液的離屯、管置于56°C的金屬浴上，解育比，期間顛倒混勻3次，直至 樣品完全溶解;將離屯、管轉移至90°C的金屬浴上，再次解育化;短暫離屯、，將管蓋上的溶液 甩至管底；向管內加入20化L Buffer AL，充分振蕩混勻。然后加入20化L乙醇(96-100%)， 再次振蕩混勻；短暫離屯、，將管蓋上的溶液甩至管底；小屯、將混合液用移液器轉移至含有 QIAamp Mi址lute column吸附柱的2mL收集管內，800化pm離屯、Imin，棄收集管，將吸附柱置 于一個新的收集管上；向吸附柱內加入50化L Buffer AW1，務必不要打濕吸附柱管口邊緣。 800化pm離屯、Imin，棄收集管，將吸附柱置于一個新的收集管上；向吸附柱內加入500化 Buffer AW2，務必不要打濕吸附柱管口邊緣。800化pm離屯、Imin，棄收集管，將吸附柱置于一 個新的收集管上；13200rpm室溫離屯、3min，W徹底甩掉吸附膜上殘留的溶液;將吸附柱將吸 附柱置于一個干凈的1.5mL離屯、管上（自備），小屯、向膜中央滴加50化Buffer ATE; 1320化pm室溫離屯、Imin，取收集到的DM溶液1.扣L用Nano化op檢測所得DM的濃度和純度； 將剩余的DNA溶液于-20°C保存。
[0049] 實施例3
[(K)加]亞硫酸鹽處理試劑和方法如下。
[0化1] 操作步驟:將實施例2提取的基因組DNA與1.5naEP管中使用雙蒸水稀釋至50ul加 5.5ul新鮮配制的3M化0扣容液，42°C水浴30min ;水浴期間配制W下溶液：lOmM氨釀溶液 化y化yquinone):取55mg氨釀于50ml水中溶解；3.6mol/LNaHS〇3:取 18.8g 化HS03加入40ml 水中，并W 3M化OH溶液調節溶液PH至5.0，最終定容至5Om 1。加30U1 1 OmM氨釀溶液和 520ul3.6mol/L化HS化至上述水浴后溶液中，EP管外包裹W侶錐紙避光，輕柔顛倒混勻溶 液，管內加 lOOul石蠟油，短暫離屯、使石蠟油蓋住液面，防止水浴過程中水分的蒸發并限制 氧化50°C避光水浴16h;水浴完后將移液器槍頭伸入石蠟油層下，先輕輕加壓使其中一小段 石蠟油排出，然后小屯、吸取約580U1DNA溶液至潔凈的1.5naEP管中，使用PCR產物回收試劑 盒回收DNA，所得到的DNA溶于50ul去離子水，加5.5ul新鮮配制的3MNa0H，室溫放置15min， 然后加33ul 10M乙酸錠中和化0H，使溶液PH = 7,也加入4ul lOmg/ml葡萄糖作為沉淀位置 指示劑，加入270ul冰無水乙醇，至于-20°C，過夜沉淀后，4°C，12000巧m離屯、，30min，倒掉上 清液，收集沉淀，加入500U170 %乙醇，洗劑沉淀，4 °C 1200化pm，5min離屯、兩次;倒掉上清，室 溫干燥至沉淀由不透明變為半透明或透明時，依DNA沉淀多少加入30-50U1雙蒸水溶解沉 淀。
[0052]利用本發明所述的DNA亞硫酸氨鋼處理試劑和方法，可W獲得更高的DNA回收率， 高轉化率，同時可W降低DNA降解率和片段化率，從而提高了PCR擴增和后續分析技術的靈 敏度。
[0化3] 實施例4
[0化4] PCR檢測方法如下。
[0055] PCR引物為:所有引物純度達到PAGE級或HPLC級，不含雜帶。提供合成結構出具的 合成產物的質檢證明，如PAGE電泳結果或HPLC分析圖譜，證明使用引物達到檢測要求。 SFRP4的引物序列如下：
[0化6]沈Q NO 1:5 '-CGGAGTTCGGGATTGGAGTTGTT-3 '；
[0057]沈Q NO 2:5 '-CTTCCTACCACCCTCATCTTTCGCTA-3 '；
[0化引 PCR檢測反應體系為：8-10 X PCR緩沖液、0.8-1.2mM dNTPs、0.8-1.2uM擴增引物 (沈Q NO 1和沈Q NO 2)、0.5-2ng模板DNA，0.05-0.1U/ul DM聚合酶。
[0059] 所述dNTPs包括：10mM dATP、10mM dCTP、10mM dTTP、10mM dGTP。
[0060] 所述PCR緩沖液包括:TRIS.化、氯化鐘、硫酸儀和氯化儀。
[0061 ] PCR檢測的反應條件為：第一階段，92-97 °C預變性5-15min;第二階段，變性溫度 92-97°C30sec，退火溫度62-66°C90sec，延伸溫度72°C30sec，循環12-18次，每循環一次，所 述退火溫度降低0.5°C ;第=階段，變性溫度92-97°C30sec，退火溫度53-57°C30sec，延伸溫 度72 °C 30sec，循環24-34次;第四階段，72 °C lOmin;第五階段，擴增反應結束，擴增產物在4 °(：下保存。
[0062] 電泳檢測后將所得PCR產物進行酶純化，測序反應，上機測序；
[0063] 所述酶純化的反應條件為:371：5〇111111，951：5111111。所述測序反應的反應條件為:95 °C4min，95°C15S;50°C20S;60°C2min，25 個循環。
[0064] 依據相關軟件獲得樣本的SFRP4啟動子甲基化狀態。W亞硫酸鹽處理后的SFRP4啟 動子序列為標準序列，通過軟件分析獲得樣本的SFRP4啟動子甲基化狀態。
[0065] 針對石蠟切片DNA片段化嚴重，而亞硫酸氨鹽修飾飽和狀態下仍呈現有效模板濃 度低的問題，將Touch-down PCR擴增和Sanger測序相結合，可顯著提高檢測靈敏度。
[0066] 實施例5
[0067] 子宮頸癌樣本檢測：
[0068] 選擇石蠟切片樣本10例，3例為已確診子宮頸癌樣本，3例為正常人樣本，其余4例 為未知樣本。利用本發明的試劑盒按照實施例3中的方法進行樣本DNA提取、亞硫酸處理、純 化回收、PCR擴增、測序及結果分析。
[0069] (1)材料:待測樣本、陽性質控品、陰性質控品、空白對照。
[0070] (2)儀器:移液器、高速離屯、機、NAN0DR0P1000、滿旋震蕩W、冰箱、電泳儀、凝膠拍 照系統，ABI 3500XL Genetic Analyzer，PCR儀。
[0071] (3)試劑:DNA聚合酶(凱杰），DNA純化試劑(凱杰），dNTPs (TaKaRa)、純化水，亞硫酸 鹽處理試劑（凱杰），EX0I(肥B)，CIP(肥B)，Bigdye Terminator(肥B).
[0072] (4)引物:所有引物純度達到PAGE級或HPLC級，不含雜帶。提供合成結構出具的合 成產物的質檢證明，如PAGE電泳結果或HPLC分析圖譜，證明使用引物達到檢測要求。SFRP4 的引物序列如下：
[0073] 沈Q NO 1:5 '-CGGAGTTCGGGATTGGAGTTGTT-3 '；
[0074] 沈Q NO 2:5'-CTTCCTACCACCCTCATCTTTCGCTA-3'；
[0075] (5化0?檢測，反應體系為:8-10乂？0?緩沖液、0.8-1.21111(1^?3、0.8-1.2碰如權利 要求3所述的擴增引物、0.5-2ng模板DM，0.05-0. lU/ul DM聚合酶。
[0076] (6)所述dNTPs中包括lOmM dATP、10mM dCTP、10mM dTTP、10mM dGTP，所述PCR緩沖 液包含TRIS. CL、氯化鐘、硫酸儀和氯化儀。
[0077] (7)所述PCR檢測的反應條件為：第一階段，92-97 °C預變性5-15min;第二階段，變 性溫度92-97°C30sec，退火溫度62-66°C90sec，延伸溫度72°C30sec，循環12-18次，每循環 一次，所述退火溫度降低〇.5°C;第S階段，變性溫度92-97°C30sec，退火溫度53-57°C 30sec，延伸溫度72 °C 30sec，循環24-34次;第四階段，72°C lOmin;第五階段，擴增反應結束， 擴增產物在4°C下保存。
[0078] (8)電泳檢測后將所得PCR產物進行酶純化，測序反應，上機測序；
[0079] (9)所述酶純化的反應條件為：37°C50min，95°C5min。所述測序反應的反應條件 為：951：4111111，95°(：155;501：205;601：2111111，25個循環。
[0080] (10)依據相關軟件獲得樣本的SFRP4啟動子甲基化狀態。W亞硫酸鹽處理后的 SFRP4啟動子序列為標準序列，通過軟件分析獲得樣本的SFRP4啟動子甲基化狀態。
[0081] 10例樣本的SFRP4基因啟動子甲基化狀態結果如下表所示：
[0082]
[0084] 檢測樣本的SFRP4基因啟動子甲基化狀態結果如圖2所示，圖2A為S4樣本檢測結 果，結果為陰性(箭頭指CG位點）。圖2B為為S1樣本檢測結果，結果為陽性(箭頭指CG位點）。
[0083]
【主權項】
1. 用于檢測SFRP4基因啟動子甲基化的引物，其特征在于，包括一對特異性擴增兼并引 物SEQ NO 1和SEQ NO 2,其序列為： SEQ NO 1:5 '-CGGAGTTCGGGATTGGAGTTGTT-3 '； SEQ NO 2:5'-CTTCCTACCACCCTCATCTTTCGCTA-3'。2. 根據權利要求1所述的引物，其特征在于，擴增引物同為測序引物，所述測序引物的 序列為： SEQ NO 1:5 '-CGGAGTTCGGGATTGGAGTTGTT-3 '； SEQ NO 2:5'-CTTCCTACCACCCTCATCTTTCGCTA-3'。3. -種用于檢測SFRP4基因啟動子甲基化的方法，包括： (1) 提取樣本中的DNA; (2) 將步驟（1)中提取的DNA進行亞硫酸氫鹽處理； (3) 以步驟（2)中的DNA作為模板，使用SEQ N01和SEQ NO 2擴增SFRP4基因片段，獲得 PCR擴增產物； (4) 對步驟(3)中獲得的產物測序； (5) 根據步驟(4)的測序結果，得到序列CG位點的甲基化結果； 其所述引物序列為： SEQ NO 1:5 '-CGGAGTTCGGGATTGGAGTTGTT-3 '； SEQ NO 2:5'-CTTCCTACCACCCTCATCTTTCGCTA-3'。4. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于，PCR擴增反應條件為:第一階段，92-97Γ預 變性5-15min;第二階段，變性溫度92-97°C30sec，退火溫度62-66°C90sec，延伸溫度72°C 30sec，循環12-18次，每循環一次，所述退火溫度降低0.5°C;第三階段，變性溫度92-97Γ 30sec，退火溫度 53-57°C30sec，延伸溫度 72°C30sec，循環 24-34次；第四階段，72°C10min; 第五階段，擴增反應結束，擴增產物在4°C下保存。5. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的測序為Sanger測序，測序引物為： SEQ NO 1:5 '-CGGAGTTCGGGATTGGAGTTGTT-3 '； SEQ NO 2:5'-CTTCCTACCACCCTCATCTTTCGCTA-3'。6. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述樣本為石蠟切片樣本、全血樣本、新鮮 組織樣本或細胞系樣本。
【文檔編號】C12N15/11GK106048035SQ201610516682
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月2日
【發明人】林有升, 單戰, 王淑, 王淑一
【申請人】上海艾迪康醫學檢驗所有限公司