mRNA甲基化高通量檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種mRNA甲基化高通量檢測方法，包括以下步驟：mRNA樣品提取；將提取的RNA樣品進行片段化；將得到的RNA片段利用特異性識別mRNA上m6A甲基化(m6A)的抗體進行免疫富集；將步富集后含有m6A的mRNA片段洗脫后進行沉淀純化；將所得純化后的RNA反轉錄成cDNA，并進行DNA末端修復、接頭連接和PCR擴增，完成mRNA甲基化文庫的構建；將完成的文庫利用分析測序文庫的高通量測序平臺進行測序。
【專利說明】
mRNA甲基化高通量檢測方法
技術領域
[0001] 本發明屬于生物技術領域，尤其設及一種mRNA甲基化高通量檢測方法。
【背景技術】
[0002] M6A是指發生在堿基A第6位N原子上的甲基化修飾，于1974年在肝癌細胞的mRNA上 最早被發現，之后在其他物種上也檢測到mRNA m6A的存在，m6A是一種最常見的轉錄后水平 修飾，大約占全部RNA修飾的S分之二。在真核生物中，m6A大約占細胞mRNA全部腺巧含量的 0.1 % -0.4 %，即哺乳動物中平均每一條mRNA含有3-5個6-甲基修飾的腺巧。1994年，科學家 從化la細胞中分離得到mRNA m6A甲基化轉移酶復合體，并在后期研究中鑒定純化出主要影 響m6A修飾水平的催化結構域METTL3,通過在化pG2細胞中超表達該基因導致細胞調亡，并 激活p53下游通路;在小鼠和人類的胚胎干細胞中敲除METTL3，mRNA m6A修飾水平顯著降 低，多能性基因長期維持高表達量，使胚胎干細胞無法退出自我更新，難W進行分化，表明 RNA m6A對增殖和調節分化發育起著重要的作用；與METTL3作用相反，2012年的化學研究中 鑒定出FT0是一種去甲基化酶，通過催化mRNA上的m6A修飾的去甲基化而參與mRNA加工過 程，FT0缺失小鼠較正常小鼠體重和體脂率顯著升高，同時FT0缺失可阻礙脂肪前體細胞 3T3-L1的分化，說明m6A在肥胖及能量代謝方面有重要作用;RNA m6A在越來越多的生命活動 中發揮重要作用，但是缺少一種可W直觀的分析出mRNA甲基化整體分布的研究技術。早在 1980年，就有科學家利用放射性同位素3中標記的ATP及T4多聚核酸激酶共解育基因篩上點 雜交的mRNA,通過陰離子交換柱，與m6A凝膠共解育后進行TLC檢測同位素標記組和非標記 組的放射性來計算基因的m6A相對含量，但該方法相當繁瑣且僅能進行低通量的檢測，隨著 二代測序技術的高速發展，各生物基因組庫逐步建立完整，，利用測序來檢測基因的甲基化 分布是一種極好的方式;不同于發展成熟的M5C測序，甲基化的胞喀晚可在重硫酸鹽的處理 下轉變為尿喀晚，而非甲基化的胞喀晚不變，可直接通過二代測序對比重硫酸鹽處理前后 的兩種樣品甲基化位點及豐度;但是m6A并不能影響其配對堿基的能力，且沒有化學試劑來 改變或特異性標記運一修飾，所W-直無法建立二代測序等高通量平臺；本發明可W實現 全轉錄本上甲基化區域的確定，實現多個樣本甲基化程度的比較，對mRNA m6A多樣性的生 物學研究開辟了新的技術。
【發明內容】
[0003] 本發明要解決的技術問題是提供一種檢測全轉錄本上mRNA甲基化修飾的檢測方 法。
[0004] 為了解決上述技術問題，本發明提供一種mRNA甲基化高通量檢測方法，包括W下 步驟：
[000引l)、mRNA樣品提取；
[0006] 2)、將步驟1)提取的RNA樣品進行片段化；
[0007] 3)、將2)得到的RNA片段利用特異性識別mRNA上m6A甲基化(m6A)的抗體(synaptic system ,202003)進行免疫富集；
[0008] 4)、將步驟3)富集后含有m6A的mRNA片段洗脫后進行沉淀純化；
[0009] 5)、將步驟4)所得純化后的RNA反轉錄成cDNA，并進行DNA末端修復、接頭連接和 PCR擴增，完成mRNA甲基化文庫的構建；
[0010] 6)、將步驟5)完成的文庫利用分析測序文庫的高通量測序平臺進行測序。
[0011] 作為本發明的mRNA甲基化高通量檢測方法的改進：
[0012] 所述步驟6)中，測序平臺包括illumina的Hiseq、MiSeq，W及ABI的Series Genetic Analyzer和Ion Torrent PGM；
[0013] 使用SR50bp，index length 6 bases;每個樣品得到30-50million reads 用于后 續數據分析。
[0014] 備注說明：SR50:single read 50bp，代表單側讀取50bp長度；index length 6 base:在建庫的時候要在1 ibrary上加一個長度是6個堿基的index，用W區分不同樣品。
[0015] 作為本發明的mRNA甲基化高通量檢測方法的進一步改進：
[0016] 所述步驟1)中，利用polyA方法在總的RNA中提純mRNA(即，舍棄tRNA，rRNA，miRNA 等其他RNA類型）。
[0017] 作為本發明的mRNA甲基化高通量檢測方法的改進：
[001引所述步驟2)中，將RNA利用超聲斷裂或者金屬離子(如化ACaAFe/等)斷裂成100 ~2(K)nt的片段(即，片段的大小在100-2(K)nt之間，下限不低于l(K)nt，上限不高于2(K)nt)。
[0019] 作為本發明的mRNA甲基化高通量檢測方法的改進:所述步驟3)中，RNA的富集時通 過抗體進行免疫富集。
[0020] 作為本發明的mRNA甲基化高通量檢測方法的改進:所述步驟4)中，將洗脫下的RNA 進行過夜沉淀提取，得含有甲基化的mRNA片段。
[0021 ] 作為本發明的mRNA甲基化高通量檢測方法的改進:所述步驟5)中，利用i 1 lumina 的TruSeq Stranded mRNA Libraiy Prep Kit的建庫試劑盒進行mRNA甲基化文庫的構建。
[0022] 本發明通過提取組織或細胞總RNA并進行片段化，利用mRNA甲基化(m6A)的抗體， 結合免疫共沉淀（IP)技術將含有m6A的mRNA片段富集，將所得片段用接頭引物和DNA聚合酶 進行PCR指數擴增，獲得擴增產物;擴增產物分離純化，構成高通量測序文庫，利用二代高通 量測序技術，對含有m6A的mRNA片段進行測序。
[0023] 具體而言，本發明提供了一種mRNA甲基化高通量檢測方法，包括甲基化mRNA提取 方案、建庫方案和測序方案：
[0024] 甲基化mRNA提取方案是指獲得含甲基化的mRNA的詳細方法步驟，包括：
[00巧]1.本發明中，作為甲基化RNA檢測的對象的樣品RNA，可舉出包括動物、植物、微生 物在內的所有生物RNA，優選為動物，更優選為哺乳動物的RNA。作為哺乳動物，可舉出人、 猴、小鼠、大鼠、豬等，但不局限于此。樣品RNA，可從來自于含有RNA的生物試樣中提取、分離 得到。作為從試樣提取或分離RNA的方法，沒有特別限制，可W適當選擇使用公知的方法； [002引 2.將1中試樣提取的總RNA樣品，經過PoWA)selection提取總的mRNA;
[0027] 3.將2中總mRNA經過超聲斷裂或者金屬離子（如化化、Ca2+、Fe2+等）斷裂成100~ 200nt的mRNA片段，利用RNA變性凝膠電泳檢測RNA片段大小，確認片段化成功且未降解； [00%] 4.將3中mRNA片段取出50ng左右作為Input,其余部分定義為IP，首先利用免疫沉 淀反應，與m6A抗體在4C低溫下解育2小時；
[0029] 5.將4中的樣品與吸附抗體的beads在4C低溫下解育2小時，洗去沒有與beads結合 的部分；
[0030] 6.將5中與beads結合的部分利用elution buffer進行洗脫，將洗脫下的RNA進行 過夜沉淀提取，即為含有甲基化的mRNA片段；
[0031] 建庫方案是指獲得待檢測的mRNA甲基化文庫的詳細方法步驟，包括：
[0032] 7.將帥的mRNA片段（IP似及4中的I叩ut首先進行第一條和第二條cDNA鏈的合 成，成為雙鏈DNA;
[0033] 8.將7所得到的雙鏈cDNA進行純化；
[0034] 9.將8得到的純化后的cDNA在3 '末端加上A堿基；
[OO%] 10.將9得到的cDNA接上adapter，并進行純化；
[0036] 11.將10得到的cDNA進行PCR擴增，擴增后的產物進行純化，W備測序。
[0037] 測序方案是指將前述建庫方案獲得的cDNA文庫進行序列測定的詳細方法步驟，包 括：
[003引12.用于分析測序文庫的高通量測序平臺包括，但不局限于illumina的化seq、 MiSeq等測序平臺，ABI的Series Genetic Analyzer和Ion Torrent PGM測序平臺；使用 SR50bp，index length 6 bases;每個樣品得到30-50million reads用于后續數據分析。
[0039] 本發明相對于現有技術而言，具有如下技術優勢：
[0040] 1、本發明首次實現全轉錄本上mRNA甲基化區域的確定；
[0041 ] 2、本發明首次實現全轉錄本上mRNA甲基化位點、頻率的確定；
[0042] 3、本發明可W實現多個樣本間甲基化位點、頻率等的比較。
【附圖說明】
[0043] 下面結合附圖對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0044] 圖1是本發明m6A-seq方法的示意圖。
[0045] 圖2顯示使用本方法片段化后片段的瓊脂糖凝膠分析結果（片段大小在100- 200bp)。
[0046] 圖3顯示豬肌肉組織mRNA甲基化高通量測序文庫的bioanalyzer--2100檢測分 析結果；
[0047 ] 左圖為樣品的input，右圖為IP;
[004引
f
[0049] 0
[0050] 圖4顯示利用本發明方法找到的m6A保守mo t i f。
[0化。圖5是豬肌肉組織mRNA上m6A甲基化圖譜細節；即，豬的第14號染色體中長達 6.5化P片段上含m6A的基因圖譜(示例）。
[0化2]圖6為單個基因（N0VA2)的甲基化圖譜。
[0化3] 圖7為qPCR驗證單個基因 m6A enrichment。
【具體實施方式】
[0054] W下結合【具體實施方式】和附圖，對本發明作進一步說明。本領域技術人員可W對 具體實施方案中所示的本發明做出多種變化和修改而不脫離廣義描述時的本發明的精神 和范圍。
[0055] 實施例1: 一種mRNA甲基化高通量檢測方法，依次進行W下步驟：
[0056] 試驗用RNA來自豬的肌肉組織，具體操作如下：
[0化7] 1、獲取總RNA:
[005引取豬肌肉樣品，利用Trizol法提取總RNA，具體方法為：
[0059] 1)將凍存于液氮中的肌肉組織樣品取出，取50-100mg在液氮中研磨成粉末，置于 RNase-free的 1.5ml eppendorf管中；
[0060] 2)加入1mlTrizol劇烈搖晃至均一溶液；
[0061 ] 3)加入200ul氯仿后，劇烈搖晃至均一溶液，4C，12000g離屯、15min;
[0062] 4)取上清到另一個RNase-打ee的1.5ml邱pendcxrf管中，加入相同體積異丙醇，輕 輕混勻，室溫解育10min，4C，12000g離屯、lOmin;
[0063] 5)去掉上清，用1ml 75%乙醇洗涂沉淀，4C，7500g離屯、5min;
[0064] 6)用20-50ul RNase-free 肥0溶解。
[00化]2、獲取 mRNA
[0066] 利用Genelute mRNA minipr邱 Kits(Sigma)提取mRNA,具體方法為：
[0067] 1)將to1:al RNA體積擴大到250ul，加入250ul binding solution,混勻；
[0068] 2)加入15ul beads,劇烈搖晃至均一溶液，置于70C解育3min后，置于室溫lOmin;
[0069] 3)最大速度離屯、2min，棄掉上清；
[0070] 4)用500ul wash buffer重懸beads,并轉移至spin filter;
[0071 ] 5)離屯、l-2min，棄掉flow though;
[0072] 6)重復 4)、5);
[0073] 7)加入預先加熱至70C的Elution Buffer 50ul，70C解育2-5min;
[0074] 8)離屯、產物即是mRNA;
[00巧]9)將所得mRNA利用真空濃縮至9u 1。
[0076] 3、片段化 mRNA
[0077] RNA片段化體系 [007引
[0079] 溫度、解育時間為:70°C、15min，加入邸TA終止反應；
[0080] *片段化緩沖液（10X)為：800化腳ase-free水，100化 1M Tris-HCl(pH = 7.0)， 10化L 1M化CI2溶液。
[0081 ] 4、片段化mRNA的檢測
[0082]將片段化后的樣品在2%瓊脂糖凝膠電泳進行1*TAE電泳檢測片段大小（圖2)，片 段在100-20化P，大小合適并濃縮至lug/lOOul后進行后續試驗。
[0086]
[0083] 5、免疫沉淀[0084] 1)試劑準備[00化]10%Ig邱al CA-630(Sigma-Aldrich，cat.no.I8896)
[0095] (#N6-Methyladenosine,50-monophosphate sodium salt(m6A,Sigma-Aldrich, cat.no.M2780))[0096] 2)mRNA的m6A免疫結合[0097] 將步驟4中所得的RNA片段，進行W下試驗：「00981
[0087]
[008引
[0089]
[0090]
[0091]
[0092] AM2696))
[0093]
[0094]
[0099] 在4 °C解育化。
[0100] 3)封閉beads(Dynabcads遲.Protein A，Life technologies, 10002D)
[0101] 取40iil beads置于磁力架上，棄去上清，用1ml的1*IP buffer洗S次，重懸于1*IP 封閉buffer中，于4°C解育化。1*IP封閉buffer配制如下：
[0102]
[0103] 解育化后，用1ml的1*IP buffer洗S次，用10化1 1*IP buffer重懸；
[0104] 4)beads與mRNA-抗體免疫沉淀：
[01化]將上述2)和3)得到的樣品混合，4。(：解育化。
[0106] 5)洗脫 I
[0107] 將4)所得樣品置于磁力架上，棄上清，用50化1 1*IP buffer洗S次，重懸于洗脫 buf f er，置于4 °C解育化。洗脫buf f er配制如下：
[010 引 0109 0110 0111 0112 0113 0114 0115 0116 0117 *
[0109] 6)洗脫 II
將5)所得樣品置于磁力架上，收集上清，然后在beads中再加入50ul洗脫buffer， 置于4°C解育30min。
[0111] 7)將5)、6)合并到一起，得到20〇111洗脫液。
[0112] 8)乙醇沉淀：將200ul RNA洗脫液巧Oul 化oAc+500ul乙醇（100%)+4ul glycogen (5mg/ml)，-80 °C，過夜沉淀。
[0113] 9)第二天，將8)取出，在4C，14000巧m離屯、30min，棄上清，加入lml75%乙醇在4C， 1400化pm離屯、30min，棄上清，風干后，加入9ul RNase-打ee水，并測定濃度。 6、建庫
[0115] 使用111皿ina的TruSeq Stranded mRNA Libraiy Pr邱 Kit的建庫試劑盒， 1)第一鏈合成： 取步驟5的9)所得6-7ul RNA，加入10-llul FPF mix得到17ur混合物;經94°C加熱 10s后立即置于冰上。
[0118] 按如下混合后放入PCR儀，按25°C lOmin，42°C 15min，70°C 15min，4°C保持進行試 驗。
[0119]
[0120」 （Superscript II reverse transcriptase invitrogen 18064-014)
[0121] 2)第二鏈合成：
[0122] 將1)中的產物按如下體系混合后放入PCR儀，按16°C化，4°C保持運行： 「01231
[0124] 3)利用AMPure XP磁珠純化cDNA
[01巧]向2)中50ul cDNA中加入90ul AMPure XP beads,室溫放置15min后轉移至磁力架 上分離5min，吸棄13加1上清，加入200ul 80%的乙醇洗磁珠2次后，室溫放置5min，等待驚 干;加入20ul elution buffer室溫下靜置解育2min，轉移至磁力架上放置5min，將17.5ul 上清液轉移至新管中；
[0126] 4)合成的cDNA 3'端加 A堿基
[0127] 在3)中 17.5ul cDNA溶液中加入 12.5ul A-tailing mix;將30ul混合物在37°C反 應30min后，70°C反應5min，保持在4°C。
[012引5)連接接頭
[01巧]配制如下體系后在30°C反應lOmin，加入加1 stop ligation buffer終止反應。
6)第一次純化樣
[0130]
[0131] 0132 0133 0134 0135
[0132] 6)品 在5)中加入42ul AMPurea XP beads,室溫放置15min，轉移至磁力架放置5min，吸 棄79.5ul上清，加入200ul 80 %乙醇將磁珠洗兩次后，室溫驚干5min ;加入52.5ul resuspension buffer,室溫放置2min后轉移至磁力架5min，取50ul上清轉移至新管中； 7)第二次純化樣品
[0136] 向6)中加入50ul AMPurea XP beads,室溫放置15min，轉移至磁力架放置5min，吸 棄95ul上清，加入200ul 80 %乙醇將磁珠洗兩次后，室溫驚干5min ;加入2 2.5ul resuspension buffer,室溫放置2min后轉移至磁力架5min，取20ul上清轉移至新管中；
[0137] 8)PCR 擴增
[013引反應體系按如下配制后放入PCR儀，按98°C30s;98°C，10s，60°C，30s，72°C，30s, 13-15cycles;72°C，5min;Hold at 4°C設定PCR程序
[0139]
[0140] 9)純化PCR產物
[0141] 向8)的50ul PCR產物中加入50ul AMPurea XP beads,室溫放置15min，轉移至磁 力架放置5min，吸棄95ul上清，加入200ul 80 %乙醇將磁珠洗兩次后，室溫驚干5min;加入 32.5ul resuspension buffer，室溫放置2min后轉移至磁力架5min，取20ul上清轉移至新 管中，用如bit測定濃度。
[0142] 7、上機測序
[0143] DBioanalyzer 檢測分析。
[0144] 2)利用illumina公司Hiseq 4000平臺進行高通量測序，使用SR50bpW及index length 6bases，具體測序流程與試劑均采用Illumina公司標準流程與試劑盒，測序結果產 生40M reads,能比對(ma卵ing)到豬基因組（SGSC Ssc;rofal0.2/susScr3)達到91.6%。
[0145] 8、結果分析
[0146] DBioanalyzer 檢測分析見圖 3;
[0147] 2)m6A 保守的 Motif 見圖 4;
[014引3)豬染色體含m6A的基因表達量圖譜見圖5;
[0149] 4)單個基因（N0VA2)的甲基化圖片示例見圖6;
[0150] 5)用QPCR方法驗證，證明測序結果是真實可信的，見圖7。
[0151] 最后，還需要注意的是，W上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發 明不限于W上實施例，還可W有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容 直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
【主權項】
1. mRNA甲基化高通量檢測方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 、mRNA樣品提取； 2) 、將步驟1)提取的RNA樣品進行片段化； 3) 、將2)得到的RNA片段利用特異性識別mRNA上m6A甲基化(m6A)的抗體進行免疫富集； 4 )、將步驟3)富集后含有m6A的mRNA片段洗脫后進行沉淀純化； 5) 、將步驟4)所得純化后的RNA反轉錄成cDNA，并進行DNA末端修復、接頭連接和PCR擴 增，完成mRNA甲基化文庫的構建； 6) 、將步驟5)完成的文庫利用分析測序文庫的高通量測序平臺進行測序。2. 根據權利要求1所述的mRNA甲基化高通量檢測方法，其特征在于： 所述步驟6)中，測序平臺包括illumina的Hiseq、MiSeq，以及ABI的Series Genetic Analyzer和Ion Torrent PGM； 使用SR50bp，index length 6bases;每個樣品得到30_50mi 11 ion reads，用于后續數 據分析。3. 根據權利要求1或2所述的mRNA甲基化高通量檢測方法，其特征在于： 所述步驟1)中，利用P〇 1 yA方法在總的RNA中提純mRNA。4. 根據權利要求1或2所述的mRNA甲基化高通量檢測方法，其特征在于： 所述步驟2)中，將RNA利用超聲斷裂或者金屬離子斷裂成100~200nt的片段。5. 根據權利要求1或2所述的mRNA甲基化高通量檢測方法，其特征在于:所述步驟3)中， RNA的富集時通過抗體進行免疫富集。6. 根據權利要求1或2所述的mRNA甲基化高通量檢測方法，其特征在于： 所述步驟4)中，將洗脫下的RNA進行過夜沉淀提取，得含有甲基化的mRNA片段。7. 根據權利要求1或2所述的mRNA甲基化高通量檢測方法，其特征在于： 所述步驟5)中，利用illumina的TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit的建庫試 劑盒進行mRNA甲基化文庫的構建。
【文檔編號】C40B50/06GK106047997SQ201610362981
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月27日
【發明人】王新霞, 汪以真, 江芹
【申請人】浙江大學