一種測定1,5?脫水葡糖醇的試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種測定1,5?脫水葡糖醇的試劑盒及其制備方法，包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2雙液體組分：試劑R1：Tris緩沖液、葡萄糖激酶、丙酮酸激酶、抗壞血酸氧化酶、三磷酸腺苷、磷酸丙酮酸烯醇式鹽、4?氨基安替吡啉、MgCl2、KCl，其溶劑為純化水，試劑R2：Tris緩沖液、吡喃糖氧化酶、辣根過氧化物酶、3?羥基?2、4、6?三碘苯甲酸，其溶劑為純化水，制備方法為：配制好試劑；將待測血清樣本與試劑R1和試劑R2混合；測定反應后的吸光度差值；計算出樣本中的1,5?脫水葡糖醇的濃度。本發明具有準確度高等優點。
【專利說明】
-種測定1，5-脫水葡糖醇的試劑盒及其制備方法
技術領域
[0001] 本發明設及醫學及生物化學技術領域，具體來說是一種測定1,5-脫水葡糖醇的試 劑盒及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 1,5-脫水葡糖醇（1，5-AG)又稱1,5-脫水山梨醇或1-脫氧葡萄糖，是一種具有化喃 環結構的六碳單糖，廣泛分布于人體各組織中，其它組織中1，5-AG含量遠遠超過血液中的 含量，因代謝緩慢，故血液中濃度變化很小，1，5-脫水葡糖醇（1，5-AG)在血漿中W非結合形 式存在，分子量小，親水性強，可自由通過腎小球基底膜，幾乎在腎小管全部被重吸收，運種 重吸收明顯受到尿葡萄糖排泄的抑制。
[0003] 血漿中1,5-脫水葡糖醇（1，5-AG)水平與葡萄糖、糖化血紅蛋白和果糖胺呈顯著負 相關，有資料表明，血漿葡萄糖〉8.3mmol/L者，無一例外有高水平的血漿1,5-脫水葡糖醇 (1，5-AG)，糖尿病人的血漿1，5-脫水葡糖醇（1，5-AG)顯著低于健康人，糖尿病患者由于反 復、持久的增加尿中葡萄糖的排泄，因此抑制了腎小管對1，5-AG的重吸收，導致血漿中濃度 明顯降低。
[0004] 目前測定1,5-脫水葡糖醇主要采用全酶法測定，主要有氧化酶法和脫氨酶法兩種 方法，但是運兩種方法不僅操作復雜，而且由于會有葡萄糖干擾，因此檢測準確性比較差。
【發明內容】
[0005] 本發明所要解決的技術問題是為了克服現有檢測方法操作復雜、檢測準確性差的 缺陷，而提供一種測定1,5-脫水葡糖醇的試劑盒及其制備方法。
[0006] 本發明解決上述技術問題提供的技術方案是:本發明公開了一種測定1,5-脫水葡 糖醇的試劑盒，包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應含量為：
[00
[000引作為優選，本發明公開了一種測定1，5-脫水葡糖醇的試劑盒，包括彼此獨立的試 劑R1和試劑R2雙液體組分組成，包括的成分及相應含量為：
[00
[0010] 作為優選，所述的試劑R1中，所述的化is緩沖液的pH值為6~9。
[0011] 作為優選，所述的試劑R2中，所述的化is緩沖液的pH值為6~9。
[0012] 作為優選，本發明還公開了上述測定1,5-脫水葡糖醇的試劑盒的制備方法和使用 方法，包括W下步驟：
[0013] 試劑R2:
(b)將待測血清樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應； (C)用全自動生化分析儀測定反應后的吸光度差值； (d)根據吸光度變化值計算出樣本中的1,5-脫水葡糖醇的濃度。
[0014] 本發明的檢測原理是:首先用試劑R1處理血清樣本，經葡萄糖激酶和丙酬酸激酶 偶聯系統使血清中葡萄糖徹底轉化為不與化喃糖氧化酶反應的6-憐酸葡萄糖，W除去葡萄 糖的干擾作用，然后加入試劑R2,其中被測的1，5-AG氧化成1,5-脫水果糖和出化，后者經辣 根過氧化物酶、4-氨基安替化嘟和3-徑基-2、4、6-S艦苯甲酸反應系統作用，產生化inder 反應，發生顯色反應進行比色測定，從而計算出樣本中1，5-AG的含量。
[0015]
式中：A At W空白管吸光度作對照的樣品管吸光度值 AAs W空白管吸光度作對照的校準管吸光度值 Cs校準液中1，5-AG的濃度 與現有技術相比，本發明具有W下有益優點： 血清1，5-AG檢測作為篩選糖尿病的隨機實驗較其它評價實驗而言更為靈敏，且操作簡 便，適合臨床實驗室常規開展大規模的檢測，血清1，5-AG檢測無需像0GTT-樣，需要反復采 血進行檢測，且無需采血限制，且該方法應用了葡萄糖激酶和丙酬酸激酶系統反應，將葡萄 糖轉化為不參與反應的6-憐酸葡萄糖，消除了內源性葡萄糖的干擾，因此使得檢測結果更 加準確。
【具體實施方式】
[0016] W下結合具體實施例進一步說明，但本發明并不僅限于運些實施例。
[0017] 實施例1 本發明的試劑盒包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，其中
KCl 80 mmol/L 其溶劑為純化水。
[001引試劑R2: Tris緩沖液 100 mmol/L 化喃糖氧化酶 100 KU/L 辣根過氧化物酶 8 KU/L 3- 徑基-2、4、6-S艦苯甲酸 4.5 mmol/L 其溶劑為純化水。
[0019] 實施例2 本發明的試劑盒包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，其中 試劑R1: Tris緩沖液 110 mmol/L 葡萄糖激酶 65 g/L 丙酬酸激酶 7.0 KU/L 抗壞血酸氧化酶 2.0KU/L S憐酸腺巧 0.2 mmol/L 憐酸丙酬酸締醇式鹽 6.5 mmol/L 4- 氨基安替化嘟 0.2 mmol/L MgC12 5 mmol/L KCl 10 mmol/L 其溶劑為純化水。
[0020] 試劑 R2: Tris 緩沖液 20mmol/L 化喃糖氧化酶 150 KU/L 辣根過氧化物酶 16 KU/L 3- 徑基-2、4、6-S 艦苯甲酸 0.5mmol/L 其溶劑為純化水。
[0021] 實施例3 試劑盒的制備和使用方法 1、按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: Tris緩沖液 100 mmol/L 葡萄糖激酶 35 g/L 丙酬酸激酶 3.5 KU/L 抗壞血酸氧化酶 6.0 KU/L S憐酸腺巧 1.0 mmol/L 憐酸丙酬酸締醇式鹽 4.0 mmol/L 4- 氨基安替化嘟 1.0 mmol/L MgC12 15 mmol/L KCl 80 mmol/L 其溶劑為純化水。
[00剖試劑R2: Tris緩沖液 100 mmol/L 化喃糖氧化酶 100 KU/L 辣根過氧化物酶 8 KU/L 3- 徑基-2、4、6-S艦苯甲酸 4.5 mmol/L 其溶劑為純化水。
[0023] 2、全自動生化分析儀參數設置 (a) 檢測溫度:37°C; (b) 檢測波長:主波長570皿、副波長700皿； (C)反應時間：10min，其中，解育時間5min，加入試劑R2后立即測定讀取吸光度 Al，5min后讀取吸光度A2,計算吸光度變化AA = A2-A1 ; (d)反應方向：正反應。
[0024] 3、檢測步驟 (a) 取22扣1試劑R1與化1待測血清樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下解育5min; (C)加入75iil試劑R2,立即測定讀取吸光度Al，5min后讀取吸光度A2,計算吸光度變化 AA = A2-A1 ； (d)十算出樣本中的1，5-脫水葡糖醇的濃 度。
[00巧]實施例4 試劑盒的制備和使用方法 1、按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: Tris緩沖液 110 mmol/L 葡萄糖激酶 65 g/L 丙酬酸激酶 7.0 KU/L 抗壞血酸氧化酶 2.0KU/L S憐酸腺巧 0.2 mmol/L 憐酸丙酬酸締醇式鹽 6.5 mmol/L 4- 氨基安替化嘟 0.2 mmol/L MgC12 5 mmol/L KCl 10 mmol/L 其溶劑為純化水。
[0026]試劑 R2: Tris 緩沖液 20mmol/L 化喃糖氧化酶 150 KU/L 辣根過氧化物酶 16 KU/L 3-徑基-2、4、6-S艦苯甲酸 0.5mmol/L 其溶劑為純化水。
[0027] 2、全自動生化分析儀參數設置 (a) 檢測溫度:37°C; (b) 檢測波長:主波長570皿、副波長700皿； (C)反應時間：10min，其中，解育時間5min，加入試劑R2后立即測定讀取吸光度 Al，5min后讀取吸光度A2,計算吸光度變化AA = A2-A1 ; (d)反應方向：正反應。
[002引 3、檢測步驟 (a) 取22扣1試劑R1與化1待測血清樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下解育5min; (C)加入75iil試劑R2,立即測定讀取吸光度Al，5min后讀取吸光度A2,計算吸光度變化 AA = A2-A1 ； (d):
十算出樣本中的1,5-脫水葡糖醇的濃度。
[0029] 表1為實施例1所制得的測定1,5-脫水葡糖醇的試劑盒W及實施例2所制得的測定 1,5-脫水葡糖醇的試劑盒分別對質控品1進行測定的結果，其中質控品1中的1,5-脫水葡糖 醇的濃度為120umol/L，測定結果見表1: 表1
由表1可知，本發明所制得的測定1,5-脫水葡糖醇的試劑盒對質控品1的測定結果偏差 較小，因此測定準確度高，而且實施例1為最優的選擇。
[0030] 表2為實施例1所制得的測定1,5-脫水葡糖醇的試劑盒W及實施例2所制得的測定1,5- 脫水葡糖醇的試劑盒分別對質控品2進行測定的結果，其中質控品2中的1,5-脫水葡糖醇的 濃度為28(kimol/L，測定結果見表2: 表2_
由表2可知，本發明所制得的測定1,5-脫水葡糖醇的試劑盒對質控品2的測定結果偏差 較小，因此測定準確度高，而且實施例1為最優的選擇。
[0031] 表3為實施例3所制得的測定1,5-脫水葡糖醇的試劑盒對同一待測樣本進行的多 次反復測定W及實施例4所制得的測定1,5-脫水葡糖醇的試劑盒對同一待測樣本進行的多 次反復測定，對所得的結果進行SD和CV的計算，結果如下： 表3
由表3可知本發明所制得的測定1，5-脫水葡糖醇的試劑盒的精密度比較好，而且由表1 可知，實施例3為最優的選擇。
[0032]上述實施例僅例示性說明本發明的原理及其功效，而非用于限制本發明。任何熟 悉此技術的人±皆可在不違背本發明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因 此，舉凡所屬技術領域中具有通常知識者在未脫離本發明所掲示的精神與技術思想下所完 成的一切等效修飾或改變，仍應由本發明的權利要求所涵蓋。
【主權項】
1. 一種測定1，5-脫水葡糖醇的試劑盒，其特征在于:包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2 雙液體組分，包括的成分及相應含量為： 試劑R1: Tris緩沖液 20~180 mmol/L 葡萄糖激酶 5~65 g/L 丙酮酸激酶 0.1~7.0 KU/L 抗壞血酸氧化酶 2.0~10.0 KU/L 三磷酸腺苷 0.2~1.8 mmol/L 磷酸丙酮酸稀醇式鹽1.5~6.5 mmol/L 4-氨基安替P比啉 0.2~1.8 mmol/L MgC12 5~25 mmol/L KC1 10-150 mmol/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Tris緩沖液 20~180 mmol/L 吡喃糖氧化酶 50~150 KU/L 辣根過氧化物酶 0.1~16 KU/L 3- 羥基-2、4、6_三碘苯甲酸0.5~8.5 mmol/L 其溶劑為純化水。2. 根據權利要求1所述的一種測定1，5_脫水葡糖醇的試劑盒，其特征在于:包括彼此獨 立的試劑R1和試劑R2雙液體組分組成，包括的成分及相應含量為： 試劑R1: Tris緩沖液 100 mmol/L 葡萄糖激酶 35 g/L 丙酮酸激酶 3.5 KU/L 抗壞血酸氧化酶 6.0 KU/L 三磷酸腺苷 1.0 mmol/L 磷酸丙酮酸稀醇式鹽 4.0 mmol/L 4- 氨基安替吡啉 1.0 mmol/L MgC12 15 mmol/L KC1 80 mmol/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Tris緩沖液 100 mmol/L 吡喃糖氧化酶 100 KU/L 辣根過氧化物酶 8 KU/L 3-羥基-2、4、6_三碘苯甲酸4.5 mmol/L 其溶劑為純化水。3. 根據權利要求1或2所述的一種測定1，5_脫水葡糖醇的試劑盒，其特征在于:所述的 試劑R1中，所述的Tris緩沖液的pH值為6~9。4. 根據權利要求1或2所述的一種測定1，5_脫水葡糖醇的試劑盒，其特征在于:所述的 試劑R2中，所述的Tris緩沖液的pH值為6~9。5. 根據權利要求1或2所述的一種測定1，5_脫水葡糖醇的試劑盒的制備方法和使用方 法，其特征在于:包括以下步驟： (a) 按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: Tris緩沖液 20~180 mmol/L 葡萄糖激酶 5~65 g/L 丙酮酸激酶 0.1~7.0 KU/L 抗壞血酸氧化酶 2.0~10.0 KU/L 三磷酸腺苷 0.2~1.8 mmol/L 磷酸丙酮酸稀醇式鹽 1.5~6.5 mmol/L 4-氨基安替P比啉 0.2~1.8 mmol/L MgC12 5~25 mmol/L KC1 10-150 mmol/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Tris緩沖液 20~180 mmol/L 吡喃糖氧化酶 50~150 KU/L 辣根過氧化物酶 0.1~16 KU/L 3-羥基_2、4、6_三碘苯甲酸 0.5~8.5 mmol/L 其溶劑為純化水； (b) 將待測血清樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應； (c) 用全自動生化分析儀測定反應后的吸光度差值； (d) 根據吸光度變化值計算出樣本中的1，5-脫水葡糖醇的濃度。
【文檔編號】C12Q1/28GK106047988SQ201610273306
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年4月28日
【發明人】蔡曉輝, 莊慶華, 吳錚, 徐運
【申請人】安徽伊普諾康生物技術股份有限公司