一種基于生物發光法測定斑馬魚m受體水平的方法
【專利摘要】本發明公開了一種基于生物發光法測定斑馬魚M受體水平的方法，步驟包括：取斑馬魚組織上清液將GDP和GMP轉化為GTP；將ATP和UTP破壞掉；將GTP轉化為ATP；檢測ATP并進行數據處理計算得出斑馬魚M受體水平變化。本發明首次提出基于生物發光法檢測斑馬魚M受體的含量變化，無需測定M受體蛋白含量，該方法靈敏度高、穩定性好、不需要復雜設備；本發明操作簡單快捷、特異性高、成本低，從分子方面研究膽堿能系統的內在作用機制，再結合斑馬魚行為變化方面的研究，最終實現對水質的實時在線評估與監測。
【專利說明】
一種基于生物發光法測定斑馬魚M受體水平的方法
技術領域
[0001]本發明屬于生理生態學技術領域，具體涉及一種基于生物發光法測定斑馬魚M受體水平的方法。
【背景技術】
[0002]近年來，隨著經濟的快速發展，水污染問題日益突出，嚴重影響生態環境的平衡和穩定。斑馬魚是一種小型熱帶淡水魚，近年來，眾多研究顯示斑馬魚應用于環境毒理學研究中有其獨特的優勢，斑馬魚已逐漸成為環境毒理學家們的新寵，利用斑馬魚對水環境污染物進行快速監測已成為目前研究的熱點。
[0003]目前，人們通常依據對斑馬魚死亡率、畸形率、體長、體重、軀體質量指數(BMI)等進行測定，然而斑馬魚的生物的病理損傷或死亡往往較為滯后，難以發揮快速監測的作用。近年來，有越來越多的研究指出魚類對污染物的適應反應從神經內分泌活動變化開始，而M受體(毒蕈堿型受體)作為神經遞質乙酰膽堿的受體，其蛋白含量變化必然受到污染物的影響。因此，對斑馬魚M受體蛋白活性的測定可實現對水環境污染物的快速監測。
[0004]然而，目前對M受體蛋白活性的測定主要集中在大鼠、小鼠、電鰩這些物種上，方法主要是放射結合分析法、Western Blotting、ELISA等，這些方法普遍存在技術步驟繁瑣、耗時長、試劑價格昂貴、對實驗人員人體有潛在危害等缺點，而目前尚沒有明確的方法能對斑馬魚M受體的蛋白含量進行測定，而且由于M受體蛋白組織和種屬之間存在差異性，因此測定M受體蛋白含量的方法并不具有普適性，所以亟需研發一種靈敏、快速、簡便的測定斑馬魚M受體水平的方法。
【發明內容】
[0005]為解決現有技術中的上述技術問題，本發明人通過研究發現由于斑馬魚M受體屬于G蛋白偶聯受體，參與細胞信號轉導過程，其在信號傳導時會消耗GTP，當斑馬魚暴露在環境中污染物之后，作為G蛋白偶聯受體的M受體蛋白水平會發生相應變化，此時細胞GTP水平同樣會發生變化，因此可以通過GTP水平變化來反映M受體水平變化。本發明即是將GTP轉化為ATP通過生物發光法來檢測ATP含量，從而實現對GTP的檢測，進而測定出斑馬魚M受體水平變化。
[0006]具體的，本發明涉及以下技術方案:
[0007]本發明提供一種生物發光法在測定斑馬魚M受體水平中的應用。
[0008]此外，本發明還提供一種基于生物發光法測定斑馬魚M受體水平的方法，該方法步驟簡單，檢測結果準確，能夠快速測定斑馬魚M受體水平，包括如下步驟:
[0009]取斑馬魚組織上清液將GDP和GMP轉化為GTP ；將ATP和UTP破壞掉；將GTP轉化為ATP;檢測ATP并進行數據處理計算得出斑馬魚M受體水平變化。
[0010]具體的，一種基于生物發光法測定斑馬魚M受體水平的方法，步驟包括:
[0011 ] (I)將斑馬魚組織破碎，低溫離心處理，取上清液，將上清液等量置于A、B、C三個孵育管中；
[0012](2)將步驟(I)得到上清液中的GDP和GMP轉化為GTP;更具體的，首先向各孵育管加入一定量的上清液，然后再向各管中加入PH7.5的兩性離子緩沖液，MgCl2和KCl，之后A管不再添加任何物質，B管再加入一定量的磷酸烯醇丙酮酸鹽和丙酮酸激酶，C管再加入一定量ATP和鳥苷酸激酶，各孵育管內反應混合液均用超純水調至相同體積;將反應混合物孵育再沸水浴終止反應，然后將裝有反應混合液的孵育管置于冰塊中冷卻；
[0013](3)破壞各反應混合液中的ATP和UTP，具體的，從步驟(2)的各孵育管中的混合液中取一定量混合液置于新的孵育管中，向混合液中加入一定量的葡萄糖磷酸鹽，葡萄糖，NADP+，兩性離子緩沖液，MgCl2，己糖激酶，6-磷酸葡萄糖脫氫酶和二磷酸尿苷葡萄糖焦磷酸化酶;各孵育管內反應混合液均用超純水調至相同體積;將含有反應混合液的各孵育管孵育一定時間后再置于冰塊中冷卻一定時間；
[0014](4)將各反應混合液中的GTP轉化為ATP;具體的，從步驟(3)的各孵育管中取出一定量反應混合液置于新的孵育管中，然后向所述各孵育管中加入一定量二磷酸核苷激酶，ADP，兩性離子緩沖液，MgS04，EDTA和二硫蘇糖醇，將各孵育管內反應混合液均用超純水調至相同體積并將含有反應混合液的各孵育管孵育一定時間；
[0015](5)檢測步驟(4)得到的各混合液中的ATP;具體的，從步驟(4)的各孵育管中取出一定量反應混合液，然后向所述各反應混合液中加入一定量螢火蟲熒光素酶，在全自動計數菌落器上測試結果；
[0016](6)數據處理；由于細胞內的GTP、GDP、GMP水平是相對恒定的，三個管測試出來的ATP水平分別代表GTP、GDP和GMP水平，所以不同時間斑馬魚細胞內GTP: GDP: GMP水平變化即可得出斑馬魚M受體水平變化。
[0017]優選的，所述步驟(2)中，各孵育管內反應混合液用超純水調定體積后，所述兩性離子緩沖液的濃度為15mmol/L，所述MgCl2的濃度為1.0mmOl/L，所述KCl的濃度為2.5μmOl/L，所1述磷酸稀醇丙酮酸鹽的濃度為0.02mmol/L，所述丙酮酸激酶的濃度為16mg/L，所述ATP濃度為0.4ymol/L，所述鳥苷酸激酶濃度為0.8U/mL；
[0018]優選的，所述步驟(2)中，所述孵育溫度為30°C，時間為30min;所述冷卻時間為1min；
[0019]優選的，所述步驟(3)中，各孵育管內反應混合液用超純水調定體積后，所述葡萄糖磷酸鹽濃度為0.5mmol/L，所述葡萄糖濃度為0.5mmol/L，所述NADP+濃度為0.5mmol/L，所述兩性離子緩沖液濃度為75mmol/L，所述MgCl2的濃度為0.5mmol/L，所述KCl的濃度為
0.0125mmol/L，所述己糖激酶的濃度為2U/mL，所述6-磷酸葡萄糖脫氫酶的濃度為0.8U/mL，所述二磷酸尿苷葡萄糖焦磷酸化酶的濃度為lU/mL;
[0020]優選的，所述步驟(3)中，所述孵育溫度為30°C，時間為30min;所述冷卻時間為1min；
[0021]優選的，所述步驟(4)中，各孵育管內反應混合液用超純水調定體積后，所述二磷酸核苷激酶濃度為0.025U/mL，所述ADP濃度為37.5pmol/mL，所述兩性離子緩沖液的濃度為31.25mmol/L，所述MgSO4濃度為6.25mmol/L，所述二硫蘇糖醇的濃度為0.625mmol/L;所述步驟(4)中，所述孵育溫度為30°C，時間為5min;
[0022]優選的，所述步驟(5)中，所述螢火蟲熒光素酶濃度為20mmol/L。
[0023]本發明還公開了上述方法在水質實時在線評估與監測中的應用。
[0024]本發明的有益效果為:
[0025](I)本發明基于GTP與斑馬魚M受體之間的關系，首次提出基于生物發光法檢測斑馬魚M受體的含量變化，無需直接測定M受體蛋白含量，該方法靈敏度高、穩定性好、不需要復雜設備；
[0026](2)本發明操作簡單快捷、特異性高、成本低，本發明從分子方面研究膽堿能系統的內在作用機制，再結合斑馬魚行為變化方面的研究，最終能夠實現對水質的實時在線評估與監測。
【附圖說明】
[0027]圖1為實驗例I中實驗組與對照組GTP: GDP: GMP對比曲線圖
【具體實施方式】
[0028]結合附圖對本發明作進一步的說明，應該說明的是，下述說明僅是為了解釋本發明，并不對其內容進行限定。
[0029]實施例1
[0030](I)將斑馬魚組織破碎，低溫離心處理，取上清液，將上清液等量置于A、B、C三個孵育管中；
[0031](2)將步驟(I)得到上清液中的GDP和GMP轉化為GTP;更具體的，首先向各孵育管加入50yL的上清液，然后再向各管中加入PH7.5的兩性離子緩沖液，MgCl2和KCl，之后A管不再添加任何物質，B管再加入一定量的磷酸烯醇丙酮酸鹽和丙酮酸激酶，C管再加入一定量ATP和鳥苷酸激酶，各孵育管內反應混合液均用超純水調至250yL;將反應混合物孵育再沸水浴終止反應，然后將裝有反應混合液的孵育管置于冰塊中冷卻，所述孵育溫度為30°C，時間為30min;所述冷卻時間為1min;
[0032](3)破壞各反應混合液中的ATP和UTP，具體的，從步驟(2)的各孵育管中的混合液中取出50yL混合液置于新的孵育管中，向混合液中加入一定量的葡萄糖磷酸鹽，葡萄糖，NADP+，兩性離子緩沖液，MgCl2，己糖激酶，6-磷酸葡萄糖脫氫酶和二磷酸尿苷葡萄糖焦磷酸化酶;各孵育管內反應混合液均用超純水調至250yL;將含有反應混合液的各孵育管孵育一定時間后再置于冰塊中冷卻一定時間，所述孵育溫度為30°C，時間為30min;所述冷卻時間為1min;
[0033](4)將各反應混合液中的GTP轉化為ATP;具體的，從步驟(3)的各孵育管中取出50μL反應混合液置于新的孵育管中，然后向所述各孵育管中加入一定量二磷酸核苷激酶，ADP，兩性離子緩沖液，MgSO4，EDTA和二硫蘇糖醇，將各孵育管內反應混合液均用超純水調至400PL并將含有反應混合液的各孵育管孵育一定時間，所述孵育溫度為30°C，時間為5min;
[0034](5)檢測步驟(4)得到的各混合液中的ATP;具體的，從步驟(4)的各孵育管中取出50yL反應混合液，然后向所述各反應混合液中加入10yL螢火蟲熒光素酶，所述螢火蟲熒光素酶濃度為20mmol/L，在全自動計數菌落器上測試結果；
[0035](6)數據處理；由于細胞內的GTP、GDP、GMP水平是相對恒定的，三個管測試出來的ATP水平分別代表GTP、GDP和GMP水平，所以不同時間斑馬魚細胞內GTP: GDP: GMP水平變化即可得出斑馬魚M受體水平變化。
[0036]其中，所述步驟(2)中，各孵育管內反應混合液用超純水調定體積后，所述兩性離子緩沖液的濃度為15mmo I /L，所述MgC12的濃度為1.0mmo I/L，所述KCI的濃度為2.5ymo I/L，所述磷酸稀醇丙酮酸鹽的濃度為0.02mmol/L，所述丙酮酸激酶的濃度為16mg/L，所述ATP濃度為0.4ymol/L，所述鳥苷酸激酶濃度為0.8U/mL;
[0037]所述步驟(3)中，各孵育管內反應混合液用超純水調定體積后，所述葡萄糖磷酸鹽濃度為0.5mmol/L，所述葡萄糖濃度為0.5mmol/L，所述NADP+濃度為0.5mmol/L，所述兩性離子緩沖液濃度為75mmol/L，所述MgCl2的濃度為0.5mmol/L，所述KCl的濃度為0.0125mmol/L，所述己糖激酶的濃度為2U/mL，所述6-磷酸葡萄糖脫氫酶的濃度為0.8U/mL，所述二磷酸尿苷葡萄糖焦磷酸化酶的濃度為lU/mL;
[0038]所述步驟(4)中，各孵育管內反應混合液用超純水調定體積后，所述二磷酸核苷激酶濃度為0.025U/mL，所述ADP濃度為37.5pmol/mL，所述兩性離子緩沖液的濃度為31.25mmol/L，所述MgSO4濃度為6.25mmol/L，所述二硫蘇糖醇的濃度為0.625mmol/L。
[0039]實驗例I
[0040]1.實驗分為實驗組和對照組，每組放入6條斑馬魚，每條斑馬魚做為一個樣品，分別在2h，4h，6h，8h，1h，12h取一次樣品。實驗組用0.0lmol/L的阿托品(阻斷M受體的抗膽堿藥)暴露12h，對照組不添加任何物質。
[0041 ] 2.取出樣品加入預冷PBS，冰浴下充分勻漿，然后4°C，12000轉離心20分鐘，取上清液，分別經以下步驟處理。
[0042]實驗組和對照組分別準備A，B，C三個分開的孵育管，分別經以下步驟處理:
[0043](I)將得到的斑馬魚上清液中的GDP和GMP轉化為GTP;更具體的，首先向各孵育管加入獲得50yL的上清液，然后再向各管中加入PH7.5的兩性離子緩沖液，MgCl2和KCl，之后A管不再添加任何物質，B管再加入一定量的磷酸烯醇丙酮酸鹽和丙酮酸激酶，C管再加入一定量ATP和鳥苷酸激酶，各孵育管內反應混合液均用超純水調至250yL;將反應混合物孵育再沸水浴終止反應，然后將裝有反應混合液的孵育管置于冰塊中冷卻，所述孵育溫度為300C，時間為30min ；所述冷卻時間為1min ；
[0044](2)破壞各反應混合液中的ATP和UTP，具體的，從步驟(I)的各孵育管中的混合液中取出50yL混合液置于新的孵育管中，向混合液中加入一定量的葡萄糖磷酸鹽，葡萄糖，NADP+，兩性離子緩沖液，MgCl2，己糖激酶，6-磷酸葡萄糖脫氫酶和二磷酸尿苷葡萄糖焦磷酸化酶;各孵育管內反應混合液均用超純水調至250yL;將含有反應混合液的各孵育管孵育一定時間后再置于冰塊中冷卻一定時間，所述孵育溫度為30°C，時間為30min;所述冷卻時間為1min;
[0045](3)將各反應混合液中的GTP轉化為ATP;具體的，從步驟(2)的各孵育管中取出50μL反應混合液置于新的孵育管中，然后向所述各孵育管中加入一定量二磷酸核苷激酶，ADP，兩性離子緩沖液，MgSO4，EDTA和二硫蘇糖醇，將各孵育管內反應混合液均用超純水調至400PL并將含有反應混合液的各孵育管孵育一定時間，所述孵育溫度為30°C，時間為5min;
[0046](4)檢測步驟(3)得到的各混合液中的ATP;具體的，從步驟(3)的各孵育管中取出50yL反應混合液，然后向所述各反應混合液中加入10yL螢火蟲熒光素酶，所述螢火蟲熒光素酶濃度為20mmol/L，在全自動計數菌落器上測試結果；
[0047](5)數據處理；由于細胞內的GTP、GDP、GMP水平是相對恒定的，三個管測試出來的ATP水平分別代表GTP、GDP和GMP水平，所以不同時間斑馬魚細胞內GTP: GDP: GMP水平變化即可得出斑馬魚M受體水平變化。
[0048]其中，所述步驟(I)中，各孵育管內反應混合液用超純水調定體積后，所述兩性離子緩沖液的濃度為15mmo I /L，所述MgC12的濃度為1.0mmo I/L，所述KCI的濃度為2.5ymo I/L，所述磷酸稀醇丙酮酸鹽的濃度為0.02mmol/L，所述丙酮酸激酶的濃度為16mg/L，所述ATP濃度為0.4ymol/L，所述鳥苷酸激酶濃度為0.8U/mL;
[0049]所述步驟(2)中，各孵育管內反應混合液用超純水調定體積后，所述葡萄糖磷酸鹽濃度為0.5mmol/L，所述葡萄糖濃度為0.5mmol/L，所述NADP+濃度為0.5mmol/L，所述兩性離子緩沖液濃度為75mmol/L，所述MgCl2的濃度為0.5mmol/L，所述KCl的濃度為0.0125mmol/L，所述己糖激酶的濃度為2U/mL，所述6-磷酸葡萄糖脫氫酶的濃度為0.8U/mL，所述二磷酸尿苷葡萄糖焦磷酸化酶的濃度為lU/mL;
[0050]所述步驟(3)中，各孵育管內反應混合液用超純水調定體積后，所述二磷酸核苷激酶濃度為0.025U/mL，所述ADP濃度為37.5pmol/mL，所述兩性離子緩沖液的濃度為31.25mmol/L，所述MgSO4濃度為6.25mmol/L，所述二硫蘇糖醇的濃度為0.625mmol/L。
[0051 ] 實驗結果分析:以阿托品模擬污染物，分別以實驗組和對照組六條魚GTP:GDP:GMP水平做一條曲線做對比。如圖1所示，阿托品抑制組的GTP含量低于對照組而⑶P和GMP水平高于對照組，表明斑馬魚暴露在阿托品中，M受體含量降低。
[0052]上述雖然結合附圖對本發明的【具體實施方式】進行了描述，但并非對本發明保護范圍的限制，所屬領域技術人員應該明白，在本發明的技術方案的基礎上，本領域技術人員不需要付出創造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發明的保護范圍以內。
【主權項】
1.一種生物發光法在測定斑馬魚M受體水平中的應用。2.—種基于生物發光法測定斑馬魚M受體水平的方法，其特征在于，步驟包括:取實驗組和對照組斑馬魚組織上清液將GDP和GMP轉化為GTP ；將ATP和M TP破壞掉；將GTP轉化為ATP;檢測ATP并進行數據處理計算得出實驗前后斑馬魚M受體水平變化。3.如權利要求2所述的一種基于生物發光法測定斑馬魚M受體水平的方法，其特征在于，步驟包括: (1)將斑馬魚組織破碎，低溫離心處理，取上清液，將上清液等量置于A、B、C三個孵育管中； (2)將步驟(I)得到上清液中的GDP和GMP轉化為GTP;更具體的，首先向各孵育管加入一定量的上清液，然后再向各管中加入PH7.5的兩性離子緩沖液，MgCl2和KCl，之后A管不再添加任何物質，B管再加入一定量的磷酸烯醇丙酮酸鹽和丙酮酸激酶，C管再加入一定量ATP和鳥苷酸激酶，各孵育管內反應混合液均用超純水調至相同體積;將反應混合物孵育再沸水浴終止反應，然后將裝有反應混合液的孵育管置于冰塊中冷卻； (3)破壞各反應混合液中的ATP和UTP，具體的，從步驟(2)的各孵育管中的混合液中取一定量混合液置于新的孵育管中，向混合液中加入一定量的葡萄糖磷酸鹽，葡萄糖，NADP+，兩性離子緩沖液，MgCl2，己糖激酶，6-磷酸葡萄糖脫氫酶和二磷酸尿苷葡萄糖焦磷酸化酶；各孵育管內反應混合液均用超純水調至相同體積;將含有反應混合液的各孵育管孵育一定時間后再置于冰塊中冷卻一定時間； (4)將各反應混合液中的GTP轉化為ATP;具體的，從步驟(3)的各孵育管中取出一定量反應混合液置于新的孵育管中，然后向所述各孵育管中加入一定量二磷酸核苷激酶，ADP，兩性離子緩沖液，MgSO4,EDTA和二硫蘇糖醇，將各孵育管內反應混合液均用超純水調至相同體積并將含有反應混合液的各孵育管孵育一定時間； (5)檢測步驟(4)得到的各混合液中的ATP;具體的，從步驟(4)的各孵育管中取出一定量反應混合液，然后向所述各反應混合液中加入一定量螢火蟲熒光素酶，在全自動計數菌落器上測試結果； (6)數據處理；由于細胞內的GTP、GDP、GMP水平是相對恒定的，三個管測試出來的ATP水平分別代表GTP、GDP和GMP水平，所以不同時間斑馬魚細胞內GTP: GDP: GMP水平變化即可得出斑馬魚M受體水平變化。4.如權利要求3所述的一種基于生物發光法測定斑馬魚M受體水平的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，各孵育管內反應混合液用超純水調定體積后，所述兩性離子緩沖液的濃度為15mmo 1/L，所述MgCl2的濃度為I.0mmol/L，所述KCl的濃度為2.5ymol/L，所述磷酸烯醇丙酮酸鹽的濃度為0.02mmol/L，所述丙酮酸激酶的濃度為16mg/L，所述ATP濃度為0.4μmo 1/L，所述鳥苷酸激酶濃度為0.8U/mL05.如權利要求3所述的一種基于生物發光法測定斑馬魚M受體水平的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，所述孵育溫度為30°C，時間為30min;所述冷卻時間為lOmin。6.如權利要求3所述的一種基于生物發光法測定斑馬魚M受體水平的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，各孵育管內反應混合液用超純水調定體積后，所述葡萄糖磷酸鹽濃度為0.5mmol/L，所述葡萄糖濃度為0.5mmol/L，所述NADP+濃度為0.5mmol/L，所述兩性離子緩沖液濃度為75mmol/L，所述MgCh的濃度為0.51111]101凡，所述1((]1的濃度為0.01251]11]101凡，所述己糖激酶的濃度為2U/mL，所述6-磷酸葡萄糖脫氫酶的濃度為0.8U/mL，所述二磷酸尿苷葡萄糖焦磷酸化酶的濃度為lU/mL。7.如權利要求3所述的一種基于生物發光法測定斑馬魚M受體水平的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，所述孵育溫度為30°C，時間為30min;所述冷卻時間為lOmin。8.如權利要求3所述的一種基于生物發光法測定斑馬魚M受體水平的方法，其特征在于，所述步驟(4)中，各孵育管內反應混合液用超純水調定體積后，所述二磷酸核苷激酶濃度為0.025U/mL，所述ADP濃度為37.5pmol/mL，所述兩性離子緩沖液的濃度為31.25mmol/L,所述MgSO4濃度為6.25mmol/L，所述二硫蘇糖醇的濃度為0.625mmol/L，所述孵育溫度為30°C，時間為5min。9.如權利要求3所述的一種基于生物發光法測定斑馬魚M受體水平的方法，其特征在于，所述步驟(5)中，所述螢火蟲熒光素酶濃度為20mmol/L。10.如權利要求2-9任一項所述方法在水質實時在線評估與監測中的應用。
【文檔編號】G01N21/76GK106047984SQ201610364625
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月27日
【發明人】任宗明, 任晴, 張婷婷, 齊魯慧子, 邢娜, 李尚戈
【申請人】山東師范大學