一種苦蕎胚芽活性肽及其制備方法
【專利摘要】本發明屬于食品生物技術領域，涉及一種以苦蕎麥胚芽粉為原料制備抗氧化活性肽的技術，所采用的原料是制備苦蕎精米后的剩余產物，只接觸過機器設備，無化學試劑等污染，是一種原生態食品原料；經過堿性蛋白酶可控酶解技術，膜分離技術有效地獲得不同分子量的苦蕎麥胚芽肽，通過抗氧化活性的多種檢測從而確定了一條最優的抗氧化活性肽，且DPPH自由基清除的IC50值為1.8967～2.0628mg/mL、ABTS自由基清除的IC50值為0.2272～0.2638mg/mL、FRAP值為1220～1480mmol Fe2+/mg。本發明有效地提高了苦蕎麥胚芽的利用價值，為食品、藥品及化妝品行業研發新型天然添加劑提供了理論依據和實踐參考。
【專利說明】
一種苦蕎胚芽活性肽及其制備方法
技術領域
[0001]本發明屬于食品生物技術領域，具體涉及一種以苦蕎胚芽粉為原料制備的苦蕎胚芽抗氧化活性肽及其制備方法。
【背景技術】
[0002]食品中的各種成分在不斷的發生著氧化反應導致食品質量變差;人因為與外界的持續接觸，包括呼吸、放射線照射等因素不斷的在人體內產生自由基，這些過量自由基與癌癥、衰老或其它疾病大都有所關聯。所以抗氧化的研究成為現在國內外研究的熱點。
[0003]苦蕎麥富含多種營養化學成分，包括豐富的蛋白質、膳食纖維、生物類黃酮、多種維生素、葉綠素及砸、鋅、鎂、鉻、鈣等礦物質及微量元素。尤其是苦蕎麥含有18種氨基酸且組成比例均衡，營養價值明顯比小麥、玉米等其他谷類作物高得多，被譽為“五谷之王”。有研究表明將苦蕎麥蛋白提取物水解成小的多肽片段后，能顯著增強抗氧化等生理活性，具有清除體內自由基，延緩衰老，預防和治療腫瘤、癌癥等功能。
[0004]目前，國內外研究制備抗氧化肽所用的谷物類材料大多為玉米、小麥等，而以苦蕎麥為原料關于抗氧化肽的研究與開發卻鮮有報道。因此，以苦蕎胚芽為基礎，酶解分離制備苦蕎胚芽肽并評價其相關的抗氧化活性，對關于制備食源性抗氧化劑的研究以及研發新型抗氧化食品的意義重大。
【發明內容】
[0005]本發明所需解決的技術問題:
[0006]以苦蕎胚芽粉為原料，經過Alcalase堿性蛋白酶酶解，以水解度為指標通過單因素實驗確定酶解最優條件，在最優條件下酶解得到苦蕎胚芽酶解液，經過膜分離、真空冷凍干燥過程，獲得不同分子量的苦蕎胚芽肽粉，分別測定其對DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力以及鐵還原能力從而確定分子量為I?3kDa的苦蕎胚芽肽具有最高的抗氧化活性。
[0007]本發明的技術方案:
[0008]1.一種苦蕎胚芽活性肽，其特征在于，以蛋白質含量為35?45 %，脂肪含量為8?15%,碳水化合物含量為15?25 %的苦蕎胚芽粉為原料，經過酶解、膜分離、真空冷凍干燥得到苦蕎胚芽肽，該肽的分子量在I?3kDa，DPPH自由基清除的IC5q值為1.8967?2.0628mg/mL、ABTS自由基清除的IC5Q值為0.2272?0.263811^/11^小狀?值為1220?1480_01 Fe2+/mg。
[0009]2.—種苦蕎胚芽活性肽及其制備方法，其特征在于，苦蕎胚芽粉經過Alcalase堿性蛋白酶可控酶解、滅酶和離心、膜分離、真空冷凍干燥、抗氧化活性測定得到一條苦蕎胚芽活性肽；
[0010]I)所述的Alcalase堿性蛋白酶可控酶解過程，是指將18?23g苦蕎胚芽粉倒入酶解瓶中，加入195?205mL蒸餾水，啟動攪拌器將轉速設置為20?30r/min，攪拌5?1min后置于85?95 0C的水浴鍋中加熱10?15min，使蛋白質變性，將酶解瓶中料液溫度降低至45?70°C后，保持恒溫和攪拌狀態，利用0.8?1.0mol/L的氫氧化鈉溶液或者鹽酸調節酶解瓶中料液pH為8?11;按[E]/[S]為6?12%加入Alcalase堿性蛋白酶，使用0.8?1.0mol/L的氫氧化鈉溶液或者鹽酸使酶解瓶中料液的pH變化在±0.04內，酶解時間為1.5?4h。
[0011]2)所述的滅酶和離心過程，是指酶解結束后，將酶解瓶中的酶解液迅速升溫至90?95°C時，滅酶10?20min后，冷卻至2?6°C，將冷卻后的酶解液離心，離心溫度為O?4°C，轉速為8000?10000r/min，離心時間為15?25min，收集上清液并將pH值調至7，4°C冰箱冷減備用；
[0012]3)所述的膜分離過程，是指將離心上清液進行膜分離處理，膜分截流量分別為小于IkDa、I?3kDa、3?1kDa與大于1kDa，調控進口壓力為10?30psi，回流壓力為5?20psi，流速為1.0?2.0mL/min，收集膜下液，獲得四種不同分子量的苦蕎胚芽肽液；
[0013]4)所述的真空冷凍干燥過程，是指將2?8°C四種分子量的苦蕎胚芽肽液分裝在400 X 200_的冷凍盤中，厚度為3?5_，用保鮮膜密封;然后置于預凍溫度為-80?-70°C冰箱中，預凍1.0?2.0h后取出并將保鮮膜扎孔，移至真空冷凍干燥機中，制冷溫度設定為-60?-50°C，真空度壓力設定為20?50Pa，凍干時間為10?16h，獲得四種分子量的苦蕎胚芽肽粉。
[0014]5)所述的抗氧化活性測定，是指分別測定這四種分子量的苦蕎胚芽肽粉對DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力以及鐵還原能力。
[0015]3.根據權利要求2所述的一種苦蕎胚芽活性肽及其制備方法，其特征在于，所述的Alcalase堿性蛋白酶可控酶解過程，Alcalase堿性蛋白酶的酶活力為20萬u/g，所用的水是PH為7.0的蒸餾水。
[0016]4.根據權利要求2所述的一種苦蕎胚芽活性肽及其制備方法，其特征在于，所述的膜分離過程，分子量為lkDa、3kDa、10kDa的超濾膜使用前要用蒸餾水清洗I?2次，再用0.5?0.1mol/L的NaOH清洗I?2次，最后再經蒸餾水沖洗I?2次。
[0017]申請發明技術效果:
[0018](I)本申請發明是以苦蕎胚芽粉為原料，經Alcalase堿性蛋白酶可控酶解、滅酶和離心、膜分離、真空冷凍干燥、抗氧化活性的測定，獲得苦蕎胚芽抗氧化活性肽，DPPH自由基清除的IC5Q值為I.8967?2.0628mg/mL、ABTS自由基清除的IC5q值為0.2272?0.2638mg/mL、FRAP值為 1220?1480mmol Fe2Vmg；
[0019](2)本發明設計的工藝技術路線簡單，投入設備較少，有利于提高苦蕎胚芽的利用價值，為食品、藥品及化妝品行業研發新型天然添加劑提供了理論依據和實踐參考。
[0020]本申請發明專利的技術優勢分析
[0021]第一，本專利所采用的原料來源廣泛，天然、無污染，易獲取，成本低。苦蕎麥在中國東北、華北、西北、西南山區都有所栽培，苦蕎胚芽粉是制備苦蕎精米后的剩余產物，只接觸過機器設備，無化學試劑等污染，是一種原生態食品原料。
[0022]第二，本發明采用Alcalase堿性蛋白酶可控酶解技術，膜分離技術方便有效地分離出不同分子量的苦蕎胚芽肽，并通過DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力以及鐵還原能力(FRAP)的測定對其進行抗氧化活性評價，最終確定了分子量在I?3kDa的苦蕎胚芽肽具有最高的抗氧化活性；
[0023](I)本發明使用Alcalase堿性蛋白酶酶解苦蕎胚芽粉，通過單因素實驗選取了最優酶解條件并獲得苦蕎胚芽酶解液；
[0024](2)采用膜分離技術有效地分離出四種分子量的肽液，通過對其抗氧化活性的測定，確定了 I?3kDa分子量的苦蕎胚芽肽具有最高的抗氧化活性；
[0025](3)本專利以DPPH自由基清除能力為衡量指標，經測定，分子量在I?3kDa的苦蕎胚芽肽DPPH自由基清除的IC5q值為1.8967?2.0628mg/mL;
[0026](4)本專利以ABTS自由基清除能力為衡量指標，經測定，分子量在I?3kDa的苦蕎胚芽肽ABTS自由基清除的IC5q值為0.2272?0.2638mg/mL；
[0027](5)本專利以FRAP鐵還原能力為衡量指標，經測定，分子量在I?3kDa的苦蕎胚芽肽FRAP值為 1220?1480mmol Fe2+/mg。
【具體實施方式】
[0028]實施例1:
[0029]以蛋白質含量為45%，脂肪含量為11%，碳水化合物含量為15%的苦蕎胚芽粉為原料，稱取20g原料倒入酶解瓶中，加入200mL蒸餾水，啟動攪拌器將轉速設置為23r/min，攪拌9min后置于87 °C的水浴鍋中加熱13min，使蛋白質變性，將酶解瓶中料液溫度降低至45 °C后，保持恒溫和攪拌狀態，利用0.85mol/L的氫氧化鈉溶液或者鹽酸調節酶解瓶中料液pH為8.5;按[E]/[S]為9%加入Alcalase堿性蛋白酶，使用0.85mo VL的氫氧化鈉溶液或者鹽酸使酶解瓶中料液的PH變化在± 0.04內，酶解時間為4h ο酶解結束后，將酶解瓶中的酶解液迅速升溫至90°C時，滅酶ISmin后，冷卻至4°C，將冷卻后的酶解液離心，離心溫度為2°C，轉速為10000r/min，離心時間為25min，收集上清液并將pH值調至7。將離心上清液進行膜分離處理，膜分截流量分別為小于IkDa、I?3kDa、3?1kDa與大于1kDa，調控進口壓力為1psi，回流壓力為5psi，流速為1.5mL/min，收集膜下液，獲得四種不同分子量的苦蕎胚芽肽液。將6°C四種分子量的苦蕎胚芽肽濃分裝在400 X 200mm的冷凍盤中，厚度為4mm，用保鮮膜密封；然后置于預凍溫度為-80°C冰箱中，預凍2.0h后取出并將保鮮膜扎孔，移至真空冷凍干燥機中，制冷溫度設定為_50°C，真空度壓力設定為20Pa，凍干時間為15h，獲得四種分子量的苦蕎胚芽肽，再經過抗氧化活性的測定優選出分子量為I?3kDa的肽具有最好的抗氧化活性，且DPPH自由基清除的IC5Q值為1.9048mg/mL、ABTS自由基清除的1(:5()值為0.237811^/11^1^?值為 1400mmol Fe2+/mg。
[0030]實施例2:
[0031 ]以蛋白質含量為38 %，脂肪含量為8 %，碳水化合物含量為25 %的苦蕎胚芽粉為原料，稱取22g原料倒入酶解瓶中，加入205mL蒸餾水，啟動攪拌器將轉速設置為25r/min，攪拌8min后置于90 °C的水浴鍋中加熱12min，使蛋白質變性，將酶解瓶中料液溫度降低至50 °C后，保持恒溫和攪拌狀態，利用0.9mol/L的氫氧化鈉溶液或者鹽酸調節酶解瓶中料液pH為10;按[E]/[S]為12%加入Alcalase堿性蛋白酶，使用0.9mol/L的氫氧化鈉溶液或者鹽酸使酶解瓶中料液的PH變化在± 0.04內，酶解時間為2h ο酶解結束后，將酶解瓶中的酶解液迅速升溫至95°C時，滅酶20min后，冷卻至2°C，將冷卻后的酶解液離心，離心溫度為1°C，轉速為9000r/min，離心時間為15min，收集上清液并將pH值調至7。將離心上清液進行膜分離處理，膜分截流量分別為小于lkDa、l?3kDa、3k?1kDa與大于lOkDa，調控進口壓力為30psi，回流壓力為20psi，流速為2.0mL/min，收集膜下液，獲得四種不同分子量的苦蕎胚芽肽液。將2°C四種分子量的苦蕎胚芽肽濃分裝在400 X 200mm的冷凍盤中，厚度為5mm，用保鮮膜密封；然后置于預凍溫度為_73°C冰箱中，預凍1.3h后取出并將保鮮膜扎孔，移至真空冷凍干燥機中，制冷溫度設定為_55°C，真空度壓力設定為50Pa，凍干時間為12h，獲得四種分子量的苦蕎胚芽肽，再經過抗氧化活性的測定優選出分子量為I?3kDa的肽具有最好的抗氧化活性，且DPPH自由基清除的IC5Q值為1.9264mg/mL、ABTS自由基清除的1(:5()值為0.240311^/11^1^?值為 1390mmol Fe2+/mg。
[0032]實施例3:
[0033]以蛋白質含量為42%，脂肪含量為13 %，碳水化合物含量為22 %的苦蕎胚芽粉為原料，稱取18g原料倒入酶解瓶中，加入198mL蒸餾水，啟動攪拌器將轉速設置為30r/min，攪拌5min后置于95 °C的水浴鍋中加熱1min，使蛋白質變性，將酶解瓶中料液溫度降低至70 °C后，保持恒溫和攪拌狀態，利用1.0mo 1/L的氫氧化鈉溶液或者鹽酸調節酶解瓶中料液pH為11;按[E]/[S]為6%加入Alcalase堿性蛋白酶，使用1.0mol/L的氫氧化鈉溶液或者鹽酸使酶解瓶中料液的PH變化在±0.04內，酶解時間為1.5h。酶解結束后，將酶解瓶中的酶解液迅速升溫至94°C時，滅酶13min后，冷卻至6°C，將冷卻后的酶解液離心，離心溫度為3°C，轉速為9500r/min，離心時間為23min，收集上清液并將pH值調至7。將離心上清液進行膜分離處理，膜分截流量分別為小于IkDa、I?3kDa、3k?1kDa與大于1kDa，調控進口壓力為25psi，回流壓力為13psi，流速為1.3mL/min，收集膜下液，獲得四種不同分子量的苦蕎胚芽肽液。將5°C四種分子量的苦蕎胚芽肽濃分裝在400 X 200mm的冷凍盤中，厚度為4.5mm，用保鮮膜密封;然后置于預凍溫度為-70°C冰箱中，預凍1.0h后取出并將保鮮膜扎孔，移至真空冷凍干燥機中，制冷溫度設定為_58°C，真空度壓力設定為35Pa，凍干時間為10h，獲得四種分子量的苦蕎胚芽肽，再經過抗氧化活性的測定優選出分子量為I?3kDa的肽具有最好的抗氧化活性，且DPPH自由基清除的IC5q值為2.0038mg/mL、ABTS自由基清除的IC5q值為0.2469mg/mL、FRAP值為 1370mmol Fe2+/mg。
[0034]實施例4:
[0035]以蛋白質含量為35%，脂肪含量為10 %，碳水化合物含量為20 %的苦蕎胚芽粉為原料，稱取23g原料倒入酶解瓶中，加入20 ImL蒸餾水，啟動攪拌器將轉速設置為20r/min，攪拌1min后置于85°C的水浴鍋中加熱15min，使蛋白質變性，將酶解瓶中料液溫度降低至65°(:后，保持恒溫和攪拌狀態，利用0.8mol/L的氫氧化鈉溶液或者鹽酸調節酶解瓶中料液pH為8;按[E]/[S]為8%加入Alcalase堿性蛋白酶，使用0.8mol/L的氫氧化鈉溶液或者鹽酸使酶解瓶中料液的PH變化在± 0.04內，酶解時間為3.5h。酶解結束后，將酶解瓶中的酶解液迅速升溫至92°C時，滅酶15min后，冷卻至3°C，將冷卻后的酶解液離心，離心溫度為4°C，轉速為8000r/min，離心時間為20min，收集上清液并將pH值調至7。將離心上清液進行膜分離處理，膜分截流量分別為小于IkDa、I?3kDa、3k?1kDa與大于1kDa，調控進口壓力為20psi，回流壓力為1psi，流速為1.0mL/min，收集膜下液，獲得四種不同分子量的苦蕎胚芽肽液。將8°C四種分子量的苦蕎胚芽肽濃分裝在400 X 200mm的冷凍盤中，厚度為3mm，用保鮮膜密封;然后置于預凍溫度為_75°C冰箱中，預凍1.5h后取出并將保鮮膜扎孔，移至真空冷凍干燥機中，制冷溫度設定為-600C，真空度壓力設定為45Pa，凍干時間為13h，獲得四種分子量的苦蕎胚芽肽，再經過抗氧化活性的測定優選出分子量為I?3kDa的肽具有最好的抗氧化活性，且DPPH自由基清除的IC5Q值為2.0608mg/mL、ABTS自由基清除的IC5Q值為0.2597mg/mL、FRAP值為 1230mmol Fe2+/mg。
[0036]實施例5:
[0037]以蛋白質含量為40%，脂肪含量為15%，碳水化合物含量為18%的苦蕎胚芽粉為原料，稱取21g原料倒入酶解瓶中，加入195mL蒸餾水，啟動攪拌器將轉速設置為27r/min，攪拌6min后置于92 °C的水浴鍋中加熱I Imin，使蛋白質變性，將酶解瓶中料液溫度降低至60 °C后，保持恒溫和攪拌狀態，利用0.95mol/L的氫氧化鈉溶液或者鹽酸調節酶解瓶中料液pH為10.5;按^]/[5]為7%加入41(^1&%堿性蛋白酶，使用0.9511101/1的氫氧化鈉溶液或者鹽酸使酶解瓶中料液的PH變化在± 0.04內，酶解時間為3.0h。酶解結束后，將酶解瓶中的酶解液迅速升溫至93 °C時，滅酶1min后，冷卻至5 °C，將冷卻后的酶解液離心，離心溫度為O °C，轉速為8500r/min，離心時間為18min，收集上清液并將pH值調至7。將離心上清液進行膜分離處理，膜分截流量分別為小于IkDa、I?3kDa、3k?1kDa與大于1kDa，調控進口壓力為15psi，回流壓力為8psi，流速為1.8mL/min，收集膜下液，獲得四種不同分子量的苦蕎胚芽肽液。將4°C四種分子量的苦蕎胚芽肽濃分裝在400 X 200mm的冷凍盤中，厚度為3.5mm，用保鮮膜密封;然后置于預凍溫度為_78°C冰箱中，預凍1.Sh后取出并將保鮮膜扎孔，移至真空冷凍干燥機中，制冷溫度設定為-530C，真空度壓力設定為25Pa，凍干時間為16h，獲得四種分子量的苦蕎胚芽肽，再經過抗氧化活性的測定優選出分子量為I?3kDa的肽具有最好的抗氧化活性，且DPPH自由基清除的IC5q值為2.0537mg/mL、ABTS自由基清除的IC5q值為0.252511^/11^小1^?值為1250臟01 Fe2+Aig。
【主權項】
1.一種苦蕎胚芽活性肽，其特征在于，以蛋白質含量為35?45%，脂肪含量為8?15%，碳水化合物含量為15?25%的苦蕎胚芽粉為原料，經過酶解、膜分離、真空冷凍干燥得到苦蕎胚芽肽，該肽的分子量在I?3kDa，DPPH自由基清除的IC5q值為1.8967?2.0628mg/mL、ABTS 自由基清除的 IC5Q 值為0.2272?0.263811^/11^狀?值為1220?1480_01 Fe2+/mg。2.權利要求1所述的一種苦蕎胚芽活性肽的制備方法，其特征在于:是將苦蕎胚芽粉經過Alcalase堿性蛋白酶可控酶解、滅酶和離心、膜分離、真空冷凍干燥、抗氧化活性測定得到一條苦蕎胚芽活性肽； 1)所述的Alcalase堿性蛋白酶可控酶解過程，是指將18?23g苦蕎胚芽粉倒入酶解瓶中，加入195?205mL蒸饋水，啟動攪拌器將轉速設置為20?30r/min，攪拌5?1min后置于85?95 0C的水浴鍋中加熱10?15min，使蛋白質變性，將酶解瓶中料液溫度降低至45?70°C后，保持恒溫和攪拌狀態，利用0.8?1.0mol/L的氫氧化鈉溶液或者鹽酸調節酶解瓶中料液pH為8?11 d$[E]/[S]為6?12%加入Alcalase堿性蛋白酶，使用0.8?1.0mol/L的氫氧化鈉溶液或者鹽酸使酶解瓶中料液的pH變化在±0.04內，酶解時間為1.5?4h; 2)所述的滅酶和離心過程，是指酶解結束后，將酶解瓶中的酶解液迅速升溫至90?950C時，滅酶10?20min后，冷卻至2?6 °C，將冷卻后的酶解液離心，離心溫度為O?4°C，轉速為8000?10000r/min，離心時間為15?25min，收集上清液并將pH值調至7，4°C冰箱冷藏備用； 3)所述的膜分離過程，是指將離心上清液進行膜分離處理，膜分截流量分別為小于lkDa、l?3kDa、3?1kDa與大于10kDa，調控進口壓力為10?30psi，回流壓力為5?20psi，流速為1.0?2.0mL/min，收集膜下液，獲得四種不同分子量的苦蕎胚芽肽液； 4)所述的真空冷凍干燥過程，是指將2?8°C四種分子量的苦蕎胚芽肽液分裝在400X200_的冷凍盤中，厚度為3?5_，用保鮮膜密封;然后置于預凍溫度為-80?-70°C冰箱中，預凍1.0?2.0h后取出并將保鮮膜扎孔，移至真空冷凍干燥機中，制冷溫度設定為-60?-500C，真空度壓力設定為20?50Pa，凍干時間為10?16h，獲得四種分子量的苦蕎胚芽肽粉； 5)所述的抗氧化活性測定，是指分別測定這四種分子量的苦蕎胚芽肽粉對DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力以及鐵還原能力。3.如權利要求2所述的一種苦蕎胚芽活性肽的制備方法，其特征在于，所述的Alcalase堿性蛋白酶可控酶解過程，Alcalase堿性蛋白酶的酶活力為20萬u/g，所用的水是pH為7.0的蒸餾水。4.如權利要求2所述的一種苦蕎胚芽活性肽的制備方法，其特征在于，所述的膜分離過程，分子量為lkDa、3kDa、1kDa的超濾膜使用前要用蒸餾水清洗I?2次，再用0.5?0.1mol/L的NaOH清洗I?2次，最后再經蒸餾水沖洗I?2次。
【文檔編號】C07K1/34GK106047973SQ201610634137
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月5日 公開號201610634137.1, CN 106047973 A, CN 106047973A, CN 201610634137, CN-A-106047973, CN106047973 A, CN106047973A, CN201610634137, CN201610634137.1
【發明人】張鳴鏑, 張絲甜, 林松毅, 葉海青, 黃延軍
【申請人】吉林大學