一種抗菌肽Nisin及其提取方法與應用
【專利摘要】本發明涉及一種抗菌肽Nisin及其提取方法與應用，提取方法主要包括：(1)將購買的乳酸乳球菌菌種經活化、平板劃線、種子液培養、擴大培養后，得到乳酸乳球菌發酵液；(2)將乳酸乳球菌發酵液經調節pH為2.0，水浴，離心處理后，棄沉淀得上清，再用0.22μm濾膜過濾除菌得到Nisin懸浮發酵液；(3)用離子液體雙水相[Bmim]Cl?K2HPO4處理發酵液，制得Nisin富集液；(4)將Nisin富集液經CH2Cl2萃取，除去離子液體，制得Nisin精提液。本發明提取工藝簡單，成本低，污染小，適用于規模化生產高純度的Nisin。得到的高純度抗菌肽Nisin，可有效抑制革蘭氏陽性細菌的生長，抑菌活性強，可作為天然、綠色的食品防腐劑進行推廣應用。
【專利說明】
-種抗菌化N i s i n及其提取方法與應用
技術領域
[0001] 本發明設及天然產物深加工技術領域，具體設及乳酸乳球菌ATCC 11454發酵液中 的抗菌膚Nisin及其提取方法與應用。
【背景技術】
[0002] 化sin是由乳酸乳球菌乳酸亞種(Xactococ州.lactis. subsp. lactis)分泌的一種 具有抗菌活性的多膚，由34個氨基酸殘基組成，分子量為3510,通常W二聚體形式存在。在 天然狀態下，Nisin有Nisin A和Nisin Z兩種形式，后者的抑菌能力比前者強。研究認為， Nisin對細菌的營養細胞和抱子都有作用，它對于營養細胞的主要作用點是細胞質膜，抑制 細胞壁中膚聚糖的生物合成，從而使細胞壁質膜和憐脂化合物合成受阻，造成細胞內物質 外泄，引起細胞裂解。對芽抱的作用是在抱子出現膨脹的起始階段抑制其發芽。Nisin在60 多個國家得到廣泛應用，主要作為乳制品、肉制品、罐藏食品W及飲料的天然防腐劑。與其 他防腐劑相比，Nisin具有安全無毒、抗菌性強、水溶性好、熱穩定性好等優點，但Nisin也存 在抑菌譜較窄的弊端。細菌素在pH 6.0-6.5的條件下能吸附在產生菌的細胞上，離屯、收集 菌體，再在pH=2條件下使細菌素從菌體上解離下來。
[0003] Nisin的生產，主要是W乳酸乳球菌作為生產菌，經過發酵獲得，發酵產物的提取 方法主要有有機溶劑法、吸附法和柱層析法。有機溶劑法是利用正丙醇、丙酬、乙酸等有機 溶劑沉淀Nisin,利用K也P〇4等進行鹽析，是一種經典的方法，但其缺點是回收率低，回收產 物活性低。吸附法是利用菌體對Nisin在高抑吸附、低抑解析附的特性進行純化，但當Nisin 的濃度非常高時，會超過細胞吸附Nisin的能力，只能回收部分Nisin。柱層析法是利用一些 層析介質對Nisin進行分離純化，其優點是操作簡便、分離效果好，缺點是處理量小、分離時 間較長。
【發明內容】
[0004] 本發明目的在于提供一種抗菌膚Nisin及其提取方法與應用解決現有Nisin回收 率低，回收產物活性低等問題。
[0005] 為了實現上述的目的，采用如下的技術方案：
[0006] -種抗菌膚Nisin的提取方法，包括W下步驟：
[0007] (1)將購買的乳酸乳球菌菌種經活化、平板劃線、種子液培養、擴大培養后，得到乳 酸乳球菌發酵液；
[000引（2)將乳酸乳球菌發酵液經調節pH為2.0，水浴，離屯、處理后，棄沉淀得上清，再用 0.22WI1濾膜過濾除菌得到Nisin懸浮發酵液；
[0009] (3)用離子液體雙水相[Bmim] CI-K2HPO4處理發酵液，制得Ni sin富集液；
[0010] (4)將Nis in富集液經C也Ch萃取，除去離子液體，制得Ni sin精提液。
[0011] CH2CI2萃取主要作用是回收[Bmim]Cl，可W使抗菌膚Nisin與[Bmim]Cl分離開， [Bmim]Cl價格昂貴，回收后可循環使用。Nisin得到進一步純化，可應用與食品領域。
[0012]進一步的，步驟（1)中，所述菌種的活化為將購買的菌種ATCC 11454干粉用0.5mL 液體培養基溶解，再W5 % (v/v)的比例接入5mL液體培養基中，活化22-24h;所述平板劃線 為用接種針取少許活化好的菌液，劃線接種于平板上，靜置培養18-2化;所述種子液培養為 從平板上挑取單菌落，接種于30mL液體培養基中，恒溫培養19-2化;所述擴大培養為將培養 好的種子液W3%(v/v)的比例接種于新鮮的200mL液體培養基中，恒溫培養16-1化得到乳 酸乳球菌發酵液，所有培養溫度維持在29-3rC。
[0013] 進一步的，步驟(2)所述水浴為在80-85°C水浴20min，所述離屯、處理為4000巧m的 條件下離屯、5min。
[0014] 進一步的，步驟(3)所述離子液體雙水相[Bmim]Cl-K2HP〇4中[Bmim]Cl的質量分數 為27.6%-28.6%，K2HP化的質量分數為14%-15%。質量分數處于運個范圍是獲得穩定萃取 體系的質量分數。[Bmim]Cl和K2HP化的質量分數過多或過少都會影響萃取體系的萃取性能 和穩定性，主要影響雙水相體系的形成，不會形成本發明保護的萃取體系性能。
[0015] 進一步的，步驟(3)所述離子液體雙水相[Bmim]Cl-K抽P〇4與所述發酵液的重量比 為2:0.8-1.2。處于運個比例才有利于獲得穩定的萃取體系，過多或過少都不能形成穩定的 萃取體系。
[0016] 進一步的，步驟(4)中所述Nisin富集液與所述CH2CI2的重量比為1:1.5-2。處于此 比例可得到最佳的[Bmim]Cl回收效果，過多或過少均沒有本發明保護的此最佳效果。
[0017 ] -種上述制備方法制得的N i S i n精提液。
[001引進一步的，上述Nisin精提液的抑菌效價為3037IU/mL。
[0019] 本發明制得的Nisin精提液經蛋白濃度檢測，回收率為95-97%。
[0020] 本發明所得的Nisin精提液經lYicine-SDS-PAGE電泳鑒定在5.8邸曰、7.8邸曰附近 有條帶。本發明利用牛津杯測抑菌圈的方法檢測提取物的抑菌活性，WNisin標準品作為對 照；WBCA法測蛋白濃度，在562皿處測其吸光值，WTricine-SDS-PAGE電泳鑒定提取物的分 子量，W超低分子蛋白標準為maker。
[0021] -種上述Nisin精提液的應用，作為天然、綠色的食品防腐劑。
[0022] 與現有技術相比，本發明采用高溫濃縮、離子液體雙水相處理、C此C12萃取出去離 子液體[Bmim]Cl可W回收，Nisin可單獨被純化出來，避免了傳統方法高成本、低回收的弊 端，提取工藝簡單，離子液體相對于傳統的有機溶劑毒性和污染性較低，適用于大規模化生 產。而且本發明制得的Nisin精提液具有良好的抑菌效果，可有效抑制革蘭氏陽性細菌的生 長，可應用于食品領域可W作為天然、綠色的食品防腐劑。
【附圖說明】
[0023] 圖1是本發明的Nisin精提液提取工藝流程圖；
[0024] 圖2是Nisin標準品抑菌效價標準曲線；
[00巧]圖3是化1別116-505斗466電泳鑒定結果，1為1曰1?5。2為標準品化3111;3為化3111懸 浮液;4為[Bmim]Cl-K2HP〇4體系上相；
[00%]圖4是[Bmim]Cl-K2HP化體系分配發酵液的抑菌試驗結果，a為上相，b為下相，C為標 準品5000IU/mL，d為Nisin懸浮液；
[0027]圖5是蛋白回收率結果;測定的是Nisin懸浮液在離子液體雙水相[Bmim]Cl-K2HP化 體系萃取后，總蛋白的回收率，白色柱子對應離子液體雙水相體系上相的蛋白回收率，黑色 柱子對應離子液體雙水相體系下相的蛋白回收率。
【具體實施方式】
[0028]為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明作進一 步地詳細描述。
[00巧]實施例1
[0030] 制備Nisin精提液，如圖1所示，主要包括W下步驟：
[0031] (1)制備乳酸乳球菌發酵液:按表1配制乳酸乳球菌培養基將抑調至6.8,若是固體 培養基，則還需加入1.5 %的瓊脂，115°C滅菌15min;將購買的菌種ATCC 11454干粉用0.5mL 液體培養基溶解，再W 5 % (v/v)的比例接入5mL液體培養基中，在培養箱中培養24h;用接種 針取少許活化好的菌液，劃線接種于平板上，在培養箱中靜置培養1她;從平板上挑取單菌 落，接種于30mL液體培養基中，在培養箱中培養1她。將培養好的種子液W3%(v/v)的比例 接種于新鮮的200mL液體培養基中，培養箱中靜置培養16h，培養箱溫度為29°C。
[0032] 表1乳酸乳球菌ATCC 11454培養基配方
[0033]
[0034] (2)制備Nisin懸浮液:將乳酸乳球菌發酵液調節pH至2W下，在80°C水浴20min， 4000rpm的條件下離屯、5min，棄沉淀取上清液，用0.22]im濾膜過濾一次除菌，得到Ni sin懸浮 液。
[00巧](4)制備Nisin富集液：利用離子液體雙水相[Bmim]Cl-K2HP化處理分配Nisin懸浮 液，其中離子液體雙水相體系包含27.6%(wt化抽P〇4+14%(wt)[Bmim]Cl;萃取條件為20g的 雙水相體系中加入9g發酵液，充分混勻30min后，400化pm離屯、20min分相;Nisin富集在上 相，制得Nisin富集液；
[0036] (5)制備Nisin精提液:將Nisin富集相與C此CbWl: 1.5的比例充分混勻，靜置化， C出C12溶解離子液體在下相，取上相即為Nisin精提液。
[0037] 實施例2
[003引制備Ni S in精提液，如圖1所示，主要包括W下步驟：
[0039] (1)制備乳酸乳球菌發酵液:按表1配制乳酸乳球菌培養基將抑調至6.8,若是固體 培養基，則還需加入1.5 %的瓊脂，115°C滅菌15min;將購買的菌種ATCC 11454干粉用0.5mL 液體培養基溶解，再W5% (v/v)的比例接入5mL液體培養基中，在3培養箱中培養22h;用接 種針取少許活化好的菌液，劃線接種于平板上，在培養箱中靜置培養1她;從平板上挑取單 菌落，接種于30mL液體培養基中，在培養箱中培養20h。將培養好的種子液W3%(v/v)的比 例接種于新鮮的200mL液體培養基中，培養箱中靜置培養17h，培養箱溫度為3(TC。
[0040] (2)制備Nisin懸浮液:將乳酸乳球菌發酵液調節pH至2W下，在83°C水浴20min， 4000rpm的條件下離屯、5min，棄沉淀取上清液，用0.22]im濾膜過濾兩次除菌，得到Ni sin懸浮 液。
[0041 ] (4)制備Nisin富集液:利用離子液體雙水相[Bmim]Cl-K2HP化處理分配Nisin懸浮 液，其中離子液體雙水相體系包含28.1 % (wt化抽P04+14.5% (wt) [Bmim]Cl;萃取條件為20g 的雙水相體系中加入9g發酵液，充分混勻30min后，400化pm離屯、20min分相;化sin富集在上 相，制得Nis in富集液；
[0042] (5)制備Nisin精提液:將Nisin富集相與C此CbWl:1.7的比例充分混勻，靜置化， C出C12溶解離子液體在下相，取上相即為Nisin精提液。
[0043] 實施例3
[0044] 制備Nisin精提液，如圖1所示，主要包括W下步驟：
[0045] (1)制備乳酸乳球菌發酵液:按表1配制乳酸乳球菌培養基將抑調至6.8,若是固體 培養基，則還需加入1.5 %的瓊脂，115°C滅菌15min;將購買的菌種ATCC 11454干粉用0.5mL 液體培養基溶解，再W 5 % (v/v)的比例接入5mL液體培養基中，在培養箱中培養24h;用接種 針取少許活化好的菌液，劃線接種于平板上，在培養箱中靜置培養20h;從平板上挑取單菌 落，接種于30mL液體培養基中，在培養箱中培養2化。將培養好的種子液W3%(v/v)的比例 接種于新鮮的200mL液體培養基中，培養箱中靜置培養1她，培養箱溫度為3rC。
[0046] (2)制備Nisin懸浮液:將乳酸乳球菌發酵液調節pH至2W下，在85°C水浴20min， 4000rpm的條件下離屯、5min，棄沉淀取上清液，用0.22]im濾膜過濾S次除菌，得到Ni sin懸浮 液。
[0047] (4)制備Nisin富集液:利用離子液體雙水相[Bmim]Cl-K2HP化處理分配Nisin懸浮 液，其中離子液體雙水相體系包含28.6%(wt化抽P〇4+15%(wt)[Bmim]Cl;萃取條件為20g的 雙水相體系中加入9g發酵液，充分混勻30min后，400化pm離屯、20min分相;Nisin富集在上 相，制得Nis in富集液；
[004引（5)制備Nisin精提液：將Nisin富集相與C出CbWl: 2的比例充分混勻，靜置化， C出C12溶解離子液體在下相，取上相即為Nisin精提液。
[0049] 實施例4
[0050] 將按照實施例1、實施例2和實施例3所述方法制備的抗菌素做如下檢測。
[0化1] 一、抑菌活性實驗
[0052]本實例中W金黃色葡萄球菌為指示菌，根據Nisin標準品的抑菌效價標準曲線來 計算樣品的效價。
[005引1 .根據表2配制金黃色葡萄球菌，將pH調至7.5。若是固體培養基，則還需加入 1.5%的瓊脂，115°C滅菌15min; W10% (v/v)的比例在5血液體培養基中接入保存在甘油中 的菌種，在37°C恒溫搖床中W20化pm轉速振蕩培養12h;用接種針取活化好的菌液劃線接種 于平板上，在37°C恒溫培養箱中靜置培養化W獲得單菌落;挑取單菌落接種于30mL液體培 養基中，在37°C，200巧m轉速的搖床中振蕩培養12h;然后W3%(v/v)的比例接入100血新鮮 液體培養基中，在相同條件下振蕩培養化后，將菌液用0.02M PBS稀釋至濃度為1 X 108c化/ mL左右的菌懸液。
[0054]表2金黃色葡萄球菌培養基配方
[0化5]
[0056] 2.抑菌實驗:取lOmL培養基平鋪于平板中，待其凝固之后取稀釋后的ImL金黃色葡 萄球菌菌懸液與15mL培養基混勻，傾倒于平板中，效價培養基中瓊脂的含量為1 %。將牛津 杯放置于平板上，在牛津杯中加入1(K)化的標準品或樣品。加入后先在無菌操作臺中通風擴 散30min，然后在4 °C冰箱中擴散24h，最后將平板放入37 °C恒溫培養箱中培養24h，培養完畢 后用游標卡尺測量并記錄抑菌圈的大小。
[0057] 標準品與樣品的牛津杯放置方法。選用的標準效價從高到低依次為80000IU/mL、 40000IU/mL、20000IU/血、10000IU/血、5000IU/mL、2500IU/mLW 及 1250IU/mL，分別對應 S1 ~S7，S4為中間濃度。每個濃度的標準品需準備=個平板，實驗結束后分別求出六個中間濃 度標準品與六個Si(i為1、2、3、5、6或7)抑菌圈大小的平均值，并計算標準偏差與相對標準 偏差。然后進行平板間差異校正，計算公式如下：
[0化引 Xc = Xs-(Xr-P)
[0059] XC為標準品平均值的校正值，Xs為原始標準品平均值，Xr為六個中間濃度標準品的 平均值，P為所有中間濃度標準品的平均值。
[0060] 計算出Xc后，即可繪制Nisin抑菌標準曲線，如圖2所示，y = 1.373x+0.648，R2 = 0.993。樣品效價的測定與標準曲線的繪制類似，用樣品化1)替代其他標準品溶液與中間濃 度標準品進行實驗即可。
[0061] 二、Tricine-SDS-Page
[0062] 1、TCA-丙酬沉淀:取未開封的500g TCA藥品，加入227mL超純水，用磁力攬拌器混 勻溶解，配制成100%的TCA溶液；取1.35mL Nisin懸浮液與體系[Bmim]Cl-K2冊〇4上相與 0.15mL 100 %的TCA溶液混合，此過程在冰浴上進行，防止蛋白局部變性；混合均勻后，置 于-20°C的冰箱中靜置沉淀化;將丙酬放入-20°C的冰箱中預冷30min，待沉淀好的蛋白在4 °C、14000巧m的條件下離屯、2min后，棄上清，在沉淀中加入0.2mL丙酬清洗;將加入丙酬的沉 淀在4°C、14000rpm的條件下離屯、2min，棄上清，再次加入0.2mL丙酬清洗沉淀;再次將加入 丙酬的沉淀在4°C、14000rpm的條件下離屯、2min，棄上清;將蛋白沉淀放入37°C烘箱中烘干 5min，加入裂解液溶解。
[0063] 2、Tricine-SDS-PAGE 電泳
[0064] 2.1、用超純水清洗電泳玻璃板和膠條，烘干后按儀器說明進行安裝，然后用1.5% 的瓊脂封膠。
[0065] 2.2、電泳試劑及膠的配制：按表3與表4的配方配制電泳試劑和電泳膠，從下至上 依次為分離膠、夾層膠、濃縮膠，插入樣品梳，凝膠聚合后，在上、下電泳槽內分別加入陰極 緩沖液與陽極緩沖液，小屯、拔出梳子，可準備上樣。
[0066] 表3電泳試劑配方
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[0070] 2.3、樣品與Marker的處理及上樣：將30化蛋白質樣品與10jiL4Xloading buffer 混勻后，與Marker-同放入沸水浴中加熱5min后即可用微量進樣器依次上樣。
[0071 ] 2.4、電泳：上樣完成后，插上電極，接通電源進行電泳。先將電壓調至20V電泳 2〇111111，^利于膠孔疏松。然后^6(^電壓進行電泳，樣品進入分離膠后，將電壓調至8〇- 100V。當漠酪藍遷移至分離膠底部時，停止電泳，關閉電源，擦開玻璃板取出凝膠。由于電壓 加大時緩沖液溫度會升高，小分子蛋白易被降解，所W電泳過程宜在4 °C冰箱中進行。電泳 完成后，取出凝膠，進行固定、染色和脫色處理。
[0072] 如圖3所示，Nisin的分子量為3 .化Da，但是在電泳圖中標準品與樣品均在5.8- 6kDa有條帶，原因是Nisin抑菌作用需要一條前導膚輔助吸附在細胞表面，才能發揮抑菌效 果，運條前導膚的大小為2.35kDa，說明電泳圖中發酵液與[Bmim]Cl-K2HP〇4體系上相有 Nisin的目的條帶，而7.8-lOkDa處的條帶可能是Nisin作為二聚體或四聚體的存在形式，說 明離子液體雙水相體系對Nisin具有一定的富集純化效果。
[0073] S、[Bmim]Cl-K2HP〇4體系分配發酵液的抑菌試驗結果
[0074] 如圖4所示，對[Bmim]Cl-K2HP〇4體系分配發酵液的抑菌試驗，其中a為上相，b為下 相，C為標準品5000IU/mL，d為Nisin懸浮液，其中a和b都經過C出Cl2萃取過[Bmim]Cl的溶液， C和d未經什么處理。從圖4可W看出發酵液中具有抑菌效果的Nisin富集在[Bmim]Cl-K2HP化 體系上相中。
[0075] 四、蛋白回收率結果
[0076] 測定的是Nisin懸浮液在離子液體雙水相[Bmim]Cl-K2HP化體系萃取后，總蛋白的 回收率如圖5所示，測定的是Nisin懸浮液在離子液體雙水相[Bmim](n-K2HP化體系萃取后， 總蛋白的回收率，白色柱子對應離子液體雙水相體系上相的蛋白回收率，黑色柱子對應離 子液體雙水相體系下相的蛋白回收率，說明蛋白質成分富集在[Bmim]Cl-K2HP〇4體系的上相 中。回收率為95-97 %。
[0077] 雖然，上文中已經用一般性說明、【具體實施方式】及實驗，對本發明作了詳盡的描 述，但在本發明基礎上，可W對之做一些改進，運對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發明的基礎上所做的運些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
【主權項】
1. 一種抗菌肽Ni s in的提取方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 將購買的乳酸乳球菌菌種經活化、平板劃線、種子液培養、擴大培養后，得到乳酸乳 球菌發酵液； (2) 將乳酸乳球菌發酵液經調節pH為2.0,水浴，離心處理后，棄沉淀得上清，再用0.22μ m濾膜過濾除菌得到Nisin懸浮發酵液； ⑶用離子液體雙水相[Bmim]Cl-K2HP〇4處理發酵液，制得Nisin富集液； (4)將Ni s in富集液經CH2C12萃取，除去離子液體，制得Ni s in精提液。2. 根據權利要求1所述提取方法，其特征在于，步驟（1)中，所述菌種的活化為將購買的 菌種ATCC 11454干粉用0.5mL液體培養基溶解，再以5% (v/v)的比例接入5mL液體培養基 中，活化22-24h;所述平板劃線為用接種針取少許活化好的菌液，劃線接種于平板上，靜置 培養18-20h;所述種子液培養為從平板上挑取單菌落，接種于30mL液體培養基中，恒溫培養 19-2lh;所述擴大培養為將培養好的種子液以3 % (v/v)的比例接種于新鮮的200mL液體培 養基中，恒溫培養16-18h得到乳酸乳球菌發酵液，所有培養溫度維持在29-31°C。3. 根據權利要求1所述提取方法，其特征在于，步驟（2)所述水浴為在80-85Γ水浴 20min，所述離心處理為4000rpm的條件下離心5min。4. 根據權利要求1所述提取方法，其特征在于，步驟(3)所述離子液體雙水相[Bmim]Cl-K2HPO4中[Bmim]Cl的質量分數為27·6%-28·6%，Κ 2ΗΡ〇4的質量分數為 14%-15%。5. 根據權利要求4所述提取方法，其特征在于，步驟(3)所述離子液體雙水相[Bmim]Cl-K2HP〇4與所述發酵液的重量比為2:0.8-1.2。6. 根據權利要求1所述提取方法，其特征在于，步驟（4)中所述Nisin富集液與所述 012(：12的重量比為1 :1.5-2。7. 根據權利要求1-6任一項所述提取方法制得的Nisin精提液。8. 根據權利要求7所述Nisin精提液，其特征在于，抑菌效價為3037 IU/mL。9. 根據權利要求7所述Nisin精提液，其特征在于，所述Nisin精提液經Tricine-SDS-PAGE電泳鑒定在5.8KDa、7.8KDa附近有條帶。10. 根據權利要求7-9任一項所述Nisin精提液的應用，其特征在于，作為天然、綠色的 食品防腐劑。
【文檔編號】A23L3/3526GK106047966SQ201610553056
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月12日
【發明人】劉楊, 李夏云, 肖湘
【申請人】汕頭大學