一種(s)?1?(2,6?二氯?3?氟苯基)乙醇的生物制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種(S)?1?(2,6?二氯?3?氟苯基)乙醇的生物制備方法，所述方法包括以下步驟：將共表達全細胞、2,6?二氯?3?氟苯乙酮、葡萄糖和緩沖液按一定比例混合后反應，在pH＝5～8、溫度為30～40℃下反應，經后處理得到目標產物，其中共表達全細胞為含羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶的基因工程菌。與現有技術相比，本發明所采用的方法無需添加外源性輔酶，催化劑與反應液極易分離，極大地簡化了工藝，降低生產成本，同時產物收率及ee值均較高，具有較好的工業應用價值。
【專利說明】
-種(S)-1-(2,6-二氯-3-氣苯基)乙醇的生物制備方法
技術領域
[0001] 本發明屬于生物制藥領域，具體設及一種（S)-1-(2,6-二氯-3-氣苯基）乙醇的生 物制備方法。
【背景技術】
[0002] 克挫替尼(Cr i Z 01 i n i b)是由輝瑞公司研制的抑制ALK/ME T/R0S的ATP競爭性的多 祀點蛋白激酶抑制劑，該藥在ALK、R0S和MET激酶活性異常的腫瘤患者中均被證實對人體有 顯著臨床療效。2011年克挫替尼被美國食品藥品管理局(抑A)批準上市，2013年1月在我國 進口上市，商品名為"賽可瑞"，目前主要用于治療間變性淋己瘤激酶陽性的局部晚期和轉 移的非小細胞肺癌。其結構式如下所示：
[000
[0004] (S)-1-(2,6-二氯-3-氣苯基）乙醇是合成克挫替尼的關鍵中間體，國內外對其制 備方法進行廣泛研究，目前制備方法包括化學合成法和生物轉化法?；瘜W合成法主要采用 手性催化劑不對稱還原2,6-二氯-3-氣苯乙酬得到（S)-1-(2,6-二氯-3-氣苯基）乙醇 (CN103319311AXN201510820824等），該方法存在反應條件苛刻、手性催化劑昂貴、產物手 性純度低及廢液處理成本高等問題。
[0005] 與化學合成法相比，生物合成法具有反應條件溫和、轉化率高和立體選擇性強等 優點。專利W02006021881、W02007066187、W02009036404公開了克挫替尼及關鍵中間體(S)- 1-(2,6-二氯-3-氣苯基）乙醇的制備方法，主要是通過醋酶催化水解的方法合成關鍵中間 體，但該方法操作過程復雜，反應時間長，收率低于50 %，難W實現工業化生產。
[0006] 專利CN101851237報道了采用豬肝脂肪酶催化水解1-(2,6-二氯-3-氣苯基）乙基 醋酸醋進行選擇性拆分，該方法中原料1-(2,6-二氯-3-氣苯基）乙基醋酸醋需經多步反應 制備得到，催化工藝步驟較多，最終得率僅為49 %，后提取工藝復雜，不利于實現工業化生 產。
[0007] 專利胖02006021885報道了不同生物催化劑還原2,6-二氯-3-氣苯乙酬直接得到 (S)-1-(2,6-二氯-3-氣苯基）乙醇，但反應的轉化率較低，當用馬肝醇脫氨酶和輔酶NADH、 NADPH為催化劑時，轉化率為55 % ;當用來源于化odutorula SP.的菌株Y2-UC2387為催化劑 時轉化率為57%，同時反應時間較長高達7天，該方法目前難W實現工業化生產。
[000引專利W02009036404報道了酬還原酶催化2,6-二氯-3-氣苯乙酬得到（S)-1-(2,6- 二氯-3-氣苯基）乙醇的方法，轉化率為94%。該方法中使用了兩種氧化還原酶酶粉W及外 源性輔酶NADP，反應體系復雜，生產成本高。此外，W酶粉作為催化劑時后處理過程乳化嚴 重，對提取效率和操作過程具有不利的影響。
【發明內容】
[0009] 為了克服現有技術所存在的上述缺陷，本發明公開了一種(S)-1-(2,6-二氯-3-氣 苯基)乙醇的生物制備方法，W此提高該產品的生產效率。
[0010] 具體工藝路線如下所示：
[0011；
[0012]為實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下：
[OOU] 1)將能夠還原2,6-二氯-3-氣苯乙酬到（S)-1-(2,6-二氯-3-氣苯基）乙醇的酬還 原酶編碼基因與葡萄糖脫氨酶的編碼基因串聯插入同一表達載體中，構建共表達重組菌， 通過兩種酶的共表達和細胞自帶的輔酶實現底物還原和輔酶循環的催化體系，無需添加外 源性輔酶；
[0014] 2)將上述共表達游離細胞或固定化全細胞、2,6-二氯-3-氣苯乙酬、葡萄糖、緩沖 液按一定比例混合，在pH=5~8、溫度為30~40°C下反應1~48h。反應混合液中共表達游離 細胞濃度為25~50g/L或者固定化全細胞濃度為100~200g/L、2,6-二氯-3-氣苯乙酬的濃 度為100~200g/L、葡萄糖濃度為100~200g/L和緩沖液的濃度為50~lOOmM。反應結束后離 屯、或過濾回收細胞，用乙酸乙醋萃取、濃縮和結晶，目標產物（S)-1-(2,6-二氯-3-氣苯基） 乙醇摩爾收率大于90%、ee值大于99.9%。
[0015] 進一步說，所述幾基還原酶為高加索乳桿菌來源的酬還原酶突變體，所述葡萄糖 脫氨酶為枯草芽抱桿菌來源的葡萄糖脫氨酶突變體。
[001W 進一步說，緩沖液為憐酸鹽緩沖液或醋酸鋼緩沖液，優選為憐酸鹽緩沖液。
[0017] 進一步說，所述基因工程菌選自重組大腸桿菌或重組畢赤酵母菌，其中優選為重 組大腸桿菌化2UDE3)。
[0018] 進一步說，共表達細胞W游離細胞或固定化全細胞的形式加入，優選W固定化全 細胞加入。
[0019] 進一步說，所述固定化全細胞制備方法為:將共表達游離細胞與固定劑混合、干燥 成型。
[0020] 進一步說，所述固定劑為聚乙二醇、聚丙締酷胺、聚乙締醇或海藻酸巧中的一種或 它們的組合，其中優選為聚乙締醇。
[0021 ]進一步說，所述共表達游離細胞與所述固定劑的質量比為1:1~1: 2。
[0022] 進一步說，所述固定化全細胞經過濾后可W回收套用，套用次數為1~5次。
[0023] 與現有技術相比，本發明的優點在于：（1)利用共表達細胞作為催化劑，無需添加 外源性輔酶，極大地簡化了工藝，降低生產成本；（2)利用固定化細胞進行催化反應，細胞與 反應液易分離，操作過程簡單，催化劑可重復利用，提高了生產效率；（3)反應條件溫和，產 物收率及ee值均較高，反應過程中W葡萄糖作為氨供體，價格低廉，性質穩定，便于工業化 生產。
【附圖說明】
[0024] 圖巧本發明實施例3中檢測的反應轉化率的HPLC圖譜。
[0025] 圖2為本發明實施例3中檢測的產物ee值的手性HPLC圖譜。
【具體實施方式】
[0026] 下面結合具體實施例對本發明的技術內容作進一步的闡述，其目的是為了更好的 理解本發明的內容，但本發明的保護范圍不限于此。
[0027] 實施例1共表達重組菌的構建
[00%]將全合成的KRED182基因作為模板進行PCR擴增并在兩端引入酶切位點（正向引物 引入Ncol酶切位點，反向引物引入化ndlll酶切位點），使用Nco巧肌indin對其酶切，并回 收得到KR抓基因片段。同時，提取pRSF-Duet載體的質粒，也對其進行化〇1和化ndin酶切， 并回收酶切后的載體片段。將KR抓基因片段和載體片段使用T4連接酶進行連接，并轉化入 E. CO1 i BL21 (DE3)中，涂布Kan抗性平板，于37 °C培養箱培養。待轉化子長出后，挑取若干單 克隆進行菌落PCR驗證，選取驗證結果為陽性的單克隆進行后續實驗，將該菌種命名為 KRED-1菌。然后提取KR抓菌質粒，再使用Nde巧日趾〇1對其進行酶切，回收該載體片段；另一 方面，對GDH105基因進行PCR擴增，W全合成的基因為模板，并在兩端引物酶切位點化向引 物加入Ndel酶切位點，反向引物加入趾〇1酶切位點）回收后，也使用Nde巧日化〇1對其進行酶 切，并將GDH基因片段和KRED-1菌質粒片段連接后轉化E.coli BL2UDE3)中，涂布Kan抗性 平板，于37°C培養箱培養。待菌落長出后挑取單克隆進行菌落PC閲金證，選取陽性單克隆，即 得到共表達重組菌。
[0029] 實施例2共表達重組菌游離細胞及固定化全細胞的制備
[0030] 共表達游離細胞可W經過發酵培養獲得，發酵培養基使用2YT培養基，含有16g/L 蛋白腺，lOg/L酵母粉，5g/L化Cl，2g/L甘油。具體步驟如下:首先將該菌種接種于裝有50mL 培養基的小搖瓶(容量250ml)中，于37°C搖床培養12h對菌種進行活化，然后將活化后的菌 體接種入裝有400mL培養基的大搖瓶（容量1L，帶擋板）中，接種量8ml，于37°C搖床培養至 0D600nm達到0.6-1.0時，加入IPTG至終濃度為0.1 mM，于25°C搖床誘導表達20h后離屯、收集 共表達細胞，即為游離細胞。
[0031] 稱取300g聚乙締醇加入3.化水中，升溫至90-95 °C，攬拌直至聚乙締醇完全溶解后 降溫至25-30°C。向上述溶液中加入200g共表達細胞，攬拌化后，用蠕動累和塑料排槍吸取 混合液注在平面上形成圓片狀，干燥箱30°C干燥比，移入0.1M化2S化溶液穩定化后濾干，清 水洗涂兩次，得到800g固定化全細胞。
[0032] 實施例3共表達游離細胞轉化制備(S)-1-(2,6-二氯-3-氣苯基)乙醇
[0033] 于25mL反應容器中加入lOOmM的憐酸鹽緩沖液（lOmL，抑= 6.0)、葡萄糖（3.0g)及 底物2，6-二氯-3-氣苯乙酬(3. Og)，定容至15mL，攬拌均勻后共表達游離細胞(750mg)，35°C 下磁力攬拌反應，化20)3(20%，w/v)控制反應抑在6.0左右，TLC檢測反應進程。反應結束后 離屯、去除細胞，等體積乙酸乙醋萃取=次，合并有機相，無水硫酸鋼干燥，減壓旋干即得產 品（S)-1-(2，6-二氯-3-氣苯基）乙醇2.84g，產物摩爾收率為94%、ee值大于99.9 % dHPLC檢 測轉化率及產物ee值，轉化率>99%，S型產物ee值>99%，檢測結果分別見圖1(底物保留時 間為6.7min，產物保留時間為4. Omin)和圖2 (S型產物保留時間為16.3min，R型產物保留時 間為 17.6min)。
[0034] 實施例4共表達游離細胞轉化制備(S)-1-(2,6-二氯-3-氣苯基)乙醇
[0035] 于25mL反應容器中加入70mM的憐酸鹽緩沖液（10血，抑=8.0)、葡萄糖(2g)及底物 2,6-二氯-3-氣苯乙酬(2g)，定容至15血，攬拌均勻后共表達游離細胞(375mg)，35°C下磁力 攬拌反應，化20)3(20%，w/v)控制反應抑在8.0左右，TLC檢測反應進程。反應結束后離屯、去 除細胞，等體積乙酸乙醋萃取=次，合并有機相，無水硫酸鋼干燥，減壓旋干即得產品（S)- 1-( 2，6-二氯-3-氣苯基）乙醇1.88g，產品純度為97 %，產物摩爾收率為93 %、ee值大于 99.9%。
[0036] 實施例5固定化全細胞轉化制備(S)-1-(2,6-二氯-3-氣苯基)乙醇
[0037] 于25mL反應容器中加入lOOmM的憐酸鹽緩沖液（lOmL，抑=6.5)、葡萄糖（3.0邑)及 底物2,6-二氯-3-氣苯乙酬（3.0g)，定容至15mL，攬拌均勻后加入固定化全細胞(3g)，30°C 下磁力攬拌反應，化20)3(20%，w/v)控制反應抑在6.5左右，TLC檢測反應進程。反應結束后 過濾回收固定化全細胞，濾液加入等體積乙酸乙醋萃取=次，合并有機相，無水硫酸鋼干 燥，減壓旋干即得產品（S)-1-(2，6-二氯-3-氣苯基）乙醇2.89g，產品純度為96%，產物摩爾 收率為95 %、ee值大于99.9 %。
[0038] 實施例6公斤級(S)-1-(2,6-二氯-3-氣苯基）乙醇的制備
[0039] 向帶夾套的玻璃反應蓋(2化）中加入50mM的憐酸鹽緩沖液（1化，抑=6.0)、葡萄糖 (3.0kg)及底物2,6-二氯-3-氣苯乙酬（3.0kg)，定容至15L，攬拌均勻后加入固定化全細胞 (3kg)，35 °C攬拌反應，化0H(0.5M)控制反應抑在6.0左右，TLC檢測轉化率達到99 %后結束 反應，過濾回收固定化全細胞。濾液調節抑至2.0左右，60 °C保溫化，加入娃藻±攬拌15min 后過濾，濾液加入等體積乙酸乙醋萃取=次，合并有機相，無水硫酸鋼干燥，減壓旋干，即得 產品2.8kg，摩爾收率為92 %，產品純度為97 %，產物ee值>99.9 %。
[0040] 實施例7公斤級(S)-1-(2,6-二氯-3-氣苯基)乙醇的制備
[0041 ]向帶夾套的玻璃反應蓋(2化）中加入80mM的憐酸鹽緩沖液（1化，抑=7.0)、葡萄糖 (2kg)及底物2,6-二氯-3-氣苯乙酬（1.5kg)，定容至15L，攬拌均勻后加入固定化全細胞 (1.54肖），35°(：攬拌反應，化細(0.51)控制反應抑在7.0左右，化(：檢測轉化率達到99%后結 束反應，過濾回收固定化全細胞。濾液調節pH至2.0左右，60°C保溫化，加入娃藻±攬拌 15min后過濾，濾液加入等體積乙酸乙醋萃取S次，合并有機相，無水硫酸鋼干燥，減壓旋 干，即得產品1.38kg，摩爾收率為91 %，產品純度為98 %，產物ee值>99.9 %。
[0042] 實施例8用回收固定化全細胞轉化制備(S)-1-(2,6-二氯-3-氣苯基)乙醇
[0043] 向帶夾套的玻璃反應蓋(2化）中加入50mM的憐酸鹽緩沖液（1化，抑=6.0)、葡萄糖 (3.0kg)及底物2,6-二氯-3-氣苯乙酬(3.0kg)，定容至15L，攬拌均勻后加入實施例6回收套 用的固定化全細胞(3kg)，35°C攬拌反應，化0H(0.5M)控制反應pH在6.0左右，TLC檢測轉化 率達到99 %后結束反應，過濾回收固定化細胞。濾液調節pH至2.0左右，60°C保溫化，加入娃 藻±攬拌15min后過濾，濾液等體積乙酸乙醋萃取=次，合并有機相，無水硫酸鋼干燥，減壓 旋干，即得產品2.73kg，摩爾收率為90 %，產品純度96 %，產物ee值>99.9 %。
[0044] 將實施例6的固定化細胞進行依次回收套用，反應條件及后處理過程同實施例6， 套用效果如下表所示：
[0045]
[0046]
【主權項】
1. 一種(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基）乙醇的生物制備方法，其特征在于:將共表達全細 胞、2,6_二氯-3-氟苯乙酮、葡萄糖和緩沖液按一定比例混合后反應得到產物，所述共表達 全細胞為含羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶的基因工程菌。2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述共表達全細胞為固定化全細胞，反應中 所述固定化全細胞濃度為100~200g/L。3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述共表達全細胞為游離細胞，反應中所述 游離細胞濃度為25~50g/L。4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述羰基還原酶為高加索乳桿菌來源的酮還 原酶突變體，所述葡萄糖脫氫酶為枯草芽孢桿菌來源的葡萄糖脫氫酶突變體。5. 如權利要求1所述的方法，其特征在于：所述2,6_二氯-3-氟苯乙酮的濃度為100~ 200g/L、所述葡萄糖濃度為100~200g/L、所述緩沖液的濃度為50~100mM，反應在pH=5~ 8、溫度為30~40 °C下進行。6. 如權利要求1所述的方法，其特征在于：所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液或醋酸鈉緩沖 液。7. 如權利要求3所述的方法，其特征在于:所述游離細胞由基因工程菌發酵得到，所述 基因工程菌選自大腸桿菌或酵母菌。8. 如權利要求2所述的方法，其特征在于:所述固定化全細胞的制備方法為將共表達游 離細胞與固定劑混合、干燥成型，所述共表達游離細胞與所述固定劑的質量比為1:1~1: 2。9. 如權利要求8所述的方法，其特征在于:所述固定劑為聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚乙烯 醇或海藻酸鈣中的一種或它們的組合。
【文檔編號】C12N11/08GK106047950SQ201610504004
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月30日
【發明人】竺偉, 高新星, 胡集鋮, 吳會
【申請人】尚科生物醫藥（上海）有限公司