一種電壓門控鈉離子通道Nav1.9異源表達系統及應用
【專利摘要】一種電壓門控鈉離子通道Nav1.9異源表達系統及應用。基于蛋白融合表達策略，成功構建一種在異源細胞（ND7/23細胞和CHO?K1細胞）功能性表達的Nav1.9異源表達系統，其表達的電流幅度較大且穩定、具有DRG細胞上野生型Nav1.9電流相似的電生理和藥理學特征，用于研究Nav1.9藥理學及作用于Nav1.9的藥物分子篩選。
【專利說明】
一種電壓門控鈉離子通道Nav1.9異源表達系統及應用
技術領域
[0001]本發明涉及分子生物學中一種表達系統及應用，具體涉及一種疼痛相關鈉離子通道Nav1.9異源表達系統及應用。
【背景技術】
[0002]Navl.9電流在小直徑的DRG細胞和三叉神經等外周傷害感覺神經元中高表達，對比另外8個鈉離子通道，Navl.9具有獨特的電生理特性使得其在神經元中扮演著一個“閾值通道”，能放大細微的閾下刺激而介導動作電位的產生從而引起神經元的興奮。近年來大量的研究證明Navl.9在炎性、神經性疼痛以及冷覺感知中扮演重要的角色。特別是隨著高通量測序技術的發展，鑒定到多個Navl.9通道編碼基因突變引起神經性疼痛和家族性的神經性疾病。因此Navl.9與疼痛相關的研究是研究者聚焦的一個熱點。再者，目前Navl.9幾乎不能異源表達的問題是世界公認的，并且在低溫(28°C)培養轉入ND7/23細胞也只有300pA左右的電流產生，且電流不穩定，無論是對Navl.9的藥理學研究和藥物篩選都存在很大的限制，這實際上也是導致對Navl.9研究進展相對較為緩慢的原因之一。因此，構建一個能穩定表達Navl.9電流的異源表達系統是急待解決的關鍵技術。
【發明內容】
[0003]本發明旨在于提供一種Nav1.9的異源表達系統及應用，該表達系統能夠穩定表達電流幅度大的Nav1.9電流，以解決Nav1.9疼痛相關研究中電流表達的關鍵問題。
[0004]下面結合附圖對本研究作進一步的說明說明書附圖
圖1 Nav1.9-GFP蛋白框架圖；
圖2 Nav1.9-GFP在ND7/23細胞中表達的電生理特征圖譜；
圖3 Nav1.9-GFP在CHO-Kl細胞中表達的電流圖。
[0005]跨膜蛋白的功能性表達與翻譯修飾后內質網轉運相關，而內質網轉運主要是由于跨膜蛋白的胞內段所影響(N-端、C-端和三個胞內連接區)。以CDSa為模式分子研究內質網滯留情況，我們將五個胞內區分別嵌入⑶8α的C-端，發現Nav1.9的C-端存在顯著的內質網滯留信號。由于通道的C-端自身柔性大，存在多個調控位點，可能C-端是影響Nav1.9異源表達的一個重要原因。據這一點，我們經過數年探索，基于蛋白融合表達策略，成功構建了一個在異源細胞(ND7/23細胞和CHO-Kl細胞)功能性表達的Nav1.9異源表達體系，其表達的電流幅度較大且穩定、具有DRG細胞上野生型Nav1.9電流相似的電生理和藥理學特征；
本發明構建的Nav1.9表達系統具有易操作，電流幅度大且穩定，背景干擾小，可對Nav1.9的動力學進行研究等優勢，是一個研究Nav1.9藥理學及作用于Nav1.9的藥物分子篩選的理想工具。
[0006]【具體實施方式】:
ND7/23細胞是大鼠DRG細胞與神經膠質瘤細胞的雜交細胞，CHO-Kl細胞是中國倉鼠卵母細胞，這兩種細胞易于培養且相對穩定，在電生理研究中常被用來各種離子通道的表達。我們設計了一個Nav1.9的融合蛋白(稱為Nav1.9-GFP)，表達于ND7/23細胞中，培養36h后進行全細胞膜片鉗實驗。
[0007]1.本發明關鍵技術
1.1以pEGFP-ΝΙ表達載體為模板，構建hNavl.9(p.V165I )-linker_GFP融合蛋白，簡稱Nav1.9-GFP。如圖1所示，人類Nav1.9(p.V165I)蛋白和通過短的I inker (ARDPPAA)連接綠色熒光蛋白GFP;
1.2異源細胞表達:根據轉染試劑的要求，將4yg Nav1.9-GFP質粒轉入密度約90%的ND7/23或CHO-Kl細胞中，6小時后用胰酶消化更換成正常培養基放入37°C、5% CO2培養箱中培養20小時，然后再將細胞轉入29 °C、5% CO2培養箱中培養，待培養20小時后即可進行電生理分析和其他Nav1.9相關研究。
[0008]
2.實驗結果
2.1 Nav1.9-GFP在ND7/23細胞中表達的電生理特征
如圖2所示，轉染Nav1.9通道后通過膜片鉗全細胞記錄模式記錄的最大電流只有200pA左右(圖2A左)，而轉染Nav1.9-GFP通道的最大激活電流近1.5nA(圖2A右)，電流密度顯著增大(圖28，20。表明似￥1.9-6??能在仰7/23細胞中表達幅度大且穩定的似￥1.9電流。并且Nav1.9-GFP表達的電流在記錄的十分鐘內保持穩定(圖2D);
Nav1.9-GFP的激活曲線和穩態失活曲線，兩者有較大重疊區，這與文獻報道類似(圖
2E)；
2.2圖3所示，Nav1.9-GFP在CHO-Kl細胞中表達也能產生大的電流。
[0009]上述實驗結果表明通過蛋白融合表達策略構建的Nav1.9異源表達體系在ND7/23細胞以及CHO-Kl細胞中均能表達幅度較大且穩定的電流，具有DRG細胞上野生型Nav1.9電流相似的電生理和藥理學特征。并且利用該系統驗證了已報道的致病突變的電生理特點，跟報道的結果一致。因此，本發明構建的鈉離子通道Nav1.9異源表達系統，是研究Nav1.9與疼痛疾病相關的分子機制以及作用于Nav1.9的藥物分子篩選的理想工具。
【主權項】
1.一種鈉離子通道Navl.9異源表達系統，其特征在于，基于蛋白融合表達策略構建一種在異源細胞功能性表達的Nav1.9異源表達系統。2.根據權利要求書I所述融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白框架為圖1所示。3.根據權利要求書I所述表達系統，其特征在于，表達的電流幅度較大且穩定、具有DRG細胞上野生型Nav1.9電流相似的電生理和藥理學特征。4.一種如權利要求1?3中所述Navl.9異源表達系統在Nav1.9藥理學研究及Nav1.9的藥物分子篩選中的應用。
【文檔編號】G01N33/68GK106047929SQ201610460598
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月23日
【發明人】劉中華, 梁宋平, 周熙
【申請人】湖南師范大學