源于稻瘟病菌的真菌致病性基因Moarrdc1及用圖
【專利摘要】本發明提供了一個源于稻瘟病菌的真菌致病性基因Moarrdc1及用途，同時提供了該基因的核苷酸序列或其互補鏈的核苷酸序列、該基因編碼的cDNA序列以及該基因編碼的蛋白質的氨基酸序列。該基因在營養生長、孢子形成模式、孢子產生量、侵染菌絲形成和致病過程中起重要作用，該基因Moarrdc1或其編碼的蛋白質的表達可作為用于設計和篩選抗真菌藥物的靶標。
【專利說明】
源于稻痘病菌的真菌致病性基因 Moarrdcl及用途
技術領域
[0001] 本發明屬于植物病理學和微生物基因工程領域，提供了一個來源于稻攝病菌的、 在營養生長、抱子形成模式、抱子產生量、侵染菌絲形成和致病過程中起重要作用的新基因 Moarrdcl編碼區核巧酸序列及其編碼蛋白質的氨基酸序列。
【背景技術】
[0002] 稻攝病又稱為稻熱病，是由稻攝病菌(Magnaporthe 0巧zae)引起的一種世界性重 要稻病。稻攝病與紋枯病和白葉枯病被列為=大水稻病害。該病主要通過氣流傳播，對水稻 生產的危害程度因品種、栽培技術W及氣候條件不同有所差別。世界上每年由稻攝病造成 的水稻產量損失在10%-30%，局部田塊甚至絕收。我國幾乎每年都有稻攝病的流行和爆 發。如2005年，四川省20個市和127個縣的230萬畝稻田，重慶市100多萬畝稻田發生稻攝病， 因其流行迅速、發病品種多，對水稻產量影響嚴重。在2011年7-10月間，中國龍川、肇慶、陽 江等地遭受不同程度的稻攝病菌侵害，江西宜春和浙江等"高產抗病"品種也大面積發病。 除此W外，稻攝病菌也能侵染其他禾本科植物，對小米、大麥和小麥等農作物造成的影響也 不可估量。
[0003] 稻攝病菌的生活史分為有性階段和無性階段。有性階段不參與病害循環，其在自 然環境中也沒有觀察到。在實驗室條件下，將兩個不同交配型的菌株進行有性雜交，可產生 子囊和子囊抱子。在自然界中，無性階段始于營養菌絲分化產生分生抱子梗;而后，分生抱 子梗W合軸式的產抱模式產生分生抱子;分生抱子隨風雨降落到水稻葉片上，抱子尖端釋 放粘膠，使其與水稻葉片的疏水表面緊密粘貼;2小時之內，分生抱子萌發產生芽管，芽管尖 端形成腫大并"鉤化"，繼而形成具有侵染能力的特殊細胞結構-附著胞；附著胞形成侵染 栓，穿透寄主表皮，進入葉肉組織，形成次生侵染菌絲在寄主組織胞內進行胞間傳播，導致 寄主退綠和組織壞死，產生病班;最后在被侵染的葉片表面產生出新的分生抱子梗，其再次 W合軸方式產生分生抱子，新產生的分生抱子進行下一輪侵染循環。進入冬天時，分生抱子 和營養菌絲在稻谷和稻草上越冬，完成其生活史。次年春天，分生抱子重新開始新一輪的病 害循環過程。由上述可見稻攝病菌W合軸方式產生分生抱子是其成功進入病害循環的先決 條件，研究表明稻攝病菌W其他方式產生的分生抱子，其往往無法完成侵染循環。
[0004] 鑒定和克隆植物病原真菌的致病性基因，尤其是與病害循環緊密相關的基因，可 為設計和篩選抗真菌藥物提供有用的祀標位點。目前已在包括稻攝病菌在內的許多真菌中 證明了一些藥物祀點的存在，并獲得了療效不錯的抗真菌農藥制劑。例如，稻攝病菌抗菌劑 =環挫，其祀點是稻攝病菌的=徑糞還原酶，其作用機制是抑制黑色素合成；另外一種青霉 菌多膚殺菌劑so巧henA，其作用祀點是青霉CYP51基因產物脫甲基酶。因此，利用分子生物 學技術鑒定和克隆在稻攝病菌侵染過程中具有重要功能的致病性基因，可W為設計和篩選 新的抗真菌藥物提供有用的藥物祀點。
【發明內容】
[0005] 本發明要解決的技術問題是提供一種新的、對稻攝病菌等真菌的菌絲生長、分生 抱子產生模式和分生抱子產生量、侵染菌絲形成W及致病性有重要影響的基因 Moarrdcl及 該基因的用途。
[0006] 為了解決上述技術問題，本發明提供了一種源于稻攝病菌的真菌致病性基因 Moarrdcl，該基因的核巧酸序列或其互補鏈的核巧酸序列為SEQ ID N0:1。
[0007] 本發明同時提供了上述基因 Moarrdcl編碼的cDNA序列，該cDNA序列具有SEQ ID NO :2所示的核巧酸序列。
[000引本發明同時提供了上述基因 Moarrdcl編碼的蛋白質，該蛋白質具有SEQ ID N0:3 所示的氨基酸序列。
[0009] 本發明還同時提供了基因 Moarrdc 1的用途，該基因 Moarrdc 1的表達作為用于設計 和篩選抗真菌藥物的祀標。
[0010] 本發明還同時提供了基因 Moarrdcl編碼的蛋白質的用途，該蛋白質的表達和修飾 作為設計和篩選抗真菌藥物的祀標。
[0011] 本發明通過同源序列比對，在稻攝病菌中克隆了與致病性相關的基因 Moarrdcl， 該基因在真核生物中高度保守，唯獨在植物中不存在其同源序列。
[0012] 本發明通過構建Moarrdcl基因同源置換載體，利用農桿菌介導的轉化將載體轉入 到野生型稻攝病菌，得到了基因缺失突變體A Moarrdcl;在基因缺失突變體A Moarrdcl中， 重新引入A Moarrdc 1基因，突變體的表型恢復。
[0013] 本發明分析了基因缺失突變體A Moarrdcl的基本表型，稻攝病菌Moarrdcl基因缺 失后，氣生菌絲變得稀少，菌落生長緩慢;分生抱子的產抱方式發生根本性改變，由合軸式 (sympodial)變為向頂式(acropetal);產抱能力大幅下降；侵染菌絲形成大幅下降；水稻和 大麥的致病性顯著減弱。
[0014] 本發明所設及的基因因為同源重組造成的基因缺失突變導致稻攝病菌生長緩慢、 產抱方式改變，產抱量下降，侵染菌絲形成降低，并在感病水稻品種上的致病力大幅下降； 更重要的是，比較基因組學研究發現此類基因雖在多數真核生物中保守，其在植物中卻不 存在。因此，本發明最重要的用途是:應用上述成果，設計和篩選能夠破壞該基因的表達、剪 切及其編碼蛋白表達的化合物，或設計和篩選能對該蛋白的氨基酸序列進行修飾的化合 物，從而開發出新的抗真菌藥物。同時，由于此類基因所在的基因家族在植物中不存在同源 基因，因此W此基因為祀點開發的抗真菌藥物對宿主植物本身的影響會比較小。此外，本發 明的用途還包括利用該基因的DNA或cDNA序列作為探針在其它真菌中分離與該基因具有一 定序列同源性的序列。
【附圖說明】
[0015] 下面結合附圖對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0016]圖1:稻攝病菌中全部arrestin家族蛋白示意圖。Arrestin家族蛋白是除植物W外 的所有真核生物中廣泛保守存在的一類重要信號調控因子。本發明針對其中命名為 Moarrdcl的蛋白；
[0017] 圖2:Moarrdcl基因敲除過程示意圖；
[0018]圖3: Southern 雜交驗證 Moarrdcl的敲除；
[0019] 圖4:基因缺失突變體AMoarrdcl產抱模式由合軸式變為向頂式。4A/4B/4C，野生 型(Wild-type)、基因缺失突變體（AMoa;rrdcl)及互補突變體(a;rrdc-c)在CM平板上的生長 速度（圖4A)，產抱量（圖4B)和分生抱子萌發率（圖4C)統計結果。AMoarrdcl在CM培養基上 生長速度明顯慢于野生型和互補突變體，其產抱量亦大幅下降，并且所產生的抱子萌發率 大幅下降；
[0020] 圖5:巧巧光白染色表明缺失突變體抱子形態發生明顯改變；
[0021] 圖6:野生型抱子一般具有1到2個橫隔，而缺失突變體抱子橫隔數明顯增多；
[0022] 圖7:絲狀真菌產抱模式多達20余中，野生型稻攝病菌W合軸式（sympodial)產生 分生抱子，而基因缺失突變體不僅產抱量大幅下降，其產抱模式也發生根本性改變，突變體 W向頂式(acropetal)產抱；
[0023] 圖8:野生型、基因缺失突變體及互補突變體中產抱關鍵基因的表達情況。稻攝病 菌中，只有兩個轉錄因子(acrl和ccal)被報道參與產抱模式的調控。而Moarrdcl的缺失導 致其中ccal轉錄因子的大幅下調，標尺=20皿；
[0024] 圖9: AMoarrdcl突變體宿主植物接種實驗。AMoarrdcl突變體水稻葉片噴霧接種 致病結果代表性圖片，表明A Moarrdcl突變體對水稻的致病力大幅下降；
[00巧]圖10: AMoarrdcl突變體宿主植物接種實驗。AMoarrdcl突變體水稻葉片噴霧接 種致病統計結果，結果表明A Moarrdcl突變體對水稻的致病力大幅下降；
[0026] 圖11:分生抱子被稀釋成5 X 104個/ml,接種于完整（intact)或擦傷(wounded)大 麥葉片的表面，30小時后用甲醇脫色觀察試驗菌株的致病結果代表性圖片，結果表明A Moarrdcl突變體的侵染釘和侵染菌絲形成過程嚴重受阻；
[0027] 圖12:分生抱子被稀釋成5 X 104個/ml，接種于完整（intact)或擦傷(wounded)大 麥葉片的表面，30小時后用甲醇脫色觀察試驗菌株的致病統計結果，結果表明AMoarrdcl 突變體的侵染釘和侵染菌絲形成過程嚴重受阻，標尺= 20wii;
[0028] 圖13:MoARRDCl的亞細胞轉運。在休眠的分生抱子，EGFP-ARRDC1分散于微弱但明 顯可見的點狀結構。抱子萌發后，綠色巧光信號明顯增強，點狀星號增多。增加培養時間發 現綠色點狀信號變得異常巨大，并且常常可見小點匯聚到大點周圍，標尺= l〇wii;
[0029] 圖14:MoAR畑Cl蛋白與自隧泡標志性蛋白Atg8共定位于抱子及菌絲中。圖13和圖 14結果表明MoARRDCl蛋白在抱子萌發過程中從細胞溶質漸漸轉移至自隧泡，MoARRDCl蛋白 的轉運與自隧過程相關，標尺=10皿。
【具體實施方式】
[0030] 下面結合附圖對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0031] 實施例l:Moarrdcl基因的分離和克隆
[00創使用來源于N C B I網站的C D D蛋白結構域數據庫鏈接h t t P : / / WWW .ncbi.nlm.nih. gov/cdd/獲得序列信息arrest inN(pfam00339)和arrest inC (pfam02752)，在稻攝病菌數據庫ht1:p: //www. broadinstitute. org/anno1:ation/genome/ magnapo;rthe_g;risea/Mul tiHome . html通過blastP進行同源序列捜索，獲得 了屯個 arrest in家族蛋白，并命名為Moarrdcl-6 W及Mo化IF為了研究Moarrdcl基因的功能，從稻 攝病菌野生型菌株KJ201的基因組中，利用引物arrdcl-xbal和arrdcl-xba2克隆了 Moarrdcl基因全序列，并且連接到pkdSGFP載體上，進行了測序；同時，在野生型菌株KJ201 的cDNA中克隆了該基因的編碼序列并且連接到pkdSGFP載體上，進行了測序分析。DNA序列 見沈Q ID NO: l，cDNA序列見沈Q ID NO:2。氨基酸序列見沈Q ID NO:3。
[0033] 實施例2:Moarrdcl基因缺失突變體和互補突變體的獲得
[0034] 2.1 Moarrdcl基因敲除載體的構建
[00巧]WKJ201的基因組為模板，用引物3241-U1/2和3241-dl/2分別擴增上、下游片段。 引物3241-U1/2和3241-dl/2的序列見表1。
[0036] 表1引物序列
[00；3 引
[0039] 擴增體系為：
[0040]
[0041] 擴增程序為：
[0042] PCR反應條件：
[0043] 1.95°C 預變性 2min
[0044] 2.98°C10s
[0045] 3.58°C15s
[0046] 4.72 °C 30s
[0047] 2-4.35 個循環
[0048] 5.72°C5min
[0049] 6.4°C 保溫。
[0050] 用Hph-ml/巧I物，W質粒PCB1003為模版，擴增1.4化潮霉素的片段。Hph-ml/巧I物 的序列(見表1)
[0化1 ]
[0052]擴增程序為：
[0化3] PCR反應條件：
[0054] 1.94°C 預變性 2min
[0055] 2.98°C 10s
[0056] 3.58°C 15s
[0057] 4.72°C 30s
[0化引 2-4.35個循環
[0059] 5.72°C 5min
[0060] 6.4°C 保溫
[0061] 上述S個片段利用融合PCR的方法連接到一起，融合產物作為模版，用3241-nl/2 引物進行巢式PCR(引物的序列見表1)，擴增的片段引入EcoRI/BamhI位點（設計的引物上面 含有EcoRI/BamhI位點），連接到PCAMBIA1300相應位置，載體構建成功。所得的載體為包含 Moarrdcl基因上游序列-潮霉素抗性基因-下游片段的pl300-Moarrdcl載體。具體如下：
[0062] 融合PCR擴增體系為：
[0070] 備注說明：
[0063]
[0064]
[00 化]
[0066]
[0067]
[006引
[0069]
[0071] 上文中上游片段具體如SEQ ID N0:4所示；
[0072] 上文中下游片段具體如SEQ ID N0:5所示；
[0073] 上文中潮霉素的片段具體如SEQ ID N0:6所示；
[0074] 上文中S片段融合后的巢式PCR產物片段具體如SEQ ID N0:7所示。
[00巧]2.2 AMoarrdcl突變體的獲得
[0076] 包含Moarrdcl基因上游序列-潮霉素抗性基因-下游片段的pl300-Moarrdcl載體 轉化到農桿菌中后，通過農桿菌介導方法轉化稻攝病菌野生型菌株KJ201。在基因置換過程 中，大部分外源DNA插入到稻攝病菌的基因組中，由于兩端同源序列的存在，部分會發生同 源置換，同源置換的過程見圖1。試驗中總挑取得到12個轉化子，提取所得轉化子的基因組 DNA，利用3241-ckl/2和Hph-ckl/2引物進行多重PCR(引物的序列見表1)，所有轉化子對應 的PCR產物電泳均具有1.4kb左右的潮霉素條帶，表明PCR體系運作正常并且轉化子均為潮 霉素陽性，其中部分轉化子PCR產物電泳沒有42加 P的目的條帶（3241-ckl/2對應的PCR產 物），初步斷定運些沒有目的條帶的轉化子為基因置換突變體(運部分被潮霉素抗性基因替 換）。選取其中S個突變體arrdc 1-C1/2/3大量提取基因組DNA，進行Southern雜交驗證。用 Seal對arrdcl-cl/2/3的基因組進行酶切，野生型KJ201為對照，引物3241-sbl和3241-sb2 的PCR擴增產物，合成雜交探針。
[0077] 備注說明：突變體arrdcl-cl/2/3的PCR產物電泳中沒有42化P的目的條帶。
[007引轉化子多重PCR反應體系：
[0079]
[0080]
[0081]
[0082]
[0083] 本發明Southern雜交用Roche公司地高辛DNA標記與檢測試劑盒(DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Kit I)進行。雜交探針的合成:反應體系與程序，與上游片 段操作方法相同。獲得的PCR產物，進行探針合成，步驟如下：
[0084] 1)將全部50山體系的PCR產物進行膠回收，回收產物沸水浴中溫育lOmin，使DNA變 性，并迅速在冰水中冷卻。
[0085] 2)混勻DIG-High Prime,加化1 DIG-High Prime到16山變性的模板DNA中，混合并 稍離屯、。在37°C溫箱溫浴2地。
[0086] 雜交結果顯示，野生型KJ201菌株在化b處有雜交信號，而突變體在4kb處有雜交信 號并且是單拷貝，該雜交結果證實了arrdcl-1/2/3為Moarrdcl基因缺失突變體（圖1)。選取 arrdcl-1進行單抱分離并保存，命名為A Moarrdcl進行后續試驗。
[0087] 備注說明：arrdcl-l/2/3S個缺失突變體均表現生長速度緩慢，氣生菌絲疏松;野 生型菌株生長速度真長，氣生菌絲較多。
[0088] 2.3互補載體的構建
[0089] 為了驗證突變體的表型是因為基因 Moarrdcl的缺失引起的，構建了互補載體 pl300G418-Moarrdcl。利用引物1300-g418u/d擴增G418片段，通過無縫克隆（TARAKA clontech公司無縫連接試劑盒）連接到PCAMBIA1300的Hind^I和PstI位點上獲得 P1300G418載體。利用引物3241-C1/2擴增了含有基因 CDS及其上游序列和下游序列的全長 4.5郵片段，無縫克隆到13006418載體趾〇巧郵(3〇1?1的位點上，獲得互補載體913006418- Moarrdcl。將pl300G418-Moarrdcl載體轉化到農桿菌中后，通過ATMT方法利用農桿菌轉化 稻攝病菌突變體A Moarrdcl。
[0090] 由于AMoarrdcl缺失突變體和野生型的差異非常大，互補后，缺失突變體的表型 得到恢復，表型與野生型KJ201相同。AMoarrdc 1表型的變化是由Moarrdc 1基因的缺失引起 的。選取互補菌株arrdc-c進行后續試驗(備注說明：C表示補充、恢復的意思）。
[0091] 備注說明：互補后，突變體A Moarrdcl的缺失表型得到恢復，互補菌株arrdc-c (arrdc-c是由A Moarrdcl缺失突變體互補后而得)生長速度變快，氣生菌絲濃密，與野生型 KJ201的表型相同。
[0092] 實施例3:突變體關鍵性表型分析
[0093] 3.1突變體菌落生長速度
[0094] 在CM培養基上，野生型KJ201和互補型arrdc-c的氣生菌絲濃密，而AMoarrdcl菌 落的氣生菌絲稀疏，生長緩慢，約為野生型的70% (圖4AKMoarrdcl基因的缺失影響了稻攝 病菌的菌落形態和生長速度。
[00巧]3.2突變體A Moarrdcl產抱量下降
[0096] 將菌株接種在CM培養基上，16/8小時光照/黑暗，28°C生長10天后，現慢菌落直徑， 計算菌落面積，然后使用無菌水洗脫氣生菌絲，=層擦鏡紙過濾，定容到5毫升，顯微鏡下統 計。野生型KJ201的抱子產量為20.45 ± 5.14 X 103個/cm2，互補型菌株arrdc-c抱子產量為 22.90 ± 2.52 X 1〇3個/cm2，而基因缺失突變體A Moarrdcl的產抱量為0.90±0.13 X 1〇3個/ cm2(圖4B)。因此，A Moarrdc 1的缺失降低了稻攝病菌在CM平板上的單位面積產抱量。
[0097] 3.3突變體A Moarrdcl分生抱子形態發生顯著變化
[0098] 對菌株分生抱子的進一步觀察發現，野生型和互補型菌株在水里的化萌發率分別 為97.50± 1.04%和96.80± 1.54%，而缺失突變體的萌發率降低為73.50± 3.45% (圖4C)。 并且突變體分生抱子形態發生嚴重改變，主要表現在橫隔數量。野生型分生抱子中，約90% 的抱子由兩個橫隔將其劃分為=個相鄰細胞，剩余10%的抱子擁有一個橫隔或無橫隔了。 互補型菌株橫隔情況與野生型類似。而突變體中只有約36%的抱子擁有兩個橫隔，約43% 的抱子擁有一個橫隔或者沒有橫隔，多達21 %的抱子擁有大于等于兩個橫隔，因而抱子形 態發生嚴重改變，形態圖和統計數據見圖5和圖6。
[0099] 3.4突變體A Moarrdcl分生抱子產抱模式發生根本性改變
[0100] 對產抱過程的進一步觀察發現，野生型和互補型菌株分生抱子梗濃密，并且均W 合軸方式(sympodial)產生分生抱子。而缺失突變體分生抱子梗稀疏，并且分生抱子梗W向 頂式(acropetal)產生分生抱子（圖7)。定量PCR實驗亦表明，缺失突變體與野生型相比，在 產抱階段，控制分生抱子梗的關鍵性基因 C0S1和控制分生抱子梗產抱模式的關鍵性基因 CCA1，其表達量均有明顯下調（圖8)。
[0101]實施例4:Moarrdcl是稻攝病菌致病力所必需的
[0102] 在實驗室條件下，菌株在CM平板上生長10天后，水洗收集分生抱子，將其配置為5 X 104個/ml的0.02 % Tween 20懸浮液。對感病型水稻品種進行葉片噴霧接種實驗，未接菌 的葉片作對照。結果表明突變體AMoarrdcl分生抱子懸浮液只能水稻葉片上產生極少量無 法擴展的病斑（圖9和圖10)。同時，我們還分析了 A Moarrdc 1突變體的植物組織致病性。A Moarrdcl突變體無論在完整或擦傷的大麥葉片上均只能導致少量病斑，結果表明突變體雖 能成功侵入植物組織，但其后的次生侵染菌絲生長受阻。統計結果發現，在30h完整葉片侵 染試驗中，野生型和互補型菌株侵染菌絲形成率分別為89.47 ± 2.01 %和91.47 ± 1.76%， 而突變體A Moarrdcl侵染菌絲形成率為14.60 ± 3.61 % ;在30h擦傷葉片侵染試驗中，結果 類似，野生型和互補型菌株侵染菌絲形成率分別為88.83±2.89%和89.13± 1.67%，而突 變體A Moarrdcl侵染菌絲形成率為21.60±8.07% (圖11和圖12)。
[0103] 實施例5:Moarrdcl與自隧泡共定位
[0104] 5.1 EGFP-AR 畑 C1 載體構建
[0105] 為了研究Moarrdcl在稻攝病菌中的空間表達模式，Wp邸5GFP載體為骨架構建了 pEGFP-ARRDC 1載體，由于Moarrdc 1基因自身啟動子作用下的基因融合載體，其轉化稻攝病 菌菌株后獲得的巧光非常微弱。我們使用了PKD5GFP載體自身帶有的H3強啟動子，使用 arrdcl-xbal和arrdcl-xba2引物從稻攝病菌cDNA文庫中擴增基因 CDS片段，然后使用融合 PCR方法將CDS引入載體的Xbal位點，獲得了祀GFP-ARRDC1載體。載體利用ATMT方法轉化野 生型和缺失突變體菌株獲得了基因融合巧光蛋白的突變體菌株。
[0106] 5.2 EGFP-ARRDC1融合蛋白的胞內轉運觀察
[0107] 在休眠的分生抱子，EGFP-MoARRDCl分散于微弱但明顯可見的點狀結構。抱子萌發 后，巧光信號明顯增強，點狀信號增多。增加培養時間發現綠色點狀信號變得異常巨大，并 且常常可見小點匯聚到大點周圍（圖13)。進一步研究發現EGFP-ARRDC1與細胞自隧泡標志 性蛋白Atg8共定位(圖14)。圖13和圖14結果表明MoARRDCl蛋白在抱子萌發過程中從細胞溶 質漸漸轉移至自隧泡，MoARRDCl蛋白的轉運與自隧過程相關。
[010引 CM培養基（Ta化ot et al. ,1993)
[0109
[0111] 若配固體培養基，每1L培養基中加 15g瓊脂粉;12 rc濕熱滅菌20min。[0112] *20X化trate salts(lOOOml):
[011C
[0116] lOOOXTrace elements(lOOml)
[0113]
[0114]
[0115]
[0117
[0118」 W上二種巧刑均巧繼隊菌，4-U黑暗儲存。
[0119] 實施例6:利用Moarrdcl基因的表達情況作為祀標，篩選抗真菌藥物。
[0120] 把稻攝病菌在液體完全培養基中大量培養，收集菌絲后分成若干小份，每一份加 入待篩選的化合物或候選藥物繼續在液體完全培養基培養數小時，提起菌絲RNA，采用QPCR 的方法檢測Moarrdcl基因的表達情況。如果Moarrdcl的表達被候選藥物抑制，則菌絲細胞 內沒有Moarrdcl的表達或者Moarrdcl的表達減少。獲得的化合物再利用實施例4的方法，在 接種的抱子液中加入候選藥物，測定野生型稻攝病菌在運種化合物存在的條件下對水稻致 病性有沒有減弱，進一步確定該化合物的抗真菌效果。當測定結果為菌株對水稻致病性減 弱時，說明候選藥物具有明顯抗菌效果，可W作為抗菌藥物的來源；當測定結果為菌株對水 稻致病性沒有明顯變化時，說明候選藥物不具有明顯抗菌效果，不可作為抗菌藥物的來源。
[0121] 實施例7:利用Moarrdcl蛋白的表達或修飾作為祀標，篩選抗真菌藥物。
[0122] 把受Moarrdcl基因調控的下游基因啟動子與GFP巧光蛋白構建融合載體，將載體 轉入稻攝病菌中，然后把巧光轉化子在液體完全培養基中大量培養，收集菌絲后分成若干 小份，每一份加入待篩選的化合物或候選藥物繼續在液體完全培養基培養數小時，取菌絲 在巧光顯微鏡下觀察菌絲GFP巧光的情況。如果Moarrdcl的表達被候選藥物抑制，則其失去 對下游基因的調控作用，GFP不表達從而菌絲失去綠色巧光。獲得的化合物再利用實施例4 的方法，在接種的抱子液中加入候選藥物，測定野生型稻攝病菌在運種化合物存在的條件 下對水稻致病性有沒有減弱，進一步確定該化合物的抗真菌效果。當測定結果為菌株對水 稻致病性減弱時，說明候選藥物具有明顯抗菌效果，可W作為抗菌藥物的來源；當測定結果 為菌株對水稻致病性沒有明顯變化時，說明候選藥物不具有明顯抗菌效果，不可作為抗菌 藥物的來源。
[0123] 最后，還需要注意的是，W上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發 明不限于W上實施例，還可W有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容 直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
【主權項】
1. 源于稻瘟病菌的真菌致病性基因 Moarrdcl，其特征是：所述的真菌致病性基因 Moarrdcl的核苷酸序列或其互補鏈的核苷酸序列為SEQ ID N0:1。2. 如權利要求1所述的源于稻瘟病菌的真菌致病性基因 Moarrdcl，其特征是:所述真菌 致病性基因 Moarrdcl編碼的cDNA序列具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。3. 如權利要求1所述的源于稻瘟病菌的真菌致病性基因 Moarrdcl，其特征是:所述真菌 致病性基因 Moarrdcl編碼的蛋白質具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。4. 如權利要求1所述的源于稻瘟病菌的真菌致病性基因 Moarrdcl的用途，其特征是:所 述的基因。5. 如權利要求1所述的源于稻瘟病菌的真菌致病性基因 Moarrdcl的用途，其特征是:基 因 Moarrdc 1的表達作為用于設計和篩選抗真菌藥物的祀標。6. 如權利要求3所述的源于稻瘟病菌的真菌致病性基因 Moarrdcl的用途，其特征是:所 述基因 Moarrdc 1編碼的蛋白質的表達和修飾作為設計和篩選抗真菌藥物的革巴標。
【文檔編號】G01N33/68GK106047901SQ201610403138
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月8日
【發明人】董波, 徐小金, 張丹丹, 唐明智
【申請人】浙江省農業科學院