抑制血液腫瘤細胞增殖的PVT1 siRNA?1055及其應用
【專利摘要】本發明公開一種抑制血液腫瘤細胞增殖的PVT1 siRNA?1055及其應用，涉及siRNA及其應用領域。本發明所述的抑制血液腫瘤細胞增殖的PVT1 siRNA?1055能高效抑制PVT1表達，有效抑制血液腫瘤細胞的增殖。對于開發新的抗血液腫瘤基因藥物和提高血液腫瘤的治療效果有重要意義。人類生存環境日益惡化，血液腫瘤(包括白血病和淋巴瘤)發病率和死亡率越來越高，已經成為影響人們健康和壽命的主要腫瘤性疾病之一。絕大多數的血液腫瘤均有PVT1表達增加，而PVT1具有癌基因的功能，因此靶向PVT1的治療將具有比較普遍的意義，適用于絕大多數血液腫瘤，將具有巨大的市場潛力。
【專利說明】
抑制血液腫瘤細胞増殖的PVT1 s i RNA-10巧及其應用
技術領域
[0001 ]本發明設及siRNA及其應用領域，具體設及一種抑制血液腫瘤細胞增殖的PVT1 siRNA-1055及其在制備治療和/或預防血液腫瘤藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] RNAi技術是一種高效的高特異性抑制基因表達的新途徑。體內外的研究已顯示了 RNAi技術在癌癥基因治療方面比反義核酸具有更好的應用前景。大量的研究表明，體外通 過RNAi抑制腫瘤相關基因的表達可抑制腫瘤細胞的增殖、生長，誘導細胞調亡，增加腫瘤細 胞對藥物的敏感性。
[0003] 長鏈非編碼RNA(lncRNA)是長度超過200個核巧酸的不具有編碼蛋白質功能的 RNA，在調控細胞增殖和分化中發揮重要作用。許多IncRNA在器官發育和腫瘤發生中起轉錄 調控或轉錄后調控作用，并在其中具有重要作用。LncRNA PVTl(plasmac}ftoma variant translocation 1)基因定位于染色體8q24[G;r址am M,Adams JM.Qiromosome Sbreakpoint far 3'of the c_myc oncogene in 曰 Burkitt's lymphoma 2;8v曰ri曰nt translocation is equivalent to the murine pvt-llocus.EMBO J.1986Nov;5(ll):2845-51.]，PVT1在 腫瘤發生發展中占有重要作用，具有癌基因的功能，在多種腫瘤(包括血液腫瘤）顯著高表 達[Wang F,化an JH'Wang SB'Yang F'Yuan SX,化 C'Yang N'Zhou WP，Li WL，Li W，Sun SH.Oncofetal long noncoding RNA PVTl promotes proliferation and stem cell? like property of hepatocellular carcinoma cells by stabilizing N0P2.Hepatology.20140ct；60(4):1278-90；Colombo T,Farina L,Macino G,Paci P.PVTl:a rising star among oncogenic long noncoding RNAs.Biomed Res Int.2015； 2015:304208.]，并與c-Myc表達呈顯著相關。進一步研究表明，PVTl通過調控c-Myc蛋白的 穩定性而控制c-Myc蛋白水平，并與c-Myc協同作用促進癌細胞的增殖[Tseng YY, Moriarity BS,Gong W,Akiyama R,Tiwari A,Kawakami H,Ronning P,Reuland B, Guenther K,Beadnell TC,Essig J, Otto GM,0'Sullivan MG ,Largaespada DA, Schwertfeger KL,Marahrens Y,Kawakami Y,Bagchi A.PVTl dependence in cancer with MYC copy-number increase.Na1:ure.20l4Aug 7;512(7512):82-6.]。
[0004] 現有的研究表明PVTl與血液腫瘤的發生相關，但目前還沒有PVTl SiRNA可用于腫 瘤，尤其是血液腫瘤治療和/或預防的證據。
【發明內容】
[0005] 為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的目的在于提供一種抑制血液腫瘤細胞 增殖的PVT1 siRNA-1055。該PVT1 siRNA-1055可抑制PVT1表達和血液腫瘤細胞增殖。
[0006] 本發明的另一目的在于提供所述的抑制血液腫瘤細胞增殖的PVT1 SiRNA-1055的 應用。
[0007] 本發明的目的通過下述技術方案實現：
[000引一種抑制血液腫瘤細胞增殖的PVTl siRNA-1055,序列如下所示：
[0009] 正義鏈的序列為：5' -GCUUCUCCUGUUGCUGCUATT-3';
[0010] 反義鏈的序列為:5^UAGCAGCAACAGGAGAAGCTT-3\
[0011] 所述的抑制血液腫瘤細胞增殖的PVT1 siRNA-1055在制備治療和/或預防血液腫 瘤藥物中的應用。
[0012] 所述的血液腫瘤包括白血病和淋己瘤。
[0013] 本發明相對于現有技術，具有如下的優點及效果：
[0014] (1)本發明所述的抑制血液腫瘤細胞增殖的PVT1 SiRNA-1055能高效抑制PVT1表 達。
[001引（2)本發明所述的抑制血液腫瘤細胞增殖的PVT1 SiRNA-1055能有效抑制血液腫 瘤細胞的增殖。
[0016] (3)本發明所述的抑制血液腫瘤細胞增殖的PVT1 SiRNA-1055對于開發新的抗血 液腫瘤基因藥物和提高血液腫瘤的治療效果有重要意義。人類生存環境日益惡化，血液腫 瘤(包括白血病和淋己瘤)發病率和死亡率越來越高，已經成為影響人們健康和壽命的主要 腫瘤性疾病之一。絕大多數的血液腫瘤均有PVT1表達增加，而PVT1具有癌基因的功能，因此 祀向PVT1的治療將具有比較普遍的意義，適用于絕大多數血液腫瘤，將具有巨大的市場潛 力。
【附圖說明】
[0017] 圖1是轉染PVT1 siRNA-1055后K562細胞中的PVT1 RNA表達量圖。
[0018] 圖2是轉染PVT1 siRNA-1055后Raji細胞中的PVT1 RNA表達量圖。
[0019] 圖3是轉染PVT1 siRNA-1055后K562細胞增殖抑制率。
[0020] 圖4是轉染PVT1 SiRNA-1055后Raji細胞增殖抑制率。
[0021] 圖5是流式細胞儀檢測轉染PVT1 SiRNA-1055后K562細胞周期圖。
[0022] 圖6是流式細胞儀檢測轉染PVT1 SiRNA-1055后Raji細胞周期圖。
【具體實施方式】
[0023] 下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限 于此。
[0024] 實施例1
[0025] 一、實驗材料和方法
[0026] (l)PVTl siRNA的設計和合成
[0027] 依據Amb ion公司在網上提供的設計工具軟件（參見WW. amb ion. com/tech lib/ 11113。/311?麻^11(16'.11加1)針對？￥1'11?麻設計4條311?歴序列，分別命名為？￥1'1811?麻- 1055、PVT1 siRNA-845、PVTl siRNA-176和PVTl siRNA-54,同時設計無關的陰性對照序列 (negative control，NC)siRNA作為對照，由上海吉瑪基因化學技術有限公司合成。
[0028] PVT1 siRNA-1055 的序列如下：
[00巧]正義鏈：5' -GCUUCUCCUGUUGCUGCUATT-3';
[0030]反義鏈：5' -UAGCAGCAACAGGAGAAGCTT-3';
[0031] PVTl siRNA-845的序列如下：
[0032] 正義鏈：5' -CCUGUUACACCUGGGAUUUTT-3';
[0033] 反義鏈：5' -AAAUCCCAGGUGUAACAGGTT-3';
[0034] PVTl siRNA-176的序列如下：
[003引 正義鏈：5' -GCUGAAUGCCUCAUGGAUUTT-3';
[0036] 反義鏈：5' -AAUCCAUGAGGCAUUCAGCTT-3';
[0037] PVT1 siRNA-54 的序列如下：
[0038] 正義鏈：5' -CCUGAUGGAUUUACAGUGATT-3';
[0039] 反義鏈：5' -UCACUGUAAAUCCAUCAGGTT-3';
[0040] 陰性對照-siRNA的序列如下：
[0041 ]正義鏈：5' -GCUACGAUCUGCCUAAGAUdTdT-3';
[0042] 反義鏈：5' -AUCUUAGGCAGAUCGUCGCdTdT-3'。
[0043] (2)細胞培養
[0044] 將K562細胞(美國ATCC細胞庫）和淋己瘤細胞系Raji(美國ATCC細胞庫）分別接種 于含體積分數10%新生牛血清、lOOU/mL青霉素和lOOU/mL鏈霉素的RPMI1640培養基中，在 含體積分數5 % C〇2的培養箱37 °C連續培養。
[0045] (3)細胞轉染
[0046] ①轉染前一天，將細胞密度調至2X105/mL，然后重懸在24孔板中，每孔加入0.5mL 的細胞懸液，37°C、5 % C〇2培養箱中培養。
[0047] ②轉染當天，將24孔板中每孔的細胞重懸在10化L含有體積分數10%新生牛血清 的RPMI1640培養基中。
[004引③用10化L不含血清的RPMI1640培養基稀釋siRNA，siRNA的終濃度為10化M。再加 入化L Hiperfect轉染試劑，混勻。室溫解育混合液5~10分鐘。
[0049]④將W上準備好的混合液分別加入到細胞懸液中，搖動培養板，輕混勻。37°C、5% C〇2培養箱中培養。
[(K)加]⑤化后，每孔加入40化L含有體積分數10 %新生牛血清的RPMI1640培養基，37r、 5 % CO播養箱中培養。
[0051 ] (4)巧光定量RT-PCR檢測轉染細胞PVT1 RNA表達水平
[0化2 ] 將單純細胞組即空白組、單純轉染試劑組即空轉組、NC- S i RNA組、P VT1 S i RNA- 1055組、PVTl siRNA-845組、PVTl siRNA-176組和PVTl siRNA-54組細胞W(4~8)Xl〇5/mL 起始濃度接種于24孔板，每孔接種ImL，按化化rfect轉染試劑盒說明進行轉染后繼續培養 4她，離屯、收集細胞。RNA提取應用RNAzol試劑盒(G化co，B化)并應用隨機引物和反轉錄酶試 劑盒（Supersetipt II Kit，Invitrogen，USA)反轉錄合成cDNA第一鏈。并經GAPDH基因的 RT-PC閒角定所合成cDNA的質量。均按常規方法進行，具體抽提過程如下所述。
[0053] 1)細胞總RNA的提取和純化
[0054] ①收集離屯、細胞，去其上清，用PBS(0.01M:化C1 8g、KCl 0.2g、化2冊〇4 1.44邑、 K此P〇4 0.24g，pH7.4)洗兩次后，將細胞轉移入1.5mL離屯、管中，每管加 Trizol試劑山^搖 勻，室溫下靜置15min后，反復吹打裂解細胞；
[0055]②將各管內消化好的細胞裂解液吸到DEPC處理過的1.5mL EP管中，加氯仿0.2mL (Trizol:氯仿約為5:1)，輕搖15s，并在冰上解育15min;
[0化6] ③4°C、12,000rpm離屯、15min。然后取上清無色水相到DEPC處理過的EP管，加0.5mL 異丙醇，室溫下靜置lOmin;
[0化7] ④4^、12,00化9111離屯、1〇111111。觀察總1?酷在管底的白色沉淀，棄去上清；
[0化引⑤加入用DEPC水新配制的經預冷的體積百分比75 %的乙醇溶液1. OmL，輕輕洗涂 沉淀，4°C、12,000巧m離屯、5min;
[0059] ⑥去上清，瞬時離屯、，用小Tip頭吸干液體;使沉淀自然干燥，DEPC處理水20~30化 加入，混勻，55~60 °C水浴1 Omin溶解總RNA;
[0060] ⑦用紫外分光光度儀測總RNA純度和濃度，用瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA是否降解， 鑒定后于-70°C保存備用。
[00W] 2)細胞總RNA的鑒定
[0062] 濃度分析和純度鑒定：從提取的RNA中吸取化L，WDEPC水稀釋至10化L，用紫外分 光光度儀分別測總RNA的濃度，光吸收度A260和A280的比值(A260/A280)。
[0063] 3)逆轉錄反應
[0064] 取上述RNA樣品，將其稀釋成化g/化，在PCR管中加入下列試劑的混合物： 「00 化 1
[0066] 在 PCR 儀上按照下列條件反應:30°(：1〇111111，421：2〇111111，991：5111111，41：5111111，瞬時離 屯、，-20°C保存備用。
[0067] 4)PCR 擴增
[006引實時定量PCR試劑盒購于北京天根生物公司。實時定量PCR反應管和反應儀器為美 國BI0-RAD公司產品。PVT1 上游引物5' -GTCTTGGTGCTCTGTGTTC-3'，下游引物5'- CCCGTTATTCTGTCCTTCT-3'。WGAPDH為內參照，GAPDH上游引物5' -CGCTGAGTACGTCGTGGAGTC- 3'，下游引物5'-6口'641641'(：176466口'61761'(：-3'。
[0069] 利用SYBR GreenI染料法檢測細胞PVT1表達情況，并將GAPDH作為內參照。總反應 體積為20化。反應條件:95 °C lOmin變性后，共進行40個循環擴增，每一循環包括95 °C 15s，60 °C30s和80°C5s，并在80°C讀板1次。隨后，W〇.17°C/s變化速度從65°C到95°C，每隔2s記錄 1次巧光值，獲得烙解曲線。將所擴增的PCR產物烙解曲線分析，同時隨機進行質量體積比 2%瓊脂糖凝膠電泳，W確定產物是否為所擴增的目的片段。采用相對定量公式 100%，Act = Ct(PVT1)-Ct(GAPDH)，計算細胞PVT1 的相對量。
[0070] 5)CCK騎去測細胞生長抑制率
[0071] 將對數生長期的K562細胞和Raji細胞分別接種于96孔培養板中，按照上述步驟 (步驟(3))進行轉染，置于37°C、飽和濕度、5%C02條件下常規培養24、48和7化后，向每孔內 加入30化CCK8,再置于37°C解育4h。然后直接在酶聯檢測儀上450nm波長處測A450值，W A450間接反映細胞存活數量。結果按照W下公式計算:細胞增殖抑制率（％ )=(對照組A450 值-實驗組A45Q值)八對照組A45Q值-空白組A45Q值）X 100%。實驗重復3次，據此可推算PVT1 S iRNA轉染后各時間點對細胞的抑制率。
[0072] 6)流式細胞儀檢測細胞周期
[0073] 按照^上轉染方法將各組313魁序列轉到1(562細胞和1?3^'1細胞，轉染48、7化后收 集細胞，用70%乙醇4°C固定過夜，次日按照艦化丙錠(PI)染液說明書進行染色，過濾后用 流式細胞儀檢測細胞周期。
[0074] 9)統計學處理
[0075] 采用SPSS13.0軟件進行數據的統計學分析。實驗數據W均值±標準差表示，多組 間數據比較采用完全隨即區組設計的單因素方差分析，組間的比較選用可進行多個樣本均 數間兩兩均數比較的S-N-K檢驗。
[0076] 二、實驗結果
[0077] 1.巧光定量RT-PCR檢測細胞PVT1 RNA表達水平
[007引提取的總RNA經紫外分光光度計檢測其吸光度A260/A280的比值，都在1.8~2.0， 說明提取的RNA純度較高。
[0079] 首先，在4條PVT1 siRNA中siRNA-1055轉染K562細胞24、4化下調PVT1 RNA的表達， 其值顯著低于空白組（即指未經任何處理的細胞組）、空轉組（即指單純轉染試劑處理組)和 NC-siRNA組（P<0.05)，而其它的3條siRNA(PVTl siRNA-845、PVTl siRNA-176和PVT1 siRNA-54)、空轉組及NC-siRNA組分別與空白組細胞的PVTl RNA表達量間無顯著差異(P〉 0.05)。同樣，siRNA-1055轉染Raji細胞24、4化顯著下調PVT1 RNA的表達(P<0.05)，可見， PVT1 siRNA-1055可特異性抑制K562細胞和Raji細胞中PVT1的表達(結果如圖1和2所示）。
[0080] 2.PVT1 siRNA-1055對 K562 和 Raji 細胞生長的影響
[0081 ]根據CCK8結果得出:PVT1 SiRNA-1055轉染組細胞的增殖活性較低，其細胞增殖抑 制率顯著高于其它對照組（即空轉組、NC-siRNA組與空白組(0% )) (P<0.05)，而空轉組及 NC-siRNA組分別與空白組細胞的增殖能力間差異無顯著性(P〉0.05)(見圖3和4)。可見PVT1 siRNA-1055可抑制K562和Raji細胞的生長。
[0082] 3.流式細胞儀檢測細胞周期
[0083] PVTl-siRNA-1055和NC-siRNA序列轉染K562和Raji細胞48、7化后細胞周期結果見 圖5和6DsiRNA-1055組轉染K562和Raji細胞48、7化后細胞周期G1期細胞比例均增多，分別 與NC-siRNA組、空轉組和細胞組相比有統計學差異(P<0.05)，并且W4她的G1期阻滯更明 顯。轉染K562和Raji細胞4她后G2、S期細胞比例均減少，與NC-siRNA組、空轉組和細胞組相 比有統計學差異(P<〇. 05)。而轉染7化后G2期變化不明顯，與NC-siRNA組和細胞組相比差異 無統計學意義。S期細胞比例明顯減少，與NC-siRNA組、空轉組和細胞組相比有統計學差異 (P<0.05)。可見PVT1 SiRNA-1055可通過阻滯K562和Raji細胞周期的進展而抑制細胞的增 殖。
[0084] 上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種抑制血液腫瘤細胞增殖的PVTlsiRNA-1055,其特征在于：所述的PVTlsiRNA-1055的序列如下所示： 正義鏈的序列為:5' -GCUUCUCCUGUUGCUGCUATT-3'; 反義鏈的序列為:5' -UAGCAGCAACAGGAGAAGCTT-3'。2. 權利要求1所述的抑制血液腫瘤細胞增殖的PVTlsiRNA-1055在制備治療和/或預防 血液腫瘤藥物中的應用。3. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于:所述的血液腫瘤包括白血病和淋巴瘤。
【文檔編號】A61P35/02GK106047880SQ201610688470
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月18日
【發明人】何冬梅, 鄭嬋麗, 陳盛亭, 李揚秋
【申請人】暨南大學