一種口腔咽拭子細菌宏基因組dna提取方法
【專利摘要】本發明提供一種口腔咽拭子細菌宏基因組DNA提取方法，包括口腔咽拭子的前處理、細菌裂解、DNA的分離和雜蛋白的去除，硅膠膜純化柱吸附DNA以及雜質的去除，DNA洗脫這五個步驟提取口腔咽拭子細菌基因組DNA。本發明特殊的樣本處理方式，可以大大提高得率。同時，使用超聲波破碎裂解結合酶裂解，利用恰當的破壁時間和溫和的條件，使革蘭氏陰性菌和陽性菌及其他細菌適當破壁，又能使基因組DNA不受過強的物理因素導致斷裂。本發明僅用1.5 h就可以提取口腔咽拭子細菌宏基因組DNA，且細菌宏基因組得率更高。
【專利說明】
-種口腔咽拭子細菌宏基因組DNA提取方法
技術領域
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體設及一種口腔咽拭子細菌宏基因組DNA提取方法。
【背景技術】
[0002] 宏基因組是指生境中全部微生物基因的總和，它包含了可培養的和未培養的微生 物的基因總和。人類生活在一個微生物的世界，作為一個完整的人體，真核細胞僅占細胞總 數的10 %，而90 %是原核細胞，因此諾貝爾獎獲得者Lederberg提出人體是由真核細胞與 體內共生的原核細胞共同組成的"超級生物體(Super organism)"。
[0003] 人體口腔咽部為細菌提供了良好的棲息環境，菌群一旦失衡，會影響全身健康。學 者們提出，一些慢性疾病的病因可能是細菌群落。細菌宏基因組研究的對象是特定環境中 的總DNA，所W，DNA的提取是細菌宏基因組研究成功關鍵步驟。口腔咽拭子細菌宏基因組 DNA的提取，不僅要盡可能地提取所有細菌的基因組，還要保持片段的純度和完整度。
[0004] 目前所開發的口腔咽拭子提取方法，往往只能針對革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性 細菌的一類，缺乏通用性，因此提取出來的宏基因組DNA豐度不好。另外，有些方法雖然能夠 更好地提取口腔咽拭子細菌的基因組DNA，但卻存在成本高、得率低、操作繁瑣的弊端。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種口腔咽拭子細菌宏基因組DNA的提取方法，本發明提 供的方法能夠提高豐度、片段完整性、得率和純度，且操作簡單，成本較低。
[0006] 為實現上述目的，本發明采用如下技術方案： 本發明所采用的操作步驟為： (1)用超聲波細胞破碎儀對口腔咽拭子及其保存液中的細菌進行初步裂解； (2 )向拭子樣品中加入裂解液和酶液進行裂解； (3)向步驟(2)的樣品中加入酪-氯仿-異戊醇混合液，震蕩離屯、取上清液； (4)將步驟(3)中的上清液中加入等體積的氯仿-異戊醇混合液混勻，離屯、取上清液。
[0007] 巧）向步驟(4)的上清液中加入乙醇； (6) 將步驟巧）的上清液移入硅膠膜純化柱，離屯、棄濾過液； (7) 在步驟(6)的硅膠膜純化柱中加入去蛋白液，離屯、棄濾過液； (8) 在步驟(7)的硅膠膜純化柱中加入漂洗液，離屯、棄濾過液； (9) 用洗脫液將步驟(8)硅膠膜上的DNA洗脫下來。
[0008] 步驟（1)是指口腔咽拭子采集后應立即操作或于-80°C冰箱中冷凍保存后進行提 取。口腔咽拭子充分震蕩，W使口腔咽拭子上的細菌充分脫落到拭子保存液中（IxPBS)。并 且，拭子保存液和口腔咽拭子均進行裂解，W便將口腔咽拭子上余下的細菌裂解，釋放出 DNA，從而提高細菌宏基因組DNA得率。
[0009] 步驟(2)中的裂解液的用量為500 yl，包含濃度為100 ml的化is,濃度為20 mM的 EDTA，質量濃度3%的SDS，pH=8.0;酶液包含50 mg/ml溶菌酶和25 mg/ml蛋白酶K，用量為 5041。
[0010] 步驟(3)中的酪-氯仿-異戊醇混合液的用量為500 yl，其成分酪-氯仿-異戊醇體 積比為25:24:1。
[0011] 步驟(4)中的氯仿-異戊醇混合液的體積比為24:1。
[0012] 步驟巧）中的乙醇質量濃度為82%，用量為步驟(4)中上清液體積的兩倍。
[0013] 步驟(6)的硅膠膜純化膜購自上海捷瑞生物工程有限公司。
[0014] 步驟(7)的去蛋白液包含濃度9 mM Tris，濃度8 mM鹽酸脈，pH=7.0,使用前需要 加乙醇，使得最終去蛋白液中無水乙醇質量濃度為35%。
[001引步驟（8)的漂洗液包含濃度8 ml lYis，濃度17 mM化C1，抑=8.0,調整抑之后加 入無水乙醇，使漂洗液中乙醇質量濃度為90%。最終去蛋白液用量為500 iil。
[0016] 步驟(9)的洗脫液用量為40-80iil，包含濃度8 mM Tris，濃度2 mM EDTA，pH= 8 ? 0 D
[0017] 本發明的優點在于：本發明采用W上的方法，包括口腔咽拭子的前處理、細菌裂 解、DNA的分離和雜蛋白的去除，硅膠膜純化柱吸附DNAW及雜質的去除，DNA洗脫運五個步 驟提取口腔咽拭子細菌基因組DNA。本發明特殊的樣本處理方式，可W大大提高得率。同時， 使用超聲波破碎裂解結合酶裂解，利用恰當的破壁時間和溫和的條件，使革蘭氏陰性菌和 陽性菌及其他細菌適當破壁，又能使基因組DNA不受過強的物理因素導致斷裂。與傳統的口 腔咽拭子細菌宏基因組DNA提取方法相比，本發明僅用1.5 h就可W提取口腔咽拭子細菌 宏基因組DNA，且細菌宏基因組得率更高。不僅節約了大量的提取時間，同時試劑耗材易獲 得且簡化了步驟，能夠高效、快速、經濟地提取口腔咽拭子細菌宏基因組DNA。
【附圖說明】
[001引圖1本專利方法提取的DNA PCR產物電泳圖。
[0019] 圖2常規方法提取的DNA PCR產物電泳圖。
【具體實施方式】
[0020] 實施例1 一種口腔咽拭子細菌宏基因組DNA提取方法，需用到所述硅膠膜純化柱及W下試劑組 成： 裂解液:濃度為100 ml的Tris，終濃度為20 ml的邸TA，質量濃度3%的SDS，PH=8.0; 酶液:50 mg/ml溶菌酶和25 mg/ml蛋白酶K; 酪-氯仿-異戊醇混合液:酪-氯仿-異戊醇體積比為25:24:1; 氯仿-異戊醇混合液:氯仿-異戊醇體積比為24:1; 乙醇:質量濃度為82%; 硅膠膜純化柱:購自上海捷瑞生物工程有限公司； 去蛋白液:濃度9 mM Tris，8 mM鹽酸脈，pH=7.0,使用前需要加乙醇，使得最終去蛋白 液中乙醇質量濃度為35%; 漂洗液:8 mM Tris，17 mM化Cl，pH=8.0,調整PH之后加入乙醇，使漂洗液中乙醇質量 濃度為90%; 洗脫液：8 ml Tris，2 ml 邸TA，pH=8.0。
[0021 ]所述提取方法，包括W下步驟： 1) 口腔咽拭子的前處理:取新鮮采集的或者儲存于-80°C的口腔咽拭子，溶解后在高頻 率震蕩器上，充分震蕩10 min，使拭子上的細菌脫落到拭子保存液(IxPBS)中。
[0022] 2)細菌細胞的初裂解:取上述口腔咽拭子保存液及口腔咽拭子，置于裝有冰塊的 燒杯中，用清洗過的超聲波細胞破碎儀變幅桿，插入保存液中。在135 W條件下，超聲5 S， 間隔3 S，循環40次。
[0023] 3)細菌細胞的裂解:取上述口腔咽拭子保存液40化1及口腔咽拭子于干凈的2ml離 屯、管中，加入50化1裂解液及50iil酶液，混勻后36°C干浴20 min。之后震蕩10sec，56°C干浴 10 min。
[0024] 4)DNA的分離與雜蛋白的去除：在上述溶液中加入500 yl酪-氯仿-異戊醇混合 液，震蕩器震蕩15 S后，14000 rpm離屯、5 min。將上清液轉移到新的無菌離屯、管中，并加 入等體積的氯仿-異戊醇混合液，震蕩混勻離屯、，取上清液。
[0025] 5)硅膠膜純化柱吸附DNA及雜質的去除:往上述的上清液中，加入2倍體積的82%的 乙醇，震蕩混勻后，加入硅膠膜純化柱的硅膠膜上，14000 rpm離屯、1 min，丟棄濾過液，加 入500 iil去蛋白液，14000巧m離屯、1 min，丟棄濾過液，然后加入500 iil漂洗液，14000 巧m離屯、3 min，丟棄濾過液。將硅膠膜純化柱的蓋子打開，置于干浴器上，56 °C干浴2 min。
[00%] 6)DNA洗脫:往吸附柱加入60iil的洗脫液，14000巧m離屯、1 min。
[0027] 7)聚合酶鏈式反應擴增:PCR擴增細菌16S rDNA V3-V4區，得到的產物用1%的瓊 脂糖凝膠電泳檢測，W此確定細菌總DNA的質量;其中的引物為： 319F:5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3 ' 806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3' 反應條件如下：
結果如表1和圖1，從中可W看出，實例樣得到的濃度較高，且純度也較高。實例樣目的 條帶清晰，提取出的細菌宏基因組DNA的量較多。
[002引 表1
采用常規方法提取口腔咽拭子細菌宏基因組DNA，采用相同方法檢測DM濃度，結果如 下：
W上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所做的均等變化與修 飾，皆應屬本發明的涵蓋范圍。
【主權項】
1. 一種口腔咽拭子細菌宏基因組DNA提取方法，其特征在于:所述方法包括如下： (1)用超聲波細胞破碎儀對口腔咽拭子及其保存液中的細菌進行初步裂解； (2 )向拭子樣品中加入裂解液和酶液進行裂解； (3)向步驟(2)的樣品中加入酚-氯仿-異戊醇混合液，震蕩離心取上清液； (4)將上述步驟(3)中的上清液中加入等體積的氯仿-異戊醇混合液混勻，離心取上清 液； (5 )向步驟(4 )的上清液中加入乙醇； (6)將上述步驟(5)的上清液移入硅膠膜純化柱，離心棄濾過液； (7 )在上述步驟(6 )的硅膠膜純化柱中加入去蛋白液，離心棄濾過液； (8) 在上述步驟(7)的硅膠膜純化柱中加入漂洗液，離心棄濾過液； (9) 用洗脫液將上述步驟(8)硅膠膜上的DNA洗脫下來。2. 根據權利要求所述1所述的一種口腔咽拭子細菌宏基因組DNA提取方法，其特征在 于:步驟（1)中的樣品為400 μL 口腔咽試子保存液及口腔咽拭子;步驟(2)中的裂解液的用 量為500 μL，包含濃度為100 mM的Tris，濃度為20 mM的EDTA，質量濃度3%的SDS，pH=8.0;酶 液包含50 mg/ml溶菌酶和25 mg/ml蛋白酶K，用量50μ1。3. 根據權利要求所述1所述的一種口腔咽拭子細菌宏基因組DNA提取方法，其特征在 于:步驟(3)中的酚-氯仿-異戊醇混合液的用量為500 μL，其成分酚-氯仿-異戊醇體積比為 25：24：1〇4. 根據權利要求所述1所述的一種口腔咽拭子細菌宏基因組DNA提取方法，其特征在 于:步驟(4)中的氯仿-異戊醇混合液的體積比為24:1。5. 根據權利要求所述1所述的一種口腔咽拭子細菌宏基因組DNA提取方法，其特征在 于:步驟(5)中的乙醇質量濃度為82%，用量為步驟(4)中上清液體積的兩倍。6. 根據權利要求所述1所述的一種口腔咽拭子細菌宏基因組DNA提取方法，其特征在 于:步驟(7)的去蛋白液包含濃度9 mM Tris，濃度8 mM、pH=7.0鹽酸胍，使用前需要加乙醇， 使得最終去蛋白液中無水乙醇質量濃度為35%;最終去蛋白液用量為500 μL。7. 根據權利要求所述1所述的一種口腔咽拭子細菌宏基因組DNA提取方法，其特征在 于:步驟(8)的漂洗液包含濃度8 mM Tris，濃度17 mM NaCl，pH=8.0,加入無水乙醇使漂 洗液中乙醇質量濃度為90%;漂洗液用量為500 μL。8. 根據權利要求所述1所述的一種口腔咽拭子細菌宏基因組DNA提取方法，其特征在 于:步驟(9)的洗脫液用量為40-80 μL，包含濃度8 mM Tris，濃度2 mM EDTA，pH=8.0。
【文檔編號】C12N15/10GK106047868SQ201610700904
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月23日
【發明人】王松林, 謝文龍, 劉青青, 李珊, 陳榮山, 肖辛野, 李奇淵, 姚迅
【申請人】廈門基源醫療科技有限公司