切膠純化同位素標記核酸探針的方法
【專利摘要】本發明公開了一種切膠純化同位素標記核酸探針的方法。該方法包括如下步驟：制備與目標同位素標記核酸探針相對應的核酸片段；電泳分離該核酸片段；使用常規染色法定位該核酸片段在電泳膠上的位置；使用相同的條件，電泳分離目標同位素標記核酸探針；切割已預先明確位置上的膠塊；回收所述膠塊中的探針。采用本發明切膠純化同位素標記核酸探針的方法，可以減少操作同位素的步驟，進而縮短操作同位素的時間。
【專利說明】
切膠純化同位素標記核酸探針的方法
技術領域
[0001]本發明屬于生物技術領域，具體地說涉及一種切膠純化同位素標記核酸探針的方法。
【背景技術】
[0002]核酸探針是帶有標記物的已知序列的核酸片段。根據堿基互補配對原則，它可以和與其互補的或同源性很高的核酸序列雜交，形成雙鏈，進而通過探針標記物的特性，反映被檢測樣品中特定序列的存在情況。每一個物種，包括各種病原菌，都具有獨特的核酸序列，所以核酸探針在生物技術、疾病診斷等領域都用廣泛的使用。
[0003]同位素標記核酸探針，因其標記物是同位素，具備靈敏度高、不改變核酸序列化學性質、可以檢測Pg級目的片段的特性，而被廣泛使用。為了提升單一性和純度，在制備同位素標記核酸探針的過程中，有時需要對探針進行切膠純化。
[0004]切膠純化同位素標記核酸探針的一般流程如下:1、電泳分離目標同位素標記核酸探針;2、電泳結束后，用塑料薄膜包裹電泳膠;3、使用X光膠片曝光電泳膠;4、根據曝光的X光膠片結果，定位所述探針在電泳膠上的具體位置;5、切割該位置上的膠塊;6、回收所述膠塊中的同位素標記核酸探針。
[0005]同位素具有強烈的放射性，能誘導細胞癌變及造成人體其他方面的傷害。這種放射性對人體的傷害與操作同位素的時間成正比。與同位素接觸的時間越長，傷害越大。上述切膠純化同位素標記核酸探針一般流程的不足之處在于:與同位素接觸的步驟多，操作同位素的時間長。
【發明內容】
[0006]本發明要解決的技術問題是提供一種與同位素接觸步驟少、操作同位素時間短的切膠純化同位素標記核酸探針的方法。該方法通過預先確定電泳結束后同位素標記核酸探針在電泳膠上的具體位置，從而減少操作同位素所需的步驟。
[0007]為解決上述技術問題，本發明的切膠純化同位素標記核酸探針的方法由以下步驟組成:
步驟一:制備與目標同位素標記核酸探針相對應的核酸片段；
步驟二:電泳分離所述核酸片段；
步驟三:使用常規染色法定位所述核酸片段在電泳膠上的位置；
步驟四:使用另一塊與步驟二相同的電泳膠，采用與步驟二相同的條件，電泳分離目標同位素標記核酸探針；
步驟五:經過與步驟二相同的時長后，停止電泳，切割步驟四所述電泳膠上的由步驟三所確定的位置處的膠塊；
步驟六:回收所述膠塊中的同位素標記核酸探針。
[0008]目標同位素標記核酸探針可以是單鏈DNA、雙鏈DNA、單鏈RNA或雙鏈RNA中的任一種。
[0009]目標同位素標記核酸探針所使用的同位素可以是32P、3H或14C中的任一種。
[00?0] 步驟三所述的常規染色法可以是溴化乙錠染色法、Go IdView染色法、GeneFinder染色法、SYBR Green I染色法、GelRed染色法、GelGreen染色法或銀染法中的任一種。
[0011]本方法電泳采用的介質可以是聚丙烯酰胺凝膠。
[0012]放射性同位素和與其對應的非放射性同位素相比，如32P和31P，具有相同的化學性質、分子量差別小，如32P的分子量是32、31P的分子量是31。所以，同位素標記的核酸探針和與其對應的無標記的核酸片段在同等條件下的電泳過程中，具備相同的迀移率。電泳相同的時長后，同位素標記核酸探針和與其對應的無標記的核酸片段在電泳膠上的迀移距離是相同的。所以，可以根據無標記的核酸片段電泳后在電泳膠上的位置，預先確定同位素標記核酸探針在相同條件、電泳相同時長的情況下，出現在電泳膠上的具體位置，從而減少操作同位素所需的步驟。這是本發明的基本原理。
[0013]本發明步驟一、二、三的作用，是使用無標記的核酸片段預先確定電泳結束后同位素標記核酸探針在電泳膠上的具體位置。步驟四所要求的“相同的電泳膠、相同的條件”和步驟五所要求的“相同的時長”，是確保同位素標記核酸探針和與其對應的無標記的核酸片段具備相同的迀移率和在電泳膠上的迀移距離。
[0014]本發明切膠純化同位素標記核酸探針的方法，使用無標記的核酸片段，在無放射性的環境中，預先確定電泳結束后同位素標記核酸探針在電泳膠上的具體位置，從而省略【背景技術】部分所述切膠純化同位素標記核酸探針一般流程中的步驟2、3、4。達到減少操作同位素步驟和縮短操作時間的有益效果。
【附圖說明】
[0015]下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明作進一步詳細的說明。
[0016]圖1是本發明的切膠純化同位素標記核酸探針方法的流程圖。
【具體實施方式】
[0017]如下的實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗步驟或方法，通常按照常規實驗條件，如Sambrook等編，《分子克隆:實驗室手冊》(New York:Cold Spring Harbor laboratory Press，2002)中所述的實驗條件，或按照制造廠商所建議的實驗條件。
[0018]本發明所指的“同位素”，如無特殊說明，一般是指具有放射性的同位素。
[0019]圖1是本發明的切膠純化同位素標記核酸探針方法的流程圖。作為對比，右側是切膠純化同位素標記核酸探針的一般流程。虛線框表示該部分需要操作放射性同位素。
[0020]本發明的方法共六個步驟，分為兩個階段。第一個階段由前三個步驟組成，目的是確定目標同位素標記核酸探針電泳結束后在電泳膠上的位置。第二個階段由后三個步驟組成，目的是切割電泳結束后目標同位素標記核酸探針所在位置處的膠塊，并進一步回收探針。第一個階段不需要操作同位素;第二個階段需要操作同位素。這兩個階段在不同的電泳膠上完成。
[0021]作為對比，切膠純化同位素標記核酸探針的一般流程也有六個步驟組成，但是這六個步驟都需要操作同位素，且這六個步驟是在同一塊電泳膠上完成的。
[0022]制備目標同位素標記核酸探針。
[0023]本發明的方法適用于有特定序列的同位素標記核酸探針，可以使用各種已知的方法進行制備。這些方法包括:缺口平移法、末端加尾法、末端標記法、逆轉錄摻入法、體外轉錄法、PCR法。上述各種制備同位素標記核酸探針的方法有大量的參考文獻及相應的商業化產品可用，如《分子克隆:實驗室手冊》、Invitrogen公司相關產品、Amb1n公司相關產品等。核酸探針的序列可以是單鏈DNA、雙鏈DNA、單鏈RNA或雙鏈RNA，被標記的放射性同位素可以是 32P、3喊 14C。
[0024]需要說明是，本發明的目的是提供一種切膠純化同位素標記核酸探針的方法，所以制備同位素標記核酸探針只是為本發明提供工作對象，而不是本發明的步驟之一。
[0025]制備與目標同位素標記核酸探針相對應的核酸片段(步驟一)。
[0026]所謂與目標同位素標記核酸探針相對應的核酸片段，是指該核酸片段與目標同位素標記核酸探針具備相同的堿基性質和堿基序列。如目標同位素標記核酸探針是雙鏈DNA，則所制備的核酸片段也是雙鏈DNA，且兩者的堿基序列相同。如目標同位素標記核酸探針是單鏈RNA，則所制備的核酸片段也是單鏈RNA，且兩者的堿基序列相同。
[0027]制備與目標同位素標記核酸探針具備相同序列的核酸片段，可以采用與制備目標同位素標記核酸探針相同的方法，也可以是其他的方法，只要滿足所制備的核酸片段與目標同位素標記核酸探針具備相同的堿基性質和堿基序列。如使用PCR法制備目標同位素標記核酸探針，則同樣可以使用PCR法制備對應的核酸片段，也可以使用人工合成的方法制備對應的核酸片段。
[0028]電泳分離所制備的核酸片段(步驟二)。
[0029]按照《分子克隆:實驗室手冊》或其他文獻資料所記載的凝膠電泳法，電泳分離所制備的核酸片段。優化的電泳介質是聚丙烯酰胺凝膠。
[0030]使用常規染色法定位所述核酸片段電泳后在電泳膠上的位置(步驟三)。
[0031]所謂常規染色法是指不借助于標記物的特性就可以使DNA、RNA顯現的方法，包括溴化乙錠染色法、GoldView染色法、GeneFinder染色法、SYBR Green I染色法、GelRed染色法、GelGreen染色法、銀染法。所述染色法詳細記載于《分子克隆:實驗室手冊》、公開文獻資料和相關產品說明書之中。除上述的常規染色法之外，其他常規染色法也適用于本發明。
[0032]染色之后，通過凝膠成像系統成像。通過圖像，可判斷和測量所述核酸片段在凝膠中的具體位置。該位置就是后續目標同位素標記核酸探針電泳結束后的所在位置。此位置命名為T-site。該名稱僅僅是所述位置在本說明書中的代號，可以使用任一名稱命名該位置。
[0033]電泳分離目標同位素標記核酸探針(步驟四)。
[0034]使用另一塊與步驟二相同的電泳膠，采用與步驟二相同的條件，電泳分離目標同位素標記核酸探針。所謂與步驟二相同的電泳膠是指，兩塊電泳膠具備相同的化學和物理特性，如凝膠性質、濃度、長度、寬度、厚度等。所謂相同的條件是指，除了被電泳的樣品之夕卜，電泳過程中涉及的其他物品和參數都是相同的。相同的物品和參數包括:電泳膠、電泳液、電泳系統、施加的電壓等。
[0035]因為目標同位素標記核酸探針和與其對應的核酸片段的性質相同，分子量差異極小，所以在相同的電泳條件下，迀移率也是相同的。
[0036]電泳結束后，切割已預先確定位置上的膠塊(步驟五)。
[0037]經過與步驟二相同的時長后，停止電泳。因為目標同位素標記核酸探針和與其對應的核酸片段的迀移率是相同的，電泳持續的時長也是相同的，所以目標同位素標記核酸探針和與其對應的核酸片段在電泳膠上的迀移距離也是相同的。電泳結束后，目標同位素標記核酸探針位于上述標注的T-s i te位置。
[0038]切割T-site位置處的膠塊。需要說明的是，被切割的膠塊是從電泳同位素標記核酸探針所用的電泳膠而來(步驟四)，而不是從電泳核酸片段所用的電泳膠而來(步驟二)。
[0039]回收上述膠塊中的探針(步驟六)。
[0040]使用《分子克隆:實驗室手冊》所描述的方法或商業化產品，如Amb1n公司產品、Progema公司產品，回收所述膠塊中的同位素標記核酸探針。
[0041]在閱讀了本發明的上述內容之后，本技術領域人員可以對本發明作各種修改或變動，如使用瓊脂糖凝膠替代聚丙烯酰胺凝膠，使用其他同位素、其他的常規染色方法替代本發明的相應部分，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍內。
【主權項】
1.一種切膠純化同位素標記核酸探針的方法，該方法包括如下步驟: 步驟一:制備與目標同位素標記核酸探針相對應的核酸片段； 步驟二:電泳分離所述核酸片段； 步驟三:使用常規染色法定位所述核酸片段在電泳膠上的位置； 步驟四:使用另一塊與步驟二相同的電泳膠，采用與步驟二相同的條件，電泳分離目標同位素標記核酸探針； 步驟五:經過與步驟二相同的時長后，停止電泳，切割步驟四所述電泳膠上的由步驟三所確定的位置處的膠塊； 步驟六:回收所述膠塊中的同位素標記核酸探針。2.按照權利要求1所述的一種切膠純化同位素標記核酸探針的方法，其特征在于:所述核酸探針為單鏈DNA、雙鏈DNA、單鏈RNA或雙鏈RNA中之一。3.按照權利要求1所述的一種切膠純化同位素標記核酸探針的方法，其特征在于:所述同位素為32P、3H或14C中之一。4.按照權利要求1所述的一種切膠純化同位素標記核酸探針的方法，其特征在于:所述常規染色法為溴化乙錠染色法、GoIdView染色法、GeneFinder染色法、SYBR Green I染色法、GelRed染色法、GelGreen染色法或銀染法中之一。5.按照權利要求1所述的一種切膠純化同位素標記核酸探針的方法，其特征在于:所述電泳采用的介質為聚丙烯酰胺凝膠。
【文檔編號】C12N15/10GK106047863SQ201610433854
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月18日
【發明人】朱晨剛
【申請人】貴州師范學院, 朱晨剛