一種基于反向遺傳技術將ibv h120株重組表達ndv hn基因的二聯疫苗株的制作方法
【專利摘要】本發明公開了以構建的禽傳染性支氣管炎病毒H120反向遺傳系統為基礎，將禽新城疫病毒HN基因替換H120毒株5a基因（圖1），獲得R?H120?Lasota（HN）二聯疫苗拯救毒株，該重組疫苗株能同時對IBV 標準攻毒毒株和新城疫標準攻毒毒株具有良好的保護作用，可用于預防禽傳染性支氣管炎病毒和禽新城疫病毒。
【專利說明】
一種基于反向遺傳技術將IBV H120株重組表達NDV HN基因的二聯疫苗株
技術領域
[0001 ]本發明涉及動物醫藥生物工程領域，是一種禽傳染性支氣管炎病毒H120重組表達禽新城疫病毒Lasota毒株HN基因疫苗。
【背景技術】
[0002]禽傳染性支氣管炎病毒(IBV)引起的禽傳染性支氣管炎(IB)，是危害養禽業的重大傳染病之一，以呼吸道癥狀、產蛋雞產蛋下降30-50%、蛋品質下降、腎臟病變及胃腸道病變為主要特征。在我國該病發病率100%，死亡率10-30%，國內每年造成的經濟損失超過十億元。毒載體是利用重組DNA技術將外源基因插入經過改造的病毒基因組內部，而后感染細胞，使外源基因在細胞內有效表達。病毒載體作為一種常用于分子生物學的工具多用于疫苗研究等方向。反向遺傳技術的成熟，催生出了許多RNA病毒載體，Zhao H等分別在NDV強毒株、弱毒株的4個不同基因間插入外源基因，發現病毒的復制效率和滴度并沒有受到明顯的影響，證實NDV作為疫苗載體是完全可行的。2001通過反向遺傳在新城疫病毒中重組表達禽流感血凝蛋白，發現所構建的重組的拯救病毒可以誘導對禽流感病毒強烈的體液抗體免疫反應對小鼠致死劑量禽流感病毒具有完全保護作用。Huang Z H等先后用重組NDVLasota株表達傳染性法氏囊病毒VP2蛋白，對NDV強毒株和傳染性法氏囊病毒超強毒株的攻擊均能起到相當良好的保護。2007年Joshua M和PANS利用新城疫病毒做為載體表達SARS病毒S基因所構建的疫苗在對實驗動物進行雙倍劑量的SARS病毒接種，發現在病毒在肺部復制頂峰時期的含量要遠遠低于對照。2008年Man-Seong Park應用ND病毒載體表達禽流感H5、H9血凝素基因構建為疫苗，發現不僅對新城疫具有致死性劑量的保護作用，同時對禽流感病毒同時具有良好的保護作用。2007哈獸研Ge等通過反向遺傳手段將AIV H5N1 HA基因插入到NDV Lasota中，形成二聯苗能夠對同源或者異源的新城疫病毒、高致病性禽流感具有完全的免疫保護作用。
【發明內容】
[0003]本發明根據本實驗室成功構建的禽傳染性支氣管炎病毒H120反向遺傳系統為基礎，將禽新城疫病毒HN基因替換H120毒株5a基因，獲得R-H120-Lasota(HN)拯救毒株。
【附圖說明】
[0004]圖1:H120重組表達NDV HN基因構建策略圖。
【具體實施方式】
[0005]1、本發明所用禽傳染性支氣管炎病毒H120毒株反向遺傳系統為四川大學動物疫病防控與食品安全四川省重點實驗室構建。使用的傳代細胞BHK21為四川大學動物疫病防控與食品安全四川省重點實驗室保存。PCR高保真酶，限制性內切酶BsaI，BsmB I,Neil, T4連接酶為購自NEB公司，PCR高保真酶，pMD-lOT購自大連寶生物有限公司膠回收試劑盒購自TIANGEN有限責任公司，引物設計和序列測定為英濰捷基公司完成。
[0006]2、設計引物:設計引物擴增所改造的禽新城疫病毒HN基因，用以替換禽傳染性支氣管炎病毒Hl20毒株反向遺傳系統中5a基因，構建策略見圖1。
[0007]3,RNA提取:使用Trizol法提取其Lasota毒株全基因組RNA，其過程為:取200 yL禽傳染性支氣管炎病毒液加750 yL TRIzol ? Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA);混勻，15-30°C放置5 min，加200 yL氯仿，劇烈振蕩15 S，室溫放置3 min，4°C 12000 rpm離心10 min，取上層水相，轉入新的離心管中，緩慢加入I倍體積70%異丙醇，混勻，放置10-20min,40C 12000 rpm離心30 S，棄廢液;4°C 12000 rpm離心2 min，去除殘余液體。加入30yLRNase-free水，室溫放置2 min,4°C 12000 rpm離心2 min，收集離心后上清液，取5 yL于1.0%的瓊脂糖凝膠上進行電泳。其它于-70 °C保存備用。cDNA的合成，使用寶生物反轉錄試劑盒primeScripts，按照試劑盒說明進行，其反應體系Buffer 2 yL，oligdT 0.5 yL,radome 0.5 yL，RNA模板，37攝氏度15 min,85°C 5 S。禽新城疫病毒HN基因PCR獲取，以cDNA為模板，加入KOD plus polymerase (Toyobo, Japan)。聚合酶、上下游引物、dNTP進行擴增反應。PCR的反應體系為:10Xbuffer 5yL，4XdNTP mix(2.5 mmol/L)4 yL，上、下游引物(20 μπιοΙ/L)各2 yL,Mgcl2 3 yL，cDNA 2 yL，ddH20 31.75 yL，0.25 yL。反應參數為:94°C 5 min，25個循環，94°C 30 s，60°C，30 s，72°C 2 min 最后 72°C 10 miruPCR產物在1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察，擴增條帶大小與預期的結果一致。
[0008]PCR產物純化，瓊脂糖凝膠電泳，將目的條帶切下，通過使用膠回收試劑盒進行純化回收，獲得純化的禽新城疫病毒HN基因PCR片段。
[0009]PCR片段的克隆，將純化的禽新城疫病毒HN PCR片段與pMD-19T連接反應如下，PCR產物4.5 yL，pMD-19T載體0.5yL solut1n〗5 yL，混勻，16°C過夜，將連接產物轉化DH5a感受態細胞，在含有氨芐青霉素的LB平板上37°C培養16 h后，在含有氨芐青霉素的LB平板上挑取單個菌落，接種5 mL液體培養基中，37 °C，進行培養，然后挑陽性菌液2_3個送上海生工進行測序，若比對分析結果序列與GenBank中一致，表明克隆成功。堿裂解法抽提質粒DNA，將所鑒定陽性克隆子大量培養，堿裂解法提取質粒。
[0010]目的CDNA片段的酶切回收:對載有HN片段的質粒進行BsmB頂每切
酶切體系為BsmB I:NEB buffer 3 5 yL,BSA(10mg/Ml)0.5 yL，BsmB I 2 yL，質粒20yL，ddH20 22.5 yL，總體系為50μΙ^55Γ溫育8 h。
[0011]4、全長cDNA的體外構建
使用已建立的禽傳染性支氣管炎病毒H120毒株反向遺傳系統，重新連接改造后的全長cDNA。
[0012]5、細胞適應性H120毒株cDNA的體外轉錄及恢復病毒的獲得
體外轉錄試劑盒進行轉錄:取約200 ng經純化連接產物作為模板，使用mMESSAGEmMACHINE T7 Ultra Kit進行體外轉錄，反應體系如下:
(1)全長00嫩體外轉錄體系:10父丁7React1n Buffer 2 yL，T7 2XNTP/ARCA 10 yL,GTP 3 yL，Template DNA5 yL，T7 Enzyme Mix 2 yL，20 yL
(2)N-3’cDNA體外轉錄體系:10XT7React1n Buffer 2 yL, T7 2XNTP/ARCA 10 μL，GTP 3 yL，Template DNA 5yL，T7 Enzyme Mix 2 yL37°C溫育2 h后，加入I yL TURBO DNase，溫育 15 1^11。-70°(:保存。
[0013]6、電擊轉染
(I)將BHK細胞培養至單層時，用0.25%胰酶消化，加入8 mL DMEM完全培養基，懸浮細胞。4°C 400 g離心3 min。棄上清，加入10 mL不含FBS、青鏈霉素的DMEM重懸細胞，離心。
[0014](2)重懸細胞于不含FBS、青鏈霉素的DMEM，使細胞濃度約為I X 107/mL。
[0015](3)將細胞置冰浴中10 11^11，取0.8 1^轉入0.4 mL電擊杯中，將I yg轉錄體與細胞小心混勻。
[0016](4)進行電穿孔，使用Gene Pulser Xcell系統，電擊參數為:電壓400 V、脈沖時長25 ms、脈沖次數3、脈沖間隔0.5 S。
[0017](5)電擊結束后，將電擊杯置冰浴中5 min，將細胞稀釋后轉入培養瓶中，補加培養液稀釋20倍，37 °C培養并觀察。
[0018](6)將細胞培養物傳雞胚收獲其雞胚尿囊液。并將雞胚尿囊液儲存于_70°C冰箱。
[0019]7、反向遺傳拯救株R-Hl 20-Lasota (HN)的鑒定
(1)沉默突變鑒定
分別對轉染后48 h的細胞液、和將細胞液接入雞胚中獲得的雞胚尿囊液RT-PCR鑒定，引物擴增區域覆蓋引入的沉默突變位點，目標片段長度為584 bp，引物序列為:
IBV-H-R-F:5'- AATATAAGACAGAGCACAAG -3，
IBV-H-R-R:5'- CTGTCATACAAAGCAGCACTACA -3’
(2)HN基因鑒定 5-ATGGACCGCGCCGTTAGCCA-3
5-〇61'(^(:0^60^640^66(:1'1'(:1'0^-3，目標長度1800 bp
(3)IFA鑒定
將BHK21細胞培養于96孔細胞培養板，置37°C、5% C02恒溫箱中培養12-24 h，待細胞長至80%-90%的單層后，棄去培養液，以DMEM原液洗2次。將已經稀釋好10TCID5q的IBV加入細胞培養板的相應板孔中，每孔50 yL，同時設不接種病毒的正常細胞為空白對照。讓病毒吸附I h，其間每隔20 min搖勻I次，然后將所有板孔補加細胞維持液至200 yL，置于37°C、5%CO2培養箱中培養6 h。棄去細胞培養板中的細胞維持液，每孔加入一20°C預冷的70%丙酮100 L，4°C固定15 min，棄去固定液，晾干，此細胞培養板可以立即使用或置一20°C冰箱中保存，備用。封閉:用PBS將固定了的細胞培養板洗滌3次，每孔加入1% BSA 100此，室溫放置30 min，再用I3BS洗滌3次。加入50 yL已稀釋好的一抗于培養板孔內，細胞培養箱孵育適當時間，PBS振洗3次，每次5 min，然后加入50此已稀釋好的二抗于培養板孔內，在培養箱內避光孵育適當時間，PBS振洗3次，每次5 min。鏡檢:感染的細胞漿中顯示特異性的黃綠色免疫熒光可判定為陽性，沒有顯示特異性的黃綠色免疫熒光則判定為陰性。
[0020]8、反向遺傳拯救株R-Hl 20-Lasota (HN)遺傳生物學特性
(1)將拯救毒株1?-11120-1^8(^3(!^)在雞胚中生長曲線與親本毒株!1120無顯著性差異。
[0021 ] (2)連續提取10代拯救毒株RNA，RT-PCR順利擴增拯救毒株R-H120_Lasota(HN)和親本毒株N基因，順利擴增出490 bp左右大小的特異性目的片段。并順利擴增出R-H120-NDV-HN/(5a)毒株HN基因，表明拯救毒株R-H120-Lasota(HN)能夠穩定遺傳。
[0022](3)拯救毒株R-Hl2O-Lasota(HN) HA測定拯救毒株R-H120-Lasota(HN)與陽性對照H120毒株經過魏氏梭菌處理后能夠凝集雞紅細胞，滴度為211，而未經處理的R-H120_Lasota(HN)與陽性對照Lasota能凝集雞紅細胞，血凝價為211。
[0023](4)拯救毒株EID50測定
R-H120-Lasota(HN)拯救毒株接種SPF雞胚表現出感染IBV的典型癥狀，發育遲緩、矮小、蜷縮。按Reed-Muench法計算，H120毒株的EID50為EID50=10—7/0.2mL，R-H120-Lasota(HN)毒株EID50為10—6'8EID50/0.2mL。拯救毒株EID50與親本毒株無顯差異。
[0024](5)拯救毒株在傳代細胞CK細胞中病理變化(CPE)
R-H120-Lasota(HN)毒株接種CK細胞后，能夠使CK細胞產生明顯的細胞病變(CPE)，脫落、死亡。
【主權項】
1.一種禽傳染性支氣管炎病毒H120重組表達禽新城疫病毒Lasota毒株HN基因疫苗株構建技術，其特征在于:使用反向遺傳技術，將禽傳染性支氣管炎病毒Hl 20毒株對禽新城疫病毒Lasota毒株HN進行表達，構建以禽傳染性支氣管炎病毒H120為載體的二聯苗株R-H120-Lasota(HN)o2.根據權利要求1所述的R-H120-Lasota(HN)疫苗株，其特征在于:按照Nosee’M策略設計引物，在擴增HN基因的上下游引物引入BsmBI限制性內切酶，并在HN基因起始 密碼子 ATG 前面引入 GeneEnd，Genestar，korzea “AGAAAAAATACGGGTAGAACACTAGTCCGCCACCA”， 用所擴增的HN基因替換H120毒株的5a閱讀框、并通過反向遺傳技術獲得拯救毒株R-H120-Lasota(HN)o3.根據權利要求1所述，拯救獲得的R-H120-Lasota(HN)疫苗株，其生物學特征在于:所獲得的R-H120-Lasota(HN)能夠在雞胚中穩定傳代;能夠穩定表達禽新城疫HN蛋白；IFA能夠檢測到免疫熒光;拯救毒株R-H120-Lasota(HN)與經過魏氏梭菌處理后能夠凝集雞紅細胞，滴度為211;EID50測定為 10-6.8EID50/0.2 mL;R-H120-Lasota(HN)毒株接種CK細胞后，能夠使CK細胞產生明顯的細胞病變(CPE);對IBV標準攻毒毒株和新城疫標準攻毒毒株具有良好的保護作用，可用于預防禽傳染性支氣管炎病毒和禽新城疫病毒。
【文檔編號】C12N7/01GK106047823SQ201610502356
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月1日
【發明人】王紅寧, 楊鑫, 周瀧, 周英順, 門帥
【申請人】四川大學