甲基?β?環(huán)糊精在擴(kuò)大家蠶核型多角體病毒宿主域中的應(yīng)用

甲基?β?環(huán)糊精在擴(kuò)大家蠶核型多角體病毒宿主域中的應(yīng)用
【專利摘要】甲基?β?環(huán)糊精在擴(kuò)大家蠶核型多角體病毒宿主域中的應(yīng)用，用含有一定濃度MβCD處理BmNPV非宿主細(xì)胞后，能顯著的提高BmNPV感染非宿主昆蟲(chóng)細(xì)胞效率，使BmNPV可在非宿主細(xì)胞中復(fù)制擴(kuò)增，產(chǎn)生有感染性的病毒粒子及多角體，而對(duì)照細(xì)胞BmNPV則完全不能復(fù)制，更觀察不到多角體的產(chǎn)生。本發(fā)明解決了BmNPV宿主域狹窄的問(wèn)題，能使BmNPV在非宿主細(xì)胞復(fù)制，高效感染非宿主細(xì)胞，產(chǎn)生多角體。同時(shí)也可改善桿狀病毒作為生物殺蟲(chóng)劑宿主范圍窄，殺蟲(chóng)速度慢等缺點(diǎn)，還可促進(jìn)昆蟲(chóng)桿狀病毒與宿主細(xì)胞相互作用、桿狀病毒受體以及桿狀病毒入侵宿主的機(jī)制等研究的發(fā)展。
【專利說(shuō)明】
甲基-β-環(huán)糊精在擴(kuò)大家香核型多角體病毒宿主域中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物殺蟲(chóng)劑與桿狀病毒學(xué)領(lǐng)域，涉及甲基-β-環(huán)糊精(Methyl-β-cyclodextrin，簡(jiǎn)稱MKD，也有表示為MBCD，Me-KD，MeBCD)在擴(kuò)大家蠶核型多角體病毒宿主域中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]桿狀病毒是已知昆蟲(chóng)病毒中的最大類群，是發(fā)現(xiàn)最早、研究最多的且實(shí)用意義很大的昆蟲(chóng)病毒，是一種閉合環(huán)狀雙鏈DNA的囊膜病毒，基因組大小約為80?180kb。由于桿狀病毒又是農(nóng)林業(yè)主要害蟲(chóng)的控制因子，因此也被廣泛應(yīng)用于生物殺蟲(chóng)劑。
[0003]桿狀病毒絕大部分是從昆蟲(chóng)中分尚得來(lái)的，都具有相對(duì)狹窄的宿主域。苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica nucleopolyhedrovirus AcMNPV)和家香核型多角體病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV)是研究的最為廣泛的兩種昆蟲(chóng)桿狀病毒，雖然兩個(gè)病毒基因組有很高的同源性，但是AcMNPV的宿主域比BmNPV寬得多，AcMNPV可在sf9、sf21、TN-368、CLS-79細(xì)胞系復(fù)制，但不能在家蠶BmN細(xì)胞中復(fù)制，而B(niǎo)mNPV則不同于AcMNPV，僅在BmN、Bm5等細(xì)胞系內(nèi)復(fù)制，對(duì)非宿主細(xì)胞sf 9、sf 21、TN_368等幾乎不能感染(呂鴻聲.昆蟲(chóng)病毒分子生物學(xué)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)出版社，1998，pl70-174.)。
[0004]目前已有很多利用分子生物學(xué)和基因工程手段改造桿狀病毒基因組，擴(kuò)大桿狀病毒宿主域的報(bào)道(郭睿等，可感染茶尺蠖的重組家蠶核型多角體病毒的構(gòu)建，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45 (16): 3288-3296)，但是利用Μβ⑶擴(kuò)大桿狀病毒宿主域方面還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。
[0005]家蠶是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，而B(niǎo)mNPV引起的膿病是蠶桑生產(chǎn)中最嚴(yán)重的病害，BmNPV傳染性很強(qiáng)，但是由于連續(xù)養(yǎng)蠶，導(dǎo)致病毒殺滅不完全，每年由于BmNPV感染導(dǎo)致膿病的發(fā)生給蠶絲業(yè)帶來(lái)的巨大損失高達(dá)蠶桑生產(chǎn)總值16%。家蠶在幼蟲(chóng)期體長(zhǎng)和體重迅速增加，到5齡期，體重每頭可達(dá)5-7克，由于家蠶體積大，當(dāng)BmNPV爆發(fā)性發(fā)生時(shí)可以產(chǎn)生大量的BmNPV病毒，目前生產(chǎn)中這些病毒必須經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的消殺處理，以避免病毒再次傳播。但是如果可以把這種養(yǎng)蠶業(yè)避免不了的危害物加以利用，就可以變廢為寶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]解決的技術(shù)問(wèn)題:本發(fā)明提供一種甲基-β_環(huán)糊精在擴(kuò)大家蠶核型多角體病毒宿主域中的應(yīng)用，
【申請(qǐng)人】前期研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)MKD濃度較高時(shí)，MKD可以完全抑制BmNPV入侵家蠶BmN細(xì)胞，但當(dāng)濃度較低時(shí)，它卻可以增強(qiáng)BmNPV入侵非宿主細(xì)胞，比如sf9和sf21。即用含有一定濃度?、堑募?xì)胞培養(yǎng)液孵育BmNPV的非宿主昆蟲(chóng)細(xì)胞后，再用BmNPV感染處理的細(xì)胞，即可顯著提高BmNPV對(duì)非宿主昆蟲(chóng)細(xì)胞的感染效率，該方法簡(jiǎn)單明了，便于操作，成本低廉，易于推廣，提尚效率顯者。
[0007]技術(shù)方案:甲基-β_環(huán)糊精在擴(kuò)大家蠶核型多角體病毒宿主域中的應(yīng)用。
[0008]所述甲基-β-環(huán)糊精的工作濃度為0.125-2mM。
[0009]所述宿主為8€9、8€21、11丨811f ive(Hi5)、ΤΝ369、ΗζΑΜ1。
[0010]擴(kuò)大家蠶核型多角體病毒宿主域的組合物，有效成分包括甲基-β-環(huán)糊精。
[0011]1.Μβ⑶(購(gòu)自Sigma公司)溶液的配置及病毒準(zhǔn)備
[0012]用IXPBS[購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司]溶解聽(tīng)⑶，配制濃度為50mM的儲(chǔ)存液。
[0013]BmBacJS13 是一株與 BmNP V具有相同感染特性的 Bacm i d [ Huang JS e ta 1.Construct1n of the Bac — to—Bac System of Bombyx moriNucleopolyhedroviru.Virologica Sinica.2007，22(3):218-225]。為了便于觀察及統(tǒng)計(jì)本發(fā)明所述的感染效率，將hsp70操縱下的報(bào)告基因egf p及BmNPV的多角體基因(口01}^(1瓜40111)同時(shí)轉(zhuǎn)座到&111^1(^313的1'117轉(zhuǎn)座插入位點(diǎn)，重組后的匕30111(1命名&111^1(3-egfp-ph，提取重組bacmid的DNA，轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察到強(qiáng)烈的綠色熒光，收獲出芽病毒(Budded Virus，BV)后，繼續(xù)用于感染家蠶細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增，72h后收獲病毒，利用終點(diǎn)稀釋法測(cè)定病毒滴度，4°C避光保存，用于本發(fā)明所有方法中。
[0014]2.不同濃度Μβ⑶孵育細(xì)胞及隨后病毒感染的細(xì)胞熒光觀察
[0015]分別在細(xì)胞培養(yǎng)皿中接種正常培養(yǎng)的BmNPV非宿主昆蟲(chóng)細(xì)胞，例如sf9、sf21等，貝占壁24h后，用配制好的Μβ⑶儲(chǔ)存液加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，使聽(tīng)⑶終濃度分別為0.125-2mM，孵育20-60min，孵育細(xì)胞溫度為24-29°C，以O(shè)mM MKD(即等體積I XPBS)作為對(duì)照。孵育時(shí)間到后，分別去除I XI3BS和不同濃度的MKD孵育液，用無(wú)血清的TC-100培養(yǎng)基或其它昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基輕輕沖洗細(xì)胞2次(也可不洗)，接著用MOI = 5-50攜帶綠色熒光蛋白基因的BmBac-egfp-ph病毒分別感染不同處理的細(xì)胞，27°C感染Ih后，用無(wú)血清昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基輕洗2遍(也可不洗)，放置于27°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)后6-72h，即在熒光顯微鏡下可觀察到不同處理表達(dá)熒光細(xì)胞數(shù)量的差異。在感染后期，用MPCD孵育過(guò)的細(xì)胞在光學(xué)顯微鏡下能看見(jiàn)病毒多角體的形成，而對(duì)照I ><?83孵育的細(xì)胞無(wú)多角體的形成。圖1是&1^&0-68辦-?11感染非宿主昆蟲(chóng)細(xì)胞sf21示例的結(jié)果，當(dāng)用I XPBS對(duì)照孵育sf21細(xì)胞時(shí)，病毒感染效率非常低，感染后72h沒(méi)有多角體的形成，但用0.25mM的MPCD處理后，感染效率顯著提高，感染72h后細(xì)胞全部都有綠色熒光表達(dá)，表明BmNPV在sf21細(xì)胞中可以很好的復(fù)制，而且能看見(jiàn)多角體的形成(紅色箭頭所示)。
[0016]3.不同濃度Μβ⑶孵育細(xì)胞對(duì)BmBac-egfp-ph感染率影響
[0017]分別在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種正常培養(yǎng)的BmNPV非宿主昆蟲(chóng)細(xì)胞，貼壁24h后，用配制好的MPCD儲(chǔ)存液加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，使MPCD終濃度分別為0.12 5?2mM，孵育2 O -60min，孵育細(xì)胞溫度為24-29°C，以O(shè)mM MKD(即等體積I XPBS)孵育液作為對(duì)照。孵育時(shí)間到后，分別去除I XPBS和不同濃度的MKD孵育液，用無(wú)血清昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基或者PBS輕輕沖洗細(xì)胞2次，接著用皿)1 = 10攜帶綠色熒光蛋白基因的&^&(:-叫€?-?11病毒分別感染不同處理的細(xì)胞，27°C感染Ih后，去除未吸附的病毒粒子及培養(yǎng)基，用無(wú)血清的昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基或者I3BS輕洗2遍，加入正常細(xì)胞培養(yǎng)基，放置于27 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h后，去除細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS懸浮細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀統(tǒng)計(jì)有熒光表達(dá)的細(xì)胞數(shù)，利用t測(cè)驗(yàn)分析不同濃度MKD孵育細(xì)胞與對(duì)照的在病毒感效率方面的差異。實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)重復(fù)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示0.125mM MKD處理細(xì)胞時(shí)，BmNPV感染的細(xì)胞效率約為對(duì)照2.5倍，而0.25、0.5、0.75、1、1.5、2mM Μβ⑶處理后的感染效率分別為對(duì)照5.5、5.6、6、6.3、6.7、5.9倍。
[0018]4.BmNPV在Μβ⑶孵育后的細(xì)胞中病毒生長(zhǎng)曲線測(cè)定
[0019]分別在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種正常培養(yǎng)的BmNPV非宿主昆蟲(chóng)細(xì)胞，貼壁后，用配制好的MKD儲(chǔ)存液加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，使Mf3CD終濃度為0.25mM，27°C孵育30min，以O(shè)mM Μβ⑶(即等體積I X roS)孵育液作為對(duì)照。孵育時(shí)間到后，分別去除I XI3BS和不同濃度的MKD孵育液，用無(wú)血清的昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基輕輕沖洗細(xì)胞2次，接著用M0I = 20BmBaC-egfp-ph BV病毒分別感染不同處理的細(xì)胞，27°C感染2h后去掉病毒感染液，用無(wú)血清的昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基輕洗2遍(以此時(shí)間設(shè)定為Oh)，加入2mL正常培養(yǎng)基27°C常規(guī)培養(yǎng)，分別在感染后0、12、24、48、7 2、96h取上清樣品I OyL，利用BmN細(xì)胞，采用終點(diǎn)稀釋法測(cè)定每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的病毒滴度，實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，繪制病毒的一步生長(zhǎng)曲線，以確定BmNPV病毒在sf21細(xì)胞中是否可以正常復(fù)制擴(kuò)增。圖3是Μβ⑶終濃度為0.25mM和對(duì)照I3BS的病毒一步生長(zhǎng)曲線，從圖中可以發(fā)現(xiàn)，BmNPV感染sf 21后，對(duì)照在0_96h的生長(zhǎng)曲線為一條直線，細(xì)胞沒(méi)有產(chǎn)生病毒粒子，表明BmNPV在未處理的非宿主細(xì)胞sf21不能復(fù)制，而MKD處理細(xì)胞后，在O與12h時(shí)間點(diǎn)沒(méi)有病毒粒子產(chǎn)生，但后期病毒粒子數(shù)量開(kāi)始上升，并一直持續(xù)到感染后96h，表明BmNPV感染后病毒能在非宿主細(xì)胞中復(fù)制，并產(chǎn)生具有感染性的病毒粒子。
[0020]有益效果:本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)MKD的一種新用途。用含有一定濃度Μβ⑶培養(yǎng)基處理BmNPV非宿主細(xì)胞后，能顯著的提高BmNPV感染非宿主昆蟲(chóng)細(xì)胞效率，使BmNPV可在非敏感細(xì)胞中復(fù)制擴(kuò)增，產(chǎn)生有感染性的病毒粒子及多角體，而對(duì)照細(xì)胞BmNPV則完全不能復(fù)制，更觀察不到多角體的產(chǎn)生。該用途的發(fā)明，解決了BmNPV宿主域狹窄的問(wèn)題，能使BmNPV在非宿主細(xì)胞復(fù)制，高效感染非宿主細(xì)胞，產(chǎn)生多角體。同時(shí)也可改善桿狀病毒作為生物殺蟲(chóng)劑宿主范圍窄，殺蟲(chóng)速度慢等缺點(diǎn)，還可促進(jìn)昆蟲(chóng)桿狀病毒與宿主細(xì)胞相互作用、桿狀病毒受體以及桿狀病毒入侵宿主的機(jī)制等研究的發(fā)展。本發(fā)明提供的方法簡(jiǎn)單明了，易于理解、操作簡(jiǎn)單易行，效率高。
【附圖說(shuō)明】
[0021]圖1為利用本發(fā)明中所述方法終濃度為0.25mM Μβ⑶處理sf21細(xì)胞(對(duì)照用I3BS處理)，病毒BmBac-egfp-ph感染72h后焚光及可見(jiàn)光比較圖:
[0022]A與B為BmBac-egfp-ph感染PBS處理細(xì)胞的熒光圖片及可見(jiàn)光圖片;C與D為BmBac-egfp-ph感染MPCD處理后細(xì)胞的熒光圖片及可見(jiàn)光圖片;D中箭頭所示為BmNPV多角體。放大倍數(shù)為640 X。結(jié)果顯示對(duì)照細(xì)胞熒光數(shù)量非常少，而處理后的細(xì)胞幾乎所有細(xì)胞均被感染，而且MPCD孵育過(guò)的細(xì)胞能觀察到多角體，對(duì)照處理則觀察不到多角體。
[0023]圖2為利用本發(fā)明中所述方法七種不同濃度Μβ⑶處理和對(duì)照I3BS處理sf21細(xì)胞后BmNPV感染效率比較:
[0024]BmNPV對(duì)照為BmBac-egfp-ph入侵未經(jīng)MKD處理的sf21細(xì)胞感染效率，AcMNPV對(duì)照為苜蓿銀紋核型多角體病毒(Autographa californica nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)對(duì)8€21的感染效率(101 = 1)，**表示各卵00處理組與8111邪￥對(duì)照具有顯著性差異(？〈ο.οοι)ο
[0025]圖中數(shù)據(jù)為三次重復(fù)結(jié)果。不同濃度Μβ⑶處理后，細(xì)胞感染率顯著大于對(duì)照，并且和AcMNPV達(dá)到相近的感染效果(Μ0Ι = I)，sf21為AcMNPV宿主細(xì)胞)。
[0026]圖3為利用本發(fā)明中所述方法0.25mM MKD處理和對(duì)照PBS處理sf21，BmBac_egfp-ph在sf21細(xì)胞中病毒生長(zhǎng)曲線比較:
[0027]縱坐標(biāo)為病毒半數(shù)組織感染劑量(TCID5Q)LOg1O對(duì)數(shù)，橫坐標(biāo)為感染后時(shí)間點(diǎn)。對(duì)照PBS處理細(xì)胞中沒(méi)有感染性的病毒粒子釋放，病毒生長(zhǎng)曲線為一條直線，表明BmBac-egfp-ph 在對(duì)照中沒(méi)有復(fù)制擴(kuò)增 ，而MKD 處理細(xì)胞在 12h 后開(kāi)始釋放出有感染性的病毒粒子，并一直持續(xù)到感染后96h，表明BmNPV在聽(tīng)⑶處理后細(xì)胞中可以有效復(fù)制、擴(kuò)增。
【具體實(shí)施方式】
[0028]以BmNPV感染非宿主昆蟲(chóng)細(xì)胞sf21為例，說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施步驟:
[0029]Μβ⑶(購(gòu)自Sigma公司)溶液的配置及病毒準(zhǔn)備
[0030]用IXPBS[購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司]溶解聽(tīng)⑶，配制濃度為50mM的儲(chǔ)存液。
[0031 ] BmBacJS13 是一株與 BmNP V具有相同感染特性的 Bacm i d [ Huang JS e ta 1.Construct1n of the Bac — to—Bac System of Bombyx moriNucleopolyhedroviru.Virologica Sinica.2007，22(3):218-225]。為了便于觀察及統(tǒng)計(jì)本發(fā)明所述的感染效率，將hsp70操縱下的報(bào)告基因egfp及多角體基因轉(zhuǎn)座到BmBacJS13的Tn7轉(zhuǎn)座插入位點(diǎn)，命名BmBac-egfp-ph，提取DNA，轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞，收獲出芽病毒后，繼續(xù)用于感染家蠶細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察到強(qiáng)烈的綠色熒光，72h后收獲病毒，終點(diǎn)稀釋法測(cè)定病毒滴度，4 °C避光保存，用于以下本發(fā)明所述方法中。
[0032]實(shí)施例1:終濃度為0.25mM Mf3CD孵育，對(duì)BmNPV感染非宿主細(xì)胞效率的提高
[0033]分別在兩個(gè)35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中各接種約5X 15個(gè)/皿的sf21細(xì)胞，貼壁后，取配制好的Μβ⑶儲(chǔ)存液加入到其中一個(gè)皿細(xì)胞培養(yǎng)液中，使MKD終濃度分別為0.25mM，以O(shè)mM Μβ⑶(即相應(yīng)體積I X PBS)孵育液加入另外一個(gè)皿作為對(duì)照，27°C孵育30min，然后分別去除IXI3BS和MKD孵育液，用無(wú)血清的TC-100培養(yǎng)基輕輕沖洗細(xì)胞2次，接著用MOI = 10攜帶綠色熒光蛋白基因和多角體基因的BmBac-egfp-ph病毒分別感染不同處理的細(xì)胞，27°C感染2h后，用無(wú)血清的TC-100培養(yǎng)基輕洗2遍，加入含10%胎牛血清的常規(guī)的TC-100培養(yǎng)基，放置于27°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h后，熒光顯微鏡觀察病毒感染效率的變化。如圖1所示，當(dāng)用PBS處理細(xì)胞時(shí)，病毒感染后僅有極少數(shù)細(xì)胞有綠色熒光蛋白的表達(dá)，但是當(dāng)用MKD處理后，幾乎所有細(xì)胞均被病毒感染，有綠色熒光蛋白的表達(dá)，而且能看見(jiàn)多角體的形成，表明本發(fā)明方法可以很好的提高BmNPV對(duì)非宿主細(xì)胞的感染效率。
[0034]實(shí)施例2:分別用終濃度為0.125、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2mM的MKD處理后，流式細(xì)胞儀統(tǒng)計(jì)病毒感染效率的變化
[0035]在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中各接種約I X 15個(gè)/孔的sf21，貼壁24h，分別取配制好的ΜβCD儲(chǔ)存液1.25yL、2.5yL、5yL、7.5yL、10yL、15yL、20yL加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中(細(xì)胞培養(yǎng)液總體積為500yL/孔)，使聽(tīng)⑶終濃度分別為0.125、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2mM，在BmNPV對(duì)照及AcMNPV對(duì)照中加入20yL I XPBS，27°C孵育30min后去除I X PBS和不同濃度的MKD孵育液，用無(wú)血清的TC-100培養(yǎng)基輕輕沖洗細(xì)胞2次，接著用MOI = 1攜帶綠色熒光蛋白基因和多角體基因的 BmBac-egfp-ph 病毒分別感染 0.125、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2mMM0CD孵育和 PBS孵育的細(xì)胞，并用MOI = I的AcMNPV感染PBS孵育細(xì)胞作對(duì)照，27°C感染Ih后，用無(wú)血清的TC-100培養(yǎng)基輕洗2遍，放置于27 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h后，去除細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞儀統(tǒng)計(jì)有熒光表達(dá)的細(xì)胞數(shù)，確定不同濃度Mi3CD孵育細(xì)胞后，BmNPV感染非宿主細(xì)胞的效率。圖2是BmNPV感染非宿主昆蟲(chóng)細(xì)胞sf21示例的結(jié)果，統(tǒng)計(jì)顯示0.125mM Μβ⑶處理細(xì)胞時(shí)，BmNPV感染的細(xì)胞效率約為對(duì)照2.5倍，而0.25、0.5、0.75、1、1.5、2mM Μβ⑶處理后的感染效率分別為對(duì)照5.5、5.6、6、6.3、6.7、5.9倍，達(dá)到極顯著水平(？〈0.001)。
[0036]實(shí)施例3:M0CD終濃度為0.25mM時(shí)，BmNPV感染后病毒生長(zhǎng)曲線測(cè)定
[0037]分別在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種約5X 15個(gè)/孔sf21細(xì)胞，貼壁后，取配制好的邸⑶儲(chǔ)存液1yL加入到貼壁細(xì)胞sf21的細(xì)胞培養(yǎng)液中，使MKD終濃度分別為0.25mM(總體積為2mL)，27°C孵育30min，以1yLl XPBS孵育液作為對(duì)照。孵育時(shí)間到后，分別去除I XPBS和Μβ⑶孵育液，用無(wú)血清的TC-100培養(yǎng)基輕輕沖洗細(xì)胞2次，接著用MOI = 20攜帶綠色熒光蛋白基因和多角體基因的BmBac-egfp-ph病毒分別感染不同處理的細(xì)胞，27°C感染Ih后，用無(wú)血清的TC-100培養(yǎng)基輕洗2遍，加入正常細(xì)胞培養(yǎng)液2mL(以此時(shí)間設(shè)定為Oh)，27°C正常培養(yǎng)，分別在感染后0、12、24、48、72、96h收集1yL上清病毒，利用BmN細(xì)胞通過(guò)終點(diǎn)稀釋法測(cè)定每個(gè)時(shí)間點(diǎn)病毒的滴度，感染及滴度測(cè)定設(shè)三次重復(fù)。根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)的病毒滴度，繪制病毒的一步生長(zhǎng)曲線。圖3結(jié)果表明，對(duì)照I3BS處理細(xì)胞后，BmNPV感染后，在0-96h病毒沒(méi)有感染性病毒粒子產(chǎn)生，而B(niǎo)mNPV感染Mf3CD處理細(xì)胞后，從12h開(kāi)始釋放出有感染性病毒粒子，一直持續(xù)到感染后96h，表明BmNPV病毒在Mf3CD處理細(xì)胞中可以復(fù)制、擴(kuò)增，產(chǎn)生有感染性病毒粒子。
[0038]最后應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是:以上所述的實(shí)施例和實(shí)施方式所述的MKD濃度和處理時(shí)間僅用于說(shuō)明性目的而非限制，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在細(xì)胞狀態(tài)或者細(xì)胞培養(yǎng)基理化性質(zhì)等(比如酸堿度等)微小的差異，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書(shū)所限定的本發(fā)明的精神和范圍，同時(shí)也包含其它家蠶核型多角體病毒非宿主細(xì)胞，諸如sf9、high five(Hi5)、TN369、HZAMl等非家蠶昆蟲(chóng)細(xì)胞和懸浮培養(yǎng)的上述細(xì)胞，并被包括在本申請(qǐng)的精神和范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.甲基-β-環(huán)糊精在擴(kuò)大家蠶核型多角體病毒宿主域中的應(yīng)用。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述甲基-β_環(huán)糊精的工作濃度為0.125-2mM。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述宿主細(xì)胞為sf9、sf 21、high five(Hi5)、TN369、HzAMl。4.擴(kuò)大家蠶核型多角體病毒宿主域的組合物，其特征在于有效成分包括甲基-β-環(huán)糊相ο
【文檔編號(hào)】C12N7/00GK106047822SQ201610384217
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年6月1日
【發(fā)明人】郝碧芳, 黃金山, 柳林, 南文斌, 沈興家
【申請(qǐng)人】江蘇科技大學(xué)