大熊貓促卵泡素β亞基單克隆抗體的制備及應用
【專利摘要】本發明公開了一種大熊貓促卵泡素β亞基單克隆抗體的制備及應用，抗大熊貓FSHβ亞基單克隆抗體雜交瘤細胞株09199，保藏編號：CCTCC NO：C2016144。本發明利用細胞融合技術，建立分泌抗FSHβ亞基單克隆抗體的雜交瘤細胞株，收集并純化細胞株培養上清，獲得高特異性FSHβ亞基單克隆抗體，并建立高特異性的FSHβ亞基單克隆抗體應用于Western Blot蛋白檢測，為FSH蛋白的定位和組織表達信息，及利用FSHβ亞基高特異性的單克隆抗體對FSH受體的配體、拮抗物、抗拮抗物進行深入研究，為特異性配體、拮抗物、抗拮抗物的發現創造條件。同時為進一步探討FSH分泌及基因進一步調控，揭示生殖生理規律，提供了新的資料和思路。CCTCC NO：C201614420160720
【專利說明】
大熊貓促卵泡素0亞基單克隆抗體的制備及應用
技術領域
[0001] 本發明設及一種特異的單克隆抗體的制備，特別是用于大熊貓促卵泡素蛋白的檢 測。
【背景技術】
[0002] 促卵泡素(FSH)是腦垂體前葉嗜堿性細胞分泌的糖蛋白激素。在卵巢中，促卵泡素 刺激尚未成熟的卵泡的生長，卵泡在生長過程中會釋放抑制素 W阻斷卵泡刺激素的進一步 合成。運一機制保證了排卵的選擇性。在黃體化階段的末尾，卵泡刺激素水平也有小幅度提 升，可能與下一個排卵周期的開始有關。睪丸中，卵泡刺激素提高塞爾托利細胞合成男性激 素結合蛋白的水平，誘發塞爾托利細胞的緊密結合，同時分泌抑制素，在成精子過程中起到 至關重要的作用。促卵泡素(FSH)活性形式是糖基化的異源二聚體，由a和0兩個亞基組成，0 亞基決定激素的特異抗原性和特異功能，但需與a亞基結合才具有生物學活性。促黃體素， 甲狀腺激素，等糖蛋白激素采用了與促卵泡素相似的結構。它們共享同樣的曰亞基，而e亞基 則隨激素的不同而不同。因此JS冊亞基是F甜唯一的特異亞基，由129氨基酸編碼的蛋白， 約14kd，具有活性的二聚體FSH約28kd。由于種屬差異的原因，目前沒有特異的抗大熊貓FSH 特異抗體。
【發明內容】
[0003] 本發明目的是提供一種抗大熊貓FS地亞基單克隆抗體雜交瘤細胞株、抗大熊貓 FS地亞基單克隆抗體及制備方法，解決現有技術中沒有特異的抗大熊貓F甜特異抗體的問 題。
[0004] 本發明的技術方案為:抗大熊貓FS地亞基單克隆抗體雜交瘤細胞株09199,保藏編 號:(：口'0：^:〔2016144,2016年7月20日在中國典型培養物保藏中屯、((：口'0：)進行保藏。
[0005] 抗大熊貓FS地亞基單克隆抗體雜交瘤細胞株09199用于產生抗大熊貓FS冊亞基單 克隆抗體。
[0006] 抗大熊貓!^地亞基單克隆抗體，由雜交瘤細胞株09199產生，亞型為IgGl。
[0007] 抗大熊貓FS地亞基單克隆抗體在western blot技術中的應用。
[000引抗大熊貓!^地亞基單克隆抗體的制備方法，步驟如下：
[0009] (1)設計大熊貓FS地特異序列SEQ ID NO: 1所示，氨基酸序列如下：
[0010] LVY邸PARPNIQKICTFKELAYETVKVPGC，并與KLH偶聯，作為生產特異性抗體的免疫原 F甜0-KLH;
[0011] (2似步驟(1)制備的免疫原FS地-KLH免疫小鼠；
[0012] (3)細胞融和得到抗大熊貓!^地亞基單克隆抗體雜交瘤細胞株09199;
[0013] (4)擴大培養得到抗大熊貓!^地亞基單克隆抗體。
[0014] 本發明與現有技術相比具有如下優點：
[0015] 本發明利用細胞融合技術，建立分泌抗FS冊亞基單克隆抗體的雜交瘤細胞株，收 集并純化細胞株培養上清，獲得高特異性FS冊亞基單克隆抗體，并建立高特異性的FS冊亞 基單克隆抗體應用于Western Blot蛋白檢測，為F細蛋白的定位和組織表達信息，及利用 FS地亞基高特異性的單克隆抗體對F細受體的配體、括抗物、抗括抗物進行深入研究，為特 異性配體、括抗物、抗括抗物的發現創造條件。同時為進一步探討FSH分泌及基因進一步調 控，掲示生殖生理規律，提供了新的資料和思路。
[0016] 保藏信息:本發明的抗大熊貓FS地亞基單克隆抗體雜交瘤細胞株09199,于2016年 7月20日在中國典型培養物保藏中屯、（CCTCC)進行保藏，保藏編號：CCTCC NO: C2016144，地 址：中國武漢.武漢大學
【附圖說明】
[0017] 圖1為實施例2中細胞蛋白濃度的標準曲線圖。
[0018] 圖2為實施例2中Western-blot檢測結果。
【具體實施方式】
[0019] 特異性抗大熊貓!^地單克隆抗體的制備方法，具有W下步驟：
[0020] 1)特異多膚片段的設計與合成:根據大熊貓FS冊亞基蛋白序列(NP_001291794)， 參考其它物種序列分析，設計了大熊貓FS郵亞基特異的序列SEQ ID NO: 1所示： LVYKDPARPNIQKICTFKELAYETVKVPGC，人工合成運段特異的多膚片段，并與化H偶聯，增強免 疫原性作為生產特異性抗體的免疫原巧S地-KLH)，此部分委托上海生工生物公司完成。
[0021] 2)小鼠免疫：用佐劑:抗原=1:1 (偶聯多膚FS地-KLH)的混合液，乳化完全后，腹腔 注射。首次免疫佐劑為服飾完全佐劑，后續免疫佐劑為服飾不完全佐劑，首次免疫小鼠之 前，尾部采取小鼠血液，分離血清，作為陰性對照。多次免疫，直至血清效價達標為止。
[0022] 3)細胞融合:包括常規方法進行細胞融合(包括SP2細胞的準備，飼養層細胞制備， 脾細胞的制備）、HAT選擇性培養W及化ISA法篩選，得到雜交瘤細胞。
[0023] 4)對上述得到的雜交瘤細胞進行陽性克隆的篩選，選擇陽性細胞孔進行細胞克 隆，通過有限稀釋法得到抗大熊貓FS地亞基單克隆抗體雜交瘤細胞株09199,并進行亞型鑒 定。
[0024] 5)得到的特異性抗大熊貓FS冊亞基單克隆抗體雜交瘤細胞株大量培養，收集細胞 培養上清，純化并濃縮得到特異性抗大熊貓FS地亞基單克隆抗體。
[0025] 抗大熊貓P'S地單克隆抗體在western blot技術的應用，具有W下步驟：
[0026] (1)目的蛋白表達組織總蛋白的提取:成年大熊貓睪丸和卵巢組織總蛋白的提取， 蛋白提取試劑盒:C510004-0020,生工生物工程(上海)股份有限公司，所有操作步驟按試劑 盒說明書進行。
[0027] (2)睪丸和卵巢組織總蛋白濃度的測定:BCA試劑盒，C503021-0500,生工生物工程 (上海)股份有限公司，所有操作步驟按試劑盒說明書進行。
[00巧](3)Weste;rn blot檢測應用：按常規Western blot技術方案進行，首先目的蛋白電 泳分離，然后轉膜，封閉，再進行抗大熊貓FS地亞基單克隆抗體解育和二抗Peroxidase- con化gated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)解育，最后進行E化曝光。
[00巧]實施例1
[0030] 1.抗大熊貓FS地單克隆抗體的制備
[0031] 1.1特異多膚片段的設計與合成:根據NCBI數據庫大熊貓FS地亞基氨基酸序列，登 錄號:NP_001291794,序列為：
[0032] MKSV 化 C化FCCWRAICCKSCELTN 口口 VEKEECRFCISINTTWCAGYCYT 畑 LVY 邸 PARPNIQKICTFKELAYE TVKVPGCAHQAD 化 YTYPVATECHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSF 肥 MKE，并參考其它物種序列分析， 設計了大熊貓FS地特異序列
[0033] LVY 邸 PARPNIQKICTFKELAYETVKVPGC(FS 地-1)，并通過人工合成，并與 KLH(匙空血 藍蛋白）偶聯，作文生產特異性抗體的免疫原巧S冊-KLH)。對于多膚片段的合成，此工藝比 較成熟，通過本申請公開的序列，生工生物工程(上海)股份有限公司即可生產出多膚片段 FS地-1W及免疫原FS地-KLH
[0034] 1.2抗原小鼠免疫：用佐劑:抗原=1:1的混合液接種，（抗原量不夠可與氯化鋼混 合后再與佐劑乳化）。首免用弗氏完全佐劑，后面免疫用弗氏不完全佐劑。免疫之前準備好 滅菌的注射器、S通管、一次性注射器。先用滅菌好的注射器將抗原和化C1吸進注射器中 (共400ul，四只的量），再用滅菌好的注射器將佐劑吸入注射器中（共400ul，四只的量）；最 后將滅菌好的注射器連在=通管中進行乳化(乳化大概10多分鐘，至油包水狀態即可），最 后再將融合好的混合液轉入一次性注射器中進行注射。
[0035] 第1天:腹腔注射，200ul-只。（抗原量為lOOug/只）
[0036] 第14天:腹腔注射，200ul-只。（之后抗原都為50ug/只）
[0037] 第21天:腹腔注射，200ul-只。
[003引第27天:腹腔注射，200ul-只。
[0039] .....................
[0040] (第S次免疫后巧Ij4天可小鼠尾部采血，1200化mp，8min，取血清測定其效價，W FS地-1，包被濃度為化g/ml作為抗原，ELISA方法檢測血清效價，效價達標后即可準備融合， 效價不夠高者需繼續免疫直至達標。）
[0041] 1.3細胞融合：
[0042] 1.3.1骨髓瘤細胞(SP2)的復蘇:先從液氮中取出凍存好的細胞，快速放于37 °C水 浴鍋中融化，使細胞松散；再將細胞放入15ml的離屯、管中，再取大概5ml的PBS，混勻， 100化pm，5min，離屯、，棄上清，重復兩次清洗SP2細胞，將細胞養在培養瓶中，做好標記，最后 將培養瓶放入37°C、5%C02培養箱中培養。
[0043] 1.3.2SP2細胞的傳代：當培養瓶中的細胞長滿瓶底80 %左右，就可進行細胞傳代。 用槍頭將細胞吹打下來，將培養液吸出至15ml離屯、管內lOOOr/min，離屯、5分鐘;棄上清，加 ?8551111，吹打混勻，再次離屯、棄上清，重復?85洗涂步驟2次。洗涂完后加2111110%完全培養 液重懸細胞，取適量細胞至培養瓶中，放入二氧化碳培養箱中培養。
[0044] 1.3.3滋養層巨隧細胞的制備(融合前一天可準備）：
[0045] 小鼠脫頸椎致死，注意斷頸椎時盡量減少對腹腔的壓迫，避免損傷腹腔內血管，W 防飼養細胞內含有大量血細胞。將小鼠浸泡于75%酒精中5分鐘，然后手提住小鼠尾己，上 下于酒精中測洗數次。置于無菌平皿中。用無菌剪刀從后腹剪開皮膚，用手將兩側皮膚撕 開，暴露腹部，注意不要損傷腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜。用注射器吸取6-8ml的含雙抗的不 完全培養基注射入腹腔(雙抗:不完全培養液=1:100)，注意注射時用綴子提起腹膜，避免 針頭刺到腸管等腹腔臟器。用棉球輕輕按摩腹部一分鐘，吸出注入的培養液，轉入離屯、管 中。10(K)r/min離屯、5min，棄去上清。再用PBS洗涂四次。將細胞重懸于10%的完全培養液中。
[0046] 將上述細胞懸液加入96孔板，每孔加 lOOul，最后將96孔板放入C〇2的培養箱培養。 (巨隧細胞不易過多，可視情況丟棄一部分收集到的細胞。）
[0047] 1.3.4免疫脾細胞制備：
[004引（1)取小鼠脾臟
[0049] 取達到免疫要求的小鼠。首先要注意無菌操作，W防細胞污染，處死小鼠后，將其 在75%的酒精中浸泡五分鐘左右，放在無菌的平皿中，擺放在利于自己操作的位置(超凈臺 中），進行解剖。先用剪刀將小鼠尾部剪一個小口，再用手剖開皮毛層，用酒精棉球輕拭剖開 部位，再用綴子挑起包裹內臟的那層半透明的薄膜，將其剪開，暴露出脾臟，輕輕取出脾臟， 并盡量去除上面的脂肪組織，將取出的脾臟至于PBS中洗涂。
[0050] (2)脾細胞懸液制備
[0051] 先用PBS洗涂脾臟，測洗3次左右，將脾臟置于平皿中，用剪刀將脾臟盡可能的剪 碎，加 PBS洗涂過濾，不要組織細胞，收集分離的脾細胞懸液，10(K)r/min，離屯、5分鐘，棄上 清；再用5mlPBS洗涂，lOOOr/min，離屯、5分鐘；重復S次，洗涂完后加2ml不完全培養液 (DMEM)重懸細胞，稀釋細胞懸液100倍或1000倍用于細胞計數，剩余細胞置于37°C水浴鍋中 備用。
[0052] (3)SP2細胞懸液的制備：用膠頭吸管將吸取細胞液吸氣吹打培養瓶底部的薄膜 (細胞均為懸浮或輕微帖壁生長），再將細胞液用加樣搶轉移至15ml離屯、管內lOOOr/min，離 屯、5分鐘；棄上清，再加 PBS5ml，混勻，100化/min,離屯、5分鐘，重復洗涂兩次，洗涂完后加2ml 不完全培養液(DMEM)重懸細胞，稀釋細胞懸液100倍或1000倍用于細胞計數，剩余細胞置于 37°C水浴鍋中備用。
[0化3] 1.3.5PEG作用下進行細胞融合
[0054] 將SP2與脾細胞按1:4( 1:10至1:4之間）的比例混合在一起，離屯、，eOOrpm，3min;棄 上清。輕輕彈擊離屯、管底，使細胞沉淀略松動。Imin內緩慢加入37 °C預熱好的0.6ml 50 % PEG溶液，邊加邊輕微搖動和叩擊。加完后靜置lminD37°C預熱好的不完全培養液10ml W終 止陽G作用，邊滴邊叩擊并旋轉離屯、管，勻速加入，加完后靜置2min。離屯、，80化pm，5min，棄 上清;再用PBS或不完全培養液洗涂2次，W去除PEG。
[0055] 洗涂完后棄上清，用lOmlHAT選擇培養液重懸細胞。上述細胞加到已有飼養細胞層 的96孔板內（用的是之前制備的巨隧細胞板，先將孔中的液體吸出不要，再用不完全培養液 洗涂一次，吸出液體），每孔加 lOOul;將培養板置C〇2培養箱中培養。4個小時之后再向孔中 加入含HAT的完全培養液（19.6ml 10 %完全培養液+0.4mlHAT)，每孔加 lOOul;將培養板置 C〇2培養箱中培養。
[0化6] 1.3.6選擇培養
[0057] (1)融合培養的第四天半液法換HAT培養液:用加樣槍將96孔板中的上清液每孔吸 取lOOul，棄掉，再加入新的每孔lOOulHAT培養液化AT培養液配制為：10 %的完全培養液： HAT = 1:50 )，每塊板子需要在10ml完全培養液中加入200U1 50 X HAT。
[0058] (2)融合培養的第屯天半液法換HT培養液：用加樣槍將96孔板中的上清液每孔吸 取lOOul，棄掉，再加入新的每孔lOOu化T培養液化T培養液的配制為：10%的完全培養液:HT =1:50)，每塊板子需要在10ml完全培養液中加入200ul 50 XHT。
[0化9] 1.3.7陽性克隆篩選
[0060]在培養7天左右可見孔內明顯的克隆細胞，待克隆細胞長得足夠多時(大概在第12 天左右），可吸取培養液檢測其有無分泌抗體。
[0061 ] (1)先將之前包被好的相應的化ISA(包被FS地-1，包被濃度為化g/ml)板子從冰箱 拿出讓其恢復室溫，再向板中加入要檢測的培養液lOOul每一孔，兩孔做陰陽性對照，陰性 對照用10%的培養液，陽性對照用稀釋10000倍的血清(融合前小鼠眼眶采血的血清）。
[0062] (2)解育:用封板膜封板后置37 °C解育箱中解育1小時。
[0063 ] (3)洗涂:小屯、掲掉封板膜，洗涂4遍，最后盡量扣干水分。
[0064] (4)加雙抗:雙抗稀釋10000倍，50ul每孔。
[0065] (5)解育：用封板膜封板后置37 °C解育30分鐘。
[0066] (6)洗涂:小屯、掲掉封板膜，洗涂4遍，最后盡量扣干水分。
[0067] (7)顯色:每孔加顯色劑TMBlOOul，輕輕振蕩混勻，解育箱顯色大概lOmin。
[0068] (8)比色測定:每孔加終止液50ul (終止液=21.5ml的濃硫酸定容至200ml)，輕輕 振蕩混勻，設定酶標儀波長為450nm，測定各孔值。
[0069] 選取陽性結果高者(至少為陰性對照的4倍），作為陽性克隆孔。
[0070] 1.3.7有限稀釋法篩選抗大熊貓!^地亞基單克隆抗體雜交瘤細胞株
[0071 ] (1)陽性孔細胞的計數:將篩選得到的陽性克隆孔孔可做有限稀釋。先將孔中的細 胞轉移到15ml的離屯、管中（邊吹打邊旋轉，使細胞懸浮），再補加10%的完全培養液至2ml; 再用計數板計數，計數之后取只含1000個細胞的細胞液進行下一步實驗（由于1個孔只需要 一個細胞，96孔板一板就需要大約100個細胞，10板就是1000個細胞）。
[0072] (2)將細胞液加入200ml完全培養液中，混勻，96孔板加樣，200ul/孔，共十塊96孔 板。
[0073] (3)最后將培養板置C02培養箱中培養。
[0074] (4)培養4-5天后，在倒置顯微鏡上可見到小的細胞克隆，觀察細胞的生長情況，記 錄單個細胞生長聚集的孔。
[0075] (5)培養第5天給有記錄單個細胞生長聚集的孔進行換液，加10%完全培養液 lOOuV 孔。
[0076] (6)第8-9天時，肉眼可見細胞克隆，及時進行抗體檢測，將由單個細胞生長聚集的 孔并且生長情況比較好的孔進行培養液的檢測化LSIA檢測），陽性強的孔即為抗大熊貓FSH 0亞基單克隆抗體雜交瘤細胞株。本發明最終篩選得到一株抗大熊貓FS冊亞基單克隆抗體 雜交瘤細胞株09199。
[0077] 1.3.8亞型鑒定
[007引 使用Pierce Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit 37503試劑盒進行亞型鑒 定。
[0079]準備工作：將試劑盒中TBS溶于500ml雙蒸水中，用于稀釋樣品，870ml雙蒸水與 30ml 30X Wash Buffer混勻，用于洗板，根據所做樣品的量確定需要多少條板子，其余放回4 °(：冰箱保存，準備450ul的樣品稀釋液，吸取20ul的細胞培養液加入980ul的TBS中混勻。
[0080] 實驗步驟:將板子平衡到室溫，加入待測樣品到每孔，50ul/孔，每個樣需加8孔即 一條，加入50ul/孔的Goat Anti-Mouse IgG+IgA+IgM皿P，輕柔的晃動板子混勻蓋上封板 膜，室溫解育一個小時，洗板4次，扣干水分，加入75ul/孔的TMB顯色液顯色，將會看到孔內 液體變成藍色，顯色5-15min之后加入75ul/孔的終止液終止反應，液體由藍色變為黃色。經 鑒定篩選所得到的抗大熊貓FS地亞基單克隆抗體雜交瘤細胞株09199所分泌的抗體亞型為 IgGl 型。
[0081] 1.3.9單克隆抗體的擴大培養及純化，濃縮。
[0082] (1)批量培養:將進行了亞型鑒定，結果為單抗的細胞孔轉移到24孔板中地旋轉 邊吹打，使細胞懸浮，進行完全轉移)培養，并加600ul的10 %完全培養液培養。
[0083] (2)觀察細胞的生長情況，長得比較多之后進行效價測定，效價高的細胞進行轉 移，轉移到小的培養瓶中培養(先將24孔板中的細胞吹打使細胞懸浮，在用加樣槍將細胞轉 移到培養瓶中，補加10%的完全培養液7ml)。
[0084] (3)觀察細胞生長情況，長得比較好之后再轉移至大的培養瓶中培養。一個小的培 養瓶分別轉移兩個大的培養瓶中進行培養(細胞傳代）。
[0085] (4)可多傳幾個培養瓶培養，凍存一部分細胞，再拿培養液進行抗體過柱純化。所 用柱子為所用填料為Pierce Protein G Agarose,并用lOOOOkda超濾管濃縮純化過的抗大 熊貓FS地單克隆抗體，-20度保存備用。
[0086] 1.3.10單克隆抗體細胞株凍存
[0087] 將鑒定的抗大熊貓FS冊亞基單克隆抗體雜交瘤細胞株09199培養穩定后，將培養 瓶中的細胞吹打使細胞懸浮在培養液中（細胞一般懸浮在培養液中或貼壁生長），在將細胞 轉移至15ml的離屯、管中。離屯、，1000轉/5分鐘。用PBS洗涂兩次：先將離屯、管中的上清液吸 出，棄掉，加 PBS，混勻，離屯、1000轉/5分鐘，最后重復一次。最后再用加樣槍吸出上清液，再 向細胞中加入適量凍存液(凍存液=5ml血清+4mlDMEM+lmlDMS0，顛倒混勻，過濾備用），混 勻。最后加入凍存管中，每管1ml細胞液。放入凍存盒，先放-80°C過夜，再將細胞株B10放入 液氮中長期保存備用。
[0088] 實施例2
[0089] 抗大熊貓FS地亞基單克隆抗體在western blot技術中的應用。
[0090] 1.目的組織總蛋白的提取
[0091] 應用蛋白提取試劑盒:C510004-0020,生工生物工程(上海)股份有限公司提供，提 取成年大熊貓睪丸和卵巢組織總蛋白，并通過BCA法對總蛋白濃度進行測定。
[0092] 2制膠:制備聚丙締酷胺凝膠，濃縮膠5%，分離膠12%。
[0093] 4.制樣:蛋白上樣量為80ug
[0094] 5.電泳:濃縮膠80V，30min;分離膠 120V，90min。
[0095] 6.轉膜:250mA，40min。
[0096] 7.封閉：5%脫脂乳，37°C緩慢震蕩化。
[0097] 8.解育一抗:雜交瘤細胞株09199(2)、C12(3)抗體均1:500稀釋，4°C緩慢振蕩過 夜，次日37°C復溫化。
[009引 9.解育二抗：1:8000稀釋，37 °C解育化。
[0099] 10. E 化曝光。
[0100] 應用結果
[0101] 1.細胞蛋白濃度
[0102] 際準曲純
[0103]
[0104] 標準曲線圖如圖1所示。
[0105] (2)蛋白濃度
[0106]
[0107] (3)Weste;rn-blot檢測結果如圖2所示。
[0108] 本發明開發的抗大熊貓FS冊亞基單克隆抗體，能準備識別目標蛋白FSH，為為FSH 蛋白的定位和組織表達信息，及利用FSH高特異性的單克隆抗體對FSH受體的配體、括抗物、 抗括抗物進行深入研究，為特異性配體、括抗物、抗括抗物的發現創造條件。
[0109] W上所述實施例僅表達了本申請的【具體實施方式】，其描述較為具體和詳細，但并 不能因此而理解為對本申請保護范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員 來說，在不脫離本申請技術方案構思的前提下，還可W做出若干變形和改進，運些都屬于本 申請的保護范圍。
【主權項】
1. 抗大熊貓FSHf3亞基單克隆抗體雜交瘤細胞株09199，保藏編號:CCTCC NO: C2016144。2. 根據權利要求1所述的抗大熊貓FSffi亞基單克隆抗體雜交瘤細胞株09199用于產生 抗大熊貓FSffi亞基單克隆抗體。3. 抗大熊貓FSK3亞基單克隆抗體，其特征在于，由雜交瘤細胞株09199產生，亞型為 IgGl〇4. 根據權利要求3所述的抗大熊貓FSHP亞基單克隆抗體在western blot技術中的應 用。5. 抗大熊貓FSH0亞基單克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟如下： (1) 設計大熊貓FSH0特異序列如SEQ ID NO: 1所示，并與KLH偶聯，作為生產特異性抗體 的免疫原FSffi-KLH; (2) 以步驟(1)制備的免疫原FSHi3-KLH免疫小鼠； (3) 細胞融和得到抗大熊貓FSH0亞基單克隆抗體雜交瘤細胞株09199; (4) 擴大培養得到抗大熊貓FSH0亞基單克隆抗體。
【文檔編號】C12R1/91GK106047820SQ201610704652
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月22日
【發明人】蔡開來, 侯蓉, 葉尚勉, 張志和, 王涓, 劉玉良, 羅娌, 蔡志剛
【申請人】成都大熊貓繁育研究基地