Car?t細胞及其制備方法與應用
【專利摘要】本發明公開了一種CAR?T細胞及其制備方法與應用，其中，所述CAR?T細胞的CAR包括胞膜外抗原結合區、鉸鏈區和胞內信號傳導區，所述胞膜外抗原結合區為用于結合HER2蛋白的chA21scFv；所述胞內信號傳導區為CD28?X?ITAM，其中，所述X為ICOS、CD137、CD134、CD80或者CD86共刺激分子。本發明CAR?T細胞的chA21scFv能夠表達抗HER2單克隆抗體，且以HER2蛋白為靶向直接識別并結合腫瘤細胞表面高表達的HER2蛋白，從而活化T細胞而分泌殺傷表達HER2蛋白的腫瘤細胞的細胞因子。
【專利說明】
CAR-T細胞及其制備方法與應用
技術領域
[0001] 本發明設及T淋己細胞技術領域，尤其設及一種CAR-T細胞及其制備方法與應用。
【背景技術】
[0002] CAR-T細胞(Qiimeric antigen receptor T cell，嵌合抗原受體T細胞）即是表達 嵌合抗原受體修飾的T細胞，而CAR-T細胞的嵌合抗原受體（Chimeric antigen receptor， CAR)包括胞膜外抗原結合區、較鏈區和胞內信號傳導區S部分構成。其中，胞膜外抗原結合 區是一段單鏈可變區結構域(single chain Fv domain，scFv)，具有特異性識別并結合TAA (Uimor-associated antigen，腫瘤相關性抗原）的功能。scFv的構成是將單克隆抗體的重 鏈可變區（the variable region of heavy chain, VH)和輕鏈可變區（the variable region of li曲t chain,化）用一可彎曲的多膚接頭化inker)將VH和化連接起來，構成￥護 Linker-VU^VkLinker-VH。較鏈區通常是由免疫球蛋白超家族組成，比如CD8、CD28和IgG。 胞內信號傳導區包括共刺激分子kostimulatory molecule,CM)和免疫受體酪氨酸活化基 序（immunorec邱tor tyrosine-based activation motifs, ITAM)，其中，CM通常為CD28， ITAM通常為CD3C或化eRI 丫。表達CAR的T細胞可通過scFv直接識別并結合腫瘤細胞表面的 TAA，CA時尋信號傳入T細胞內，激活T細胞分泌細胞因子包括穿孔素、顆粒酶、INF- 丫、TNF-a 等，從而發揮殺傷腫瘤細胞作用。因此，CAR-T細胞是MHC非限制性的。CAR-T細胞將抗體-抗 原特異性結合能力W及T細胞介導的殺傷功能結合于一體，是免疫抗腫瘤治療的重要方法。 嵌合性抗原受體方法應用的關鍵是確定一種腫瘤相關性抗原，在腫瘤細胞表面高表達，而 在正常組織中無表達或者低表達。
[0003] 原癌基因人上皮生長因子受體2化uman邱idermal growth factor receptor 2， 化r-2/neu)又稱肥R2或c-erbB-2基因，在多種腫瘤的發病及臨床進程中發揮重要作用，體 外與動物實驗己明確顯示化r-2/neu基因擴增、蛋白過度表達在致瘤轉化和腫瘤發展中起 著關鍵作用。研究證實：30% W上的人類腫瘤組織中，如乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、輸卵 管癌、宮頸癌、前列腺癌、胃癌、唾液腺癌、舌癌、頭頸部鱗癌、非小細胞性肺癌等，均伴有 Her-2/neu基因的擴增及pl85蛋白的過度表達，而正常組織中pl85蛋白為陰性或微量表達。 而在乳腺癌中，大約有1/3的病人過表達肥R2蛋白。過表達皿R2蛋白使腫瘤的侵襲性更強， 是乳腺癌病人預后不良的獨立的危險因素。盡管抗肥R2單克隆抗體(如曲妥株單抗)在臨床 的應用使部分病人獲益，但是其價格昂貴，很大程度上限制了其大規模臨床應用。皿R2蛋白 位于細胞表面，容易被抗體識別，因此，皿R2蛋白可作為CAR-T細胞抗腫瘤治療的一個理想 祀點。
[0004] 然而，現有技術中并未提供表達抗皿R2單克隆抗體的CAR-T細胞，即現有的CAR-T 細胞并不能W皿R2蛋白為祀向而直接識別并結合肥R2蛋白，導致CAR無法將信號傳入T細胞 內，而無法分泌殺傷高表達肥R2蛋白的腫瘤細胞的細胞因子。
【發明內容】
[0005] 本發明的主要目的在于提供一種CAR-T細胞，旨在表達抗皿R2單克隆抗體，而W HER2蛋白為祀向直接識別并結合腫瘤細胞表面高表達的HER2蛋白。
[0006] 為實現上述目的，本發明提供一種CAR-T細胞，所述CAR-T細胞的CAR包括胞膜外抗 原結合區、較鏈區和胞內信號傳導區，所述胞膜外抗原結合區為用于結合HER2蛋白的 cM21scFv;所述胞內信號傳導區為CD28-X-ITAM，其中，所述X為10)5、〔0137、〔0134、〔080或 者CD86共刺激分子。
[0007] 優選地，所述X為IC0S共刺激分子。
[000引本發明還提供一種CAR-T細胞的制備方法，包括步驟如下：
[0009] 構建CAR表達載體，其中，所述CAR表達載體的CAR包括胞膜外抗原結合區、較鏈區 和胞內信號傳導區，所述胞膜外抗原結合區為用于結合HER2蛋白的chA21scFv，所述胞內信 號傳導區為CD28-X-ITAM，所述X為10)5、〔0137、〔0134、〔080或者〔086共刺激分子；
[0010] 包裝所述CAR表達載體，而制得感染混合物；
[0011] 將所述感染混合物感染T細胞，而制得CAR-T細胞。
[0012] 優選地，所述構建CAR表達載體的過程中，包括步驟如下：
[0013] 獲取所述chA21scFv的基因片段、所述較鏈區的基因片段、所述CD28的基因片段、 所述X的基因片段W及所述ITAM的基因片段；
[0014] 提供引導鏈，基因融合所述引導鏈與所述chA21scFv的基因片段，而形成引導鏈- chA21scFv；
[0015] 基因融合所述較鏈區的基因片段、所述CD28的基因片段、所述X的基因片段和所述 ITAM的基因片段，而形成較鏈區-CD28-X-ITAM;
[0016] 基因融合所述引導鏈-chA21scFv和所述較鏈區-CD28-X-ITAM，而形成引導鏈- cM21S cFv-較鏈區-CD28-X-ITAM;
[0017] 將所述引導鏈-cM21scFv-較鏈區-CD28-X-ITAM接入載體，而獲得CAR表達載體。
[0018] 優選地，所述獲取所述chA21scFv的基因片段、所述較鏈區的基因片段、所述CD28 的基因片段、所述X的基因片段W及所述ITAM的基因片段的過程中，包括步驟如下：
[0019] 獲取并激活PMBCs;
[0020] 提取所述PMBCs的mRNA并反轉錄為cDNA;
[0021] 分別提供所述較鏈區的引物、所述CD28的引物、所述X的引物和所述ITAM的引物， 且均W所述PMBCs的cDNA為模板，分別進行PCR擴增，而獲得所述較鏈區的基因片段、所述 CD28的基因片段、所述X的基因片段W及所述ITAM的基因片段；
[0022] 提供所述chA21scFv的模板DNA和所述chA21scFv的引物，并進行PCR擴增，而獲得 所述cM21scFv的基因片段。
[0023] 優選地，所述CAR表達載體為CAR表達病毒質粒。
[0024] 優選地，所述包裝所述CAR表達載體的過程中，包括步驟如下：
[0025] 將12~20yg的包裝質粒與12~20yg的所述CAR表達病毒質粒通過培養基共混，而 獲得質粒混合物；
[0026] 將所述質粒混合物與35~45iU的脂質體通過培養基共混，而獲得混合液；
[0027] 將所述混合液轉染真核細胞，而獲得所述真核細胞的上清液；
[00%]濃縮所述上清液，而制得感染混合物。
[0029] 優選地，所述將所述感染混合物感染T細胞的過程中，包括步驟如下：
[0030] 將0.8~2ml的感染混合物加入(6~10) X105個T細胞中而進行感染；
[0031 ]將凝聚胺加入所述T細胞中，使所述凝聚胺的終濃度為10~20μg/ml;
[0032] 培養擴增感染后的T細胞，而獲得CAR-T細胞。
[0033] 優選地，所述X為IC0S共刺激分子。
[0034] 本發明還提供一種如上所述的CAR-T細胞在治療乳腺癌的藥物上的應用。
[0035] 本發明技術方案，通過表達chA21scFv而識別和結合腫瘤細胞表面高表達的皿R2 蛋白，并通過胞內信號傳導區將信號傳入T細胞，從而活化T細胞，促進T細胞分泌細胞因子， 該細胞因子進而可W殺傷高表達皿R2蛋白的腫瘤細胞。而且，胞內信號傳導區整合了CD28 共刺激分子W及X共刺激分子，可使T細胞持續活化增殖，細胞因子持續分泌，增強殺傷腫瘤 細胞作用。
【附圖說明】
[0036] 為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可W 根據運些附圖示出的內容獲得其他的附圖。
[0037] 圖1為本發明實施例1制備的CAR表達載體的基因結構圖；
[003引圖2為化ISA法檢測本發明實施例1制備的CAR-T細胞及現有的NT-T細胞分別與 肥R2+/-腫瘤細胞的共培養后的IFN- 丫分泌量的柱狀圖；
[0039] 圖3為化ISA法檢測本發明實施例1制備的CAR-T細胞及現有的NT-T細胞分別與 肥R2+/-腫瘤細胞的共培養后的IL-2分泌量的柱狀圖；
[0040] 圖4為ELISA法檢測本發明實施例1制備的CAR-T細胞的肥R2特異性的統計圖；
[0041] 圖5為siCr釋放試驗檢測本發明實施例1制備的CAR-T細胞對乳腺癌細胞的特異性 殺傷作用的統計圖。
【具體實施方式】
[0042] 下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明的一部分實施例，而不是全部的實施例。基 于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其 他實施例，都屬于本發明保護的范圍。
[00創本發明提供一種CAR-T細胞，其中，該CAR-T細胞的CAR包括胞膜外抗原結合區、較 鏈區和胞內信號傳導區，胞膜外抗原結合區為用于結合HER2蛋白的chA21scFv;胞內信號傳 導區為 CD28-X-ITAM，其中，X為 10)5、〔0137、〔0134、〔080或者〔086共刺激分子。
[0044] 本發明CAR-T細胞通過表達chA21scFv而識別和結合腫瘤細胞表面高表達的皿R2 蛋白，并通過胞內信號傳導區將信號傳入T細胞，從而活化T細胞，促進T細胞分泌細胞因子， 該細胞因子進而可W殺傷高表達皿R2蛋白的腫瘤細胞。而且，胞內信號傳導區整合了CD28 共刺激分子W及X共刺激分子，可使T細胞持續活化增殖，細胞因子持續分泌，增強殺傷腫瘤 細胞作用。
[0045] 需要說明的是，在該CAR的結構中，chA21為采用表面包埋法（surface epitope masking method，SEM)生產的人源化單克隆抗體A21，是一種抗化bB2抗體，其具有很強的結 合特異性和抑瘤活性，chA21可特異性識別肥R2胞外區C-端的第I結構域，遠離皿R2受體二 聚化功能位，因此，本發明W抗肥R2的chA21為基礎構建CAR-T細胞;chA21S cFv由cM21單克 隆抗體的重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域通過多膚接頭連接形成，由于不少供應商或科 研機構已經成功合成chA21scFv，且合成方法也為現有技術，故該chA21scFv可W直接由供 應商或科研機構提供。較鏈區可W是CD3、CD4、CD8、或者CD28，具體視實際情況而定。胞內信 號傳導區的共刺激分子X可為10)5、〔0137、〔0134、〔080或者〔086共刺激分子，均可起到傳導 信號的作用，實現T細胞持續活化增殖，細胞因子持續分泌，增強殺傷腫瘤細胞的目的;胞內 信號傳導區的ITAM通常為CD3C或者化eRI 丫。
[0046] 本發明還提供一種CAR-T細胞的制備方法，包括步驟如下：
[0047] S1、構建CAR表達載體，其中，CAR表達載體的CAR包括胞膜外抗原結合區、較鏈區和 胞內信號傳導區，胞膜外抗原結合區為用于結合皿R2蛋白的chA21scFv，胞內信號傳導區為 CD28-X-口AM，X為 IC0S、CD137、CD134、CD80 或者 CD86 共刺激分子；
[004引 S2、包裝CAR表達載體，而制得感染混合物；
[0049 ] S3、將感染混合物感染T細胞，而制得CAR-T細胞。
[0050]本發明CAR-T細胞的制備方法通過構建CAR表達載體，并通過包裝、轉染的方式將 CAR表達載體接入T細胞中，由于該CAR表達載體表達抗皿R2單克隆chA21，從而可W識別和 結合腫瘤細胞表面高表達的肥R2蛋白，并通過胞內信號傳導區將信號傳入T細胞，從而T細 胞激活，促進T細胞分泌細胞因子，該細胞因子進而可W殺傷高表達皿R2蛋白的腫瘤細胞。 該制備方法高效、簡單、成本低。
[0051 ] 進一步地，在步驟S1中，構建CAR表達載體的過程中，具體包括步驟如下：
[0052] S10、獲取chA21scFv的基因片段、較鏈區的基因片段、CD28的基因片段、X的基因片 段W及ITAM的基因片段；
[0053] S11、提供引導鏈，基因融合引導鏈與chA21scFv的基因片段，而形成引導鏈- chA21scFv；
[0054] S12、基因融合較鏈區的基因片段、CD28的基因片段、X的基因片段和ITAM的基因片 段，而形成較鏈區-CD28-X-ITAM;
[005引 S13、基因融合引導鏈-chA21scFv和較鏈區-CD28-X-ITAM，而形成引導鏈- cM21S cFv-較鏈區-CD28-X-ITAM;
[0056 ] S14、將引導鏈-cM21S cF V-較鏈區-CD28-X-1TAM接入載體，而獲得CAR表達載體。
[0057] 通過PCR擴增技術和重疊 PCR技術，將chA21scFv的基因片段、較鏈區的基因片段、 CD28的基因片段、X的基因片段W及ITAM的基因片段進行基因融合，而構建CAR表達載體，其 構建方式高效、簡單。需要說明的是，該引導鏈優選為人CD8a引導鏈，人CD8a引導鏈可W從 人CD8a細胞中提取，也可W從相應的供應商中獲取，而人CD8a引導鏈的引物可由相應的供 應商提供。
[005引進一步地，步驟S10具體包括步驟如下：
[0059] S100、獲取并激活PMBCs(pe;ripheral blood mononuclear cells,外周血單核細 胞)；
[0060] SlOl、提取 PMBCs 的 mRNA 并反轉錄為 cDNA;
[00川 S10 2、分別提供較鏈區的引物、CD28的引物、X的引物和I TAM的引物，且均w PMBCs 的cDNA為模板，分別進行PCR擴增，而獲得較鏈區的基因片段、CD28的基因片段、X的基因片 段W及ITAM的基因片段；
[0062] S103、提供chA21scFv的模板DNA和chA21scFv的引物，并進行PCR擴增，而獲得 cM21scFv的基因片段。
[0063] 通過PMBCs獲得T細胞的mRNA,然后將mRNA反轉錄為cDNA，從而為不同種類的T細胞 的基因片段的擴增提供了模板，同時通過現有的chA21scFv的模板DNA和chA21scFv的引物 對cM21scFv進行PCR擴增，顯然，上述PCR擴增高效、簡便，有利于提供CAR表達載體的構建。
[0064] 進一步地，CAR表達載體為CAR表達病毒質粒，換而言之，步驟S14中，將引導鏈- chA21scFv-較鏈區-CD28-X-ITAM接入了病毒載體，而形成了CAR表達病毒質粒，其中，該病 毒載體可W是逆轉錄病毒或者慢病毒，并通過質粒的形式存在。
[0065] 進一步地，在步驟S2中，包裝CAR表達載體的過程中，具體包括步驟如下：
[0066] S20、將12~20yg的包裝質粒與12~20yg的CAR表達病毒質粒通過培養基共混，而 獲得質粒混合物；
[0067] S21、將質粒混合物與35~45iil的脂質體通過培養基共混，而獲得混合液；
[0068] S22、將混合液轉染真核細胞，而獲得真核細胞的上清液；
[0069] S23、濃縮上清液，而制得感染混合物。
[0070] 通過對CAR表達載體的包裝，可W提高為CAR表達病毒質粒的感染效率，從而提高 CAR-T細胞的制備效率。
[0071 ] 進一步地，步驟S3中，將感染混合物感染T細胞的過程中，包括步驟如下：
[0072] S30、將0.8~2ml的感染混合物加入(6~10)X105個T細胞中而進行感染；
[0073] S31、將凝聚胺加入T細胞中，使凝聚胺的終濃度為10~20iig/ml;
[0074] S32、培養擴增感染后的T細胞，而獲得CAR-T細胞。
[0075] 該凝聚胺轉染劑可W提高T細胞的感染效率，實現對T細胞的修飾。
[0076] 本發明還提供一種如上所述的CAR-T細胞在治療乳腺癌的藥物上的應用。
[0077] 由于CAR-T細胞通過表達chA21scFv而識別和結合腫瘤細胞表面高表達的皿R2蛋 白，并通過胞內信號傳導區將信號傳入T細胞，從而活化T細胞，促進T細胞分泌細胞因子，該 細胞因子進而可W殺傷高表達皿R2蛋白的腫瘤細胞，因此，該CAR-T細胞應用于治療乳腺癌 時，由于乳腺癌細胞的表面高度表達肥R2蛋白，可W高效殺傷乳腺癌細胞。
[0078] 現通過實施例1對本發明CAR-T細胞及其制備方法與應用做進一步解釋和說明，在 該CAR-T細胞中，CAR的胞內信號傳導區的X共刺激分子優選為IC0S共刺激分子，CAR-T細胞 具體構建方式參見如下詳述的內容。同理，根據下述的構建方式，可W構建X共刺激分子為 其他共刺激分子時的CAR-T細胞，至于X共刺激分子的引物序列可W從NCBI的GenBank中查 找獲得，X共刺激分子的引物可W相應的商家中購買獲得，也可W自行設計。
[0079] 實施例1
[0080] -、本發明實施例所用到的材料及試劑
[0081] 1、人外周血單核細胞
[0082] =位健康志愿者的外周血單核細胞來源于北京大學深圳醫院腫瘤介入科。
[0083] 2、細胞系
[0084] 人乳腺癌細胞株5邸1?3^470，]\?^-7，]\?^-]\?-231和卵巢癌細胞株51(0￥3,0￥〔4尺3， A1847和A2780, W及肥R2陰性的腫瘤細胞株MDA-MB-468(購買于ATCCKTC-1是HPV-16轉染 的小鼠肺癌細胞，用來作為人肥R2陰性表達的對照，也購買于ATCCd293T細胞購買于ATCC。
[0085] 3、試劑
[0086] (1 )RPMI-1640培養基（Invitrogen 公司）
[0087] (2)滅活胎牛血清（Invitrogen公司）
[0088] (3)青一鏈霉素 lOOOOU/ml lOOOOIU/mKlnvitrogen公司）
[0089] (4)抗CD3/抗CD28磁珠 （Inv i trogen公司）
[0090] (5)重組人白介素-2(比-2)(Peprol'ech公司）
[0091 ] (6)DMS0(二甲基亞諷）（Invitrogen 公司）
[0092] (7)0.25% 膜酶（Invitrogen 公司）
[0093] (8化TS1077淋己細胞分層液(上海研謹生物科技有限公司）
[0094] (9 )mRNA 提取試劑盒（Invi trogen公司）
[00M] (10)反轉錄試劑盒（Invitrogen公司）
[0096] (11 )PCR 試劑盒（Invitrogen 公司）
[0097] (12)PCR產物純化試劑盒(Qiagen公司）
[009引 （13)含有人源化抗肥R2的cM21 scFv的質粒陽E14-CM21 (中國科技大學提供）
[0099] (14)人CD8a 引導鏈（CDSaleader鏈）（hkara公司）
[0100] (15)人CD8a引導鏈的正向引物AF (Takara公司）
[0101] (16) CD8a較鏈區（CDSahinge)的正向引物CF和反向引物CR( Takara公司）
[0102] (17) CD28的正向引物DF和反向引物DR (Takara公司）
[0103] (18) I COS的正向引物GF和反向引物GR (Takara公司）
[0104] (19)CD3C的正向引物EF和反向引物邸(Takara公司）
[0105] (20)cM21scFv的正向引物BF和反向引物BR^akara公司）
[0106] (21)口10.6質粒、口101^邑/口質粒、1?6￥表達質粒(〇1曰邑6]1公司）
[0107] (22)F]；TC標記的山羊抗鼠 F(ab'）2抗體(Jackson ImmunoResearch公司）
[0108] (23)APC CY7標記的抗人-CD3,陽標記的抗人-CD45，FITC抗人-CD4,陽抗人-CD4， APC抗人-CD8，陽抗人CD45R0，APC抗人CD6化抗體(B i 01 egend公司）
[0109] (24) IFN- 丫化ISA試劑盒(Biolegend公司）
[0110] (25)比-沈 LISA 試劑盒(Biolegend 公司）
[0111] (26)肥R2-FC嵌合蛋白（R&D Systems公司）
[0112] (27)CD19-FC嵌合蛋白（S陽邸BioSystems公司）
[0113] (28)銘酸鋼(Na25iCr〇4)(D證ont 肥N公司）
[0114] (29)FITC 兔抗人肥 R2 抗體(Clone24D2，Biolegend 公司）
[0115] (30)脂質體2000( Invi trogen公司）
[0116] (31)凝聚胺(Sigma 公司）
[0117] 4、引物序列表
[011引 表一
[0119]
[0120] 二、本實施例的技術方案
[0121] ( -）、外周血單核細胞的分離與激活
[0122] 1、人外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的分離
[0123] (1)抗凝血管抽取健康志愿者的外周血15ml;
[0124] (2)向該抗凝血管中加入等體積的PBS，輕輕吹打成細胞懸液30ml;
[01巧](3)另取兩支50ml離屯、管，向一離屯、管加入15ml的LTS1077淋己細胞分層液;然后， 用吸管吸取15ml的細胞懸液，在距離LTS1077淋己細胞分層液上方1cm處將細胞懸液小屯、而 緩慢的加入，使細胞懸液重疊于LTS1077淋己細胞分層液上，200化pm離屯、20min;
[0126] (4)取出離屯、后的離屯、管，移液管吸去最上層的血漿，移液槍吸取血漿層下的單個 核細胞置入另一離屯、管中；然后，加入15ml的PBS洗涂，輕輕吹打均勻后再次離屯、，150化pm， lOmin，去掉上清;共洗涂3次；
[0127] (5)向去掉上清后的離屯、管內加入含10%滅活胎牛血清、lOOU/ml青一鏈霉素、 lOOU/ml IL-2的RPMI-1640培養基，放置于37°C，5%C02的細胞培養箱中培養，而分離獲得 PBMC細胞制劑。
[0128] 2、人外周血單核細胞的激活
[0129] (1)取步驟1獲得的PBMC細胞制劑，于24孔板中種植IxlO6個PBMC細胞（1 X lOVml);
[0130] (2)按照免疫磁珠分選試劑盒的說明書的方法，用PBS將包被抗CD3/CD28的磁珠洗 3遍；
[0131] (3)將磁珠按3:1 (磁珠:細胞)比例加入PBMC細胞中，放置37°C、5 %C化培養箱中培 養過夜；
[0132] (4)細胞激活12~24小時后，離屯、，收取被激活的人外周血單核細胞，用作提mRNA 并反轉錄為cDNA。
[0133] (二）、提取激活的外周血單核細胞的mRNA并反轉錄為cDNA
[0134] 1、外周血單核細胞的mRNA的提取
[013引（1)取出被激活后的人外周血單核細胞1.5 X106個，用PBS沖洗2遍；
[0136] (2)去掉上清后，向細胞沉淀中加入1.5ml的化izol，吹打成均勻細胞懸浮液；
[0137] (3)采用1ml注射器來回抽吸細胞懸浮液，W剪切基因組DNA，然后用注射器直接將 樣品轉移到一新的1.5ml的EP管中；
[0138] (4)向EP管中加入25化1的氯仿，劇烈震蕩30sec，12000巧m離屯、5min;
[0139] (5)將離屯、后產生的上清移至另一新的1.5ml的Ep管中，并加入等體積的異丙醇， 室溫放置5min;
[0140] (6) 12000巧m離屯、5min，吸走上清液；
[0141] (7)向吸走上清液后的Ep管中加入70 %的乙醇750iil，不需吹打，12000巧m離屯、 2min;
[0142] (8)盡可能徹底吸走離屯、后產生的上清，室溫干燥使乙醇揮發，而形成沉淀；
[0143] (9)向該沉淀加入60]il的DEPC(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙醋）水，而溶 解該沉淀，即溶解外周血單核細胞的mRNA;
[0144] (10)取溶解的mRNA化1，加至1ml的DEPC水中，采用紫外分光光度計測量260nm和 280nm 的吸光度值:00260/280 = 1.9~2.0;按10D = 40yg的 mRNA 計算 mRNA 的產率，0D260/280 在1.9~2.0視為提取的mRNA純度很高；
[0145] (11)用提取的RNA產物來進行下一步的RT反應。
[0146] 2、RT(Reverse Transcription,反轉錄）反應
[0147] (1)將步驟1提取的mRNA與其他試劑構成如下的反應體系：
[0149」 （2)RT反應余件：室溫，lOmin ; 42"C，Ih ; 99"C，5min火巧AMV Reverse Transcriptase;進而反轉錄獲得PMBCs的cDNA;
[0150] (3)將反轉錄得到的PMBCs的cDNA置于-80°C冰箱保存，備用。
[0151] (;)、祀向肥R2的嵌合性抗原受體(CAR)載體的構建
[0152] 1、PCR 擴增。114213。尸￥、〔08地111邑6、〔028、10)5和〔03(
[0153] 1.UPCR 擴增 cM21scFv
[0154] a、提供cM21scFv的DM模板及cM21scFv的引物：
[0155] cM21scFv的DNA模板由中國科技大學提供的質粒陽E14-CM21獲得；chA21scFv的 正向引物BF和反向引物BR由化kara公司提供，其引物系列具體見上表一）；
[0156] b、按照如下的PCR反應體系和PCR反應條件獲得PCR產物；
[0157] PCR反應體系： 「015只 1
[0161] C、電泳
[0162] 配制瓊脂糖凝膠(20g/L):稱取0.6g的瓊脂糖凝膠粉，加入30ml的TAE電泳緩沖液， 混勻后放入微波爐中加熱45s，加入lul的邸液，混勻后灌注，室溫冷卻；向電泳槽中加入適 量TAE電泳緩沖液，用化2000作為DNA Marker，向樣本孔中加入加1的上述PCR產物，調節電 泳儀電壓為90mV，電泳半小時；
[0163] d、結果觀察
[0164] 利用數碼凝膠圖像采集與分析系統進行掃描分析可知：上述PCR產物為chA21scFv 基因片段；
[01化]e、PCR產物回收
[0166] (1)將電泳后余下的PCR產物轉移至2ml的EP管中，加入300ul的PB緩沖液，充分混 勻；
[0167] (2)吸附：QIAquick柱子鏈接2ml的EP管，將含PCR產物的PB緩沖液緩慢加入 QIAquick柱子，13000轉/分離屯、30秒；
[016引（3)洗涂:棄去EP管中的液體，向QIAquick柱子中加入800ul的陽緩沖液，13000轉/ 分離屯、30秒；
[0169] (4)棄去EP管中的液體，13000轉/分離屯、1分鐘；
[0170] (5)洗脫:將QIAquick柱子置于新的1.5ml的EP管中，向柱子中加入60ul的邸緩沖 液，13000轉/分離屯、1分鐘，棄去EP管中的液體而回收PCR產物；
[0171] (6)將回收后的PCR產物置于-20°C冰箱保存。
[0172] 1.2、PCR 擴增 CDSahinge、CD28 和 CD3C
[0173] a、提供引物W及步驟(二)制得的PBMCs的cDNA:
[0174] CDSahinge的正向引物CF和反向引物CR由化kara公司提供，其引物系列見上表一；
[0175] CD28的正向引物DF和反向引物DR由化kara公司提供，其引物系列見上表一；
[0176] IC0S的正向引物DF和反向引物DR由化kara公司提供，其引物系列見上表一；
[0177] CD3C的正向引物EF和反向引物邸由化kara公司提供，其引物系列見上表一；
[017引b、按照如下的PCR反應體系和PCR反應條件獲得PCR產物；
[0179] PCR反應體系： QAl
[i
0182 0183 0184 0185 0186 0187 123456 PCR反應條件:與PCR擴增cM21scFv的PCR反應條件相同； 2 c、PCR產物回收(與PCR擴增chA21scFv的PCR產物回收的步驟相同），進而獲得CD8a hinge/CD28/lC0S/CD3C 的 PCR 產物。 3 2、重疊 PCR而進行基因融合 4 2.1、提供 CDSaleader 鏈（CD8a 引導鏈），將 CDSaleader 鏈與 PCR 擴增后的 cM21scFv 進行基因融合，而形成CD8aleade;r-cM21scFv: 5 a、第一步PCR反應，其反應體系和反應時間如下； 6 第一步PCR反應體系：
[018 引
[0191] b、第二步PCR反應，其反應體系和反應時間如下；
[0192] 第二步PCR反應體系：向第一步PCR反應完成后的體系中加入CDSaleader鏈的正向 引物AF (其引物系列如表一所示）W及cM21S cFv的反向引物BR (其引物序列如表一所示)各 2ul；
[0193] 第二步PCR反應條件：
[0194]
[01M] e、將第二步PCR反應的PCR產物進行電泳，數碼凝膠圖像采集與分析系統進行掃描 分析，而證明第二步PCR反應的PCR產物為CD8aleader-cM21scFv;
[0196] f、第二步PCR反應的PCR產物回收(與PCR擴增chA21scFv的PCR產物回收的步驟相 同），而獲得CD8aleade;r-cM21scFv;
[0197] 2.2、將擴增后的〔08地1雌6與擴增后的〔028進行基因融合，獲得〔08地1雌6-〔028;
[0198] 將 CD8ahinge-CD28 與擴增后的 IC0S 進行基因融合，獲得 CD8ahinge-CD28-IC0S;
[0199] 將 CD8ahinge-CD28-IC0S 與擴增后的 CD3C 進行基因融合，獲得 CD8ahinge-CD28- IC0S-CD3C;
[0200] 將 CD8aleader-cM21scFv 與 CDS 址 inge-CD28-IC0S-CD3C 進行基因融合，獲得 CD8a leader-cM21scFv-CD8ahinge-CD28-IC0S-CD3C，其基因結構如圖 1 所示；
[0201] 具體方法同上，其中，CDSahinge與CD28融合過程中所添加的引物為CF，DR;CD8a hinge-CD28與IC0S融合過程中所添加的引物為CF，GR;CD8址inge-CD28-IC0S與CD3C融合過 程中所添加的引物為〔。，63;〔08日16日(16'-證4213。。￥與〔08地1叫6-〔028-10)5-〔03(融合過 程中所添加的引物為AF，ER(引物序列如表一所示）。將PCR產物進行電泳，數碼凝膠圖像采 集與分析系統進行掃描分析，最終回收PCR產物CD8aleader-chA21scFv-CD8ahinge-CD28- IC0S-CD3C。
[0202] 3、將 CD8aleader-cM21scFv-CD8ahinge-CD28-IC0S-CD3C 交由美國劍橋加基因公 司(Addgene，Camb;ridge，MA，USA)接入 pSin(慢病毒)骨架形成 pSin-chA21-28C 質粒，即 CAR 表達載體。
[0203] (四）包裝CAR表達載體(包裝pSin-cM21-28。區病毒質粒），而制得感染混合物
[0204] U293T細胞傳代培養及準備 [02化]a、293T細胞復蘇及培養
[0206] (1)細胞培養基:配置含10%滅活胎牛血清、lOOU/ml青一鏈霉素的RPMI-1640培養 基；
[0207] (2)從液氮罐取出凍存的293T細胞，迅速放入37°C水浴鍋，凍存的293T細胞融化 后，在超凈臺內將細胞懸液移入離屯、管中，加入4ml的RPMI-1640培養基，放入離屯、機中， 1000轉/分離屯、3~4分鐘；
[020引（3)棄去上清液，加入1ml配制的RPMI-1640培養基輕輕吹打成細胞懸液，移入 75cm2細胞培養瓶中，加入RPMI-1640培養基至10ml，放入37°C，5%C02的細胞培養箱中培養， 24小時后給予換液；
[0209] b、293T細胞傳代
[0210] 培養皿中的細胞布滿約80~90%時進行傳代。將舊的培養基吸走，向培養皿中加 入2~3ml的PBS沖洗1遍，吸走PBS，向培養皿中加入0.25 %的膜蛋白酶2ml，消化3~5min，注 意在倒置顯微鏡下觀察細胞形態的變化，當見到細胞回縮，形態變圓，細胞間連接間隙增大 時，向培養皿中加5ml的RPMI-1640培養基終止消化，吸管反復吹打使細胞脫落，制成細胞懸 液后，按大約1:化k例傳代培養；
[0211] c、293T細胞凍存
[0212] (1)生長狀態良好的細胞，布滿培養瓶約80~90%時可W凍存。細胞消化后吹打成 細胞懸液，移入15ml離屯、管中，放入離屯、機中，1000轉/分離屯、3~4分鐘；
[0213] (2)棄去上清液，加入含10%二甲基亞諷的滅活胎牛血清1ml，輕輕吹打成細胞懸 液，移入細胞凍存管中，做好標記，置入冰上，并迅速投入液氮罐中保存。
[0214] 2、慢病毒質粒的包裝
[0215] (1)取出凍存的293T細胞，并置于75cm2的細胞培養瓶培養;選取融合度60~70% 的293T細胞，換液后S小時后備用；
[0216] (2)將巧巾包裝質粒9]\?).6、9]\?)1^9、1?6￥及95111-證421-2化質粒按下表比例于11111 無血清無雙抗的37 °C預熱的RPMI-1640中混合均勻，室溫解育5分鐘，而獲得質粒混合物； rn9i7i
[0218] (3)將26iig的上述質粒混合物與3化1脂質體2000(質粒與脂質體2000的比率為化 g: 1.扣1)逐滴加入1ml無血清無抗生素的RPMI-1640中輕輕混合均勻，室溫解育5分鐘，而獲 得混合液；
[0219] (4)將最終的脂質體2000及質粒共混物的混合液逐滴加到293T細胞培養皿中，輕 輕混合均勻，37 °C、5 % C0播養箱中培養；
[0220] (5川欠集轉染24小時和48小時的293T細胞上清液；
[0221] (6)取收集的293T細胞上清液約35ml，收集于50ml離屯、管中，2000轉，10分鐘，去除 293T細胞碎片，而獲得去碎片后的上清液；
[0222] (7)將步驟(6)獲得的上清液置于冰上，用60ml注射器連接0.45皿針頭濾器將離屯、 后的上清液過濾于35ml超速離屯、管中，25000轉，3小時；
[0223] (8)將離屯、管輕輕取出，置于冰上；
[0224] (9)在病毒專用超凈臺中，打開金屬離屯、管，吸去部分離屯、后的病毒上清，用綴子 取出超速離屯、管，吸去大部分上清，剩余約4ml;
[0225] (10)用5ml移液管反復吹打剩余的4ml病毒上清約10次，0.75ml/管進行分裝，放 入-80°C冰箱中保存備用，而獲得慢病毒顆粒，即感染混合物。
[0226] (五）、轉染外周血單核細胞
[0227] 1、人外周血單核細胞的分離與激活 [022引與步驟(一)相同。
[0229] 2、人外周血單核細胞的轉染
[0230] (1)人外周血單核細胞在24孔板中激活12~24小時后，離屯、24孔板，吸走80化1上 清培養液，加入新的培養液，調整每孔細胞數目約0.5 X 10^20化1;
[0231] (2)從人外周血單核細胞分選出T細胞并激活，取（7~9) X105激活的T細胞，用 CD45R0，CD6化抗體染色，流式細胞儀檢測轉染前激活的人外周血單核細胞的分型（方法同 上)；
[0232] (3)在室溫下將凍存的慢病毒顆粒融化，輕輕混勻，將1ml的慢病毒顆粒加入T細胞 中，向24孔板中加入凝聚胺，用RPMI1640培養基調整至終濃度為12μg/ml，將24孔板放入離 屯、機離屯、，25(K)r/min，離屯、1.5小時;離屯、后將24孔板放于37°C、5%C02培養箱中培養過夜；
[0233] (4)離屯、過夜培養的24孔板，去掉大部分含慢病毒顆粒的上清培養液，加入新鮮的 RPMI-1640培養液，擴增T細胞；
[0234] (5)每2天計數T細胞，向RPMI-1640培養基中加入化-250IU/ml，維持T細胞密度為 (0.5~l)Xl〇6/ml;
[0235] (6) 2周后，使用抗人CD3，CD45，CD4，CD8，CD45R0，CD6化抗體W及FITC標記的羊抗 鼠 F(ab'）2抗體，進行流式細胞儀分析(方法同上）；
[0236] (7)轉染成功的 cM21-28-IC0SCCAR-T 細胞備用。
[0237] (六）、表達抗肥R2的CAR-T細胞體外功能的檢測
[0238] 在檢測前，先將實施例1制備的CAR-T細胞與表達肥R2的腫瘤細胞株(實施例1所設 及的材料中的細胞系)按如下步驟進行共培養，而獲得共培養液：
[0239] (1)用0.25%膜酶消化腫瘤細胞后，加入RPMI1640培養基中和膜酶，離屯、后調整細 胞密度為IxloVml，取10化1 (IxlO5)腫瘤細胞接種于U型96孔板中，設置3個復孔；
[0240] (2)表達抗皿R2的chA21-28-IC0SCCAR-T細胞體外培養擴增14天后，離屯、去掉抗 CD3/CD28磁珠，在無 IL-2的RPMI1640培養液中培養過夜，使T淋己細胞靜息；
[0241] (3)收取靜息的T淋己細胞，離屯、去掉上清，將細胞重懸于RPMI1640培養液中，計 數，調整細胞密度為IxloVml，取1(K)山（IxlO5)T細胞接種于U型96孔板中已經接種腫瘤細胞 的相應的孔中，將96孔板放置于37°C、5%C02培養箱中培養過夜。只有T細胞的孔作為陰性 對照孔。
[0242] 1、ELISA法檢測共培養液中IFN- 丫的含量
[0243] (1)包被:按說明書指導，將化Pture抗體稀釋于IX包被緩沖液中，向試劑盒提供的 微孔板中的各反應孔中各加0.1ml，塑料貼紙覆蓋微孔板，放置4°C過夜；
[0244] (2)封閉：將過夜后的微孔板用自動化ISA洗板機洗漆4次后，拋干，用IX分析緩沖 液10化1封閉1小時；
[0245] (3)加樣:將微孔板再次洗漆4次后，拋干，向各反應孔加入待檢測的T細胞與腫瘤 細胞共培養的上清液10化1，相應稀釋倍數的上清液及IFN- 丫標準品（100化g/ml，倍比稀釋 至15.6pg/ml)，室溫解育2小時；
[0246] (4)加檢測抗體:微孔板洗涂4次后，拋干，按說明書指定將Detection抗體用IX分 析緩沖液稀釋，取10化1加入各反應孔中，室溫解育1小時；
[0247] (5)加辣根過氧化物酶標記的二抗:微孔板洗漆4次后，拋干，將HRP標記的抗體用 IX分析緩沖液稀釋，向各反應孔中各加10化1，室溫解育0.5小時；
[0248] (6)微孔板洗漆4次后，拋干，向各反應孔中加入新鮮配制的TMB底物溶液10化1，避 光解育15分鐘；
[0249] (7)向各反應孔中加入1M硫酸10化1終止反應；
[0250] (8)結果判定：在化ISA檢測儀上，W空白對照孔調零，檢測各孔450nm吸光值(0D 值），計算IFN-丫濃度值。檢測結果如圖2所示。
[0251] 根據圖2可知，chA21-28-IC0SCCAR-T細胞可W特異性的識別所有皿R化的腫瘤細 胞并大量分泌IFN-丫，針對乳腺癌細胞（S邸R3)分泌的IFN-丫高達190(K)pg/mlW上，但將 chA21-28-IC0SCCAR-T細胞與皿R2陰性的MDA-MB-468和TC-1細胞共培養時，細胞培養液上 清中只能檢測到非常低劑量的IFN-丫。而NT-T細胞與皿R2陽性的腫瘤細胞共培養時，細胞 培養液上清中檢測不到IFN-丫。因此，結果表明：肥R2-特異性的T細胞可W特異性的識別并 殺傷肥R2陽性的腫瘤細胞。
[0252] 2、ELI SA法檢測共培養液中比-2的含量
[0253] 檢測步驟與IFN- 丫的步驟相同，檢測結果如圖3所示。
[0254] 根據圖3可知，chA21-28-IC0SCCAR-T細胞可W特異性的識別所有皿R化的腫瘤細 胞并大量分泌化-2，針對乳腺癌細胞（SKBR3)分泌的化-2高達2800pg/ml W上。但將chA21- 28-ICOSCCAR-T細胞與皿R2陰性的MDA-MB-468和TC-1細胞共培養時，細胞培養液上清中只 能檢測到非常低劑量的IL-2。而NT-T細胞與皿R2陽性的腫瘤細胞共培養時，細胞培養液上 清中檢測不到IL-2。因此，結果表明：肥R2-特異性的T細胞可W特異性的識別并殺傷肥R2陽 性的腫瘤細胞。
[0255] 3、CAR-T細胞的抗原特異性評價試驗
[0256] (1)包被：用20化1化g/ml皿R2-FC嵌合蛋白或者CD19-FC嵌合蛋白的包被96孔 板，用塑料貼紙覆蓋96孔板，4°C過夜；
[0257] (2)加入活化的T細胞：次日，PBS洗涂3次后，拋干，向96孔板中加入IX 105個 cM21-28-IC0SCCAR-T細胞或N1T細胞，37°C培養過夜；
[0258] (3)酶聯免疫法檢測IFN-丫的分泌，檢測結果如圖4所示。
[0259] 根據圖4可知，NT-T細胞對皿R2-FC嵌合蛋白和CD19-FC嵌合蛋白均無特殊反應， chA21-28-IC0SCCAR-T細胞對CD19-FC嵌合蛋白也無特殊反應，但是在皿R2-FC嵌合蛋白封 閉的96孔板中，CM21-28-IC0SCCAR-T細胞釋放了大量的INF-丫，且高達19000pg/mlW上。
[0260] 4、si化釋放試驗檢測CM21-28-IC0SCCAR-T細胞殺傷乳腺癌細胞能力
[0%1] (1)收獲處于對數生長期的乳腺癌細胞(S邸R3)，調整細胞濃度為2X106/ml;
[0%2] (2)取lX106細胞(0.5ml)，加 Na25lCr04100 uCi，37度解育2~3h，每15min輕輕振搖 一次；
[0263] (3)用 10%FCS RPMI 1640洗涂3次，每次800巧m、5min。
[0264] (4)重懸細胞濃度lXl〇5/ml;
[0265] (5)96孔U型培養板中，每孔加 lOOiiKlxlO4細胞），設3個復孔；
[0%6] (6)按照效應T細胞與祀細胞為1:1，3:1和10:1的比例，每孔加入10化1不同細胞濃 度的實施例1制備的CAR-T細胞;設置最大釋放組，向乳腺癌細胞加 lOOiil l%Triton X- 100;設置自然釋放組，向乳腺癌細胞中加10化1 RPMI1640培養基；
[0%7] (7) 200g離屯、Imin，放入37 °C、5 % C〇2解箱培養地。
[0268] (8) 200g 離屯、Imin，每孔取出 10化上清，用 Wi zard2gamma 計數(Perki 址 Imer)檢測；
[0269] (9)計算:特異性殺傷率（％) = (實驗組cpm-自然釋放cpm)/(最大釋放組-自然釋 放cpm)，計算結果圖5所示。
[0270] 根據圖5可知，chA21-28-IC0SCCAR-T細胞特異性的裂解肥R2-陽性的SKBR3腫瘤細 胞，而NTT細胞對于肥R2陽性或者陰性的S邸R3腫瘤細胞均未有裂解作用。同時，將NT-T細胞 和chA21-28-IC0SCCAR-T細胞分別與表達肥R2的SK0V3細胞共培養24小時后，可W看到NT-T 細胞對SK0V3細胞的生長沒有影響，而加入CM21-28-IC0SCCAR-T細胞的培養皿中可W看到 T細胞集落的形成，且S邸R3腫瘤細胞明顯減少。
[0271] 5、統計分析
[0272] 所有數據均為遂表示。利用Gra地Pad P;rism5.0(Gra地Pad Software，Inc.，San Diego，California USA)軟件，T檢驗法分析細胞因子分泌的差異及特異性細胞裂解的差 異。P<0.05認為有統計學意義。
[0273] 綜上所示，本發明CAR-T細胞對表達皿R2的腫瘤細胞具有良好的殺傷效果，且CAR- T細胞與乳腺癌細胞（SKBR3)共培養時分泌的INF-丫高達19000pg/mlW上，IL-2高達 2800pg/ml W上，遠高于其他第S代CAR-T細胞分泌的INF- 丫和比-2。
[0274] W上所述僅為本發明的優選實施例，并非因此限制本發明的專利范圍，凡是在本 發明的發明構思下，利用本發明說明書及附圖內容所作的等效變換，或直接/間接運用在其 他相關的技術領域均包括在本發明的專利保護范圍內。
【主權項】
1. 一種CAR-T細胞，所述CAR-T細胞的CAR包括胞膜外抗原結合區、鉸鏈區和胞內信號傳 導區，其特征在于， 所述胞膜外抗原結合區為用于結合HER2蛋白的chA21 scFv; 所述胞內信號傳導區為CD28-X-ITAM，其中，所述X為10)5、00137、00134、0)80或者0)86 共刺激分子。2. 如權利要求1所述的嵌合抗原受體T細胞，其特征在于，所述X為ICOS共刺激分子。3. -種CAR-T細胞的制備方法，其特征在于，包括步驟如下： 構建CAR表達載體，其中，所述CAR表達載體的CAR包括胞膜外抗原結合區、鉸鏈區和胞 內信號傳導區，所述胞膜外抗原結合區為用于結合HER2蛋白的chA21 scFv，所述胞內信號 傳導區為CD28-X-ITAM，所述X為10)5、0)137、0)134、0)80或者0)86共刺激分子 ； 包裝所述CAR表達載體，而制得感染混合物； 將所述感染混合物感染T細胞，而制得CAR-T細胞。4. 如權利要求3所述的CAR-T細胞的制備方法，其特征在于，所述構建CAR表達載體的過 程中，包括步驟如下： 獲取所述chA21 scFv的基因片段、所述鉸鏈區的基因片段、所述CD28的基因片段、所述 X的基因片段以及所述ITAM的基因片段； 提供引導鏈，基因融合所述引導鏈與所述chA21 scFv的基因片段，而形成引導鏈-chA21 scFv； 基因融合所述鉸鏈區的基因片段、所述CD28的基因片段、所述X的基因片段和所述ITAM 的基因片段，而形成鉸鏈區-⑶28-X-ITAM; 基因融合所述引導鏈-chA21 scFv和所述鉸鏈區-CD28-X-ITAM，而形成引導鏈-chA21 scFv-鉸鏈區-CD28-X-ITAM; 將所述引導鏈_chA21 scFv-鉸鏈區-⑶28-X-ITAM接入載體，而獲得CAR表達載體。5. 如權利要求4所述的CAR-T細胞的制備方法，其特征在于，獲取所述chA21 scFv的基 因片段、所述鉸鏈區的基因片段、所述CD28的基因片段、所述X的基因片段以及所述ITAM的 基因片段的過程中，包括步驟如下： 獲取并激活PMBCs; 提取所述PMBCs的mRNA并反轉錄為cDNA; 分別提供所述鉸鏈區的引物、所述CD28的引物、所述X的引物和所述ITAM的引物，且均 以所述PMBCs的cDNA為模板，分別進行PCR擴增，而獲得所述鉸鏈區的基因片段、所述CD28的 基因片段、所述X的基因片段以及所述ITAM的基因片段； 提供所述chA21 scFv的模板DNA和所述chA21 scFv的引物，并進行PCR擴增，而獲得所 述chA21 scFv的基因片段。6. 如權利要求3所述的CAR-T細胞的制備方法，其特征在于，所述CAR表達載體為CAR表 達病毒質粒。7. 如權利要求6所述的CAR-T細胞的制備方法，其特征在于，所述包裝所述CAR表達載體 的過程中，包括步驟如下： 將12~20yg的包裝質粒與12~20yg的所述CAR表達病毒質粒通過培養基共混，而獲得 質粒混合物； 將所述質粒混合物與35~45μ1的脂質體通過培養基共混，而獲得混合液； 將所述混合液轉染真核細胞，而獲得所述真核細胞的上清液； 濃縮所述上清液，而制得感染混合物。8. 如權利要求3所述的CAR-T細胞的制備方法，其特征在于，所述將所述感染混合物感 染Τ細胞的過程中，包括步驟如下： 將0.8~2ml的感染混合物加入(6~10) Χ105個Τ細胞中而進行感染； 將凝聚胺加入所述T細胞中，使所述凝聚胺的終濃度為10~20μg/ml; 培養擴增感染后的T細胞，而獲得CAR-T細胞。9. 如權利要求3至8任意一項所述的CAR-Τ細胞的制備方法，其特征在于，所述X為ICOS 共刺激分子。10. -種如權利要求1或2所述的CAR-τ細胞在治療乳腺癌的藥物上的應用。
【文檔編號】C12N15/867GK106047817SQ201610602458
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月28日 公開號201610602458.3, CN 106047817 A, CN 106047817A, CN 201610602458, CN-A-106047817, CN106047817 A, CN106047817A, CN201610602458, CN201610602458.3
【發明人】曾憲卓, 張翼
【申請人】深圳愛生再生醫學科技有限公司