一種成纖維細胞的快速提取方法及應用
【專利摘要】本發明公開了一種成纖維細胞的快速提取方法。包括以下步驟：S1）取離體的腫瘤組織，剪碎，加入膠原酶溶液進行消化；S2）轉移到離心管中進行震蕩、孵育及離心后，取沉淀物放進細胞培養箱中培養；S3）再加入膠原酶溶液進行消化，并重復步驟S2），得到經交替消化、培養后的組織結構松散的腫瘤組織；S4）加入胰酶溶液，常溫靜置后加入胎牛血清終止消化，再將懸浮物倒掉，得到胰酶消化后貼壁的腫瘤單細胞；S5）加入DMEM完全培養基進行傳代培養，得到所述腫瘤相關成纖維細胞。還提供了本發明提取方法的應用，利用本提取方法得到的成纖維細胞純度非常高，成纖維細胞高表達FAP，表達率為99.2%，適合醫學推廣。
【專利說明】
一種成纖維細胞的快速提取方法及應用
技術領域
[0001]本發明屬于生物醫學領域，尤其涉及一種成纖維細胞的快速提取方法及應用。
【背景技術】
[0002]腫瘤相關成纖維細胞(CA!7)是腫瘤間質中最主要的細胞成分，在腫瘤的發生和發展過程中扮演著至關重要的角色。CAF可以募集內皮祖細胞到腫瘤局部促進腫瘤新生血管的生成和腫瘤的生長。這些腫瘤相關成纖維細胞除了表達vimentin這一成纖維細胞的標記物外，還特異性表達FAP、a-SMA，但不表達CK、desmin，在形態、功能、蛋白質表達、對細胞因子的反應性及遺傳學水平上，它與正常成纖維細胞(MO存在明顯差異。
[0003]腫瘤相關成纖維細胞目前是研究熱點之一，很多機制尚存在爭議，但是普遍認為該細胞與腫瘤的發生發展和轉移侵襲有著密不可分的關系。腫瘤相關成纖維細胞能分泌趨化因子12(CXCL12)和肝細胞生長因子(HGH，前者能直接刺激腫瘤細胞進行增殖和轉移，后者導致細胞外基質(ECM)的改變，進而造成體內上皮細胞增殖和發生惡性轉化。除此之外，CXCL12和HGF與腫瘤分泌的血管內皮生長因子(VEGF)—起影響腫瘤新生血管的生成。以此方式，腫瘤相關成纖維細胞能同時影響正常上皮細胞和腫瘤細胞的旁泌性因子來影響腫瘤的發生發展，越來越多的證據表明腫瘤基質中成纖維細胞的突變往往發生在癌癥發展之前。以腫瘤相關成纖維細胞為靶點的藥物是提高腫瘤治愈率的一種新方法。正是這種固有差異為新藥物的設計和治療策略的高度選擇性提供了多種獨特的靶點。但是在現有的腫瘤相關成纖維細胞提取方法上，不能獲得大量的腫瘤相關成纖維細胞，為研究其機制及作用帶來很大的影響。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于:針對上述存在的問題，提供一種成纖維細胞的快速提取方法及應用。本發明的提取方法可以有效、快速提高腫瘤相關成纖維細胞的提取量及純度。
[0005]為了實現上述目的，本發明采用的技術方案如下:
一種成纖維細胞的快速提取方法，包括以下步驟:
51)取離體的腫瘤組織，剪碎，然后往剪碎后的腫瘤組織中加入膠原酶溶液進行消化，得到膠原酶消化后的腫瘤組織；
52)將所述膠原酶消化后的腫瘤組織轉移到離心管中進行震蕩、孵育及離心后，取沉淀物放進細胞培養箱中培養，得到組織結構松散的腫瘤組織；
53)再加入膠原酶溶液進行消化，并重復步驟S2)，得到經交替消化、培養后的組織結構松散的腫瘤組織；
54)向所述組織結構松散的腫瘤組織中加入胰酶溶液，常溫靜置后加入胎牛血清終止消化，再將懸浮物倒掉，得到胰酶消化后貼壁的腫瘤單細胞；
55)在所述胰酶消化后貼壁的腫瘤單細胞中加入DMEM完全培養基進行傳代培養，得到所述腫瘤相關成纖維細胞。
[0006]進一步地，在步驟SI)，所述將離體的腫瘤組織剪碎前，還包括將離體的腫瘤組織在PBS中浸泡1-3min，所述PBS的摩爾濃度為0.0 Imo 1/L，所述膠原酶溶液為膠原酶I溶液。
[0007]進一步地，在步驟SI)，所述摩爾濃度為0.0lmol/L的PBS的配制方法為:將KCL0.2g^KH2PO4 0.24g、NaCl 8.0g和Na2HPO4 1.44g 溶解于100mL DDH2O中；所述膠原酶I溶液中膠原酶I的質量-體積濃度為0.8-1.5mg/mL0
[0008]進一步地，在步驟S2)，所述震蕩的頻率為1500-2000rpm，時間為2-4min;所述孵育為在35-38°C水浴鍋中孵育l_3min;所述震蕩和孵育交替進行2-4次。
[0009]進一步地，在步驟S2)，所述離心為將孵育后的腫瘤組織于300g下離心5-7 min，棄上清液；向沉淀中加入18-25 mL摩爾濃度為0.01mol/L的PBS，混勻后于300g下離心5-7min，棄上清液;再向沉淀中加入18-25 mL摩爾濃度為0.01mol/L的I3BS,混勻后于300g下離心5-7min，棄上清液，取沉淀物即可。
[0010]進一步地，在步驟S2)，所述細胞培養箱中CO2的體積百分比為6-8%，溫度為35-38°C，培養的時間為1-3天。
[0011]進一步地，在步驟S4)，所述胰酶溶液的配制方法為:將NaCl 7_9g、NaHC03 0.4-0.6g、葡萄糖0.8-1.2g、EDTA 0.2-0.4g及胰酶2.3-2.8g溶解于100mL DDH2O中；所述常溫靜置的時間為l_2min。
[0012]進一步地，在步驟S5)，在進行傳代培養之前，還包括用PBS將所述胰酶消化后貼壁的腫瘤單細胞洗滌2-3次;所述DMEM完全培養基為向DMEM不完全培養基中加入胎牛血清和P/S得到的溶液，其中胎牛血清的體積百分比為10%，P/S的體積百分比為1%。
[0013]本發明還提供了一種成纖維細胞的快速提取方法在提取腫瘤相關成纖維細胞的應用。
[0014]更進一步地，所述腫瘤為實體瘤，該實體瘤為肺癌、肝癌、腸癌、前列腺癌、胰腺癌和肺腺癌中的一種或幾種。
[0015]綜上所述，由于采用了上述技術方案，本發明的有益效果是:利用本發明的成纖維細胞的快速提取方法得到的成纖維細胞純度非常高，成纖維細胞高表達FAP，表達率為99.2%。顯微鏡下腫瘤相關成纖維細胞呈長梭形或星芒狀，胞質豐富，嗜酸性，胞核位于胞體中央，圓形或長橢圓形，細胞呈放射狀或束狀排列，部分細胞排列紊亂，極性消失，有明顯的交叉重疊現象。免疫細胞化學染色結果提示，成纖維細胞表面能特異性結合抗FAP單克隆熒光抗體，發出紅色熒光。實驗證明，可利用本發明的成纖維細胞的快速提取方法提取腫瘤相關成纖維細胞，適合醫學推廣。
【附圖說明】
[0016]本發明將通過例子并參照附圖的方式說明，其中:
圖1為從荷瘤小鼠剝離得到的腫瘤組織。
[0017]圖2為剪碎的腫瘤組織。
[0018]圖3為腫瘤相關成纖維細胞顯微鏡下的細胞形態。
[0019]圖4為利用本發明提取方法得到的腫瘤相關成纖維細胞的FAP表達率。
[0020]圖5為利用本發明提取方法得到的腫瘤相關成纖維細胞的免疫細胞化學染色的實
驗結果。【具體實施方式】
[0021]
本說明書中公開的所有特征，或公開的所有方法或過程中的步驟，除了互相排斥的特征和/或步驟以外，均可以以任何方式組合。
[0022]本說明書(包括任何附加權利要求、摘要)中公開的任一特征，除非特別敘述，均可被其他等效或具有類似目的的替代特征加以替換。即，除非特別敘述，每個特征只是一系列等效或類似特征中的一個例子而已。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0023]一、實施例中使用的材料及試劑
眼科剪為大都器械醫療有限公司產品，型號為YYJ-PT> 1cm彎剪。該眼科剪頭端寬0.4毫米，尖而不銳。
[0024]人肝癌HepG2細胞(ATCC，貨號HB-8065)，公眾可從
【申請人】處獲得該生物材料，該生物材料只為重復本發明的相關實驗所用，不可作為其它用途使用。
[0025]BALB/c裸鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司，貨號401)，公眾可從
【申請人】處獲得，該生物材料只為重復本發明的相關實驗所用，不可作為其它用途使用。
[0026]震蕩器為IKA產品，型號為VORTXl。
[0027]胎牛血清(FBS)為Gibco公司產品，貨號10099-141。
[0028]膠原酶I溶液為向DMEM不完全培養基(Gibco公司產品，貨號11995-065)中加入胎牛血清和P/S(青霉素(索萊寶，貨號P8420)和鏈霉素(索萊寶，貨號S8290-5))得到的溶液，其中胎牛血清的體積百分比濃度為10%，P/S的體積百分比濃度為1%; P/S中膠原酶I的濃度為I OOmg/ mL。該膠原酶I溶液中膠原酶I的濃度為lmg/ mL。
[0029]胰酶溶液為向DDH2O中加入NaCl、NaH⑶3、葡萄糖、EDTA和胰酶得到的溶液，其中，NaCl的濃度為8mg/mL，NaHC03的濃度為0.5mg/mL，葡萄糖的濃度為lmg/mL，EDTA的濃度為
0.3mg/ mL，胰酶的濃度為2.5mg/ mL。
[0030]0.01mol/L PBS 的配制方法為:KCL 0.2g, KH2PO4 0.24g，NaCl 8.0g, Na2HPO41.44g 溶解于 I OOOmL DDH2O。
[0031]DMEM完全培養基為向DMEM不完全培養基(Gibco，貨號11995-065)中加入胎牛血清和P/S(青霉素(索萊寶，貨號P8420)和鏈霉素(索萊寶，貨號S8290-5)得到的溶液，其中胎牛血清的體積百分比濃度為10%，P/S的體積百分比濃度為1%。
[0032]二、腫瘤相關成纖維細胞的提取
步驟SI):取3只4-5周齡BALB/c裸鼠，每只于右側腋下皮下接種人肝癌HepG2細胞，待腫瘤平均體積長至約1.0 X 1.0X 1.0cm3時，得到荷瘤小鼠。將荷瘤小鼠頸椎脫臼處死后浸泡于75%(體積百分比濃度)的乙醇水溶液中3-5 min，得到消毒后的小鼠；在超凈工作臺內，用無菌剪刀和無菌鑷子從消毒后的小鼠胸口剪開小鼠皮膚，小心剝離得到腫瘤組織。附圖1為從荷瘤小鼠剝離得到的腫瘤組織。
[0033]用眼科剪稍微剪碎腫瘤組織(此時的腫瘤組織大小為0.5 X 0.5 X 0.5cm3)，并在
0.01mol/L PBS中浸泡(使腫瘤組織完全浸潤在0.01mol/L PBS中)2min后將其取出，得到浸泡后的腫瘤組織。用眼科剪在無菌平皿上充分剪碎浸泡后的腫瘤組織(此時的腫瘤組織大小為0.2X0.2X0.2mm3)，在剪碎浸泡后的腫瘤組織的過程中適時滴加0.0 Imo I /L PBS,保持該腫瘤組織處于濕潤狀態，得到剪碎的腫瘤組織。附圖2為用眼科剪充分剪碎腫瘤組織得到的剪碎的腫瘤組織。向上述盛有剪碎的腫瘤組織的無菌平皿中滴加膠原酶I溶液，用剪過頭的I mL槍頭吹散腫瘤組織，得到膠原酶1-腫瘤組織混合物。
[0034]上述方法中，所述眼科剪又稱眼科手術剪、眼用手術剪，是剪切眼部軟組織用的器械。所述眼科剪可為頭端寬0.4毫米，尖而不銳的眼科剪;所述眼科剪也可為頭端寬1.6毫米的眼科剪。
[0035]步驟S2):把膠原酶1-腫瘤組織混合物轉移到50mL離心管中，然后將該離心管進行如下Cl)和C2)的處理，Cl)和C2)交替進行3次:
Cl)將盛有膠原酶1-腫瘤組織混合物的50mL離心管在震蕩器上進行震蕩3 min，得到震蕩后的膠原酶-腫瘤組織混合物；
C2)將震蕩后的膠原酶-腫瘤組織混合物在37°C水浴鍋中孵育2 min，得到膠原酶消化后的腫瘤組織A。
[0036]將步驟C2)的膠原酶消化后的腫瘤組織A進行離心處理:
Cl)將孵育后的膠原酶消化后的腫瘤組織于300g下離心6 min，棄上清液；c2)向步驟cl)的沉淀中加入20 mL 0.01mol/L PBS，混勾后于300g下離心6 min，棄上清液；
c3)向步驟c2)的沉淀中加入20 mL 0.01mol/L PBS，混勾后于300g下離心6 min，棄上清液，得到膠原酶消化后的腫瘤組織。
[0037]將上述膠原酶消化后的腫瘤組織鋪在培養瓶中，加入DMEM完全培養基，在細胞培養箱中培養兩天，細胞培養箱中CO2的體積百分比為6-8%，溫度為35-38°C，得到組織結構松散的腫瘤組織。
[0038]步驟S3):再在結構松散的腫瘤組織中加入膠原酶溶液進行消化，并重復步驟S2)，得到經交替消化、培養后的組織結構松散的腫瘤組織。
[0039]步驟S4):向組織結構松散的腫瘤組織中加入胰酶溶液，得到胰酶-腫瘤組織混合物，將胰酶-腫瘤組織混合物在在超凈工作臺上常溫靜置Imin后，加入1mL胎牛血清FBS終止消化，倒掉胰酶腫瘤組織懸液，得到胰酶消化后貼壁的腫瘤單細胞。在胰酶消化后貼壁的腫瘤單細胞中加入DMEM完全培養基進行傳代培養，得到純化后的腫瘤相關成纖維細胞。
[0040]步驟S5):將上述腫瘤相關成纖維細胞進行培養，培養條件為:DMEM完全培養基，細胞培養箱(細胞培養箱中CO2的體積百分比為6-8%，溫度為35-38°C)，得到貼壁的腫瘤相關成纖維細胞。附圖3為腫瘤相關成纖維細胞顯微鏡下的細胞形態。
[0041]本發明成纖維細胞的快速提取方法可應用于提取腫瘤相關成纖維細胞。所述腫瘤為實體瘤，該實體瘤為肺癌、肝癌、腸癌、前列腺癌、胰腺癌和肺腺癌中的一種或幾種。所述腫瘤具體可為在BALB/c裸鼠上生長的人肝癌。
[0042]三、腫瘤相關成纖維細胞的鑒定
I.腫瘤相關成纖維細胞FAP的表達水平檢測
用流式細胞儀測定腫瘤相關成纖維細胞表達FAP的水平。首先將腫瘤相關成纖維細胞與一抗(0.58/1\106細胞)(六1?^111公司產品，貨號為3匕54651)在0.0111101/1 PBS中22°C反應30分鐘，反應結束后以0.01mol/L PBS洗三次，然后再與DyLight ? 488標記的二抗(0.0lmol/L PBS稀釋，稀釋比例為l/500)(Abcam公司產品，貨號為ab96879)在4°C反應30分鐘，反應結束后以0.0lmol/L PBS洗三次，上機分析，結果如圖4所示，圖4中左峰是陰性對照峰，右峰是陽性結果峰，表示的是FAP的表達情況;結果顯示腫瘤相關成纖維細胞純度很高，高表達FAP，表達率為99.2%(即表達FAP的腫瘤相關成纖維細胞占所檢測腫瘤相關成纖維細胞的百分比為99.2%)。
[0043]2.腫瘤相關成纖維細胞免疫細胞化學染色實驗
(I)將純化后貼壁的腫瘤相關成纖維細胞鋪板于6孔板中，用不含血清的培養基培養24小時，細胞密度可為5 X 15/孔。
[0044](2)0.01mol/LPBS 洗滌 2遍，4% 多聚甲醛固定 30min。
[0045](3)用濃度為5%的胎牛血清對非特異結合進行封閉，常溫下反應30min。
[0046](4)更換含抗FAP單克隆一抗(配成濃度為Iug/mL) (Abcam公司產品，貨號為ab28244M90.01mol/L PBS，4°C反應過夜。
[0047](5)0.0lmol/L PBS洗滌2遍，與AlexaFluor ? 594紅色焚光標記的二抗(0.0lmol/LPBS稀釋，稀釋比例為I/400)(Abcam公司產品，貨號Sab 150080)在常溫反應30分鐘。
[0048](6)0.01mol/L PBS洗滌2遍，染DAPI(配成濃度為0.14mg/mL)3分鐘，0.01mol/LPBS洗滌2遍，熒光顯微鏡下觀察。
[0049]實驗結果顯示成纖維細胞特異性結合抗FAP單克隆抗體后發出紅色熒光。見附圖5為利用本發明的提取方法得到的腫瘤相關成纖維細胞的免疫細胞化學染色的實驗結果。顯微鏡下腫瘤相關成纖維細胞呈長梭形或星芒狀，胞質豐富，嗜酸性，胞核位于胞體中央，圓形或長橢圓形，細胞呈放射狀或束狀排列，部分細胞排列紊亂，極性消失，有明顯的交叉重疊現象。免疫細胞化學染色結果提示，成纖維細胞表面能特異性結合抗FAP單克隆熒光抗體，發出紅色熒光。
[0050]本發明并不局限于前述的【具體實施方式】。本發明擴展到任何在本說明書中披露的新特征或任何新的組合，以及披露的任一新的方法或過程的步驟或任何新的組合。
【主權項】
1.一種成纖維細胞的快速提取方法，其特征在于，包括以下步驟: 51)取離體的腫瘤組織，剪碎，然后往剪碎后的腫瘤組織中加入膠原酶溶液進行消化，得到膠原酶消化后的腫瘤組織； 52)將所述膠原酶消化后的腫瘤組織轉移到離心管中進行震蕩、孵育及離心后，取沉淀物放進細胞培養箱中培養，得到組織結構松散的腫瘤組織； 53)再加入膠原酶溶液進行消化，并重復步驟S2)，得到經交替消化、培養后的組織結構松散的腫瘤組織； 54)向步驟S3)所述組織結構松散的腫瘤組織中加入胰酶溶液，常溫靜置后加入胎牛血清終止消化，再將懸浮物倒掉，得到胰酶消化后貼壁的腫瘤單細胞； S5)在所述胰酶消化后貼壁的腫瘤單細胞中加入DMEM完全培養基進行傳代培養，得到所述腫瘤相關成纖維細胞。2.根據權利要求1所述的成纖維細胞的快速提取方法，其特征在于，在步驟SI)，所述將離體的腫瘤組織剪碎前，還包括將離體的腫瘤組織在I3BS中浸泡l-3min，所述I3BS的摩爾濃度為0.0lmol/L，所述膠原酶溶液為膠原酶I溶液。3.根據權利要求2所述的成纖維細胞的快速提取方法，其特征在于，所述摩爾濃度為0.01mol/L的PBS的配制方法為:將KCL 0.2g^KH2PO4 0.24g、NaCl 8.0g和Na2HPO4 1.44g 溶解于100mL DDH2O中；所述膠原酶I溶液中膠原酶I的質量-體積濃度為0.8-1.5mg/mL。4.根據權利要求1所述的成纖維細胞的快速提取方法，其特征在于，在步驟S2)，所述震蕩的頻率為1500-2000rpm，時間為2-4min;所述孵育為在35-38°C水浴鍋中孵育l-3min;所述震蕩和孵育交替進行2-4次。5.根據權利要求1所述的成纖維細胞的快速提取方法，其特征在于，在步驟S2)，所述離心為將孵育后的腫瘤組織于300g下離心5-7 min，棄上清液；向沉淀中加入18-25 mL摩爾濃度為0.01mol/L的PBS，混勾后于300g下離心5_7min，棄上清液;再向沉淀中加入18-25mL摩爾濃度為0.01mol/L的PBS，混勾后于300g下離心5_7min，棄上清液，取沉淀物即可。6.根據權利要求1所述的成纖維細胞的快速提取方法，其特征在于，在步驟S2)，所述細胞培養箱中CO2的體積百分比為6-8%，溫度為35-38°C，培養的時間為1-3天。7.根據權利要求1所述的成纖維細胞的快速提取方法，其特征在于，在步驟S4)，所述胰酶溶液的配制方法為:將NaCl 7-9g,NaHCO3 0.4-0.6g、葡萄糖0.8-1.2g、EDTA 0.2_0.4g及胰酶2.3-2.8g溶解于100mL DDH2O中；所述常溫靜置的時間為l_2min。8.根據權利要求1所述的成纖維細胞的快速提取方法，其特征在于，在步驟S5)，在進行傳代培養之前，還包括用PBS將所述胰酶消化后貼壁的腫瘤單細胞洗滌2-3次;所述DMEM完全培養基為向DMEM不完全培養基中加入胎牛血清和P/S得到的溶液，其中胎牛血清的體積百分比為10%，P/S的體積百分比為I %。9.一種成纖維細胞的快速提取方法在提取腫瘤相關成纖維細胞的應用。10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于，所述腫瘤為實體腫瘤，該實體腫瘤為肺癌、肝癌、腸癌、前列腺癌、胰腺癌和肺腺癌中的一種或幾種。
【文檔編號】C12N5/09GK106047813SQ201610537670
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月11日
【發明人】趙永祥, 盧小玲, 周素芳, 黃盈盈
【申請人】廣西醫科大學