一種適用于高密度細胞培養體系的免疫細胞的無血清培養基的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種適用于高密度細胞培養體系的免疫細胞的無血清培養基，其包括基礎培養基和添加組分，其中，所述基礎培養基為RPMI 1640；所述添加組分及其濃度如下：人白蛋白，12?16g/L；轉鐵蛋白，20?25mg/L；人重組胰島素，24?30mg/L；L?谷氨酰胺，8?10g/L；HEPES，5?7g/L；以及白介素?2，3×105?8×105IU/L。與現有技術相比，本發明的免疫細胞無血清培養基采用RPMI 1640作為基礎培養基以及特定的添加組分的組合，能夠使得免疫細胞快速、大量的增殖，且細胞存活率更高，特別適合免疫細胞的高密度細胞培養體系。
【專利說明】
-種適用于高密度細胞培養體系的免疫細胞的無血清培養基
技術領域
[0001] 本發明設及一種適用于高密度細胞培養體系的免疫細胞的無血清培養基，屬于細 胞培養技術領域。
【背景技術】
[0002] 細胞免疫治療是采集人體自身免疫細胞，經過體外培養，使其數量成千倍增多，祀 向性殺傷功能增強，然后再回輸到人體來殺滅血液及組織中的病原體、癌細胞、突變的細 胞，打破免疫耐受，激活和增強機體的免疫能力，兼顧治療和保健的雙重功效，例如常見的 細胞免疫治療有細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)療法、樹突狀細胞(DC)療法、DC+CIK細胞療 法、自然殺傷細胞(NK)療法、DC-T細胞療法等。
[0003] 上述細胞免疫治療中比較重要的一個環節是"免疫細胞的體外培養"，而運個環節 中最重要的是用于免疫細胞培養的無血清培養基。雖然血清是動物細胞培養中最基本的添 加物，尤其是在原代培養或者細胞生長狀況不良時，常常會先使用有血清的培養液進行培 養，待細胞生長旺盛W后，再換成無血清培養液;但由于動物血清中含有動物成分，且成分 復雜，應用與臨床細胞治療體系中，可能會導致一些潛在的風險，因此，無血清培養基被廣 泛的應用于培養哺乳動物W制備單克隆抗體，病毒抗原和重組蛋白等。
[0004] 無血清培養基是指不需要添加血清就可W維持細胞在體外較長時間生長繁殖的 合成培養基，可W應用于培養免疫細胞，例如淋己細胞（例如，T淋己細胞、B細胞、NK細胞 等）、樹突狀細胞(也稱DC細胞）、單核/巨隧細胞等。
[0005] 關于細胞培養體系，現有技術中除了常規的培養板、培養皿、培養瓶等二維的細胞 培養體系，現在已研發出=維培養體系，例如目前市售的高密度細胞培養桶，是一種既可W 適用于貼壁細胞，又可W適用于懸浮細胞的=維培養體系，可W快速地培養大量細胞，且可 W進行為期半年W上的長期細胞培養，不需要經常更換耗材，與傳統的培養板、培養皿和培 養瓶相比，更方便、成本更低，因此受到本領域研發人員的廣泛關注。
[0006] 然而，現有技術中的無血清培養基大多適用于中等規模的細胞培養體系，一般來 說無法適用于大規模的、高密度的細胞培養;另一方面，現有的無血清培養基僅適用于培養 板、培養皿、培養瓶等二維的細胞培養體系，無法適用于高密度細胞培養桶運樣的=維培養 體系。
[0007] 現在亟待開發專用于高密度細胞培養體系的免疫細胞的無血清培養基。
【發明內容】
[000引鑒于相關技術的上述問題和/或其他問題，本發明一方面提供了一種適用于高密 度細胞培養體系的免疫細胞的無血清培養基，其包括基礎培養基和添加組分，其中，所述基 礎培養基為RPMI 1640 ;所述添加組分及其濃度如下：人白蛋白，12-16g/l;轉鐵蛋白，20- 25mg/l;人重組膜島素，24-30mg/L;k谷氨酷胺，8-10g/l;肥?65，5-7g/L; W及白介素-2，3 X 105-8X 105IU/1;各添加組分的濃度W所述無血清培養基的總體積為基準。
[0009] 優選的，W所述無血清培養基的總體積為基準，所述RMPI 1640培養基的干粉量為 14.8-19.8g/Lo
[0010] 優選的，W所述無血清培養基的總體積為基準，所述RMPI 1640培養基的干粉量為 18g/L，所述人白蛋白的濃度為13g/L，所述轉鐵蛋白的濃度為22mg/L，所述人重組膜島素的 濃度為27mg/L，W及所述k谷氨酷胺的濃度為9g/L。
[0011] 優選的，所述肥PES的濃度為6g/L。
[001^ 優選的，所述白介素-2的濃度為5X 105iU/L。
[0013] 優選的，所述添加組分還包括慶大霉素和鏈霉素，所述慶大霉素的濃度為IX 105- 4X105IU/L，所述鏈霉素的濃度為1 X 105-4X 105IU/L。
[0014] 優選的，所述添加組分還包括酪紅鋼，所述酪紅鋼的濃度為5-7mg/l;所述無血清 培養基的抑值為7.2~7.6。
[0015] 本發明另一方面提供了上述的無血清培養基在高密度細胞培養體系中的應用。
[0016] 優選的，所述高密度細胞培養體系為高密度細胞培養桶。
[0017] 優選的，所述免疫細胞為CIK細胞。
[001引本發明的適用于高密度細胞培養體系的免疫細胞的無血清培養基，采用RPMI 1640作為基礎培養基W及特定的添加組分的組合，尤其是人白蛋白、轉鐵蛋白、人重組膜島 素和心谷氨酷胺，四者同時滿足特定的濃度范圍時，能夠使得免疫細胞快速、大量的增殖， 且細胞存活率更高，特別適合免疫細胞的高密度細胞培養體系。
【具體實施方式】
[0019] W下通過實施例對本發明作進一步的說明，但本發明并不限于運些具體實施方 式。
[0020] 在本發明的一個具體實施方案中，一種適用于高密度細胞培養體系的免疫細胞的 無血清培養基，其包括基礎培養基和添加組分，其中，所述基礎培養基為RPMI 1640;所述添 加組分及其濃度如下：人白蛋白，12-16g/l;轉鐵蛋白，20-25mg/l;人重組膜島素，24-30mg/ 谷氨酷胺，8-10g/l;肥陽S，5-7g/L; W及白介素-2,3X 105-8X 105IU/L。
[0021] 本發明的發明人經過大量的研究試驗發現，當免疫細胞的無血清培養基采用RPMI 1640作為基礎培養基W及上述特定的添加組分的組合，尤其是人白蛋白、轉鐵蛋白、人重組 膜島素和心谷氨酷胺，四者同時滿足上述的濃度范圍時，能夠使得免疫細胞快速、大量的增 殖，且細胞存活率更高，特別適合免疫細胞的高密度細胞培養體系。
[0022] 在本發明的一個優選實施方案中，W所述無血清培養基的總體積為基準，所述 RMPI 1640培養基的干粉量為14.8-19.8g/L。
[0023] 在本發明的一個優選實施方案中，W所述無血清培養基的總體積為基準，所述 RMPI 1640培養基的干粉量為18g/L，人白蛋白的濃度為13g/L，轉鐵蛋白的濃度為22mg/L， 人重組膜島素的濃度為27111旨/1，^及心谷氨酷胺的濃度為9g/L。當本發明的免疫細胞的無 血清培養基中，人白蛋白、轉鐵蛋白、人重組膜島素和k谷氨酷胺同時采用上述特定的濃度 時，特別適合免疫細胞的高密度細胞培養體系，尤其是諸如高密度細胞培養桶之類的=維 培養體系，具有較好的增殖效果和細胞存活率。
[0024] 在本發明的一個優選實施方案中，無血清培養基中還可W添加抗生素，添加組分 還包括慶大霉素和鏈霉素，慶大霉素的濃度為1 X 105-4X 105IU/L，鏈霉素的濃度為1 X lO5- 4X105IU/L。運兩種抗生素組合及其特定的濃度，特別適合免疫細胞的高密度細胞培養體 系，抗菌效果優異，細胞存活率高。
[0025] 在本發明的另一個優選實施方案中，所述添加組分還包括酪紅鋼，所述酪紅鋼的 濃度為5-7mg/L。酪紅鋼可W作為培養基中的酸堿指示劑，當采用5-7mg/L的濃度時，更優選 6mg/L的濃度時，對于免疫細胞的高密度細胞培養體系來說，酸堿指示非常靈敏。
[0026] 在本發明的再一個優選實施方案中，將該無血清培養基的pH值控制在7.2~7.6。
[0027] 在本發明的一個優選實施方案中，本發明的無血清培養基是專用于高密度細胞培 養桶的免疫細胞無血清培養基。
[0028] 在本分嗎的一個優選實施方案中，本發明的無血清培養基是專用于CIK細胞的高 密度細胞培養體系的無血清培養基。
[0029] 實施例1
[0030] 實施例1的適用于高密度細胞培養體系的免疫細胞的無血清培養基的配制過程如 下：
[0031] 步驟1):在無菌條件下將合成的RPMI1640干粉在電子天平上稱取180g后置于消毒 容器內，力的L純化水稀釋后攬拌均勻獲得基礎培養基；
[00創步驟2):將添加組分：130g人白蛋白、220mg轉鐵蛋白、270mg人重組膜島素、90g k 谷氨酷胺、60g皿PES、2g慶大霉素(相當于2X105IU/L)和2g鏈霉素(相當于2X105IU/L)、5 X 106IU白介素-2 W及60mg酪紅鋼鹽依次加入步驟1)獲得的基礎培養基中，充分混勻；
[0033] 步驟3):過濾滅菌，再調節pH值至7.4±0.2，最后加入純化水將提及調節至lOL
[0034] 步驟4):培養基配制完成后，過濾滅菌，分裝、封口，最后冷藏(-20°C環境)備用。 [003引實施例2
[0036] 實施例2的適用于高密度細胞培養體系的免疫細胞的無血清培養基的配制過程如 下：
[0037] 步驟1):在無菌條件下將合成的RPMI1640干粉在電子天平上稱取180g后置于消毒 容器內，力的L純化水稀釋后攬拌均勻獲得基礎培養基；
[0038] 步驟2):將添加組分：126g人白蛋白、200mg轉鐵蛋白、260mg人重組膜島素、88g k 谷氨酷胺、65g皿PES、2.2g慶大霉素（相當于2.2X105IU/L)和2.2g鏈霉素（相當于2.2X 105IU/1)、4X106IU白介素-2W及65mg酪紅鋼鹽依次加入步驟1)獲得的基礎培養基中，充分 混勻；
[0039] 步驟3):過濾滅菌，再調節pH值至7.4±0.2，最后加入純化水將提及調節至lOL
[0040] 步驟4):培養基配制完成后，過濾滅菌，分裝、封口，最后冷藏(-20°C環境)備用。 [0041 ] 應用例1和應用例2
[0042] 人外周血單個核細胞分離
[0043] 人工采集外周血50-100ml，入兩個50ml離屯、管中。首先在2000巧m轉速下離屯、8分 鐘，留下血細胞沉淀。用人淋己細胞分離液分離單個核細胞，按體積比1:1用生理鹽水懸浮 血細胞。20(K)rpm轉速下離屯、20分鐘。離屯、好的樣品從上至下依次為：生理鹽水和少量血漿 層;單個核細胞層(核細胞層為少量白色層）、淋己分離液層W及粒細胞紅細胞層。將單個核 細胞層吸出轉移到1個50ml離屯、管中。
[0044] 向收集單個核細胞的離屯、管中添加生理鹽水至45ml，旋緊蓋子顛倒混勻，進行3次 梯度離屯、洗涂(依次為：180化pm轉速離屯、8分鐘、150化pm轉速離屯、8分鐘、120化pm轉速離屯、 8分鐘），離屯、溫度為20°C，最后收集細胞沉淀，獲得CIK(切tokine-Induced Ki 1 ler，細胞因 子誘導的殺傷細胞)細胞，加入本發明實施例1的無血清培養基使得細胞濃度調整至1.2X 106 個/ml。
[0045] 應用例1:采用市售的FiberCell品牌C2025型號的高密度細胞培養桶（參見 門berCell細胞培養系統產品銷售網頁），W及本發明實施例1獲得的無血清培養基進行CIK 細胞的培養。
[0046] 將5mlCIK細胞濃度為1.2 X 106個/ml的培養基用注射器載入上述的高密度細胞培 養桶中，再將25ml實施例1獲得的無血清培養基加入到50ml儲液瓶中（CIK細胞的接種密度 為2 X 105個/ml);具體地，儲液瓶中的培養基通過硅膠管與細胞培養桶連接，在蠕動累的作 用下，持續循環流動，培養基通過細胞培養桶的中空纖維進行交換，給細胞培養桶內的細胞 不斷的提供營養物質;將整個高密度細胞培養桶放入5%C02,37°C的培養箱中培養。
[0047] 應用例2:具體過程與應用例1相同，不同在于采用實施例2獲得的無血清培養基進 行CIK細胞的培養。
[004引效果數據
[00例對比例1:采用市售的FiberCell品牌C2025型號的高密度細胞培養桶（參見 門berCell細胞培養系統產品銷售網頁），W及市售的友康品牌(NC0101)常規RPMI1640免疫 細胞無血清培養基，培養過程與應用例1相同，具體不再寶述。
[0050] 對比例A:采用市售的Corning品牌T75型號的細胞培養瓶，W及市售的友康品牌 (NC0101)常規RPMI1640免疫細胞無血清培養基;具體的，在T75培養瓶中加入10ml常規免疫 細胞無血清培養基，用移液器加入2mlCIK細胞濃度為1.2 X 106個/ml的常規無血清培養基 (CIK細胞的接種密度為2 X 105個/ml)進行懸浮培養，將培養瓶放入5 % C〇2，37 °C的培養箱中 培養14天，觀察儲液瓶中培養基顏色，當培養基顏色變黃時，需要更換培養基（一般在第5 天、第10天更換培養基）。
[0051] 分別檢測應用例1、應用例2、對比例1和對比例A的細胞增殖速率W及細胞存活率。
[0052] 檢測細胞增殖速率
[0化3] 應用例1和應用例2, W及對比例1和對比例A，均在培養1、3、6、10、12和14天后，分 別取樣培養液，進行細胞濃度的檢測，檢測結果參見下表1。
[0054]表 1
[0化5]
[0056]檢測細胞存活率
[0057]培養14天后，收集各組的培養液，進行流式檢測。檢測結果如下：
[005引應用例1的細胞存活率:96.5% ;應用例2的細胞存活率:94.4% ;對比例1的細胞存 活率:89.9% ;對比例A的細胞存活率:92.3%。
[0059] 將上述的結果進行對比可W看出，一方面，對比例1的細胞增殖速率W及細胞存活 率(細胞培養效果)的結果稍劣于對比例A的結果，運說明：常規的RMPI1640免疫細胞無血清 培養基更適合于諸如細胞瓶之類的傳統小規模培養體系，不適合高密度細胞培養體系；另 一方面，本發明應用例1的細胞增殖速率和細胞存活率遠高于對比例1的，運說明：本發明實 施例的免疫細胞無血清細胞培養基相比常規的RMPI1640免疫細胞培養基更適合于高密度 細胞培養體系。
[0060] 應當理解，雖然本說明書按照實施方式加 W描述，但并非每個實施方式僅包含一 個獨立的技術方案，說明書的運種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說 明書作為一個整體，各實施方式中的技術方案也可W經適當組合，形成本領域技術人員可 W理解的其他實施方式。
[0061] 上文所列出的一系列的詳細說明僅僅是針對本發明的可行性實施方式的具體說 明，它們并非用W限制本發明的保護范圍，凡未脫離本發明技藝精神所作的等效實施方式 或變更均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種適用于高密度細胞培養體系的免疫細胞的無血清培養基，其包括基礎培養基和 添加組分，其中， 所述基礎培養基為RPMI 1640; 所述添加組分及其濃度如下： 人白蛋白，12-16g/L; 轉鐵蛋白，20-25mg/L; 人重組膜島素，24_30mg/L; L-谷氨酰胺，8-10g/L; HEPES，5-7g/L;以及 白介素-2，3 X 105-8 X 105IU/L; 各添加組分的濃度以所述無血清培養基的總體積為基準。2. 如權利要求1所述的無血清培養基，其特征在于： 以所述無血清培養基的總體積為基準，所述RMPI 1640培養基的干粉量為14.8-19.8g/ L〇3. 如權利要求2所述的無血清培養基，其特征在于： 以所述無血清培養基的總體積為基準，所述RMPI 1640培養基的干粉量為18g/L，所述 人白蛋白的濃度為13g/L，所述轉鐵蛋白的濃度為22mg/L，所述人重組胰島素的濃度為 27mg/L，以及所述L-谷氨酰胺的濃度為9g/L。4. 如權利要求2所述的無血清培養基，其特征在于： 所述HEPES的濃度為6g/L。5. 如權利要求2所述的無血清培養基，其特征在于： 所述白介素-2的濃度為5X105IU/L。6. 如權利要求1至5中任意一項所述的無血清培養基，其特征在于： 所述添加組分還包括慶大霉素和鏈霉素，所述慶大霉素的濃度為1 X 1〇5_4 X 105IU/L， 所述鏈霉素的濃度為1 X 1〇5-4 X 105IU/L。7. 如權利要求6所述的無血清培養基，其特征在于： 所述添加組分還包括酚紅鈉，所述酚紅鈉的濃度為5_7mg/L; 所述無血清培養基的pH值為7.2~7.6。8. 如權利要求1至7中任意一項所述的無血清培養基在免疫細胞的高密度細胞培養體 系中的應用。9. 如權利要求8所述應用，其特征在于：所述高密度細胞培養體系為高密度細胞培養 桶。10. 如權利要求8所述應用，其特征在于:所述免疫細胞為CIK細胞。
【文檔編號】C12N5/078GK106047807SQ201610693939
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月19日
【發明人】顏學恒, 周艷
【申請人】上海逍鵬生物科技有限公司