豬多能干細胞定向誘導分化為雄性生殖細胞的方法及專用培養基的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種豬多能干細胞定向誘導分化為雄性生殖細胞的方法及專用培養基。本發明提供了專用培養基，包括EpiLC誘導培養基、PGCLC誘導培養基和SSCLC誘導培養基；本發明的實驗證明，本發明提供了在體外將豬多能干細胞向原始生殖細胞樣細胞(PGCLC)定向誘導分化的方法，PGCLC可以進一步誘導分化形成精原干細胞樣細胞(SSCLC)；在體內，將誘導的細胞注射到去除內源精子的小鼠曲細精管中，PGCLC和SSCLC可以存活并進一步發育。因此，本發明為豬多能干細胞向生殖細胞的定向分化提供了可行有用的方案，為探索生殖細胞發育機制等奠定了基礎。
【專利說明】
豬多能干細胞定向誘導分化為雄性生殖細胞的方法及專用培 養基
技術領域
[0001] 本發明設及生物技術領域，尤其設及一種豬多能干細胞定向誘導分化為雄性生殖 細胞的方法及專用培養基。
【背景技術】
[0002] 2003年，￥日7〇;11'〇7〇〇4日等通過將小鼠胚胎干細胞(血131'〇]1；[。8161110611,650培 養形成擬胚體巧mbryoid body,EB)的方式，可W檢測到相當于體內發育過程中胎兒性腺中 集聚的生殖細胞;在體內實驗中，研究人員檢測到外源細胞分化得到的精子，通過聚合酶鏈 式反應(PCR)進行了驗證。該文章未檢測誘導分化的精子激活卵細胞的能力。2004年，Niels Geijsen等從視黃酸(RA)培養的邸中分離出來原始生殖細胞(PGC)，并繼續培養得到胚胎生 殖細胞系;EB中的PGC可W發育成單倍體精子，將得到的單倍體精子注射到卵母細胞中，可 W激活卵母細胞形成囊胚樣結構，但是該文章未檢測后續胚胎發育情況。2006年，Karim Nayernia等首次報道了體外分化小鼠 ESC形成雄性配子，并且能產生小鼠后代。但是小鼠生 長異常，出生出現死亡現象。2007年，Alexan化e Kerkis等通過RA將小鼠 ESC形成的邸分化 形成雄性和雌性兩種生殖細胞。2009年，Zhuo化等過表達化zl基因，可W促進ESC形成卵泡 樣結構和曲細精管樣的結構;將得到的單倍體細胞進行胞質注射后，卵母細胞發育至化細胞 階段。2010年，Masanori Imamura等將誘導多能干細胞（iPSC)與表達BMP4蛋白的細胞進行 共培養進行分化，但是分化效率不高;為提高誘導效率，研究者將表達BMP4的細胞進行了改 造，即通過逆轉錄病毒轉入S個基因 GDNF/SCF/EGF，再將iPSC與此改造的細胞進行共培養， 可^更快地出現乂454陽性的細胞。2011年，5曰;[1:011實驗室1(曰131111化0化7曰311；[等研究人員在 將小鼠 ESC和iPSC先分化成上胚層干細胞樣細胞化piLC)，再進一步分化成PGC樣的細胞 (PGCLC)。由過渡態化iLC分化成PG化C的過程中，使用的培養體系主要含有細胞因子BMP4/ BMP8a/SCF/EGF/LIF等。通過曲細精管注射，將得到的PG化C移植到白消安處理的小鼠曲細 精管中，兩個月后，可W分離得到精子;通過胞質注射，可W得到ESC/iPSC來源的小鼠后代。 2012年，Yong Zhu等結合體外誘導分化和體內曲細精管注射的方法將小鼠 iPSC分化成精原 干細胞(SSC)及其分化后期的雄性生殖細胞，但是該文獻沒有進行功能等方面的實驗研究。 2013年，5曰11011實驗室化11110化1?1^等在小鼠65(：中過表達轉錄因子口1?011/口1?0114/ TFAP2C。先將ESC分化形成化iLC;不需要外源細胞因子進行刺激，直接將化iLC快速有效地 分化成PG化C，運些轉錄因子誘導的PG化C能夠完成生精過程，將得到的精子注射到卵母細 胞中，通過胞質注射，可W得到小鼠后代。2014年，化ng化ng Li等將iPSC誘導成PG化C，運些 PG化C能夠表達生殖細胞標記基因，體內移植到不育小鼠的曲細精管中也能夠恢復生精過 程。同年，Tohru Kimura等通過抑制E服信號通路可W有效地將小鼠 ESC誘導形成PG化C。在 中胚層分化體系中，通過MEK抑制劑可W抑審化服信號通路，可W激活生殖細胞的分化。2016 年，Kazuhir0 Murakami等發現NAN0G可W不依賴BMP4而直接將EpiLC誘導成PG化C。同年， Quan Zhou等不依賴于體內分化實驗，直接在體外完成小鼠 ESC的減數分裂，得到單倍體精 子，通過胞質注射等得到可育的小鼠后代。該文章首次報道了完全在體外，可W將ESC分化 成有功能的單倍體精子細胞。
[0003] 小鼠多能細胞分化成生殖細胞已取得很大的研究進展，在人多能干細胞向生殖細 胞分化的研究上也取得了突破的進展。2004年，Amander T.Clark等在體外將人ESC培養形 成EB，在運些邸中可檢測到未成熟的生殖細胞向成熟生殖細胞的轉變。2008年，Katarzyna Tilgner等提供了一個從人ESC中分離PGC的方法。先將人ESC分化形成邸，再通過流式細胞 儀分選出來SSEA1陽性的細胞，該細胞高表達VASA基因，并且在表觀遺傳學方面，與體內發 育的PGC類似，運些體外誘導的細胞能夠合成聯會復合體的成分，但不能進入減數分裂階 段。2009年，Kehkooi Kee等通過過表達或者沉默DA化，可W調控人類生殖細胞的形成和發 育。除了通過轉基因的方式進行誘導分化，Tae Sub化rk等通過與人胎兒性腺細胞共培養 的方式，將人的ESC和iPSC分化為PGCeNathan Bucay等通過減少人ESC克隆的大小W及控制 其飼養周期，加快誘導的PGC出現。2010年，Sarita化nula等比較了人ESC和iPSC分化為PGC 及其進行減數分裂的能力。2011年，C.Eguizabal等第一次在沒有進行過表達生殖細胞相關 的轉錄因子前提下，將人iPSC體外分化成減數分裂后期的生殖細胞。2012年，Charles A.Easley IV等僅通過使用精原干細胞培養體系對人ESC/iPSC直接進行分化，形成不同階 段的雄性生殖細胞。2013年，口曰1:〇111口〇]1胖〇]1邑付曰1?)〇雌曰16等發現51'化1^\基因有利于人65〔向 生殖細胞和內胚層細胞系的分化。Peng Li等通過體外培養iPSC形成邸，再通過RA或者睪酬 的誘導，形成雄性生殖細胞。2014年，Renee A.Reijo化ra研究組將人的iPSC移植到不育小 鼠的曲細精管內進行研究。使用因子0CT4/S0X2/KLF4/MYC/VASA進行重編程得到的iPSC移 植到曲細精管中，他們會與支持細胞相連，定向分化成PGC，表達不同階段生殖細胞特定的 標記蛋白；而使用傳統四因子0CT4/S0X2/KLF4/MYC進行重編程得到的iPSC在曲細精管中， 更傾向于形成像癌樣組織的細胞團塊。2015年，化oko Irie等發現內胚層標記基因 S0X17是 人PG化Cs最早的一個標記基因，是人PG化C命運的關鍵調控者，運和小鼠有著很大的不同。 同年，Fumihiro Sugawa等通過無血清培養體系將人ESC/iPSC分化形成遷移前的PG化C。 Ko化ro Sasaki等將人iPSC分化形成中間過渡態細胞--中胚層樣的細胞，再進一步分化 形成PG化C。
[0004] 作為家畜大動物，豬是重要的農業經濟動物，在形態學、生理學、解剖學W及代謝 等方面與人有著很大的相似性，因此，豬多能干細胞在遺傳育種上、再生醫學W及建立疾病 模型等方面具有廣闊的應用前景。盡管小鼠和人多能干細胞向生殖細胞的定向誘導分化已 經取得突破，但是豬多能干細胞向生殖細胞的誘導分化仍具有很大的挑戰性。作為遺傳物 質的傳遞者，生殖細胞是物種進化及生命延續所必需的細胞群，在生命循環中占有著重要 的地位。如果豬多能干細胞可W向生殖細胞分化，不僅可W作為優良的種質資源，在育種等 方面有著更為重要的作用。
【發明內容】
[0005] 本發明一個目的是提供一種豬多能干細胞定向誘導分化為雄性生殖細胞的專用 培養基。
[0006] 本發明提供的專用培養基，包括化i LC誘導培養基、PGCLC誘導培養基和SS化C誘導 培養基；
[0007]所述化iLC誘導培養基中含有bFGF(成纖維細胞生長因子)和ActivinA(激活素 A)， 且所述bFGF在所述化iLC誘導培養基中的濃度為8-16ng/mL，所述ActivinA在所述化iLC誘 導培養基中的濃度為12-20ng/mL。
[000引所述PG化C誘導培養基中含有BMP4(骨形成蛋白4)、BMP8a(骨形成蛋白8a)、SCF(干 細胞因子）、EGF(表皮生長因子)和LIF(白血病抑制因子），且所述BMP4在所述PG化C誘導培 養基中的濃度為30-100ng/mL，所述BMP8a在所述PG化C誘導培養基中的濃度為30-100ng/ mL，所述SCF在所述誘導PG化幻秀導培養基中的濃度為30-100ng/mL，所述EGF在所述PG化幻秀 導培養基中的濃度為30-100ng/mL，所述LIF在所述誘導PG化C誘導培養基中的濃度為500- 1500U/mL0
[0009] 所述SS化C誘導培養基中含有睪酬、RA(視黃酸)和GDNF(神經膠質細胞源性的神經 營養因子），且所述的睪酬在所述SS化C誘導培養基中的濃度為0.5-lOiiM，所述RA在所述 SS化幻秀導培養基中的濃度為0.5-10測，所述GDNF在所述誘導SS化幻秀導培養基中的濃度為 2-20ng/mL〇
[0010] 上述培養基中，所述EpiLC誘導培養基中，所述bFGF在所述化iLC誘導培養基中的 濃度為12ng/mL，所述ActivinA在所述化iLC誘導培養基中的濃度為20ng/mL。
[0011] 所述PG化C誘導培養基中，所述BMP4在所述PG化幻秀導培養基中的濃度為50ng/mL， 所述BMP8a在所述PG化C誘導培養基中的濃度為50ng/mL，所述SCF在所述PG化C誘導培養基 中的濃度為50ng/mL，所述EGF在所述PG化C誘導培養基中的濃度為50ng/mL，所述LIF在所述 PG化幻秀導培養基中的濃度為1 OOOU/mL。
[0012] 所述SS化C誘導培養基中，且所述的睪酬在所述SS化C誘導培養基中的濃度為化M， 所述RA在所述SS化C誘導培養基中的濃度為化M，所述GDNF在所述SS化C誘導培養基中的濃 度為 4ng/mL。
[0013] 上述培養基中，所述EpiLC誘導培養基由KSC血清替代物（Knockout? Serum Replacement)、N2、B27、GlutaMAX(谷氨酷胺）、Nonessentialaminoacids(非必需氨基 酸）、2-Me;rcaptoethanol(0琉基乙醇）、DMEM、bFGF和ActivinA組成。
[0014] 所述KSC血清替代物在所述化iLC誘導培養基中的體積百分含量為1 %-5%。
[0015] 所述N2在所述化iLC誘導培養基中的體積百分含量為1%。
[0016] 所述B27在所述化iLC誘導培養基中的體積百分含量為2%。
[0017] 所述GlutaMAX在所述化iLC誘導培養基中的體積百分含量為1 %。
[0018] 所述Nonessential amino acids在所述EpiLC誘導培養基中的體積百分含量為 1%。
[0019] 所述2-Me;rcaptoethanol在所述化iLC誘導培養基中的體積百分含量為0.1%。
[0020] 所述DMEM在所述化iLC誘導培養基中的體積百分含量為93.9-89.9%。
[0021 ] 所述?6化幻秀導培養基由KSC血清替代物、GlutaMAX、Nonessential amino acids、 2-]?6'。日口1〇6地日11〇1、6161、81口4、61口8日、5〔尸、66尸和1^尸組成。
[0022] 所述KSC血清替代物在所述PG化C誘導培養基中的體積百分含量為15%。
[0023] 所述GlutaMAX在所述PG化C誘導培養基中的體積百分含量為1 %。
[0024] 所述Nonessential amino acids在所述PG化C誘導培養基中的體積百分含量為 1%。
[00巧]所述2-Mercaptoethanol在所述PG化C誘導培養基中的體積百分含量為0.1%。 [00%] 所述GMEM在所述PG化C誘導培養基中的體積百分含量為82.9%。
[0027]所述SSCLC誘導培養基由FBS、GlutaMAX、Nonessential amino acids、2- Mercaptoethanol、DMEM、睪酬、RA 和 GDNF 組成。
[00%]所述FBS在所述SS化C誘導培養基中的體積百分含量為15%。
[0029] 所述GlutaMAX在所述SS化C誘導培養基中的體積百分含量為1 %。
[0030] 所述Nonessential amino acids在所述SS化C誘導培養基中的體積百分含量為 1%。
[0031] 所述2-Mercaptoethanol在所述SS化C誘導培養基中的體積百分含量為0.1 %。
[0032] 所述DMEM在所述SS化C誘導培養基中的體積百分含量為82.89%。
[0033] 上述培養基還包括iPSCs細胞培養基，
[0034] 所述 iPSCs 細胞培養基含有 LIF、PD0325901 和 CHIR99021。
[0035] 所述UF在所述iPSCs細胞培養基中的體積百分含量為0.01%。
[0036] 所述PD0325901在所述iPSCs細胞培養基中的濃度為1-3測。
[0037] 所述CHIR99021在所述iPSCs細胞培養基中的濃度為1-3測。
[003引和/或，
[0039] 所述PD0325901在所述iPSCs細胞培養基中的具體濃度為1測。
[0040] 所述CHIR99021在所述iPSCs細胞培養基中的具體濃度為3iiM。
[0041 ] 上述培養基中，所述iPSCs細胞培養基由FBS、GlutaMAX、Nonessential amino 曰。1(13、2-]\16'。日91〇6地日11〇1、016]\1、1^、？00325901和邸11?99021組成。
[0042] 所述FBS在所述iPSCs細胞培養基中的體積百分含量為15%。
[0043] 所述GlutaMAX在所述iPSCs細胞培養基中的體積百分含量為1 %。
[0044] 所述Nonessential amino acids在所述iPSCs細胞培養基中的體積百分含量為 1%。
[0045] 所述2-Mercaptoethanol在所述iPSCs細胞培養基中的體積百分含量為0.1%。
[0046] 所述DMEM在所述iPSCs細胞培養基中的體積百分含量為82.89%。
[0047] 本發明另一個目的提供一種豬多能干細胞定向誘導分化為精原干細胞樣細胞的 方法。
[004引本發明提供的方法，為如下A或B，
[0049] A所示的方法包括如下步驟：
[0050] 1)將離體的豬多能干細胞在上述中的所述EpiLC誘導培養基中誘導培養，得到上 胚層干細胞樣細胞；
[0051] 2)將所述上胚層干細胞樣細胞在上述中的所述PG化C誘導培養基中誘導培養，得 到原始生殖細胞樣細胞；
[0052] 3)將所述原始生殖細胞樣細胞在上述中的所述SSCLC誘導培養基中誘導培養，得 到精原干細胞樣細胞。
[0053] B所示的方法包括如下步驟：
[0054] a)將離體的豬多能干細胞在上述中的所述EpiLC誘導培養基中誘導培養，得到上 胚層干細胞樣細胞；
[0055] b)將所述上胚層干細胞樣細胞在上述中的所述SS化C誘導培養基中誘導培養，得 到精原干細胞樣細胞。
[0056] 上述方法中，步驟1)中，所述誘導培養的時間為1-3天，
[0057] 步驟2)中，所述誘導培養的時間為1-3天，
[0058] 步驟3)中，所述誘導培養的時間為2-20天，
[0059] 步驟a)中，所述誘導培養的時間為1-3天，
[0060] 步驟b)中，所述誘導培養的時間為2-20天。
[0061] 和/或，步驟1)中，所述誘導培養的時間具體為2天，
[0062] 步驟2)中，所述誘導培養的時間具體為2天，
[0063] 步驟3)中，所述誘導培養的時間具體為5-20天或7-15天，
[0064] 步驟a)中，所述誘導培養的時間具體為2天，
[0065] 步驟b)中，所述誘導培養的時間具體為5-20天或7-15天。
[0066] 本發明第=個目的是提供一種豬多能干細胞定向誘導分化為原始生殖細胞樣細 胞的方法，包括如下步驟：
[0067] 1)將離體的豬多能干細胞在上述中的所述EpiLC誘導培養基中誘導培養，得到上 胚層干細胞樣細胞；
[0068] 2)將所述上胚層干細胞樣細胞在上述中的所述PG化C誘導培養基中誘導培養，得 到原始生殖細胞樣細胞。
[0069] 上述方法中，
[0070] 步驟1)中，所述誘導培養的時間為1-3天，
[0071] 步驟2)中，所述誘導培養的時間為1-3天，
[0072] 和/或，步驟1)中，所述誘導培養的時間具體為2天，
[0073] 步驟2)中，所述誘導培養的時間具體為2天。
[0074] 上述的方法制備的精原干細胞樣細胞也是本發明保護的范圍；
[0075] 或上述的方法制備的原始生殖細胞樣細胞也是本發明保護的范圍；
[0076] 或上述的方法或上述的方法或所述精原干細胞樣細胞或所述原始生殖細胞樣細 胞在精子發育研究中的應用也是本發明保護的范圍。
[0077] EpiLC誘導培養基為將多能干細胞誘導培養成化iLC的培養基；
[0078] PG化C誘導培養基為將化iLC誘導培養成PG化C的培養基；
[00巧]SS化C誘導培養基為將PG化C/化iLC誘導培養成SS化C的培養基。
[0080] 步驟1)中，所述誘導培養的時間為2天，每天換一次培養基；
[0081] 步驟2)中，所述誘導培養的時間為2天，兩天換一次培養基；
[0082] 步驟3)中，所述誘導培養的時間為7-15天，兩天換一次培養基；
[0083] 步驟a)中，所述誘導培養的時間為2天，每天換一次培養基；
[0084] 步驟b)中，所述誘導培養的時間為7-15天;兩天換一次培養基。
[0085] 本發明的實驗證明，本發明提供了在體外將豬多能干細胞向原始生殖細胞樣細胞 (PG化C)定向誘導分化的方法，PG化C可W進一步誘導分化形成精原干細胞樣細胞(SS化C); 在體內，將誘導的細胞注射到去除內源精子的小鼠曲細精管中，PG化C和SS化C可W存活并 進一步發育。因此，本發明為豬多能干細胞向生殖細胞的定向分化提供了可行有用的方案， 為探索生殖細胞發育機制等奠定了基礎。
【附圖說明】
[0086] 圖1為豬iPSC具有多能性及分化潛能；
[0087] (a)豬iPSC克隆形態，標尺=100皿；（b)堿性憐酸酶(AP)染色，標尺=10皿；（C)免 疫巧光染色檢測多能性基因，細胞核用DAPI染色(呈藍色），標尺=50皿；（d)體外形成擬胚 體(Emkryoid body,邸），標尺=100]im; (e)免疫巧光染色檢測邸分化的S胚層標記蛋白，細 胞核用DAPI染色（呈藍色），標尺=sown; (f)免疫巧光染色檢測iPSC分化為神經細胞， 肥STIN、TUJ巧日GFAP分別是神經祖細胞、神經元和星形膠質細胞的標記蛋白，細胞核用DAPI 染色(呈藍色），標尺= 25wii;(g)油紅0和尼羅紅染色檢測iPSC向脂類分化，標尺= 50wii。
[008引圖2為豬iPSC向PG化C的誘導；
[0089] (a)將豬iPSC誘導分化為雄性生殖細胞的流程圖；（b化piles的形態圖，標尺= 50y m;(c化piLC誘導過程中基因表達情況分析，iPSC作為對照，兩次生物學重復，*0.001《p《 0.05;**p<0.001;(d) PGCLC的形態圖，標尺=50皿；（e) PG化C誘導過程中基因表達情況分 析，iPSC作為對照，兩次生物學重復，d0、dl、d3、d5和d7分別是第0、1、3、5和7天的縮寫，* 0.001《口《0.05;(門免疫巧光染色檢測口6化(：中口6(：標記蛋白，細胞核用04口1染色（呈藍 色），標尺=50皿。
[0090] 圖3為豬PG化C的表觀遺傳學特征；
[0091] (a和C)免疫巧光染色檢測PG化C中的冊K9me2(a)和冊K27me3(c)，細胞核用DAPI染 色（呈藍色），標尺= 100皿；（b和d)使用ImageJ軟件定量分冊K9me2(b)和H3K27me3(d)的巧 光密度，iPSC作為對照，*p《0.05001; (e)亞硫酸鹽分析印記基因甲基化，白色和 黑色圓圈分別代表CpG島去甲基化和甲基化。
[0092] 圖4為豬PG化C誘導過程中的轉錄組概況；
[0093] (a)基因表達的層次聚類分析圖；（b)RNA-seq數據的主成分分析圖；（c)iPSC和 EpiLC中E：piSC標記基因的heatmap圖；（d)與生殖細胞相關基因的heatmap圖，D3/D5/D7,指 PGCLC誘導分化的第3/5/7天；（e)q-PCR分析heatmap中選擇的基因，兩次生物學重復，* 0.001《p《0.05;**p<0.001; (f)基因本體圖（Gene ontology,GO)。
[0094] 圖5為豬iPSC向SS化C的誘導；
[00M] (a)SS化C的形態圖（i和ii)，標尺=200皿。。和ii);(b)SS化C誘導過程中基因表 達情況分析，iPSC作為對照，兩次生物學重復，d0、d3、d7和d9分別是第0、3、7和9天的縮寫，* 0.001《p《0.05;(c)免疫巧光染色檢測SSC標記蛋白，細胞核用DAPI染色（呈藍色），（d)免 疫巧光染色檢測SS化C中的H3K9me2(a)和H3K27me3(c)，細胞核用DAPI染色（呈藍色），標尺 = 100]im〇(ii和iv)Quantification of relative H3K9me2(ii)和H3K27me3(iv)使用 Image J軟件定量分冊K9me2 (b)和冊K27me3 (d)的巧光密度，iPSC作為對照，*p《0.05;(e)亞 硫酸鹽分析印記基因甲基化，白色和黑色圓圈分別代表CpG島去甲基化和甲基化；SSCIX指 從第0天PG化C誘導的SS化Cs;P化巧旨從第3天PG化C誘導的SS化C。；（f)流式分析DNA含量， 1口5(：、口51(：和55化(：中單倍體細胞比例分別是0.31%，1.23%和3.22%;(邑)從豬睪丸中分離 的精原細胞中SSC標記基因的表達，iPSC作為對照，兩次技術重復。
[0096]圖6為曲細精管注射PG化C;
[0097] (a)注射細胞后的小鼠睪丸，標尺=1mm; (b)移植PG化C后小鼠睪丸的肥染色，黑色 箭頭指每個小管，標尺=50皿；（C)正常小鼠睪丸的皿染色，標尺=50皿;（d)白消安處理后 缺失內源精子的小鼠睪丸肥染色，標尺=50皿；（e)移植PG化C后的曲細精管，紅色箭頭指供 體細胞形成的細胞鏈，澄色箭頭指供體細胞形成的細胞簇，標尺= 500]im; (f )PCR檢測供體 細胞；（g)免疫組化檢測PG化C移植后睪丸中的生殖細胞標記蛋白，細胞核用DAPI染色(呈藍 色），標尺= 500皿。
[0098] 圖7為曲細精管注射SS化C;
[0099] (a)移植SS化C后的曲細精管，白色箭頭指供體細胞形成的細胞簇，黑色箭頭指單 個的小管，標尺=500曲1; (b)移植SS化C后小鼠睪丸的皿染色，標尺=50皿；（C)免疫組化檢 ^USSCLC移植后睪丸中的生殖細胞標記蛋白，細胞核用DAPI染色(呈藍色），標尺= 500wii。
[0100] 圖8為免疫組化檢測不含有綠色供體細胞的曲細精管；
[0101] (a)皿染色檢測移植后不含供體細胞睪丸中的生殖細胞標記蛋白標尺=50化m; (b)免疫組化檢測移植后不含供體細胞睪丸中的生殖細胞標記蛋白，細胞核用DAPI染色(呈 藍色），標尺=500皿。
【具體實施方式】
[0102] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0103] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0104] 實施例1、豬多能干細胞定向誘導分化為雄性生殖細胞
[0105] -、定向誘導分化培養基的配置
[0106] 表1為iPSCs細胞培養基（iPSC培養基)配方
[0107]
[0108] 表2為化iLC培養基配方
[0109]
「ni 1/11
[0115] 二、定向誘導分化
[0116] 在本研究中，為了在體內試驗中追蹤外源細胞，使用含有ZsGreen(綠色）的豬 iPSC，該細胞具有多能性及分化潛能，并且能初步定向分化形成神經及脂類細胞，見圖1。
[0117] 在小鼠和人多能干細胞定向誘導分化成生殖細胞的基礎上，優化培養體系，形成 豬iPSC誘導為生殖細胞的方法及流程，見圖2曰。
[011引豬成纖維細胞的分離及iPSC的制備:取胚胎期35天的豬胎兒，放于細胞培養皿中， 用含有雙抗DPBS洗S遍后，去除頭部、四肢W及內臟，將剩余部分轉移到新的細胞培養皿 中；用含有雙抗的DPBS洗S遍，用滅菌后的剪刀將組織剪碎，然后將其轉移到50mL離屯、管 中，加入膜酶，37 °C水浴鍋中振蕩消化15min;加入含有血清的培養基W終止消化，并吹散團 塊;離屯、1500巧m，5min，棄去上清，用新鮮的培養液重懸，將重懸液轉移到10cm細胞培養皿 中，再補充培養基至lOmL，放入37 °C細胞培養箱培養，此時細胞為第0代，即P0 ;培養3-4天 后，細胞長滿，進行傳代W及凍存，該細胞稱為豬胚胎成纖維細胞(PEF);
[0119] 含有ZsGreen(綠色）的豬iPSC為將0ct4基因、Sox2基因、Klf4基因、c-Myc基因、 Nanog基因、Tbx3基因和Lin28基因導入離體豬胚胎成纖維細胞(PE巧中，得到的細胞。
[0120] 上述基因相關信息如下：
[0121] 0ct4(NM_001113060.1,18-0CT-2015),
[0122] Sox2(NM_001123197.1,25-MAY-2014),
[0123] Klf4(NM_001031782.2,18-0CT-2015),
[0124] c-Myc(NM_001005154.1,24-DEC-2015),
[01 巧]Nanog(NM_001129971，05-APR-2015),
[01 %] Tbx3(XM_001928002.3，11-沈P-2015)，
[0127] Lin28(NM_001123133.1,18-0CT-2015)
[0128] 上述基因通過逆轉如病毒導入PEF細胞中，培養陽F，陽F隨后會發生形變，待轉入 外源因子30天后，挑取單克隆，將單克隆消化成單細胞，鋪到飼養層細胞上，待細胞長大長 滿，即可傳代，此細胞成為iPSC。
[0129] 1、豬誘導多能干細胞iPSC向原始生殖細胞樣細胞PG化C的體外誘導分化
[0130] 1)用Tryple將生長于飼養層細胞上的離體iPSC消化成單細胞，離屯、1000巧m， 5min，棄去上清，得到iPSC細胞沉淀；
[0131] 2)加2mL EpiLC誘導培養基重懸步驟1)處理得到的iPSC細胞，混合均勻，將細胞懸 液轉移到鋪有明膠板的六孔板培養皿中，細胞密度約為4X 105細胞/孔，每天換一次EpiLC 誘導培養基，誘導培養兩天，用化yple將細胞消化成單細胞，離屯、lOOOrpm，5min，棄去上清， 用新鮮化iLC誘導培養基重懸細胞，得到化iLC細胞(圖化）；
[0132] 3)將步驟3)應為步驟2)處理得到的化iLC細胞在PG化C誘導培養基中誘導培養，兩 天換一次培養基，得到PG化C細胞。
[0133] 上述誘導培養時間為2-15天。
[0134] 若在9抓型底培養皿中，細胞密度約為1000細胞/孔;若在六孔板培養皿中，細胞密 度約為2X105細胞/孔。
[0135] 2、原始生殖細胞樣細胞PG化C定向誘導分化為豬精原干細胞樣細胞SS化C
[0136] 用Tryple消化上述1的步驟3)中誘導培養3天（開始誘導時記為第0天）得到的 PG化C細胞，離屯、lOOOrpm，5min，棄去上清收集細胞沉淀;將細胞沉淀在SS化C誘導培養基混 合均勻，得到細胞懸液，進行細胞計數，并將細胞懸液轉移到鋪有明膠板的12孔板細胞培養 皿中，細胞密度約為2 X 105細胞/孔，兩天換一次培養基，誘導培養，得到SS化C細胞。
[0137] 上述誘導培養時間為2-15天。
[0138] 3、將上胚層干細胞樣細胞化iLC定向誘導分化為豬精原干細胞樣細胞SS化C
[0139] 用Tryple消化上述1的步驟2)中誘導培養2天（開始誘導時記為第0天）得到的 EpiLC細胞，離屯、lOOOrpm，5min，棄去上清收集細胞沉淀;將細胞沉淀在SS化C誘導培養基混 合均勻，得到細胞懸液，進行細胞計數，并將細胞懸液轉移到鋪有明膠板的12孔板細胞培養 皿中，細胞密度約為2 X 105細胞/孔，兩天換一次培養基，誘導培養，得到SS化C細胞。
[0140] 上述誘導培養時間為2-15天。
[0141] 實施例2、檢測
[0142] I、PG化C與SS化C分子水平和表觀遺傳檢測
[0143] 一、PG化C與SS化C標志基因及標志蛋白的檢測方法
[0144] 1、細胞樣品的收集
[0145] iPSC樣品的收集：因為iPSC生長再飼養層細胞上，因此收集樣品提取RNA的時候， 需要先去除飼養層細胞。利用兩種細胞貼壁時間差異，將其分離開。首先，將iPSC消化成單 細胞，離屯、后用新鮮的培養基重懸細胞沉淀，將細胞懸液混合均勻后移到細胞培養皿中，放 入細胞培養箱中，30minW后，大多數的飼養層細胞已經貼壁，而iPSC仍懸浮在培養液中，將 培養皿中的細胞懸液移到離屯、管中，離屯、1000巧m，5min，棄去上清，即可。
[0146] EpiLC/PGCUySSCLC樣品的收集：將細胞用化yple消化成單細胞，離屯、1000巧m， 5min，棄去上清，即可。EpiLC,誘導兩天的細胞;PGCLC，誘導第1/3/5/7天的細胞;SSCLC，誘 導第3/7/9天的細胞。
[0147] 2、RNA的提取W及mRNA反轉錄成cDNA
[014引使用QIAGEN公司的RNA提取試劑盒(貨號931636)，流程如下：
[0149] (1)用化yple將細胞消化成單細胞，離屯、1000巧m，5min，棄去上清。
[01加](2)加入35化L RLT buffer裂解細胞，充分裂解后，加入等體積的70%乙醇，混合 均勻。
[0151] (3)將混合液體轉移到RNeasy spin column中，再放于2mL收集管中，離屯、 10000巧m，30s，棄去廢液。
[0152] (4)加入80化DNase去除基因組，室溫解育15min。
[0153] (5)加入700化RW化uffer，離屯、10000巧m，30s，棄去廢液。
[0154] (6)加入500化RPE buffer,離屯、10000巧m，30s，棄去廢液，重復一次。
[01巧](7)空管離屯、1000化pm，30s，棄去廢液，棄去收集管。
[0156] (8)將RNeasy spin column轉移到新的1.5mL離屯、管中，加入50化R化se-free water，室溫靜置Imin，離屯、10000巧m，30s。測濃度。
[0157] 3、使用Promega公司的M-MLV反轉錄酶(貨號M1701)進行反轉錄，體系及條件見下。 (1)配制液體：
(4)將液體混勻，瞬離，置于PCR儀中進行反轉錄。
[015引 擊G
[0159]
[0160]
[0161]
[0162]
[0163]
[0164]
[0170] 表7
[0171]
[0172] 反應程序為95°C，5min;95°C，20s，60°C，20s，72°C，20s(45個循環）；72°C aOmin。
[0173] 本研究Q-PCR中所用的引物如下表8:
[0174] 表8 Q-PCR中所用的引物
[0175]
[0177] 5、PG化C與SS化C的標志蛋白表達分析
[0178] 將iPSC，誘導第屯天的PG化C，誘導第屯天的SS化C進行免疫巧光染色，來檢測生殖 細胞標記蛋白的表達情況。免疫巧光染色的流程，
[0179] a)棄去細胞培養基，用DPBS(Gibco，14190250)洗兩次，加入固定液（碧云天， P0098)，室溫固定化。
[0180] b)棄去固定液，加入DPBS洗3次，每次3-5min。
[0181] C)加0.2 % Tri tonX-100進行細胞膜的通透，室溫解育20min，用DPBS洗3次(膜蛋白 的免疫巧光染色省去此步驟）。
[0182] d)加入封閉液(碧云天，P0102，），室溫解育化。
[0183] e)棄去封閉液，加入一抗，室溫解育地。
[0184] f)棄去一抗，DPBS 洗 3 次。
[01化]g)加入二抗，室溫避光解育化。
[0186] h)棄去二抗，DPBS 洗 3 次。
[0187] i)加入DAPI染色Imin，DPBS洗3次，在培養皿中加入DPBS，進行觀察拍照。
[018 引所選擇的蛋白抗體(一抗)是 PRDM1、PRDM14、S0X17、STCLLA、DAZL、VASA、STRA8W 及 GFRal，一抗稀釋比例均為1 :300dST化LA(貨號abl9878,公司Abeam)，DAZL(ab：34139， Abeam)，VASA(abl3840，Abcam)，STRA8(ab49602，Abcam)，GFRal(ab84106，Abcam)，P畑Ml (9115，〔51')，口畑亂4(日628638,46。日111)，50乂17(81778，〔51')。二抗是1醇1付0邑611公司的邑0日1 anti-rabbit Alexa Fluor 594(貨號A11037)。
[0189] 二、表觀遺傳學檢測方法
[0190] 1、PGCLC與SSCLC的印記基因甲基化水平檢測
[0191] 使用QIAGEN公司的基因組提取試劑盒(貨號69504)?及幻moresearch公司的試劑 盒EZ DNA Methylation-Gold kit(貨號D5005)進行甲基化水平檢測，流程如下：
[0192] (1)基因組的提取：
[0193] a)用化yple將生長于飼養層細胞上的iPSC消化成單細胞，離屯、1000巧m，5min，棄 去上清。
[0194] b)用DPBS洗兩次，離屯、1000巧m，5min，棄去上清。
[01巧]C)加18化L A化buffer重懸細胞沉淀，加2化L蛋白酶K，混合均勻，56°C金屬浴解 育lOmin。
[0196] d)幹旋15s，加入200化AL buffer,幹旋混合均勻。
[0197] e)加入20化L無水乙醇，幹旋混合均勻。
[0198] f)將混合液體轉移到DNeasy Mini spin column中，放到2mL接收管中，離屯、 8000巧m，Imin，棄去廢液。
[0199] g)加入500化AW化uffer，離屯、8000巧m，lmin，棄去廢液。
[0200] h)加入500化 AW2buffer，離屯、14000巧m，3min，棄去廢液
[0201] i)將DNeasy Mini spin colu皿放到新的 1.5mL離屯、管中，加入60化 AE buffer， 室溫解育Imin。
[0202] j)離屯、，離屯、8000巧m，Imin，測濃度。
[0203] (2)在PCR管中加入基因組20化(質量200-500ng)，再加入Li曲tning Conversion Reagent 13化L，混合均勻，將15化L液體均分到3個PCR管中。
[0204] (3)將PCR管放到PCR儀中，程序為98°C，8min;54°C，60min;4°C，保存。
[0205] (4)加入600化 M-Binding Buffer到Zymo-Spin? IC Column中，再一起放到 Collection Tube上。
[0206] (5)將3個PCR管中的液體全部轉移到上一步的巧mo-Spin? 1C Column中，將其與 M-Binding Buffer混合均勻。
[0207] (6)離屯、aOOOOx g，30s，棄去離屯、后的廢液。
[020引 （7)在柱中加入100化M-Wash Buffer,離屯、，10000巧m，30s，棄去離屯、后的廢液。
[0209] (8)在柱中加入200化 kDesul地onation Buffer,室溫靜置20min，離屯、，:LOOOOx g，30s，棄去離屯、后的廢液。
[0210] (9)在柱中加入200化M-Wash Buffer,離屯、，10000巧m，30s，棄去離屯、后的廢液。
[0211] (10)將柱子放至1]1.5mL離屯、管中，加入 10化 M-Elution Buffer，離屯、，:L0000;rpm， 30 s，洗涂DM。樣品放于-20°C冰箱保存。
[0212] (11)巢式 PCR:
[0213] 兩輪PCR反應體系均如下表所示：
[0214] 表9
[0215]
[0216]
[0217]巢式PCR所用引物如下表所示：
[021引表10
[0219]
[0220] 反應程序如下表所示：
[0221] 表11
[09991
[0223] (12)將巢式PCR產物克隆到PMD-19T載體上，轉化，挑取單菌落進行測序。
[0224] 2、PG化C與SS化C的組蛋白甲基化水平檢測
[0225] 棄去iPSC和誘導第屯天的PG化C/SS化C培養液，DPBS洗3次，進行免疫巧光染色，流 程同上所述。所使用的抗體是H3K27me3和H2K9me2。H3K9me2(貨號ab71604，公司Abcam)， 冊K27me3(貨號ab6002,公司Abeam).
[0。6] S、PG化C的轉錄組水平檢測方法
[0227] (1)建庫測序；
[022引（2)全基因組比對；
[0229] (3)基因表達水平分析:一個基因表達水平的直接體現就是其轉錄本的豐度情況， 轉錄本豐度越高，則基因表達水平越高。在RNA-seq分析中，可W通過定位到基因組區域或 基因外顯子區的測序序列的計數來估計基因的表達水平。T0PHAT比對到參考基因組上的結 果，交給cuff 1 inks(v2.0.2)進行處理，W估計每個轉錄本的表達值。
[0230] (4)基因差異表達分析
[0231] a)基因表達水平對比
[0232] 通過所有基因的RPKM分布圖W及盒形圖對不同實驗條件下的基因表達水平進行 比較。對于同一實驗條件下的重復樣品，最終的RPKM為所有重復數據的平均值。
[0233] b)差異表達分析
[0234] 基因差異表達的輸入數據為基因表達水平分析中得到的readcount數據。對于有 生物學重復的樣品，采用edgeR(v2.2.5)進行分析，采用Quantile的Normalization方法，選 取Pvalue小于0.05并且抑R小于0.01的基因作為差異表達的基因列出。
[0235] C)表達聚類分析
[0236] 聚類分析用于判斷差異基因在不同實驗條件下的表達模式;通過將表達模式相同 或相近的基因聚集成類，從而識別未知基因的功能或已知基因的未知功能；因為運些同類 的基因可能具有相似的功能，或是共同參與同一代謝過程或細胞通路。W不同實驗條件下 的差異基因的RPKM值為表達水平，做層次聚類分析，不同顏色的區域代表不同的聚類分組 信息，同組內的基因表達模式相近，可能具有相似的功能或參與相同的生物學過程。所有樣 品的表達量整理之后，交給地eatmap進行基因和樣品的雙向聚類。聚類的目的是基于物體 的相似性將物體分為不同的組，聚類圖相當于某種意義上的分類圖，在此分析中，W表達量 差異進行比較，作為衡量關系遠近的標準。
[0237] (5)差異基因 GO富集分析
[023引 GO注釋信息下載自Ensembl的610111日的數據庫。GO的富集分析使用BiNG0(v2.44)進 行分。
[0239] 四、檢測結果
[0240] A、豬誘導多能干細胞向原始生殖細胞樣細胞PG化C的體外誘導分化
[0241 ] 1、PG化C的形成及其分子生物學水平檢測
[0242] 1)上胚層干細胞化piblast stem cellJpiSC)的標記基因檢測
[0243] 分別提取iPSC和EpiLC細胞的RNA反轉錄得到cDNA作為模板，結果如圖2c，與iPSC 相比較，EpiLC高表達上胚層干細胞化piblast stem cell,化iSC)的標記基因 T皿S/0TX2/ RAB15。
[0244] EpiLC細胞在PG化C誘導培養基中誘導培養得到PG化C細胞，在此步驟誘導培養的 前4天，隨著培養天數的增加，PGCLC會變緊實，細胞群體變大;然而，在培養第5天后，PGCLC 生長速率會下降，見圖2d。
[0245] 2)PG化C的標記基因檢測
[0246] 取在PG化C誘導培養基中誘導培養不同時間得到的PG化C細胞進行巧光實時定量 PCR(q-PCR)檢測。
[0247] 結果如圖2e，在第1/3/5/7天，多能性基因0CT4/S0X2會有一定程度的上升，而C- MYC會緩慢下降；在PG化C形成的過程中，P畑M1/P畑M14/S0X17有一定程度的上升;第1/3/5 天，STELLA會顯著上調，隨后便呈現下降趨勢；與生殖細胞晚期發育相關的基因 DA化/VASA 則僅僅有少量上調，運與小鼠 PG化C上面的報道類似。
[0248] 3)PG化C細胞標志蛋白檢測
[0249] 取在PG化幻秀導培養基中誘導培養7天得到的PG化C細胞進行免疫巧光染色。
[0250] 結果如圖2f所示，可W看出，PGCLC中較多細胞表達ST化LA蛋白，少部分細胞表達 DA化/VASA蛋白，運與RNA水平上的檢測相一致。
[0251] 運些結果表明，建立的誘導方法及流程能夠有效并快速地將豬iPSC定向誘導分化 為PG化C。
[0252] 2、PG化C的表觀遺傳學檢測
[0253] 在體內生殖細胞發育的過程中，PGC的表觀遺傳學會發生變化，包括DNA去甲基化 W及組蛋白修飾化3K27me3和冊K9me2)。因此，檢測了誘導的PG化C的印記基因甲基化水平 的表觀特性。
[0巧4] PGCLC的組蛋白甲基化水平檢測結果如圖3a-3d所示，與iPSC相比，PGCLC的 冊K27me3水平呈現上升趨勢，冊K9me2水平呈現下降趨勢。運樣的組蛋白甲基化動態變化與 體內豬胚胎期15天W后的PGC相一致。
[0巧5] 父源印記基因 IGF2/H19和母源印記基因 SNRPN的甲基化情況如下:PGCLC印記基因 甲基化水平檢測結果如圖3e所示，看出，PGCLC中兩者的甲基化水平均呈現下降趨勢。運表 明，在體外誘導的過程中，PGCLC已經啟始了印記去除運一過程。該表觀動態變化同體內遷 移的PGC W及到達性腺的PGC相一致。
[0256] 3、PG化C的轉錄組水平分析
[0巧7] 為了全面地了解PG化C的特征，通過RNA-seq技術進行PG化C轉錄組水平(mRNA)的 分析。
[0258] 誘導培養第0/3/5/7天得到的PG化C層次聚類分析結果如圖4a所示，層次聚類分析 (Unsupervised hierarchical clustering analysis，UHC分析）將細胞分為兩大群，一群 是iPSC，另一群是化iLC和PG化C。
[0259] 主成分分析(principal component analysis，PCA)也顯示了一致的結果，掲示了 iPSC，EpiLC和PGCLC之間存在差異性，并且在誘導過程中細胞呈現有方向性的轉化趨勢，見 圖4b。運些結果都表明，PG化C和iPSC有著不同的基因表達模式。
[0260] 在EpiLC的誘導第0/3/5/7天過程中，與化iSC相關的基因呈現上調趨勢，見圖4c。 運些結果與q-PCR結果相一致，見圖2c。胎atmap結果顯示，EpiLC與化iSC有相似的特征；與 iPSC相比，PGCLC會高表達一些與生殖細胞發育和遷移、精子發生、減數分裂W及配子產生 相關聯的基因，見圖4d。一旦細胞開始向生殖細胞分化，一些配子產生相關的基因，例如 TRIM27，TSSK3，D肥R24，DNAJA1和BRIX1會高表達;一些小鼠和人的生殖細胞減數分裂相關 的基因，例如ACTR2，PIM2和UBE2A也會高表達。隨著誘導天數的增加，可W檢測到與生精過 程和配子產生相關的基因，例如〇：^，4〇^1?18，]^1(，]?化5,5]\10,5服8。2和口刊61，見圖4(1。9- PCR也驗證了相關基因的表達，見圖4e。通過基因本體分析(Gene ontology，G0)，發現第7天 PG化C與iPSC相比，最多富集的基因是和生精過程W及配子產生相關的基因，見圖4f。
[0261] 總之，運些結果清楚地描述了體外PG化C定向誘導過程中，iPSC和PG化C兩類細胞 的轉錄組水平的特性，表明PG化C呈現出與體內PGC相類似的基因表達模式和特征。
[0262] B、豬精原干細胞樣細胞(SSCLC)檢測
[0263] USSCLC的形成及其分子生物學水平檢測
[0264] 精原干細胞(SSC)能夠經過減數分裂形成精子，在生殖細胞發育過程中有重要的 作用。進一步將PG化C誘導分化形成SS化C。
[0265] 將不同天數的PG化C在SS化C誘導培養基中進行培養，發現EpiLC(即第0天PG化C) 和第3天PG化C可W發生形態變化。隨著誘導天數的增加，出現SSC樣的細胞集落，并會增大， 見圖5曰。
[0266] SS化C標志基因 q-PCR檢測，結果顯示，生殖細胞標記基因 DA化會上調；一旦SSC樣 的集落形成，SSC標記基因 STRA8也會上調，見圖化；
[0267] SSCLC標志蛋白通過免疫巧光染色可W觀察到，SSCLC中會有部分細胞表達生殖細 胞標記蛋白DA化/STRA8/GFRa 1，見圖5c。
[0268] 單倍體細胞的標記基因 GSG2/TNP2/PRM2會有一定程度的上調，見圖5曰。
[0269] 生殖細胞標記基因的表達趨勢和從豬睪丸分離出來的SSC表達趨勢相類似，見圖 化和5g。
[0270] 2、流式細胞術分析單倍體細胞
[0271] (1)用Tryple將iPSC和第10天SS化C和第10天PSLC消化成單個細胞，離屯、lOOOrpm， 5min，棄去上清。
[0272] (2)用ImL培養基重懸細胞沉淀，加入Hoechst 33342染料進行染色，Hoechst 33342染料終濃度是10mg/mL，37°C水浴鍋中解育50min，期間搖晃3-5次，此步及之后的步驟 中要在避光條件下進行操作。
[0273] (3)將染色后的細胞離屯、，100化pm，5min，棄去上清。
[0274] (4)用ImL DPBS洗3次細胞，每次離屯、，1000巧m，5min。
[0275] (5)用40皿的濾網過濾細胞，最終用50化L DPBS重懸細胞，置于冰上，準備流式細 胞分析單倍體細胞比例。
[0276] 結果如圖5f，可W檢測到單倍體細胞的存在，運顯示，向SSC定向誘導分化后， SSCLC開啟了減數分裂。W上結果表明，向SSC定向分化的體外培養體系，模擬了體內精子發 生事件，該體系有利于SS化C的產生。
[0277] 3、SSCLC的表觀遺傳學檢測
[0278] 已有文章報道，在精子發生的過程中仍保留H3K27me3,而且在精原細胞中冊K9me2 水平低，隨后在精母細胞和精子中會高表達。
[0279] 對SS化C進行檢測，結果顯示SS化C中H3K27me3呈現上升趨勢，H3腳me2呈現下降趨 勢，見圖5d。
[0280] 與iPSC相比較，IGF2A119的甲基化水平呈下降趨勢；與PG化討目比，甲基化水平會 略有升高，見圖5e。運些表觀特征的動態變化與體內SSC發育相類似。
[0281] n、PG化C和SS化C的體內分化實驗及其檢測
[0巧2] -、檢測方法
[0283] 生殖細胞移植實驗為供體細胞完成生精過程W及產生精子提供了良好的平臺。由 于物種差異性，家畜大動物例如豬的細胞在小鼠曲細精管內無法完成完整的減數分裂W及 生精過程，但小鼠的曲細精管中的確可W為豬細胞的發育提供良好的微環境。
[0284] 1、曲細精管注射實驗
[0285] (1)受體鼠的準備
[0286] 選用6周齡的小鼠（品系Nu/Nu、維通利華公司），按照40mg/kg的劑量，小鼠腹腔注 射白消安(Sigma B2935);-個月后，白消安處理的小鼠可W作為曲細精管注射的受體鼠進 行使用。
[0287] (2)曲細精管注射針的制備
[028引選擇外徑1.0mm，內徑0.75mm，長度10cm的毛細玻璃管作為注射針;將毛細玻璃管 進行拉針和斷針，注射針的尖端外徑要求控制在50-60WI1范圍內。注射時，需用ImL注射器連 接內徑約1.0mm的塑料管，再連接注射針，進行細胞的注射。
[0289] (3)供體細胞的準備
[0290] 用化yple將誘導分化的第7-15天得到的PG化C和第7-15天得到的SS化C進行消化， 形成單細胞，然后1000巧m離屯、5min，棄去細胞上清液，用DPBS重懸細胞沉淀，然后用40皿的 濾網過濾細胞，最后進行細胞計數。每個睪丸組織需要取7-10X105個細胞，體積30-5化L， 置于冰上，進行注射。
[0291] (4)向曲細精管中注射細胞
[0292] a)腹腔注射麻醉劑，充分使小鼠麻醉。
[0293] b)將麻醉好的小鼠仰邸在操作臺上，用酒精對腹部皮膚進行消毒，然后將腹部中 間進行切口，大小約為1cm，用綴子將其中一側睪丸輕輕取出來。
[0294] C)將臺吩藍按照10%的比例加入到將要注射的細胞中，然后通過ImL注射器將細 胞吸入到注射針及其連接的塑料管中。
[0295] d)在睪丸和附睪之間的位置，有透明的輸出小管，輕輕地移去輸出小管周圍的白 色脂肪。
[0296] e)將注射針針尖部分插入到透明輸出小管中，沿著睪丸方向輕輕插入幾毫米即 可。
[0297] f)輕輕地推動注射器的活塞，將細胞通過輸出小管注射到睪丸曲細精管中，臺吩 藍作為指示。
[0298] g)當多數曲細精管中充滿注射的細胞或者細胞即將注射完的時候，停止注射，將 注射針撥出。
[0299] h)用綴子輕輕地將睪丸放回腹腔。
[0300] i)用醫用縫合針線縫合小鼠腹部皮膚。
[0301 ] j)將小鼠背部向上平放到37 °C恒溫臺上，待其清醒恢復后，放回鼠籠，做好標記。
[0302] k)大于六周W后，檢測注射細胞的小鼠睪丸組織。
[0303] (5)檢測注射細胞的睪丸組織
[0304] (a)將小鼠通過脫頸的方法處死，用酒精消毒剪刀，綴子，W及小鼠腹部皮膚。剪刀 剪開小鼠部，取出注射過細胞的睪丸組織，放于含有少量DPBS的3.5cm培養皿中。
[0305] (b)轉移至巧光顯微鏡下，觀察完整睪丸是否有綠色巧光(注射的細胞為ZsGreen 綠色巧光）。
[0306] (C)剪破白膜，將曲細精管暴露在培養皿中，再仔細觀察，曲細精管是否有綠色巧 光。
[0307] (d)將觀察到含有綠色巧光細胞的曲細精管立即剝離出來，一部分凍存-20°C冰箱 用于后續基因組的提取;一部分放于4%多聚甲醒中固定，用于石蠟切片W及免疫組化的檢 測。
[0308] (6)基因組的提取，方法同前所述。
[0309] 用于PCR的引物如下表12所示：
[0：310]表 12
[0311]
[0312] (7)對石蠟切片進行肥染色
[0313] a)脫蠟:切片在二甲苯中脫蠟5分鐘，再換用新鮮的二甲苯脫蠟，共用二甲苯脫蠟3 次。無水乙醇洗5min，兩次。90 %乙醇洗5min，兩次，70 %乙醇洗5min，一次。蒸饋水洗5分鐘， 兩次。
[0314] b)用蘇木精解育Imin，用蒸饋水洗10s; 1 %鹽酸乙醇解育3s，用蒸饋水洗10s;促藍 液反藍10s，用蒸饋水洗30s。
[0315] c)用0.5%曙紅液染色Imin，用蒸饋水洗10s ; 80%乙醇洗10s; 90%乙醇洗30s;無 水乙醇洗10s，兩次;二甲苯中20s，兩次。
[0316] d)用中性樹膠進行封片。顯微鏡下觀察拍照。
[0317] (8)對石蠟切片進行免疫巧光染色
[0318] a)脫蠟:流程同上所述。
[0319] b)抗原修復:將切片浸泡在抗原修復液（IX)中，微波爐低火加熱約20分鐘，室溫驚 涼切片。
[0320] C)接下來進行封閉等步驟，同前面所述。
[0321] 染色抗體為DA化（ab34139,Abeam)，VASA(abl3840,Abeam)，STRA8(ab49602, Abeam) ,GFRal (ab84106 , Abeam),。二抗是Invitrogen公司的goat anti-rabbit Alexa Fluor 594(貨號A11037)。
[0；3剖二、檢測結果
[0323] 1)PG化C的體內分化實驗
[0324] 為了檢測誘導的生殖細胞(PGCLC和SS化C)的發育能力，通過曲細精管注射，將誘 導培養7-15天的PG化C植入內源精子缺失的小鼠睪丸曲細精管中，見圖6a。
[0325] 經檢測，在曲細精管基底膜W及管腔中，可W檢測到外源細胞(綠色陽性細胞），誘 導的PGCLC可W在小鼠的曲細精管中存活，并且可W形成細胞鏈W及細胞簇，見圖6e。
[0326] 為了檢測該綠色細胞為供體細胞，W含有綠色細胞的組織提取基因組作為模板， 通過PCR擴增外源pMXs-0ct4,見圖6f，可W看出檢測到的綠色細胞為注射進去的誘導的豬 PG 化C。
[0327] 通過免疫組化皿染色可W觀察到，正常的、白消安處理過的W及供體細胞移植后 的睪丸結構存在差異性。正常的睪丸含有精原細胞W及成熟的精子，而白消安處理的睪丸 僅僅存在一個不含有精子的空腔，見圖6c-6d;移植有PG化C的睪丸組織的形態類似于正常 睪丸組織的形態，見圖6b，表明供體細胞在曲細精管中存活并有一定程度的發育。通過免疫 巧光染色，可W檢測到生殖細胞標記蛋白DA化/VASA/STRA8/GFRa 1的表達，見圖6g。
[032引2KSSCLC的體內分化實驗
[0329] 將SS化C移植到小鼠曲細精管中，免疫巧光染色檢測結果顯示，運些SS化C可W形 成細胞鏈W及大的細胞簇，并能夠表達生殖細胞標記蛋白DA化/VASA/STRA8/GFRa 1，見圖7。
[0330] 移植后檢測曲細精管中是否含有外源細胞時，對于含有綠色細胞的組織進行了下 一步的檢測，對于不含有綠色細胞的曲細精管，做了免疫組化，肥結果顯示曲細精管中呈空 腔;免疫巧光染色結果顯示，生殖細胞標記蛋白染色呈陰性，見圖8。
[0331] W上結果，可W看出誘導的豬生殖細胞PG化C/SS化C在體內有發育潛能，并呈現生 殖細胞的特性，說明小鼠曲細精管中可W為豬PG化C/SS化C的生長發育提供良好的微環境， 運一微環境可W提供必要的生長因子和激素等W促進外源供體細胞生長。
【主權項】
1. 一種豬多能干細胞定向誘導分化為雄性生殖細胞的專用培養基，包括EpiLC誘導培 養基、PGCLC誘導培養基和SSCLC誘導培養基； 所述EpiLC誘導培養基中含有bFGF和ActivinA，且所述bFGF在所述EpiLC誘導培養基中 的濃度為8_16ng/mL，所述ActivinA在所述EpiLC誘導培養基中的濃度為12-20ng/mL; 所述PGCLC誘導培養基中含有BMP4、BMP8a、SCF、EGF和LIF，且所述BMP4在所述PGCLC誘 導培養基中的濃度為30-100ng/mL，所述BMP8a在所述PGCLC誘導培養基中的濃度為30-100ng/mL，所述SCF在所述誘導PGCLC誘導培養基中的濃度為30-100ng/mL，所述EGF在所述 PGCLC誘導培養基中的濃度為30-100ng/mL，所述LIF在所述誘導PGCLC誘導培養基中的濃度 為5〇〇-l 5〇OU/mL; 所述SSCLC誘導培養基中含有睪酮、RA和GDNF，且所述的睪酮在所述SSCLC誘導培養基 中的濃度為〇. 5-10μΜ，所述RA在所述SSCLC誘導培養基中的濃度為0.5-10μΜ，所述⑶NF在所 述誘導SSCLC誘導培養基中的濃度為2-20ng/mL。2. 根據權利要求1所述的培養基，其特征在于： 所述EpiLC誘導培養基中，所述bFGF在所述EpiLC誘導培養基中的濃度為12ng/mL，所述 ActivinA在所述EpiLC誘導培養基中的濃度為20ng/mL; 所述PGCLC誘導培養基中，所述BMP4在所述PGCLC誘導培養基中的濃度為50ng/mL，所述 BMP8a在所述PGCLC誘導培養基中的濃度為50ng/mL，所述SCF在所述PGCLC誘導培養基中的 濃度為50ng/mL，所述EGF在所述PGCLC誘導培養基中的濃度為50ng/mL，所述LIF在所述 PGCLC誘導培養基中的濃度為1000U/mL; 所述SSCLC誘導培養基中，且所述的睪酮在所述SSCLC誘導培養基中的濃度為ΙμΜ，所述 RA在所述SSCLC誘導培養基中的濃度為2μΜ，所述GDNF在所述SSCLC誘導培養基中的濃度為 4ng/mL〇3. 根據權利要求1或2所述的培養基，其特征在于： 所述EpiLC誘導培養基由KSC血清替代物、N2、B27、GlutaMAX、Nonessential amino acids、2-Mercaptoethanol、DMEM、bFGF和 ActivinA 組成； 所述KSC血清替代物在所述EpiLC誘導培養基中的體積百分含量為1 %-5 % ; 所述N2在所述EpiLC誘導培養基中的體積百分含量為1 % ; 所述B27在所述EpiLC誘導培養基中的體積百分含量為2 % ; 所述GlutaMAX在所述EpiLC誘導培養基中的體積百分含量為1 % ; 所述Nonessential amino acids在所述EpiLC誘導培養基中的體積百分含量為1%; 所述2-Mercaptoethanol在所述EpiLC誘導培養基中的體積百分含量為0.1% ; 所述DMEM在所述EpiLC誘導培養基中的體積百分含量為93.9-89.9 % ; 所述PGCLC誘導培養基由KSC血清替代物、GlutaMAX、Nonessential amino acids、2_ Mercaptoethanol、GMEM、BMP4、BMP8a、SCF、EGF 和 LIF 組成； 所述KSC血清替代物在所述PGCLC誘導培養基中的體積百分含量為15 % ; 所述GlutaMAX在所述PGCLC誘導培養基中的體積百分含量為1 % ; 所述Nonessential amino acids在所述PGCLC誘導培養基中的體積百分含量為1%; 所述2-Mercaptoethanol在所述PGCLC誘導培養基中的體積百分含量為0.1 % ; 所述GMEM在所述PGCLC誘導培養基中的體積百分含量為82.9 % ; 所述 SSCLC誘導培養基由 FBS、GlutaMAX、Nonessential amino acids、2-Mercaptoethanol、DMEM、睪酬、RA 和 GDNF 組成； 所述FBS在所述SSCLC誘導培養基中的體積百分含量為15 % ; 所述GlutaMAX在所述SSCLC誘導培養基中的體積百分含量為1 % ; 所述Nonessential amino acids在所述SSCLC誘導培養基中的體積百分含量為1%; 所述2-Mercaptoethanol在所述SSCLC誘導培養基中的體積百分含量為0.1% ; 所述DMEM在所述SSCLC誘導培養基中的體積百分含量為82.89 %。4. 根據權利要求1-3中任一所述的培養基，其特征在于:所述培養基還包括iPSCs細胞 培養基， 所述iPSCs細胞培養基含有LIF、PD0325901和CHIR99021， 所述LIF在所述iPSCs細胞培養基中的體積百分含量為0.01 % ; 所述PD0325901在所述iPSCs細胞培養基中的濃度為1-3μΜ; 所述CHIR99021在所述iPSCs細胞培養基中的濃度為1-3μΜ; 和/或， 所述PD0325901在所述iPSCs細胞培養基中的具體濃度為ΙμΜ; 所述CHIR99021在所述iPSCs細胞培養基中的具體濃度為3μΜ。5. 根據權利要求4所述的培養基，其特征在于： 所述 iPSCs 細胞培養基由？1^、6111七&]\^父、1^〇116886111:1&1&111；[11〇&(^(18、2-Mercaptoethanol、DMEM、LIF、PD0325901 和 CHIR99021 組成， 所述FBS在所述iPSCs細胞培養基中的體積百分含量為15 % ; 所述GlutaMAX在所述iPSCs細胞培養基中的體積百分含量為1 % ; 所述Nonessential amino acids在所述iPSCs細胞培養基中的體積百分含量為1%; 所述2-Mercaptoethanol在所述iPSCs細胞培養基中的體積百分含量為0.1% ; 所述DMEM在所述iPSCs細胞培養基中的體積百分含量為82.89 %。6. -種豬多能干細胞定向誘導分化為精原干細胞樣細胞的方法，為如下A或B， A所示的方法包括如下步驟： 1) 將離體的豬多能干細胞在權利要求1-5中任一所述中的所述EpiLC誘導培養基中誘 導培養，得到上胚層干細胞樣細胞； 2) 將所述上胚層干細胞樣細胞在權利要求1-5中任一所述中的所述PGCLC誘導培養基 中誘導培養，得到原始生殖細胞樣細胞； 3) 將所述原始生殖細胞樣細胞在權利要求1-5中任一所述中的所述SSCLC誘導培養基 中誘導培養，得到精原干細胞樣細胞。 B所示的方法包括如下步驟： a) 將離體的豬多能干細胞在權利要求1-5中任一所述中的所述EpiLC誘導培養基中誘 導培養，得到上胚層干細胞樣細胞； b) 將所述上胚層干細胞樣細胞在權利要求1-5中任一所述中的所述SSCLC誘導培養基 中誘導培養，得到精原干細胞樣細胞。7. 根據權利要求6所述的方法，其特征在于： 步驟1)中，所述誘導培養的時間為1-3天， 步驟2)中，所述誘導培養的時間為1-3天， 步驟3)中，所述誘導培養的時間為2-20天， 步驟a)中，所述誘導培養的時間為1-3天， 步驟b)中，所述誘導培養的時間為2-20天； 和/或，步驟1)中，所述誘導培養的時間具體為2天， 步驟2)中，所述誘導培養的時間具體為2天， 步驟3)中，所述誘導培養的時間具體為5-20天或7-15天， 步驟a)中，所述誘導培養的時間具體為2天， 步驟b)中，所述誘導培養的時間具體為5-20天或7-15天。8. -種豬多能干細胞定向誘導分化為原始生殖細胞樣細胞的方法，包括如下步驟： 1) 將離體的豬多能干細胞在權利要求1-5中任一所述中的所述EpiLC誘導培養基中誘 導培養，得到上胚層干細胞樣細胞； 2) 將所述上胚層干細胞樣細胞在權利要求1-5中任一所述中的所述PGCLC誘導培養基 中誘導培養，得到原始生殖細胞樣細胞。9. 根據權利要求8所述的方法，其特征在于： 步驟1)中，所述誘導培養的時間為1-3天， 步驟2)中，所述誘導培養的時間為1-3天， 和/或，步驟1)中，所述誘導培養的時間具體為2天， 步驟2)中，所述誘導培養的時間具體為2天。10. 權利要求6或7所述的方法制備的精原干細胞樣細胞； 或權利要求8或9所述的方法制備的原始生殖細胞樣細胞； 或權利要求6或7所述的方法或權利要求8或9所述的方法或所述精原干細胞樣細胞或 所述原始生殖細胞樣細胞在精子發育研究中的應用。
【文檔編號】C12N5/0735GK106047800SQ201610451277
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月21日
【發明人】韓建永, 王寒凝, 相金柱
【申請人】中國農業大學