辛酰化Ghrelin在促進牛卵母細胞體外成熟中的應用
【專利摘要】本發明提供了一種牛卵母細胞體外前成熟液，所述前成熟液以牛卵母細胞體外培養液為基質，所述基質中含有辛酰化的Ghrelin。本發明通過辛酰化Ghrelin體外培養抑制牛卵母細胞減數分裂的恢復，從而使得卵母細胞核和細胞質同步成熟，進而提高了牛卵母細胞的質量以及體外發育能力。能夠成為新型的減數分裂制劑藥物在畜牧業生產上推廣應用，具有良好的市場效應和社會效應。
【專利說明】
辛醜化Ghre I i n在促進牛卵母細胞體外成熟中的應用
技術領域
[0001] 本發明設及家畜配子胚胎工程技術領域，具體設及辛酷化化relin在促進牛卵母 細胞體外成熟中的應用。
【背景技術】
[0002] 牛卵母細胞體外成熟（In Vitro Maturation, IVM)作為胚胎體外生產技術（In Vitro Production，IVP)的=大技術環節之一，是一項重要的繁殖生物技術，也是決定體外 胚胎生產的關鍵技術。其通過體外成熟培養屠宰場廢棄卵巢有腔卵泡來源卵母細胞獲得大 量可用卵子，可W為育種、克隆、性別控制、細胞核移植、轉基因動物生產等提供豐富的成熟 卵源，變廢為寶。
[0003] 卵母細胞體外成熟是指卵母細胞離開卵泡環境后，在體外一定培養條件下能夠自 發恢復減數分裂進程，并獲得能夠正常受精W及進一步發育的能力。卵母細胞的體外成熟 是一個復雜的生理過程，主要包括細胞核成熟和細胞質成熟。但在體外成熟過程中，雖然能 夠使卵母細胞在體外環境下完成減數分裂，但是由于離開了卵泡液，細胞質在未發育好的 情況下細胞核恢復減數分裂，導致細胞核、細胞質成熟不同步，運樣就會造成卵母細胞質量 W及受精后胚胎發育能力較差，因此限制了此項技術的利用效率，細胞核、細胞質同步成熟 成為亟待解決的問題。
[0004] 鑒于W上原因，許多學者開發了卵母細胞體外兩段成熟培養方法，即通過體外使 用減數分裂抑制劑暫時可逆的阻止卵母細胞減數分裂恢復，同時促進胞質發育，然后移出 減數分裂抑制環境，進行體外成熟。其中發明專利CN 102899286 A公開了卵母細胞體外成 熟的培養液W及分段培養方法。
[0005] 化relinWhre在印歐語系作詞根，意為"grow")。目前，我國學術界對化relin尚沒 有統一的譯名，所W有生長激素促釋放劑、生長激素促分泌素、生長激素釋放膚、生長素和 腦腸膚等多種稱謂。Ghrelin含28個氨基酸殘基組成，其中經測定，發現在血液和組織中 GhrelinW兩種主要形式存在:N端辛酷化和脫酷化修飾的化relin。
[0006] Ghrelin的功能除了具有調節生長素的分泌、胃腸生理活動、能量代謝、屯、血管活 動等功能外，還具有調節生殖的作用。越來越多的研究表明，Ghrelin在生殖軸的不同層次 影響著動物的生殖。其中，對激素的分泌有著十分重要的調節作用。同時，化relin還具有調 節動物的發情，胚胎的發育等功能。
[0007] 但是，辛酷化化relin在牛卵母細胞體外分段成熟培養W及進一步用于體外受精、 胚胎生產的作用尚不確定，目前尚無此方面的研究報道。
【發明內容】
[000引本發明的目的是提供一種牛卵母細胞體外成熟前培養液。
[0009] 本發明另一目的是提供一種促進牛卵母細胞體外成熟的培養液及方法。
[0010] 本發明再一目的是提供辛酷化化relin在促進牛卵母細胞成熟中的應用及辛酷化 Ghrelin在制備用于促進牛卵母細胞體外成熟藥物/減數分裂抑制劑藥物中的應用。
[0011]所述牛卵母細胞體外前成熟培養液W牛卵母細胞體外培養液為基質，在所述基質 中含有辛酷化Ghrelin。
[001 ^ 優選地，所述辛酷化趾re 1 in濃度為10-50ng/mL，更優選，所述辛酷化Ghrel in濃度 為50ng/mL。
[0013] 優選地，所述基質為不含h邱e S的TCM199培養液。
[0014] 本發明還提供牛卵母細胞體外成熟方法，其是將牛卵母細胞在上述牛卵母細胞體 外前成熟培養液中培養，然后進行體外成熟培養。牛卵母細胞采集后在添加辛酷化Ghrelin 的細胞培養液內前成熟處理6h，然后在成熟液內成熟28h，成熟后的卵母細胞進行體外受 精，然后進行體外胚胎培養。
[001引優選地，所述牛卵母細胞為3-8mm的卵丘-卵母細胞復合體。
[0016] 優選地，所述前成熟培養的培養時間為化;所述辛酷化化relin濃度為10-50ng/ mL，更優選所述辛酷化G虹el in濃度為50ng/mL，所述基質為不含hepes的TCM199培養液。
[0017] 優選地，所述體外成熟培養的成熟培養液為含有FSH 10iig/ml，LH10iig/ml，E2化 g/ml，肝素鋼lOiig/ml，半脫氨酸lOiig/ml，10%FBS的TCM199培養液;培養時間為2她。
[0018] 成熟培養后的卵母細胞還用于體外受精或體外胚胎生產。
[0019] 進一步，本發明提供辛酷化趾relin在促進牛卵母細胞體外成熟中的應用。
[0020] 進一步，本發明提供辛酷化化relin在制備用于促進牛卵母細胞體外成熟藥物/減 數分裂抑制劑藥物中的應用。
[0021] 有益效果：
[0022] 1)本發明應用辛酷化化relin前成熟處理牛卵母細胞，促進細胞核和細胞質成熟 同步，提高了卵母細胞的質量W及體外發育能力，促進了卵裂率W及囊胚率。辛酷化 Ghrelin可W作為新型的卵母細胞減數分裂抑制劑藥物在家畜胚胎工程上推廣應用。
[0023] 2)本發明所述的辛酷化化relin為體內存在的生物活性膚類物質，對卵母細胞的 毒害作用小。
【具體實施方式】：
[0024] W下實施例用于進一步說明本發明，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本 發明精神和實質的前提下，對本發明所作的修飾或者替換，均屬于本發明的范圍。實驗用卵 巢采自河北省大廠縣屠宰場，牛辛酷化化relin多膚由北京中科亞光生物科技有限公司合 成。
[0025] 實施例1卵母細胞成熟培養
[0026] (1)卵母細胞采集
[0027] 使用含有2ml抽卵液(含25mM hepes M199+l%PVA+200uM IBMX+1%雙抗）的 10ml 注射器從屠宰場獲取的牛卵巢表面抽取直徑3-8mm卵泡。將吸取卵母細胞后的吸卵液放入 7cm3國產培養皿中，在體視顯微鏡下挑選出胞質均勻，且有3層及W上緊密卵丘顆粒細胞包 裹的卵丘-卵母細胞復合體(cumulus-00巧te omplexes，COCs)用于體外前成熟培養。
[00%] (2)卵母細胞前成熟處理
[0029] 將挑選出的COCs在洗卵液(含h邱es M199+1%PVA巧OOuM IBMX+1%雙抗）中清洗3 次，在含有辛酷化化relin的前成熟液（添加1-lOOOng/ml濃度辛酷化化relin的M199培養 液）中清洗3次，然后放入預先在C〇2培養箱中平衡化的前成熟培養液的培養滴中（3.5cm3培 養皿，6化1體積培養液/滴，20枚COCs)，培養條件為含5 % C〇2的空氣，溫度38.5 °C，飽和濕 度，培養時間為化。前成熟后一部分COCs脫去顆粒細胞，4%多聚甲醒固定后DAPI染色在顯 微鏡下觀察辛酷化化relin對牛卵母細胞減數分裂的抑制情況(未添加辛酷化化relin的前 成熟液培養的COCs為對照），統計卵母細胞維持在生發泡(germinal vesicle，GV)階段的數 目。前成熟后的卵母細胞進行下一步成熟培養用于檢測發育能力W及受精能力。同時，收集 培養后的前成熟培養液，用于雌二醇、孕酬W及cAMP和MPK的檢測。結果見表1-3。
[0030]表1不同濃度辛酷化趾relin體外前成熟處理對牛卵母細胞減數分裂的影響 「nmi 1
[0032] 注：同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。
[0033] 表1實驗結果表明50ng/ml辛酷化化relin處理化后抑制了牛卵母細胞減數分裂， 卵母細胞維持在GV階段的比例顯著高于與對照(P<0.05)。
[0034] 表2不同濃度辛酷化化relin前處理對牛卵母細胞卵丘細胞復合體雌二醇和孕酬 分泌的影響
[0035]
[0
[0037] 表2結果顯示:5化g/ml的化relin能夠促進顆粒細胞中雌二醇和孕酬的分泌。
[0038] 表3不同濃度化relin前處理對牛卵母細胞卵丘細胞復合體cAMP和MAPK分泌的影 響 「nnoni
[0040] 表3結果顯示，G虹elin體外處理牛卵丘卵母細胞復合體化對卵丘細胞內MAPK分泌 有影響，50ng/ml處理濃度卵丘細胞內MAPK W及MPF水平最低。由此推測，G虹e 1 in在50ng/ml 處理濃度抑制卵母細胞GV抓發生主要是通過抑制MAPK的活性來實現的。有研究表明，在正 常情況下，MAPK在GVBD之前被激活，通過抑制mytl來活化MPF，從而刺激卵母細胞的GVBD。 [0041 ] (3)卵母細胞成熟培養
[0042] 前成熟處理后的牛卵母細胞在成熟液中進行體外成熟培養2她。
[0043] 在本發明中針對當前常用的體外成熟培養液進行了調整，本發明配置的成熟液A (F細 10μg/ml，LH 10μg/ml，E2 lμg/ml，肝素鋼 10μg/ml，半脫氨酸 10μg/ml，10%FBS的 TCM199培養液）W及常規成熟液B(添加 FSH 10μg/ml，LH liig/ml，E2 lμg/ml，EGF lOng/ml， 10%FBS的TCM199培養液），成熟培養時間為2她，同時沒有經過前成熟處理的卵母細胞設定 為對照。
[0044] 實施例2體外受精與體外胚胎生產
[0045] 用實施例1卵母細胞成熟培養的卵母細胞進行進一步實驗。
[0046] (1)體外受精
[0047] 采用培養皿微滴法，首先將成熟的卵母細胞在受精液(B0液+20mg/mlBSA+20mg/mL 肝素鋼+l〇〇mg/mL鏈霉素+100IU/mL青霉素）中清洗2-3次后放入平衡好的受精液中（放入量 為每60iil受精液，20枚卵母細胞），未添加辛酷化化relin的前成熟液培養的卵母細胞為對 照;然后采用上浮法處理冷凍精液，精子在2ml洗精液(B0液+3.38mg/mL咖啡因）上浮30min， 之后取上清600-800]il放入1.5ml離屯、管離屯、（1800轉，離屯、5min)2次，離屯、后除去上清加入 受精液最終體積為20化1，取40iU處理后的精液加入已放入卵母細胞的受精液中，精子終濃 度為1 X 106精子/ml，培養條件為5 % C〇2的空氣，溫度38.5 °C，飽和濕度，受精時間為化。
[004引（2)體外胚胎生產
[0049] 受精后的合子在前期發育液(CR1液+6mg/ml BSA，lOOul/滴)洗涂3次后采用微滴 兩步法培養:首先在10化1前期發育液(20枚左右合子)培養2d，計數卵裂胚胎后移入10化1 后期發育液(CRl液+10%FBS)培養5d，隔天半量換液，培養條件為5%C02的空氣，溫度38.5 °C，飽和濕度，胚胎發育第7天計數囊胚數。結果見表4、表5。
[0050] 表4辛酷化Ghrelin前處理對體外牛卵母細胞受精后卵裂率的影響 「nn。1
[0052]注:同列不同字母表示差異顯著(P<0.05);卵裂率=卵裂數/卵母細胞數
[0053]表5辛酷化Ghrelin前處理對體外牛卵母細胞受精后囊胚率的影響 r00541
[0055] 注:同列不同字母表示差異顯著(P<0.05);囊胚率=囊胚數/卵母細胞數
[0056] 實驗結果表明辛酷化化rel in前成熟處理化后進行體外成熟培養，在成熟培養2她 后卵裂率(表4)和囊胚率(表5)均顯著高于對照(P<0.05)。成熟液A的效果要優于B，差異顯 著。
[0057] 結論：由W上結果可知辛酷化化relin能抑制牛卵母細胞減數分裂進程，促進牛卵 母細胞體外發育能力，提高牛卵母細胞受精后卵裂率和囊胚發育率W及胚胎質量。因此，辛 酷化Ghrelin可作為潛在的減數分裂抑制劑應用于牛的卵母細胞體外培養。
【主權項】
1. 一種牛卵母細胞體外前成熟培養液，其特征在于，以牛卵母細胞體外培養液為基質， 在所述基質中含有辛酰化Ghrelin。2. 根據權利要求1所述的牛卵母細胞體外前成熟培養液，其特征在于，所述辛酰化 611代1;[11濃度為1〇-50即/111匕3. 根據權利要求1或2所述的牛卵母細胞體外前成熟培養液，其特征在于，所述辛酰化 611代1;[11濃度為5〇]^/111匕4. 根據權利要求1或2所述的牛卵母細胞體外前成熟培養液，其特征在于，所述基質為 不含hepes的TCM199培養液。5. 牛卵母細胞體外成熟培養的方法，其是將牛卵母細胞在權利要求1-4任一項所述的 牛卵母細胞體外前成熟培養液中培養，然后進行體外成熟培養。6. 根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述牛卵母細胞為3-8mm的卵丘-卵母細胞 復合體。7. 根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述牛卵母細胞的前成熟培養時間為6h。8. 根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述體外成熟培養的培養液為含有FSH 10 μg/ml，LH 10μg/ml，E 2 lμg/ml，肝素鈉10μg/ml，半胱氨酸10μg/ml，10%FBS的TCM199培養 液。9. 辛酰化Ghrel in在促進牛卵母細胞體外成熟中的應用。10. 辛酰化Ghrelin在制備用于促進牛卵母細胞體外成熟藥物/減數分裂抑制劑藥物中 的應用。
【文檔編號】C12N5/075GK106047799SQ201610621595
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月1日
【發明人】許曉玲, 劉彥, 白佳樺, 馮濤, 宋玉清, 肖霖力, 肖銀霞
【申請人】北京市農林科學院