一種適用于高密度細胞培養體系的羊水細胞培養基的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種適用于高密度細胞培養體系的羊水細胞培養基，其包括基礎培養基和添加組分，其中，基礎培養基為F12培養基，添加組分及其濃度如下：胎牛血清，80?120ml/L；人重組胰島素，24?30mg/L；人重組表皮細胞生長因子，20?25μg/L；人重組堿性成纖維細胞生長因子，35?45μg/L；人白蛋白，10?15g/L；轉鐵蛋白，4?16mg/L；氫化可的松，0.2?1mg/L；睪丸素，0.2?1mg/L；黃體酮，0.2?1mg/L；維生素E，1?5mg/L；L?谷氨酰胺，12?20g/L；HEPES，5?10g/L；嵌段式聚醚F?68，0.5?2g/L；各添加組分的濃度以所述羊水細胞培養基的總體積為基準。與現有技術相比，本發明的羊水細胞培養基能夠使得羊水細胞快速、大量的增殖，增殖效果好，培養時間短，特別適合羊水細胞的高密度細胞培養體系。
【專利說明】
-種適用于高密度細胞培養體系的羊水細胞培養基
技術領域
[0001] 本發明設及一種適用于高密度細胞培養體系的羊水細胞培養基，屬于細胞培養技 術領域。
【背景技術】
[0002] 產前診斷是優生學的重要組成部分，它是建立在遺傳咨詢基礎上通過在出生前對 胚胎或胎兒的發育狀態、是否患有疾病等方面進行檢測診斷。產前診斷目前主要有早期絨 毛組織取出、孕中期羊水和廝帶血、孕婦外周血分離胎兒細胞等診斷方法。其中孕中期羊水 細胞檢測仍然是最主要的診斷方法。
[0003] 關于孕中期羊水細胞檢測，是通過羊水穿刺抽取孕婦的羊水標本，對羊水細胞進 行培養，或提取羊水細胞DNA，再進行遺傳學診斷(例如，診斷胎兒染色體病、單基因病等）。
[0004] 關于羊水細胞的體外培養是羊水細胞檢測最為關鍵的一個環節。
[0005] 關于體外細胞培養體系，現有技術中除了常規的培養板、培養皿、培養瓶等二維的 細胞培養體系，現在已研發出=維培養體系，例如目前市售的高密度細胞培養桶，是一種既 可W適用于貼壁細胞，又可W適用于懸浮細胞的=維培養體系，可W快速地培養大量細胞， 且可W進行為期半年W上的長期細胞培養，不需要經常更換耗材，與傳統的培養板、培養皿 和培養瓶相比，更方便、成本更低，因此受到本領域研發人員的廣泛關注。
[0006] 然而，現有技術中的傳統的羊水細胞培養基大多適用于中等規模的細胞培養體 系，一般來說無法適用于大規模的、高密度的細胞培養;另一方面，現有的無血清培養基僅 適用于培養板、培養皿、培養瓶等二維的細胞培養體系，無法適用于高密度細胞培養桶運樣 的=維培養體系。
[0007] 現在亟待開發專用于高密度細胞培養體系的羊水細胞培養基。
【發明內容】
[000引鑒于相關技術的上述問題和/或其他問題，本發明一方面提供了一種適用于高密 度細胞培養體系的羊水細胞培養基，其包括基礎培養基和添加組分，其中，所述基礎培養基 為F12培養基；所述添加組分及其濃度如下：胎牛血清，80-1201111幾；人重組膜島素，24- 30mg/l;人重組表皮細胞生長因子，20-25蛇/1;人重組堿性成纖維細胞生長因子，35-45^/ L人白蛋白，10-15g/l;轉鐵蛋白，4-16mg/l;氨化可的松，0.2-lmg/l;睪丸素，0.2-lmg/l; 黃體酬，0.2-lmg/l;維生素 E，l-5mg/l;k谷氨酷胺，12-20g/l;肥陽S，5-lOg/l;嵌段式聚酸 F-68，0.5-2g/l;各添加組分的濃度W所述羊水細胞培養基的總體積為基準。
[0009] 優選的，W所述羊水細胞培養基的總體積為基準，所述F12培養基的干粉量為15- 18g/L〇
[0010] 優選的，所述人重組膜島素的濃度為28mg/L，人重組表皮細胞生長因子的濃度為 2化g/L，人重組堿性成纖維細胞生長因子的濃度為40yg/L，且人白蛋白的濃度為12g/L。
[0011] 優選的，所述k谷氨酷胺的濃度為12-20g/L。
[0012]優選的，所述轉鐵蛋白的濃度化2mg/L。
[0013] 優選的，所述嵌段式聚酸F-68的濃度為Ig/L。
[0014] 優選的，所述氨化可的松的濃度為0.7mg/L，所述睪丸素的濃度為0.6mg/L，所述黃 體酬的濃度為〇.6mg/L，且所述維生素 E的濃度為2mg/L。
[0015] 優選的，所述添加組分還包括青霉素和鏈霉素;所述青霉素的濃度100-400IU/mL， 所述的鏈霉素濃度為100-400IU/mL。
[0016] 本發明另一方面提供了上述的羊水細胞培養基在高密度細胞培養體系中的應用。
[0017] 優選的，所述高密度細胞培養體系為高密度細胞培養桶。
[0018] 本發明的適用于高密度細胞培養體系的羊水細胞培養基，采用F12培養基作為基 礎培養基W及特定的添加組分的組合，尤其是人重組膜島素、人重組表皮細胞生長因子、人 重組堿性成纖維細胞生長因子和人白蛋白，四者同時滿足特定的濃度范圍時，能夠使得羊 水細胞快速、大量的增殖，增殖效果好，培養時間短，特別適合羊水細胞的高密度細胞培養 體系。
【具體實施方式】
[0019] W下通過實施例對本發明作進一步的說明，但本發明并不限于運些具體實施方 式。
[0020] 在本發明的一個具體實施方案中，一種適用于高密度細胞培養體系的羊水細胞培 養基，其包括基礎培養基和添加組分，其中，所述基礎培養基為F12培養基;所述添加組分及 其濃度如下:胎牛血清，80-120ml/l;人重組膜島素，24-30mg/l;人重組表皮細胞生長因子， 20-2扣g/l;人重組堿性成纖維細胞生長因子，35-45iig/M人白蛋白，10-15g/l;轉鐵蛋白， 4-16mg/X;氨化可的松，0.2-lmg/L;睪丸素，0.2-lmg/L;黃體酬，0.2-lmg/X;維生素 E，1- 5mg/l; k谷氨酷胺，12-20g/l;皿陽S，5-10g/l;嵌段式聚酸F-68，0.5-2g/l;各添加組分的 濃度W所述羊水細胞培養基的總體積為基準。
[0021] 本發明的發明人經過大量的研究試驗發現，當羊水細胞培養基采用F12培養基作 為基礎培養基W及上述特定的添加組分的組合，尤其是人重組膜島素、人重組表皮細胞生 長因子、人重組堿性成纖維細胞生長因子和人白蛋白，四者同時滿足上述的濃度范圍時，能 夠使得羊水細胞快速、大量的增殖，且細胞存活率更高，特別適合羊水細胞的高密度細胞培 養體系。
[0022] 在本發明的一個優選實施方案中，W所述羊水細胞培養基的總體積為基準，所述 F12培養基的干粉量為15-18g/L。更優選的，人重組膜島素的濃度為28mg/L，人重組表皮細 胞生長因子的濃度為24yg/L，人重組堿性成纖維細胞生長因子的濃度為40yg/L，且人白蛋 白的濃度為12g/L。當本發明的羊水細胞培養基中，F12培養基的濃度，W及人重組膜島素、 人重組表皮細胞生長因子、人重組堿性成纖維細胞生長因子和人白蛋白同時采用上述特定 的濃度時，特別適合羊水細胞的高密度細胞培養體系，尤其是諸如高密度細胞培養桶之類 的=維培養體系，具有較好的增殖效果和細胞存活率。
[0023] 在本發明的一個更優選的實施方案中，所述k谷氨酷胺的濃度為12-20g/L。
[0024] 在本發明的另一個更優選的實施方案中，所述轉鐵蛋白的濃度為12mg/L。
[0025] 在本發明的一個優選實施方案中，所述嵌段式聚酸F-68的濃度為Ig/L。嵌段式聚 酸F-68,即Pluronic F-68,其為一種表面活性劑，一般常用作乳化劑和增溶劑;然而，發明 人意外的發現，在本發明的羊水細胞培養基中添加特定濃度的Pluronic F-68,對于高密度 細胞體系中的羊水細胞的生長有穩定作用，能夠提高羊水細胞的存活率。
[0026] 在本發明的一個優選實施方案中，羊水細胞培養基的激素類物質的添加量如下： 氨化可的松的濃度為〇.7mg/L，所述睪丸素的濃度為0.6mg/L，所述黃體酬的濃度為0.6mg/ L，且所述維生素 E的濃度為2111邑/1;可^滿足高密度細胞體系中的羊水細胞的生長需求。
[0027] 在本發明的一個優選實施方案中，所述添加組分還可W抗生素，例如包括青霉素 和鏈霉素;所述青霉素的濃度為100-400IU/mL，所述的鏈霉素濃度為100-400IU/mL。更優選 的，青霉素的濃度為200IU/mL，鏈霉素濃度為200IU/mL。運兩種抗生素組合及其特定的濃 度，特別適合羊水細胞的高密度細胞培養體系，抗菌效果優異，細胞存活率高。
[00%]在本發明的一個優選實施方案中，所述胎牛血清的濃度為lOOml/L。
[0029] 在本發明的一個優選實施方案中，所述肥PES的濃度為6.4g/L。
[0030] 在本發明的再一個優選實施方案中，將該無血清培養基的pH值控制在7.3~7.5。
[0031] 在本發明的一個優選實施方案中，本發明的羊水細胞培養基是專用于高密度細胞 培養桶的羊水細胞培養基。
[00扣]實施例1
[0033] 實施例1的適用于高密度細胞培養體系的羊水細胞培養基的配制過程如下：
[0034] 步驟1):在無菌條件下將合成的F12干粉在電子天平上稱取168g后置于消毒容器 內，加8.化重蒸水稀釋后攬拌均勻獲得基礎培養基；
[00巧]步驟2):將添加組分:280mg人重組膜島素、240yg人重組表皮細胞生長因子、400yg 人重組堿性成纖維細胞生長因子、120g人白蛋白、120mg轉鐵蛋白、7mg氨化可的松、6mg睪丸 素、6mg黃體酬、2mg維生素 E、1.2g青霉素(相當于2X105IU/L)、2g鏈霉素(相當于2X105IU/ L)、64g肥陽S、10g Pluronic F-68，W及1000ml胎牛血清依次加入步驟1)獲得的基礎培養 基中，充分混勻；
[0036] 步驟3):過濾滅菌，再調節pH值至7.4±0.1，最后加入重蒸水將體積調節至lOL
[0037] 步驟4):培養基配制完成后，過濾滅菌，分裝、封口，最后冷藏(-20°C環境)備用。 [00；3引 實施例2
[0039] 實施例2的適用于高密度細胞培養體系的羊水細胞培養基的配制過程如下:
[0040] 步驟1):在無菌條件下將合成的F12干粉在電子天平上稱取160g后置于消毒容器 內，加8.化重蒸水稀釋后攬拌均勻獲得基礎培養基；
[0041 ] 步驟2):將添加組分:240mg人重組膜島素、220iig人重組表皮細胞生長因子、360iig 人重組堿性成纖維細胞生長因子、llOg人白蛋白、lOOmg轉鐵蛋白、6mg氨化可的松、5mg睪丸 素、5mg黃體酬、3mg維生素 E、lg青霉素(相當于1.67 X 105IU/L)、Ig鏈霉素(相當于1 X 105IU/ L)、60g肥陽S、12g Pluronic F-68，W及8000ml胎牛血清依次加入步驟1)獲得的基礎培養 基中，充分混勻；
[0042] 步驟3):過濾滅菌，再調節pH值至7.4±0.1，最后加入重蒸水將體積調節至lOL
[0043] 步驟4):培養基配制完成后，過濾滅菌，分裝、封口，最后冷藏(-20°C環境)備用。
[0044] 應用例1和應用例2
[0045] 按照常規方法獲得羊水細胞:一般來說，取羊水，在無菌條件下離屯、獲得羊水細胞 聚團。
[0046] 應用例1
[0047] 采用上述實施例1獲得的羊水細胞培養基重新懸浮羊水細胞聚團，并將羊水細胞 濃度稀釋至IX 106個/ml。
[004引采用市售的FiberCell品牌C2025型號的高密度細胞培養桶（參見FiberCell細胞 培養系統產品銷售網頁），W及本發明實施例1獲得的羊水細胞培養基進行培養。
[0049]將2ml羊水細胞濃度為1 X 106個/ml的培養基用注射器載入上述的高密度細胞培 養桶中，再將18ml實施例1的羊水細胞培養基加入到50ml高密度細胞培養桶儲液瓶中（羊水 細胞的接種密度為1 X 105個/ml);具體地，儲液瓶中的培養基通過硅膠管與細胞培養桶連 接，在蠕動累的作用下，持續循環流動，培養基通過細胞培養桶的中空纖維進行交換，給細 胞培養桶內的細胞不斷的提供營養物質；將整個高密度細胞培養桶放入5%C02,37°C的培 養箱中培養。
[00加]應用例2
[0051] 具體過程與應用例1相同，不同在于采用實施例2獲得的羊水細胞培養基進行羊水 細胞的培養。
[0052] 效果數據
[0053] 對比例1:采用市售的FiberCell品牌C2025型號的高密度細胞培養桶（參見 門berCell細胞培養系統產品銷售網頁），W及市售的常規羊水細胞培養基(廣州白云山生 產的"一生驗"F12培養基），培養過程與應用例1相同，具體不再寶述。
[0054] 對比例A:采用市售的Corning品牌T25型號的細胞培養瓶，W及市售的常規羊水細 胞培養基(廣州白云山生產的"一生驗"F12培養基）；具體來說，將4.5ml常規羊水細胞培養 基用移液管轉移至T25培養瓶中，加入0.5ml羊水細胞濃度為IX 106個/ml的常規培養基進 行懸浮培養(羊水細胞的接種密度為1X105個/ml),將培養瓶放入5%C02,37°C的培養箱中 培養72小時。
[0055] 分別檢測應用例1、應用例2、對比例1和對比例A的羊水細胞培養效果。
[0056] 應用例1和應用例2, W及對比例1和對比例A，均在培養7天后，分別取樣細胞培養 液，對每組細胞培養液進行分裂象克隆數與總克隆數檢測。
[0化7] 檢測過程大致如下：
[0058]培養7天后，分別取樣5m 1;向每一個樣品中加0.1 m 1秋水仙胺溶液，3 7 °C解育 30min，W1000巧m離屯、5分鐘，棄去上清液;再向每個樣品中加入10ml 0.075M KC1溶液，37 °C解化10分鐘。WlOOOrpm離屯、5分鐘，棄去上清液;再向每個離屯、管中逐滴加入新鮮配制 的、預冷的固定液（固定液為醋酸：甲醇=1:3) 5ml，邊加邊搖晃;再次W1 OOOrpm離屯、5分鐘， 棄去上清液;加入1ml冰的固定液制成懸液。取35mm培養皿，滴加0.5ml細胞懸液至培養皿的 蓋玻片中央。放于干燥室或化學通風楓。染色，按要求進行染色體分析，計算分裂象的克隆 數與總克隆數(每組檢測3次，取平均值)檢測結果參見下表1。
[0化9] 表1 「noAnl
[0061] 從上述表1的結果可W看出，一方面，對比例1的有分裂象克隆數和總克隆數(羊水 細胞培養效果）的結果稍劣于對比例A的結果，運說明：常規的羊水細胞培養基更適合于諸 如細胞瓶之類的傳統小規模培養體系，不太適合高密度細胞培養體系；另一方面，本發明應 用例1的有分裂象克隆數和總克隆數(羊水細胞培養效果)遠高于對比例1的，運說明：本發 明實施例的羊水細胞培養基相比常規的羊水細胞培養基更適合于高密度細胞培養體系。
[0062] 應當理解，雖然本說明書按照實施方式加 W描述，但并非每個實施方式僅包含一 個獨立的技術方案，說明書的運種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說 明書作為一個整體，各實施方式中的技術方案也可W經適當組合，形成本領域技術人員可 W理解的其他實施方式。
[0063] 上文所列出的一系列的詳細說明僅僅是針對本發明的可行性實施方式的具體說 明，它們并非用W限制本發明的保護范圍，凡未脫離本發明技藝精神所作的等效實施方式 或變更均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種適用于高密度細胞培養體系的羊水細胞培養基，其包括基礎培養基和添加組 分，其中， 所述基礎培養基為F12培養基； 所述添加組分及其濃度如下： 胎牛血清，8〇-120ml/L; 人重組膜島素，24_30mg/L; 人重組表皮細胞生長因子，20-25yg/L; 人重組堿性成纖維細胞生長因子，35-45yg/L; 人白蛋白，l〇-15g/L; 轉鐵蛋白，4-16mg/L; 氫化可的松，0 · 2-lmg/L; 睪丸素，0.2-lmg/L; 黃體酮，〇· 2-lmg/L; 維生素 E，l_5mg/L; L-谷氨酰胺，12_20g/L; HEPES,5-10g/L； 嵌段式聚醚F-68,0.5-2g/L; 各添加組分的濃度以所述羊水細胞培養基的總體積為基準。2. 如權利要求1所述的羊水細胞培養基，其特征在于： 以所述羊水細胞培養基的總體積為基準，所述F12培養基的干粉量為15-18g/L。3. 如權利要求2所述的羊水細胞培養基，其特征在于： 所述人重組胰島素的濃度為28mg/L，所述人重組表皮細胞生長因子的濃度為24yg/L， 所述人重組堿性成纖維細胞生長因子的濃度為40yg/L，且所述人白蛋白的濃度為12g/L。4. 如權利要求3所述的羊水細胞培養基，其特征在于： 所述L-谷氨酰胺的濃度為12-20g/L。5. 如權利要求3所述的羊水細胞培養基，其特征在于： 所述轉鐵蛋白的濃度為12mg/L。6. 如權利要求2所述的羊水細胞培養基，其特征在于： 所述嵌段式聚醚F-68的濃度為lg/L。7. 如權利要求2所述的羊水細胞培養基，其特征在于： 所述氫化可的松的濃度為〇. 7mg/L，所述睪丸素的濃度為0.6mg/L，所述黃體酮的濃度 為0.6mg/L，且所述維生素 E的濃度為2mg/L。8. 如權利要求1至7中任意一項所述的羊水細胞培養基，其特征在于： 所述添加組分還包括青霉素和鏈霉素;所述青霉素的濃度為1 X 1〇5_4 X 105IU/L，所述 的鏈霉素濃度為1 X 1〇5_4 X 105IU/L。9. 如權利要求1至8中任意一項所述的羊水細胞培養基在高密度細胞培養體系中的應 用。10. 如權利要求9所述應用，其特征在于:所述高密度細胞培養體系為高密度細胞培養 桶。
【文檔編號】C12N5/071GK106047798SQ201610696788
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月19日
【發明人】顏學恒, 周艷
【申請人】上海逍鵬生物科技有限公司