一種預防和清除哺乳動物細胞污染的試劑的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種預防和清除哺乳動物細胞污染的試劑，屬于哺乳動物細胞培養中微生物污染控制領域。本發明中，一種序列為SEQ ID NO:1的多肽可用于預防和清除哺乳動物細胞污染，本發明試劑由序列為SEQ ID NO:1的多肽和氨基酸組成，不含任何抗生素成分。本發明的產品按照預防和清除污染所需濃度配制，可有效預防和清除哺乳動物細胞中的微生物污染，克服了現有產品中抗生素成分的使用限制以及處理細胞周期較長的缺陷，且該產品穩定性好，易于保存。
【專利說明】
-種預防和清除哺乳動物細胞污染的試劑
技術領域
[0001 ]本發明設及哺乳動物細胞培養中微生物污染控制領域。
【背景技術】
[0002] 細胞培養技術廣泛應用于科研、教學、臨床實驗研究、血液制品、抗體、疫苗等生物 制品的研發和生產等領域中，細胞的質量直接影響科學研究結果及生物制品的安全和質 量。在細胞培養過程中，微生物污染的威脅無處不在，潛在污染主要來自于:細胞自身攜帶 潛在污染源、原輔材料污染、細胞間的交叉污染、操作污染。
[0003] 哺乳動物細胞培養中，細菌污染特征明顯，培養液可在短時間內變黃，并出現明顯 渾濁現象，倒置顯微鏡下可見培養液中有大量圓球狀顆粒物漂浮。而支原體污染具有隱蔽 性，培養基一般不發生渾濁，細胞無明顯變化，但支原體可引起細胞變形，影響DNA、RNA合成 及蛋白表達，抑制細胞生長，顯微鏡下可見細胞間出現大量黑點，細胞空泡化，呈調亡、壞死 狀態。
[0004] 常用于預防和清除哺乳動物細胞污染的方法有:細胞培養環境的控制、無菌操作、 細胞培養基和器材的無菌處理、細胞交叉污染的控制、抗微生物試劑的添加。前幾項控制工 作中，難免百密一疏，抗微生物試劑的添加因其便捷性而為廣泛使用，市售主要抗微生物試 劑見表1: 表1市售主要抗微生物試劑
[0005] 由上表可知，市售主要抗微生物試劑大多為抗生素制劑，抗生素用于預防和清除 細胞污染雖然方便，但也存在諸多缺點：1.抗生素的使用對細胞會有不同程度的損傷(SP Langdon，Cell culture contamination: an overview[J]. Methods Mol Med, 2004,88: 309el7.)，且具有依賴性(王鴻等，細胞培養中珍貴貼壁細胞污染挽救方法的評價，首都醫 科大學學報2011，3(1):129-135.):2.賴藥性問題，傳統抗生素的作用機理大多通過阻 礙細菌細胞壁的合成、抑制蛋白質的合成、影響核酸、葉酸的代謝等來進行抗微生物，微生 物很容易通過基因突變來改變代謝途徑，進而對抗生素產生耐藥性。3.支原體無細胞壁， 通常作用于細胞壁生物合成的抗生素，如內酷胺類、萬古霉素等對其完全不敏感;4.《藥 典》2015年版對生物制品中抗生素的使用有明確限制:除另有規定外，不得使用青霉素或其 他e-內酷胺類抗生素;生產過程中，應盡可能避免使用抗生素，必須時，使用種類不得超過1 種；成品檢定中應檢測并規定殘留量限值；5.抗生素處理污染細胞時間較長，一般為1-2 周，處理后的細胞生理性能或有變化，進而影響試驗結果或最終的生物制品質量。
[0006]抗菌膚是一類堿性多膚，一般由12~50個左右氨基酸組成，具有廣譜抗菌性，對細 菌、真菌、病毒、寄生蟲和腫瘤細胞有抑制或殺滅作用，可促進傷口愈合過程，調節機體免疫 系統的功能，中和細菌內毒素 LPS，降低炎性細胞因子的釋放，減緩炎癥反應引起的組織損 傷。相對于抗生素，抗菌膚在耐藥性方面具有不可比擬的優點，抗菌膚可通過與微生物細胞 膜作用，形成孔桐，影響細胞內外滲透壓，進而使細胞死亡。細菌只有改變細胞膜結構才能 產生耐藥性，因此，運種物理抗菌機理不易使細菌產生耐藥性。
[0007]目前，抗菌膚數據庫（APD, http://aps.unmc.edu/AP/)收錄了來自6類生物共 2722種抗菌膚，其中，272種來自細菌，4種來自古生菌，8種來自原生生物，13種來自真菌， 335種來自植物，2043種來自動物。雖然抗菌膚的種類眾多，但應用于生產實踐中的不多，原 因如下：1.抗菌膚分子小，分離純化較困難，易被蛋白酶降解;2.大多數抗菌膚對微生物細 胞膜的攻擊特點令其對真核細胞(如人體細胞)有毒性;3.抗菌膚的性能各異，針對特定預 期用途須做大量基礎性研究工作，包括全面的藥理和毒理試驗，證明有足夠的安全性和有 效性才能繼續下去;4.抗菌膚制劑中組分的相容性問題，抗菌膚為生物活性物質，許多因素 會降低抗菌膚的活性，如高濃度的一價和二價陽離子、聚陰離子(polyanion)、血清、阿樸脂 蛋白A-I (apolipoprotein A-I )和蛋白酶等。
【發明內容】
[0008] 針對現有技術中的上述缺陷，本發明的第一個目的：提供一種不含抗生素的預防 和清除哺乳動物細胞污染的試劑及其配制和使用方法。本發明提供的試劑主要組分為多膚 和氨基酸，多膚代謝后產物為氨基酸，對細胞安全無毒性。
[0009] 本發明的第二個目的：拓展抗菌膚的應用領域。已知抗菌膚可用于各個領域，包括 農業、食品、衛生用品、醫藥、化妝品、生物農藥、生物飼料添加劑、天然食品防腐劑、動植物 抗病基因工程領域等，但尚無報道抗菌膚在細胞污染控制領域的應用。
【申請人】發現本發明 中的多膚用于細胞污染控制領域具有預料不到的優異技術效果。
[0010] 本發明的第=個目的：提供一種相容性好、抗微生物效果佳、協同增效的抗菌膚制 劑，用于預防和清除哺乳動物細胞污染。
[0011] 本發明提供的預防和清除哺乳動物細胞污染的試劑，含有序列為SEQ ID NO: 1的 多膚，多膚含量為1.5%-15%，優選為2.5%-12.5%。試劑中還含有賴氨酸和甲硫氨酸，所述賴 氨酸含量為0.85%-2.73%，所述甲硫氨酸含量為0.09%-1.2%。
[0012] 本發明中所述多膚可通過化學合成，也可W通過基因工程技術表達、分離純化得 質1(具體方法可參見Sambrook et al.，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor，NY，1989)〇
[0013] 為實現上述發明目的，本發明還提供了一種預防和清除哺乳動物細胞污染的試劑 的制備方法，如下： 先將溶劑經121°C高溫103Kpa高壓滅菌，在4°C環境下冷藏備用；取多膚0.15g -1.5g， 賴氨酸0 . 〇85g -0.273g和甲硫氨酸0.009g-0.12g;將9ml溶劑加入溶解桶中，依次加入多 膚、賴氨酸和甲硫氨酸，攬拌溶解，溶劑補齊至10ml;在超凈臺內將上述溶液經0.22WI1-次 性濾器過濾除菌，分裝，在-20°C下保存。
[0014] 上述溶劑可為純水、PBS溶液、細胞培養基、生理鹽水等。
[0015] 當本發明的產品用于預防哺乳動物細胞培養中微生物污染時，W相應細胞培養 基，將產品按照1:1000的稀釋體積比例進行稀釋，添加入細胞培養基中，用于細胞培養即 可，其余培養操作照常。根據細胞的周期不同，每2-4天添加1次，長期添加，W預防微生物污 染。
[0016] 當本發明的產品用于清除哺乳動物細胞培養中微生物污染時，W相應細胞培養 基，將產品按照1:1000的稀釋體積比例進行稀釋，添加入細胞培養基中，棄去舊的培養基， 用PBS將細胞清洗干凈，再加入新鮮的含有本發明產品的培養基，1天1次，連續處理3天。
[0017] 本發明與現有技術中的細胞污染控制類產品相比，具有W下技術效果： 1. 本發明在使用1-3天后有顯著微生物清除效果，而現有技術為7-14天； 2. 本發明不含有抗生素，多膚成分降解后終產物為氨基酸，符合藥典中要求； 3. 本發明產品在使用濃度下對細胞基本無毒性； 4. 本發明抗菌膚制劑中，各組分相容性好，且有協同增效作用。
[0018] 使用本發明提供的預防和清除哺乳動物細胞培養中微生物污染的試劑，可W清除 哺乳動物細胞培養中常見的細菌和支原體污染，在1-3天后有顯著清除效果，還可W用來預 防污染。經過處理的污染哺乳動物細胞，治療周期完成后，細胞培養基澄清，細胞間無黑點， 細胞生長周期回復正常，細胞形態正常，無團聚生長。
【附圖說明】
[0019] 圖1是本發明提供的試劑使用后的抑菌結果。
[0020] 圖2是本發明提供的試劑使用前后的細胞對照圖。
[0021] A:處理前的CH0-S細胞;A' ：處理后的CH0-S細胞。
[0022] B:處理前的Vero細胞;B' ：處理后的Vero細胞。
[0023] C:處理前的NIH-3T3細胞;C' ：處理后的NIH-3T3細胞。
[0024] D:處理前的HEK293細胞;D' ：處理后的HEK293細胞。
[00巧]E:處理前的化pG2細胞;E' ：處理后的化pG2細胞。
[0026] 圖3是本發明提供的試劑使用前后的巢式PCR對照圖。
[0027] 圖4是本發明提供的試劑的細胞毒性結果。
[0028] 圖5是實施例11的打孔測活對比圖。
【具體實施方式】
[0029] 實施例1 一種預防和清除哺乳動物細胞污染的試劑A及其制備方法 試劑A配方如下： 多膚:2.5% 賴氨酸:0.85〇/〇 甲硫氨酸:0. 〇9〇/〇 將純水經12rc高溫103Kpa高壓滅菌，在4°C環境下冷藏備用；取0.25g多膚，0.085g賴 氨酸，0.009g甲硫氨酸;在超凈臺內將9ml純水加入溶解桶中，依次加入多膚、賴氨酸和甲硫 氨酸，攬拌溶解，純水補齊至10ml;在超凈臺內將上述溶液經0.22um-次性濾器過濾除菌， 分裝，在-20°C下保存，即得本發明所述試劑A。
[0030]實施例2 -種預防和清除哺乳動物細胞污染的試劑B及其制備方法 試劑B配方如下： 多膚:3.8% 賴氨酸：1.56〇/〇 甲硫氨酸:0.36〇/〇 將PBS溶液經121°C高溫103化a高壓滅菌，在4°C環境下冷藏備用;取0.3始多膚，0.156g 賴氨酸，0. 〇36g甲硫氨酸;在超凈臺內將9mlPBS溶液加入溶解桶中，依次加入多膚，賴氨酸 和甲硫氨酸，攬拌溶解，PBS溶液補齊至10ml;在超凈臺內將上述溶液經0.22um-次性濾器 過濾除菌，分裝，在-20°C下保存，即得本發明所述試劑B。
[0031 ]實施例3 -種預防和清除哺乳動物細胞污染的試劑C及其制備方法 試劑C配方如下： 多膚:7.3% 賴氨酸：1.82〇/〇 甲硫氨酸:0.58〇/〇 將DMEM液體培養基經121°C高溫103Kpa高壓滅菌，在4°C環境下冷藏備用；取0.73g多 膚，0.18?賴氨酸，0.05始甲硫氨酸;在超凈臺內將9mlDMEM溶液加入溶解桶中，依次加入多 膚，賴氨酸和甲硫氨酸，攬拌溶解，DMEM補齊至10ml;在超凈臺內將上述溶液經0.22um-次 性濾器過濾除菌，分裝，在-20°C下保存，即得本發明所述試劑C。
[0032] 實施例4 一種預防和清除哺乳動物細胞污染的試劑D及其制備方法 試劑D配方如下： 多膚：10.6〇/〇 賴氨酸:2.45〇/〇 甲硫氨酸:0.9% 將生理鹽水經12TC高溫103Kpa高壓滅菌，在4°C環境下冷藏備用；取1.06g多膚， 0.245g賴氨酸，0.09g甲硫氨酸;在超凈臺內將9ml生理鹽水加入溶解桶中，依次加入多膚， 賴氨酸和甲硫氨酸，攬拌溶解，生理鹽水補齊至10ml;在超凈臺內將上述溶液經0.22um-次 性濾器過濾除菌，分裝，在-20°C下保存，即得本發明所述試劑D。
[0033] 實施例5 -種預防和清除哺乳動物細胞污染的試劑E及其制備方法 試劑E配方如下： 多膚:5% 賴氨酸：1.56〇/〇 甲硫氨酸:0.7% 將純水經12rc高溫103化a高壓滅菌，在4°C環境下冷藏備用;取0.5g多膚，0.156g賴氨 酸，0.07g甲硫氨酸;在超凈臺內將9ml純水加入溶解桶中，依次加入多膚，賴氨酸和甲硫氨 酸，攬拌溶解，純水補齊至10ml;在超凈臺內將上述溶液經0.22um-次性濾器過濾除菌，分 裝，在-20°C下保存，即得本發明所述試劑E。
[0034] 實施例6 -種預防和清除哺乳動物細胞污染的試劑F及其制備方法 試劑F配方如下： 多膚：12.5〇/〇 賴氨酸:2.73〇/〇 甲硫氨酸：1.2% 將純水經121°C高溫103Kpa高壓滅菌，在4°C環境下冷藏備用；取1.25g多膚，0.27：3g賴 氨酸，0.12g甲硫氨酸;在超凈臺內將9ml純水加入溶解桶中，依次加入多膚，賴氨酸和甲硫 氨酸，攬拌溶解，純水補齊至10ml;在超凈臺內將上述溶液經0.22um-次性濾器過濾除菌， 分裝，在-20°C下保存，即得本發明所述試劑F。
[0(X3日]實施例7抑菌試驗 將C冊-S(中國倉鼠卵巢細胞)細胞培養于96孔板中，密度為1.0 X 105 cell/well，將金 黃色葡萄球菌(ATCC6538)在營養瓊脂培養基斜面連續傳代培養2次后，取新鮮培養物，用無 菌PBS洗脫下菌苔制成菌懸液，將菌懸液于血細胞計數板計數使其菌含量為（1~5) Xl〇6 C化/mL，用PBS稀釋菌液100倍，其菌含量為（1~5)X104 C化/mL，在上述培養細胞的孔中 加入菌液100化，使其最終菌濃度為(0.5~2.5) Xl〇4 C化/mL。將試劑A-F分別Wl:1000 的稀釋比例稀釋，加入試驗組細胞培養孔中，W不加試劑的加菌CHO-S細胞為對照，W未做 任何處理的細胞作為空白，每組同時做3個復孔。將培養板置于35±2 °C培養箱，培養24 h 后觀察結果，培養基的渾濁肉眼觀察非常清晰，采用直接法讀取結果。
[0036] 培養結果如圖1所示，空白孔與試驗孔4、8、(：、0、6少無菌生長，培養基澄清，未加試 劑的加菌CH0-S細胞孔(對照）培養基渾濁。結果表明，試劑A-F配制的實際使用濃度產品對 細胞培養中的細菌有較佳的抑菌作用。
[0037] 實施例8支原體清除效果的巧光檢測 選用支原體污染的C冊-S細胞、Vero細胞、NIH-3T3細胞、肥K293細胞、HepG2細胞作為處 理對象，使用試劑B配制的產品，產品按照1:1000的稀釋體積比例，添加入細胞培養基中，棄 去舊的培養基，用PBS將細胞清洗干凈，再加入新鮮的含有本發明產品的培養基，1天1次，連 續處理3天。
[0038] 應用電子天平精確稱取化echst33342藍色染料Img，溶于10ml二甲基亞諷(DMS0) 中，使之配成lOOug/ml的儲備液。收集上述試劑處理3天前后的細胞，PBS洗涂后制成細胞懸 液，每個標本取200ul移入化pendorf管中，加入藍色染料化echs口3342至終濃度lOug/ml， 37 °C下染色15min，取40ul細胞懸液迅速滴在載玻片上，加蓋玻片，在巧光顯微鏡（日本 Olympus，CKX41)下觀察結果。Hoechst33342染料能透過胞膜完整的細胞，嵌入細胞核DNA 中，使之發出明亮的藍色巧光。支原體內含有DNA，亦能著色。
[0039] 用化echs 口 3342藍色染料染色，處理3天前后細胞的形態如圖2所示，可見支原體 污染的細胞中有顆粒狀小點，散在細胞周圍，或附于細胞膜表面;而本發明所述試劑B處理 后的細胞，可見細胞背景干凈，細胞周圍的顆粒狀物質消失，結果顯示完全清除了支原體污 染。
[0040] 實施例9支原體清除效果的PCR檢測 W試劑C處理支原體污染的CH0-K1細胞、CH0-S細胞、H460細胞，處理方法同實施例8，W 經12 rC高溫103Kpa高壓滅菌的純水為陰性對照。
[0041 ] 取處理3天前、后的細胞培養液及對照95°C水浴加熱5min，12000巧m離屯、Imin，取 上清做巢式PCR檢測。
[0042]巢式PCR第一輪體系和程序 3/
b)程序
由于PCR反應中的引物來自支原體的保守16S-23S rRNA序列，因此，可根據1%瓊脂糖凝 膠電泳檢測PCR結果判定支原體是否被清除，檢測結果如圖3,其中，泳道1為陰性對照，泳 道2、3分別為W試劑C處理3天前、后的C冊-K1細胞培養液，泳道4、5分別為W試劑C處理3天 前、后的CHO-S細胞培養液，6、7泳道分別為W試劑C處理3天前、后的H460細胞培養液，M代表 Marker。圖帥，經試劑C處理3天后的C冊-K1細胞、CHO-S細胞、H460細胞無支原體特異性條 帶，證明支原體已被清除。
[0043] 實施例10細胞毒性試驗 用3-(4,5-二甲基-2-嚷挫)-2,5-二苯基漠化四挫即M1T法對肥K-293T細胞活力進行計 量。將肥K-293T細胞培養于96孔板中，密度為1.5 X 1〇5 cell/well，W未做任何處理的細胞 作為空白對照，將試劑A、B、C、DWl :1000的稀釋比例稀釋，分別加入試驗組細胞培養孔中， 每組做S個平行樣。樣品解育化，1化，1她，24h后，向各孔中各加的MTT溶液，解育4h 后，各加入15化1 DMS0充分溶解，振蕩10分鐘，使結晶充分溶解，最后在570nm下測吸光度。
[0044] MTT試驗結果見圖4,試劑A、B、C、D的實際使用濃度對HEK-293T細胞基本無毒性。
[0045] 實施例11比較試驗 采用瓊脂糖孔穴擴散法比較試劑A中各組分及其組合對大腸桿菌E.coli K12D31的抑 菌活性。接種K12D31于液體LB培養基，37°C 20化pm培養至對數生長期，按1%菌量加至融化 的LB瓊脂糖培養基中巧5-60°C)，混勻后按15ml/皿鋪于滅菌平皿。凝固后，在無菌條件下打 孔，按照20iU/孔的量加入待測的樣品。置于37°C培養箱8小時，觀察抑菌活性。結果見圖5， 其中，孔1為空白對照，加入的是無菌水，孔2為2.5%的多膚溶液，孔3為0.85%的賴氨酸溶液， 孔4為0.09%的甲硫氨酸溶液，孔5為混合溶液(含2.5%的多膚和0.85%的賴氨酸），孔6為混合 溶液(含2.5%的多膚和0.09%的甲硫氨酸），孔7為試劑A。圖5顯示，試劑A中巧中組分的混合液 抑菌效果最佳。
[0046] 上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種序列為SEQ ID NO: 1的多肽用于預防和清除哺乳動物細胞污染的用途。2. -種預防和清除哺乳動物細胞污染的試劑，其特征在于：所述試劑含有序列為SEQ ID NO: 1的多肽。3. 如權利要求2所述的試劑，其特征在于:所述的多肽含量為1.5%-15%。4. 如權利要求2所述的試劑，其特征在于:所述的多肽含量為2.5%-12.5%。5. 如權利要求2-4任一所述的試劑，還含有賴氨酸和甲硫氨酸。6. 如權利要求5所述的試劑，其特征在于:所述賴氨酸含量為0.85%-2.73%，所述甲硫氨 酸含量為〇·〇9%-1·2%。7. 如權利要求2-4、6所述的試劑用于清除和預防哺乳動物細胞培養中的支原體生長的 用途。8. 如權利要求5所述的試劑用于清除和預防哺乳動物細胞培養中的支原體生長的用 途。
【文檔編號】C12N5/071GK106047796SQ201610672152
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月15日 公開號201610672152.5, CN 106047796 A, CN 106047796A, CN 201610672152, CN-A-106047796, CN106047796 A, CN106047796A, CN201610672152, CN201610672152.5
【發明人】凌建群, 余海, 趙玲
【申請人】江蘇吉銳生物技術有限公司