一種體外培養視網膜色素上皮細胞的方法
【專利摘要】本發明公開了一種體外培養視網膜色素上皮細胞的方法。本發明所提供的體外培養視網膜色素上皮細胞的方法，包括如下步驟：(1)制備具有極性的單層視網膜色素上皮細胞；(2)制備視網膜神經層；(3)構建視網膜色素上皮細胞與視網膜神經層的共培養體系。本發明所提供的RPE細胞與視網膜神經層共培養的方法，形成Bruch膜?RPE細胞?視網膜神經層的“三明治結構”，既模擬了Bruch膜又保持RPE與視網膜神經層直接共培養，完全模擬了RPE體內生長環境，提供了一個有價值的研究體內環境下RPE細胞生長、分化、功能的實驗平臺。
【專利說明】
一種體外培養視網膜色素上皮細胞的方法
技術領域
[0001]本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種體外培養視網膜色素上皮細胞的方法。
【背景技術】
[0002]視網膜色素上皮(retinal pigment epithelial，RPE)是具有極性的、單層上皮細胞，在視網膜中RPE基底部為Bruch膜，頂端為視網膜神經層。RPE能夠吞噬感光細胞外節、分泌營養因子、參與視循環代謝，組成血一視網膜屏障，對于正常的視網膜功能具有十分重要的功能，許多致盲性眼病的發生都與RPE的功能障礙有關，如老年性黃斑變性、視網膜色素變性等。因此，研究RPE的功能具有十分重要的意義。
[0003]將RPE細胞進行體外培養是研究RPE的必備方法，但一般的細胞培養方法是將RPE細胞培養在普通培養板上，該方法與真實的體內環境有很大差異，無法真實有效地評估細胞在體內環境中的功能。許多研究致力于采用超薄的小孔徑PET膜人工模擬Bruch膜，并將RPE細胞培養在這種人工材料上(Sonoda,S.，et al.Nat Protoc，2009，4:662-673)，發現RPE細胞能夠在這種材料上形成具有極性的、單層細胞。這種體外培養RPE細胞的方法雖然一定程度上更接近于體內生長環境，但仍然忽視了視網膜神經層對于RPE生長、分化、功能的影響。而視網膜神經層在體外培養過程中極易飄動、卷縮，使得難以與RPE細胞進行直接共培養。
[0004]因此，需要一種有效的培養體系，既模擬了Bruch膜又保持RPE與視網膜神經層直接共培養，完全模擬RPE體內生長環境，為深入研究RPE細胞在體內環境中的生長、分化和功能提供一種實驗平臺。
【發明內容】
[0005]本發明提供了一種體外培養視網膜色素上皮細胞的方法。
[0006]本發明所提供的體外培養視網膜色素上皮細胞的方法，包括如下步驟:
[0007](I)制備具有極性的單層視網膜色素上皮細胞；
[0008](2)制備視網膜神經層；
[0009](3)構建視網膜色素上皮細胞與視網膜神經層的共培養體系:將所述步驟(2)制備的視網膜神經層移到已接種了所述步驟(I)制備的視網膜色素上皮細胞的Transwell培養小室，使所述視網膜神經層的感光細胞層朝向所述視網膜色素上皮細胞，加入培養基，置細胞培養箱內于37 0C和5 %⑶2條件下共培養，2?3天換液;所述培養基為以Neurobasal-A培養基為基礎，加入如下質量百分比濃度的組分:2%B-27添加劑、I %N-2添加劑和0.4%L_谷氨酰胺。
[0010]所述步驟(I)中所述制備具有極性的單層視網膜色素上皮細胞包括如下步驟:將人胚胎干細胞Hl不傳代連續培養35?45天后，出現直徑Imm大小的色素灶，將色素灶挑出后接種在培養板中，從色素灶中長出的細胞即為視網膜色素上皮細胞，待生長至融合時，經質量百分比濃度為0.25 %胰蛋白酶37 °C消化I Omin，計數，以I X 1 Vcm2的密度將所述視網膜色素上皮細胞均勻接種于已包被過基質膠的Transwell培養小室的上層;移至細胞培養箱中，于37°C、5%C02培養視網膜色素上皮細胞14天后形成具有極性的單層視網膜色素上皮細胞。
[0011]所述培養視網膜色素上皮細胞所需的培養基為:高糖DMEM基礎培養基中添加質量百分比濃度為20%KSR、質量百分比濃度I %非必需氨基酸和ImM L-谷氨酰胺。
[0012]所述步驟(2)中所述制備視網膜神經層包括如下步驟:準備好出生后30天LongEvens大鼠的離體眼球，利用視網膜取出器在5秒內完整取出離體眼球的視網膜神經層，將取出的視網膜神經層剪成梅花狀，保持展平。
[0013]所述步驟(3)還包括將視網膜壓平器壓在所述視網膜神經層上，以保持所述視網膜神經層展平以及所述視網膜神經層與所述視網膜色素上皮細胞的緊密接觸的步驟。
[0014]本發明中，RPE細胞是原代分離或經過各種干細胞分化來的RPE細胞或經基因修飾的RPE細胞。所述干細胞是胚胎干細胞、誘導多能干細胞、各種成體干細胞、以及采用治療性克隆技術制備的干細胞等。
[0015]本發明中，若視網膜神經層來源于不同種屬、不同遺傳背景，可進行相關的免疫排斥研究。
[0016]根據實驗的設計的需要，檢測RPE細胞的生長、分化及功能，包括細胞的增殖、分化、吞噬感光細胞外節、分泌營養因子，參與視循環代謝等，為深入研究RPE細胞在體內環境中的功能提供可靠實驗依據。
[0017]本發明所提供的RPE細胞與視網膜神經層共培養的方法，形成Bruch膜-RPE細胞-視網膜神經層的“三明治結構”，既模擬了Bruch膜又保持RPE與視網膜神經層直接共培養，完全模擬了 RPE體內生長環境，提供了一個有價值的研究體內環境下RPE細胞生長、分化、功能的實驗平臺。本發明為一種完全模擬體內環境的RPE細胞培養方法，提供了一個有價值的研究體內環境下RPE細胞生長、分化、功能的實驗平臺。
【附圖說明】
[0018]圖1中A-C為RPE細胞培養在Transwell膜上的示意圖，及細胞形態、細胞極性的免疫熒光鑒定圖。
[0019]圖2為分離的視網膜神經層剪成梅花狀后的示意圖。
[0020]圖3為視網膜壓平器的結構示意圖
[0021 ]圖4為具有極性的單層RPE細胞與視網膜神經層共培養的示意圖。
[0022]圖5為共培養后檢測RPE細胞的吞噬功能。
[0023]圖6為共培養后Western blot檢測RPE細胞RPE65的表達。
[0024]圖7為共培養后檢測RPE細胞的超微結構。
【具體實施方式】
[0025]下述實施例中所使用的檢測、鑒定、純化方法如無特殊說明，均為常規方法;下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均從商業途徑得到。
[0026]實施例1、視網膜色素上皮細胞與視網膜神經層共培養的方法
[0027]—、人胚胎干細胞來源的視網膜色素上皮細胞與大鼠視網膜神經層共培養的方法
[0028]1、制備具有極性的單層RPE細胞:將人胚胎干細胞Hl(購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所，貨號為SCSP-306，記載過人胚胎干細胞Hl的非專利文獻是:郭新，秦潔，張鍵榮，唐愛發，余振東，石敏，桂耀庭，蔡志明；人胚胎干細胞Hl培養條件的優化;解剖學雜志，2008年03期)不傳代連續培養35?45天后，出現直徑約Imm大小的色素灶，將色素灶挑出后接種在培養板中，從色素灶中長出的細胞即為RPE細胞，待生長至融合時，經0.25 % (質量百分比濃度)胰蛋白酶370C消化1min，計數，以I X 105/cm2的密度將RPE細胞均勻接種于已包被過基質膠(354230，美國BD公司)的Transwell培養小室(3470，美國Corning公司)(孔徑為0.4um的PET膜)的上層。小心移至細胞培養箱中，37°C，5%⑶2培養。2?3天半量換液，培養14天后可形成具有極性的單層RPE細胞，參見圖1。
[0029]RPE細胞培養所需的培養基為:高糖DMEM基礎培養基，20% (質量百分比濃度)KSR(KnockOut?Serum Replacement) ,1% (質量百分比濃度)非必需氨基酸，ImML-谷氨酰胺，均購自美國Invitrogen公司。
[0030]2、制備視網膜神經層:準備好出生后30天Long Evens大鼠(購買自中國人民解放軍第三軍醫大學實驗動物中心)的離體眼球，利用“視網膜取出器”(發明專利號:ZL201310162184.7;公布號:CN103211677)和“視網膜神經細胞層體外分離制備的方法”(發明專利申請號:201310162180.9;授權公告號:CN 103234774B)，在5秒內快速完整的取出離體眼球的視網膜神經層，視網膜神經層剪成梅花狀，保持展平，參見圖2。
[0031 ]取出視網膜神經細胞層的具體步驟如下:
[0032]A.清潔眼球:首先用預冷的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)充分沖洗眼球;根據眼球來源，選擇相應的抗生素加入預冷的生理鹽水內充分沖洗眼球(如使用慶大霉素則每毫升生理鹽水內含有20IU);眼球放在裝有冰塊的離體眼球固定器(授權公告號:CN 203341904U)上，去除眼球表面的所有血樣附屬物和其他附屬的組織，保留四條直肌。
[0033]注意事項:
[0034]a.因為來自動物或遺體捐獻的眼球，眼球表面有許多血樣附屬物和其他附屬的組織，為了防止組織細胞之間的污染，小心用彎剪刀仔細剪除眼球表面的組織和血跡附屬物，保留四條直肌。因為眼球壁較薄，小動物眼球壁大約0.6-0.8mm，大動物眼球壁大約0.8-1.2_，人的眼球壁大約1.0-1.5_，切記不要把眼球壁剪破。
[0035]b.該步驟要求動作準確迅速，確保在0°C-4°C低溫條件下操作，以保證眼球各種細胞的活性。
[0036]c.每一個眼球，需要更換一次眼球固定器的塑料覆蓋膜，以防污染。
[0037]B.固定眼球:將清潔處理過的實驗動物來源的眼球或遺體捐獻的眼球的四條直肌固定在與眼球大小相應的裝有冰塊的眼球固定器上。
[0038]注意事項:
[0039]a.為了防止污染，每一只眼球在沖洗后，更換一張眼球固定器的塑料紙。
[0040]b.在固定眼球時，千萬注意不要強行牽拉四條直肌，因為直肌鞏膜附著點的鞏膜厚度大約為0.3mm，以免造成眼球破裂。
[0041]c.選擇大小合適的眼球固定器，以眼球的直徑大小為依據來選擇。如果眼球固定器大小不適宜，切開眼球壁的時候，嚴重者可造成眼內容物的脫出，也可帶來造成操作的不便。
[0042]C.切開眼球壁:在解剖顯微鏡下，用視網膜取出器C端的一次性刀片在小鼠、大鼠或荷蘭豬的眼球，沿角鞏膜緣后Imm切開全層的眼球壁360度，大型實驗動物小香豬、家兔、狗、獼猴等大型實驗動物的眼球，或遺體捐獻的眼球，沿眼球的平坦部(角膜緣后4mm)切開全層眼球壁360度。
[0043]注意事項:
[0044]a.—次性刀片必須確保其刀刃的鋒利，以確保手術時避免對眼球施加任何的壓力，避免重復使用，以防治污染。
[0045]b.根據不同眼球壁的厚度，掌握好切開球壁的深度，一般成年小動物眼球壁厚度大約為0.6-0.8mm，大動物眼球壁厚度大約為0.8-1.2mm，人的眼球壁厚度大約為1.0-1.5_，同一類眼球不同發育年齡其眼球壁的厚度也有所差異，應注意。
[0046]c.該步驟必須在顯微鏡下仔細操作，不要切開的過淺或過深，二者均可造成眼球組織細胞的損傷。
[0047]d.小動物眼球壁切開是沿著角膜緣外Imm切開，大動物眼球壁切開是在角膜緣后4_處切開，預先用標記筆畫出所要切開的部位，以免錯位，造成視網膜和眼內組織的損傷。
[0048]e.清除眼內容物:掀起眼球的前部，用視網膜取出器B端的視網膜一次性取出勺，沿著眼球壁的切口進入眼內，把晶狀體和玻璃體輕輕托出。
[0049]注意事項:
[0050]a.操作時，小動物用視網膜取出勺從眼球壁的切口沿球壁的弧形進入，輕輕將晶狀體和玻璃體一起托出；大動物分兩步，先用視網膜取出勺沿眼球壁切口水平進入將晶狀體托出，然后沿球壁的弧形進入將玻璃體輕輕托出。
[0051]b.視網膜取出勺進入眼內操作時，動作一定要輕柔，切記不可使用其攪動眼內物，以免牽拉視網膜，造成視網膜人為的脫離。
[0052]D.取出視網膜神經層:此時剪除眼球的前部組織，用無齒鑷輕輕夾住眼球壁呈灰白色的內層，沿眼球壁切口的全周給于充分的分離，分離深度大約5mm左右，用視網膜取出勺沿球壁的弧度進入視網膜下腔，取出完整的視網膜神經細胞層，呈灰白色球形。用微型剪刀將視網膜神經層切成“梅花形”，將視網膜神經層展平。
[0053]注意事項:
[0054]a.由于眼球離體后，尤其是人體捐獻的眼球，離體時間越長，視網膜神經層越容易與視網膜色素上皮層脫離，該步驟操作時動作一定要輕柔，沿著視網膜下腔的自然弧度進入，將全層視網膜神經層取出。
[0055]b.根據眼球的大小，選擇相適應直徑的視網膜取出勺。調整視網膜取出勺恰當的角度后，沿著眼球壁的自然弧度進入視網膜下腔，切記操作動作不要粗暴，這一步最容易造成視網膜取出不完全或視網膜呈碎片狀。
[0056]3、構建RPE與視網膜神經層的共培養體系:將步驟2中準備好的視網膜神經層移到已接種了 RPE細胞的Transwe 11培養小室(購自Corning公司，產品目錄號為3470)中，使得視網膜神經層的感光細胞層朝向RPE細胞，再用視網膜壓平器壓在視網膜上方(圖4)。視網膜壓平器(參見圖3)，中空，圓錐狀，直徑較大的一端為底座，底座呈圓環狀，底座上方設有一圈流通孔，另一端為頂端。高18_，底座直徑為6mm，內徑5mm。流通孔距離底座高1.5mm，直徑1mm，頂端直徑為5mm。整個視網膜壓平環采取有機塑料制成。
[0057]在TranswelI培養小室的上室和下室中加入適量適合視網膜生長的培養基，該培養基以Neurobasal-A培養基(購自Life Technologies公司，產品目錄號為10888-022)為基礎，加入如下質量百分比濃度的組分:2%B-27添加劑(質量百分比濃度)(購自LifeTechnologies公司，產品目錄號為17504044)，I %N-2添加劑(質量百分比濃度)(購自LifeTechnologies公司，產品目錄號為17502-048)，0.4%L-谷氨酰胺(質量百分比濃度)，置細胞培養箱內于37 °C和5 % CO2條件下共培養，2?3天換液。
[0058]二、共培養2天后檢測RPE細胞吞噬感光細胞外節功能
[0059]采用上述方法將RPE與視網膜神經層共培養2天后，去除視網膜神經層，將PET膜從Transwel I培養小室上剪下，對RPE細胞片進行免疫熒光檢測。
[0060]具體步驟包括:PBS洗3遍后，4 %多聚甲醛室溫固定15分鐘后，再次用I3BS洗3遍，加A0.2%Trit1n X-100，室溫處理30min后，PBS洗3遍，5%山羊血清室溫封閉Ih，用封閉液稀釋兔來源Rhodopsin抗體(貨號ab81702，美國abeam公司)，4°C孵育過夜，次日I3BS洗3遍后，加二抗，370C孵育60min，加入5ug/ml的FITC-鬼筆環肽，室溫染色60分鐘，PBS洗3次，DAPI染細胞核10分鐘，PBS洗細胞3次后，加熒光封片液封片，熒光或共聚焦顯微鏡下觀察。如圖5中A所示，Rhodopsin陽性的、呈點狀的感光細胞外節全部被吞噬到RPE細胞中，結果特異性好。
[0061]而常規方法檢測RPE細胞吞噬感光細胞外節時，需要事先剝離、純化感光細胞外節，再用FITC標記后與培養的RPE細胞進行共培養，采用同樣的免疫熒光方法，但不加Rhodopsin抗體，iFluor 594標記的鬼筆環肽用于顯示細胞輪廓。如圖5中B所示，FITC標記的、呈碎片狀的感光細胞外節部分被吞噬到RPE細胞中，結果特異性較差。
[0062]三、共培養14天后檢測RPE細胞的分化
[0063]RPE65是RPE細胞特異性的蛋白質，標記著細胞分化成熟度。用Western blot方法檢測細胞共培養前后RPE65的表達，并以未進行共培養的RPE細胞進行比較。具體步驟包括:
[0064]1.RPE與視網膜神經層共培養14天后，去除視網膜神經層，PBS洗3遍。再將共培養(Co-culture)和非共培養的RPE細胞用0.25 %胰酶消化，培養基中和消化后，離心，棄上清，取出細胞沉淀，置于冰上，加入10ul RIPA裂解液(強)(P0013B，Beyotime)，混勻后，14000rpm離心5min后，取上清及細胞總蛋白。
[0065]2.將提取的蛋白與蛋白上樣緩沖液混合(4:1)，100 °C變性1min。
[0066]3.配濃縮膠和12%分離膠后，上樣，電泳條件為80V，恒壓，當跑至分離膠時，120V，恒壓，直至loading buffer跑到凝膠外。
[0067]4.切膠后，將蛋白轉至PVDF膜，轉膜條件為100V，恒壓，70min。
[0068]5.取出PVDF膜，加入Western封閉液(P0023B，碧云天)，封閉60分鐘。
[0069]6.用一抗稀釋液稀釋小鼠來源RPE65抗體(貨號為abl3826，abcam公司)一1:400,4°(:孵育過夜，內參β-actin抗體(貨號為BM0627，Boster公司)一1:1000，4°C孵育過夜。
[0070]7.TBST(0.05%Tween_20)洗3遍，每遍 10分鐘。
[0071]8.用TBST稀釋HRP標記羊抗小鼠抗體(Boster，BA1050)——1:1000，37°C孵育2h。
[0072]9.TBST(0.05 % Tween-20)洗3遍，每遍 10分鐘。
[0073]10.加入ECL顯色液(P0018，碧云天)，曝光。
[0074]如圖6所示，內參表達水平相似，而共培養的RPE細胞(Co-culture)的RPE65表達水平明顯高于未共培養的對照組(Control)，說明共培養有利于RPE細胞的分化成熟。
[0075]四、共培養30天后檢測RPE細胞的超微結構
[0076]采用上述方法將RPE與視網膜神經層共培養30天后，去除視網膜神經層，與非共培養的RPE細胞一起用投射電鏡檢測其超微結構。具體步驟如下:
[0077]1.將PET膜從Transwe 11培養小室上剪下，2.5 %戊二醛固定；
[0078]2.0.1M PBS漂洗兩次，30分鐘/次；
[0079]3.1%鋨酸后固定2小時；
[0080]4.0.1M PBS漂洗;
[0081]5.丙酮梯度脫水；
[0082]6.環氧樹脂618包埋；
[0083]7.半薄切片定位；
[0084]8.超薄切片，鈾染，鉛染；
[0085]9.FEI公司TECNAI10透射電子顯微鏡觀察
[0086]如圖7所示，共培養的RPE細胞形成了典型了RPE形態，其細胞頂端出現了豐富的微絨毛，色素顆粒集中在胞質內的上方，細胞核位于細胞質下方，細胞呈單層，相連細胞之間形成了緊密連接。而非共培養的RPE細胞雖然也呈單層，但尚未出現明顯的色素顆粒和微絨毛。說明共培養更有利于使體外培養的RPE細胞形成典型的超微結構。
【主權項】
1.一種體外培養視網膜色素上皮細胞的方法，包括如下步驟: (1)制備具有極性的單層視網膜色素上皮細胞； (2)制備視網膜神經層； (3)構建視網膜色素上皮細胞與視網膜神經層的共培養體系:將所述步驟(2)制備的視網膜神經層移到已接種了所述步驟(I)制備的視網膜色素上皮細胞的Transwell培養小室，使所述視網膜神經層的感光細胞層朝向所述視網膜色素上皮細胞，加入培養基，于37°C和5 % C02條件下共培養，2?3天換液;所述培養基為以Neurobasal-A培養基為基礎加入如下質量百分比濃度的組分:2%B-27添加劑、I %N-2添加劑和0.4% L-谷氨酰胺。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于: 所述步驟(I)中所述制備具有極性的單層視網膜色素上皮細胞包括如下步驟:將人胚胎干細胞Hl不傳代連續培養35?45天后，出現直徑Imm大小的色素灶，將色素灶挑出后接種在培養板中，從色素灶中長出的細胞即為視網膜色素上皮細胞，待生長至融合時，經質量百分比濃度為0.25%胰蛋白酶37°C消化lOmin，計數，以I X 1Vcm2的密度將所述視網膜色素上皮細胞均勾接種于已包被過基質膠的TranswelI培養小室的上層;移至細胞培養箱中，于37°C、5%C02培養視網膜色素上皮細胞14天后形成具有極性的單層視網膜色素上皮細胞。3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于:所述培養視網膜色素上皮細胞所需的培養基為:高糖DMEM基礎培養基中添加質量百分比濃度為20 %KSR、質量百分比濃度I %非必需氨基酸和ImM L-谷氨酰胺。4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于: 所述步驟(2)中所述制備視網膜神經層包括如下步驟:準備好出生后30天Long Evens大鼠的離體眼球，利用視網膜取出器在5秒內完整取出離體眼球的視網膜神經層，將取出的視網膜神經層剪成梅花狀，保持展平。5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于: 所述步驟(3)還包括將視網膜壓平器壓在所述視網膜神經層上，以保持所述視網膜神經層展平以及所述視網膜神經層與所述視網膜色素上皮細胞的緊密接觸的步驟。
【文檔編號】C12N5/071GK106047792SQ201610436669
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月17日
【發明人】吳畏, 徐海偉, 曾玉曉, 彭廣華, 陰正勤
【申請人】中國人民解放軍第三軍醫大學第附屬醫院, 中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院