模擬胰島的制造方法

模擬胰島的制造方法
【專利摘要】一種模擬胰島的制造方法，其包含：在細胞培養孔內以1500個～5000個/孔來接種多能細胞，制作所述多能細胞的規定尺寸的聚集體的工序；和在所述細胞培養孔內以非貼壁狀態培養所述聚集體，使其向著包含胰島前體細胞或胰島細胞的細胞分化的工序。
【專利說明】模擬胰島的制造方法
[0001 ] 技術分野
[0002]本發明涉及一種使多能干細胞、優選為人多能干細胞向胰島細胞高效地分化誘導的模擬胰島(疑似脾島)的制造方法。
【背景技術】
[0003]作為糖尿病、特別是I型糖尿病的治療手段，胰臟移植、胰島移植是有效的，但是，臟器供體數量少、必須服用用于抑制免疫排斥的免疫抑制劑等方面成為嚴峻的課題。另一方面，正在使用來自于小鼠、人的細胞，廣泛進行由誘導多能干細胞(iPS細胞)等多能干細胞來分化誘導胰島細胞的研究。
[0004]專利文獻I公開了使用TGF-β等刺激因子誘導內胚層細胞、特別是胰島細胞的方法。但是，該文獻雖然公開了將細胞的命運誘導為內胚層系統、特別是胰島細胞所必須的刺激因子，但是對于誘導時的細胞群的形態是維持平面結構還是形成立體聚集塊則沒有公開，此外，對于此時的細胞群的尺寸的控制方法等也沒有公開。
[0005]專利文獻2中公開了:在包含帶正電的納米尺寸的纖維或粒子的基質上培養胚胎干細胞(ES細胞)或iPS細胞，不使用飼養細胞地由多能干細胞誘導胰島細胞的方法。但是，對于形成聚集體則沒有記載和教導。
[0006]非專利文獻I中公開了:由人多能干細胞分化誘導胰島細胞后，使其形成細胞聚集體、制作模擬胰島的方法。此外公開了:通過移植該模擬胰島，糖尿病模型小鼠的糖尿病狀態得到改善。該文獻中，在使細胞于培養皿底面上進行貼壁培養的狀態下進行分化誘導，在該過程中使細胞群從培養皿底面分離進行非貼壁培養(懸浮培養)，從而形成聚集體。但是，聚集體的形成依賴于懸浮培養中細胞群彼此的偶然性粘附，因此其尺寸是不可控的。
[0007]專利文獻3公開了:利用細胞無法貼壁的水凝膠基材構成凹部、使接種于其中的細胞形成聚集塊的方法及器件。但是，該文獻中并未公開用于由多能干細胞開始的分化誘導的方法。此外存在如非專利文獻2、非專利文獻3中記載那樣的、通過攪拌培養法形成的聚集體狀態的胰島細胞分化誘導法。
[0008]專利文獻4中列舉了在利用表面改性而抑制了細胞貼壁的培養皿中形成細胞聚集塊的方法、及作為有助于聚集塊的尺寸的因子的接種細胞的密度、培養液中的血清濃度。列舉了如下方法:通過在培養皿底面中限制可發生細胞貼壁的區域，結果限制所生成的聚集塊的尺寸。但是，該文獻中并未公開用于分化誘導的方法。
[0009]現有技術文獻
[0010]專利文獻
[0011]專利文獻1:美國專利第8859286號說明書
[0012]專利文獻2:日本特開2011-115161號公報
[0013]專利文獻3:日本專利第5039715號說明書
[0014]專利文獻4:日本特開2007-135593號公報
[0015]非專利文獻
[0016]非專利文獻1:DIABETES ,VOL.61 ,AUGUST 2012,2016-2029
[0017]非專利文獻2:PLoSONE.,VOL.7,May 2012,e37004,Thomas C.Schulz等，喬治亞大學、USA
[0018]非專利文獻3:Cell.VOL.159，0ct 2014，428-439，Fe I i cia ff Pagliuca 等，Harvard University,USA

【發明內容】

[0019]發明所要解決的問題
[0020]如上所述，以往一直在嘗試由多能干細胞誘導胰島細胞的方法，在效率、品質等方面，未充分得到實用的模擬胰島。此外，操作也復雜。
[0021]因此，本發明的課題在于，提供一種利用簡易的操作使多能細胞高效地向著胰島前體細胞或胰島細胞分化誘導從而制造適合于移植治療等的實用的模擬胰島的方法。
[0022]需要說明的是，本說明書中，關于“模擬胰島”，相對于由生物體的胰臟摘出的胰島，是指在生物體外由干細胞制作的組織。模擬胰島至少在其內部包含胰島素分泌細胞，例如，采取細胞團塊結構。作為模擬胰島，例如可以列舉由胚胎干細胞(ES細胞)、誘導多能干細胞(i PS細胞)等干細胞制作的組織，由生物體中所含的干細胞等其它多能干細胞制作的組織也包含在“模擬胰島”中。
[0023]用于解決問題的方法
[0024]為了解決上述課題，本發明提供一種模擬胰島的制造方法，其包含:在細胞培養孔內(例如，直徑200μπι?800μπι、深度400μπι?ΙΟΟΟμπι)以1500個?5000個/孔來接種多能細胞，制作前述多能細胞的規定尺寸的聚集體的工序;和在前述細胞培養孔內以非貼壁狀態培養所形成的前述聚集體，隨著時間推移適當改變培養液組成，從而使其向著包含胰島前體細胞或胰島細胞的細胞團塊分化的工序。本發明例如可以通過前述孔使用具有半球狀的底部的孔來實現，能夠使多個孔中的聚集體的大小大致均勻地進行分化工序。本發明可以優選使用例如水凝膠制微孔板。
[0025]發明效果
[0026]根據本發明的方法，與現有的方法相比，能夠以簡易的操作使多能細胞向著胰島前體細胞或胰島細胞高效地分化誘導。具體而言，通過控制接種細胞數、制作尺寸均勻的細胞聚集體、在I個孔內保持I個細胞聚集體的狀態下(即，在不與其它細胞聚集體接觸的狀態下)進行分化誘導，從而能夠將細胞聚集體的尺寸控制在一定的范圍，實現均勻的分化誘導效率。即，根據本發明的方法，由于氧氣、營養成分容易擴散到聚集體的中心部，因此能夠實現高細胞存活率。此外，通過避免聚集體間的接觸、在I個孔內保持I個細胞聚集體、以該細胞聚集體的狀態進行分化誘導，從而無需在分化誘導過程中的不期望的時期將細胞剝離、進而無需在規定的分化培養期后回收細胞而進行聚集體化，具有以下優點:操作得以簡化；僅需要進行培養液的更換作業直至分化誘導的最終階段，能夠實現自動化;與利用貼壁培養的現有方法相比，分化誘導效率也得到改善;認為更接近于形成立體結構地進行的生物體中的發育過程，因此可能能夠誘導出與現有技術相比性質更接近成體胰島的胰島細胞。
【附圖說明】
[0027]圖1是示出可用于本發明的方法的培養器的一個方式的圖。
[0028]圖2是示出使實施例中的iPS細胞向著胰島細胞分化誘導的條件的圖。
[0029]圖3(A)是示出分化誘導過程中聚集體的形態及由瓊脂糖微孔板回收的細胞聚集體的形態的照片。圖3(B)是示出分化誘導過程中細胞聚集體的直徑分布的圖。
[0030]圖4是示出分化誘導第3天(a)和分化誘導第20天(b)的聚集體的免疫染色結果的照片。
[0031]圖5是示出使用分化誘導第34天獲得的聚集體考察胰島素分泌的結果的圖。
[0032]圖6是示出在制作細胞聚集體時根據接種細胞數的存活率的差異的圖(照片)。
[0033]圖7是示出對聚集體培養時和貼壁培養時的、誘導初期階段向胚體內胚層細胞的分化效率進行比較的結果的圖(流式細胞術;FACS)。
[0034]圖8是示出對聚集體培養時和貼壁培養時的、誘導后期階段向胰島細胞的分化效率進行比較的結果的圖(FACS)。
[0035]圖9是示出對聚集體培養時和貼壁培養時的、誘導后期階段向胰島細胞的分化效率進行比較的結果的圖(RT-PCR)。任一圖中，左側表示貼壁培養的結果，右側表示聚集體培養的結果。
【具體實施方式】
[0036](多能干細胞)
[0037]本發明中，多能干細胞是指具有能夠分化為存在于生物體中的多種細胞的多能性、且同時具有增殖能力的干細胞，包含至少可誘導為本發明中使用的胰島前體細胞的任意細胞。對多能干細胞沒有特別限制，包含例如胚胎干(ES)細胞、來自于通過核移植而獲得的克隆胚胎的胚胎干(ntES)細胞、多潛能生殖干細胞(“mGS細胞”)、胚胎生殖細胞(“EG細胞”)、誘導多能干(iPS)細胞等。從制造工序中能夠以不破壞胚胎、卵細胞等的方式獲得的觀點出發，優選的多能干細胞為iPS細胞。
[0038]iPS細胞的制造方法在本領域中是公知的，可通過向任意的體細胞導入重編程因子而制造。其中，重編程因子可以例示出例如0(^3/4、3(?2、3(?1、3(?3、3(?15、3(?17、1(1付、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbxl5、ERas、ECAT15_2、Tcll、beta_catenin、Lin28b、Salll、Sall4、Esab、Nr5a2、Tbx3或Glisl等基因或基因產物，這些重編程因子既可以單獨使用，也可以組合使用。作為重編程因子的組合，可以例示出W02007/069666、TO2008/118820、TO2009/007852、TO2009/032194、TO2009/058413、W02009/057831、TO2009/075119、TO2009/079007、TO2009/091659、TO2009/101084、TO2009/101407、TO2009/102983、TO2009/114949、TO2009/117439、TO2009/126250、TO2009/126251、W02009/126655、W02009/157593、TO2010/009015、TO2010/033906、TO2010/033920、TO2010/042800、TO2010/050626、WO 2010/056831、TO2010/068955、TO2010/098419、TO2010/102267、TO 2010/111409、TO2010/111422、TO2010/115050、TO2010/124290、W02010/147395、W02010/147612、HuangfuD,et al.(2008),Nat.B1technol.，26:795_797、Shi Y,et al.(2008),Cell Stem Cell,2:525_528、Eminli S,et al.(2008), Stem Cells.26:2467_2474、Huangfu D,et al.(2008),Nat.B1technol.26:1269-1275、Shi Y，et al.(2008),Cell Stem Cell,3,568-574、Zhao Y，et al.(2008),Cell Stem Cell，3:475_479、Marson A,(2008),Cell StemCell，3，132_135、Feng B,et al.(2009),Nat.Cell B1l.11:197_203、R.L.Judson etal.，(2009),Nat.B1technol.，27:459-461、Lyss1tis CA,et al.(2009),Proc NatlAcad Sci U S A.106:8912_8917、Kim JB,et al.(2009),Nature.461:649-643、IchidaJK,et al.(2009),Cell Stem CelI.5:491-503、Heng JC,et al.(2010),Cell StemCell.6:167_74、Han J,et al.(2010)，Nature.463:1096_100、Mali P,et al.(2010),StemCells.28:713-720、Maekawa M,et al.(2011) ,Nature.474:225-9.中記載的組合。
[0039]體細胞非限定地包含胎兒(仔)的體細胞、新生兒(仔)的體細胞、及成熟的健康或疾病性的體細胞中的任一種，此外，還包含原代培養細胞、傳代細胞、及株化細胞中的任一種。具體而言，體細胞可以列示出例如(I)神經干細胞、造血干細胞、間充質干細胞、牙髓干細胞等組織干細胞(體性干細胞)；(2)組織前體細胞；(3)血液細胞(外周血細胞、臍帶血細胞等)、淋巴細胞、上皮細胞、內皮細胞、肌肉細胞、成纖維細胞(皮膚細胞等)、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、胰細胞(胰外分泌細胞等)、腦細胞、肺細胞、腎細胞及脂肪細胞等已分化細胞等。通過由來自于應用模擬胰島的患者本人的體細胞來制作用于制作模擬胰島的iPS細胞，期待能夠制作出不產生免疫排斥的移植用胰島的可能性高。
[0040](培養器)
[0041]關于本發明的方法中使用的培養器，為了進行非貼壁培養，可以是培養表面進行了細胞非貼壁處理的培養器，優選用能夠以非貼壁狀態培養細胞的材料制造。作為這樣的材料，優選具有三維結構的無細胞毒性的親水性材料，進而，為了容易觀察培養狀態而優選透明的材料。更具體而言，優選水凝膠。
[0042]作為用于制作水凝膠的材料，可以列舉聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙二醇、聚甲基丙烯酸-2-羥基乙基酯、聚丙烯酸-2-羥基乙基酯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸等合成高分子的化學交聯體、通過射線照射而形成的交聯體、以及構成上述高分子的單體的共聚物的交聯體等可形成水凝膠的各種合成高分子材料。此外，還可以使用作為天然高分子的瓊脂糖、海藻酸、葡聚糖、纖維素等多糖及其衍生物；以及明膠、白蛋白等蛋白質及其衍生物的交聯體等。
[0043]本發明的方法中使用的培養器具有可接種1500個?5000個/孔的細胞、優選2000個?3000個/孔的細胞并形成聚集體的大小的培養孔。本發明的方法可以使用例如容積為ο.οο?μ?/孔??ομ?/孔的培養孔來實現，此外，可以使用例如0.001?1口1/孔的培養孔來實現，進而可以使用例如0.005μ1/孔?0.5μ1/孔的培養孔來實現，進而可以使用例如ο.ο?μ?/孔?0.5μ1/孔的培養孔來實現，進而可以使用例如0.ο?μ?/孔?0.1yl/孔的培養孔來實現。此外，例如可以使用細胞向底部沉積而容易形成聚集體的形狀、例如底部向著底凸起的半球狀的培養孔、或者具有圓柱狀且底部呈半球狀的形狀的培養孔來實現。這樣的培養孔的直徑例如為200μπι?800μπι，此外，例如為400?800μπι。此外，這樣的培養孔的深度例如為400μ???ΙΟΟΟμ??，此外例如為400?800μπι。此外，可以使用具有多個上述那樣的形狀的孔的多孔培養器來獲得多個模擬胰島。
[0044](培養方法)
[0045]對本發明的培養方法的一個方式進行說明。
[0046]首先，將預先以貼壁狀態培養的多能干細胞從培養皿剝離并分離成單個細胞。該工序例如可以使用胰蛋白酶等酶來進行。然后，將分離成單個細胞的多能干細胞懸浮在培養基中，以1500個?5000個/孔的細胞濃度接種于培養容器。然后，以該狀態靜置一定時間、例如12?36小時，從而形成聚集體。
[0047]需要說明的是，形成聚集體時使用的培養基可以使用多能干細胞的培養中使用的常規培養基，優選在培養基中添加Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho-associatedcoiled-coil forming kinase，ROCK)抑制劑。形成聚集體時的培養條件可以是與常規的細胞培養同樣的條件，培養溫度優選35?39°C，更優選37°C。培養優選在O2濃度為約5?20%、CO2濃度為約5%的通常條件下進行。培養時間只要是可形成聚集體的時間即可，沒有特別限制，例如為10?30小時。
[0048]然后，對于形成了規定大小、例如直徑ΙΟΟμπι?500μηι的聚集體的多能干細胞，通過改變培養液組成而給予分化刺激，使其向著包含胰島前體細胞或胰島細胞的細胞團塊分化。
[0049]關于本工序中的培養基，可以通過在基礎培養基中添加必要的分化誘導因子來制備用于動物細胞培養的培養基。作為基礎培養基，包含例如IMDM培養基、Medium 199培養基、Eagle’s Minimum Essential Medium(EMEM)培養基、αΜΕΜ 培養基、Doulbecco ’ smodified Eagle’s Medium(DMEM)培養基、Ham’s F12培養基、RPMI 1640培養基、Fischer’s培養基、M⑶B 131培養基、E8培養基、mTeSRl培養基及這些的混合培養基等。培養基中可以含有血清，也可以為無血清培養基。根據需要，還可以含有例如白蛋白、轉鐵蛋白、Knockout血清替代品(KSR)(培養ES細胞時的胎牛血清(FBS)的血清代替物)、脂肪酸、胰島素、膠原前體、微量元素、2-巰基乙醇、3’-硫代甘油、ITS —添加劑等中的I種以上血清代替物，也可以含有B27-添加劑、N2-添加劑、脂質、氨基酸、L-谷氨酰胺、Glutamax(Invitrogen)、非必需氨基酸、維生素、生長因子、細胞因子、抗生素、抗氧化劑、丙酮酸、緩沖劑、無機鹽類等中的I種以上的物質。
[0050]在使多能干細胞分化為胰島前體細胞或胰島細胞的工序中，可以按照模仿生物體內胰腺發育的過程的方式來隨著時間推移改變培養液的組成。
[0051]作為這樣的方法，可以使用例如非專利文獻1、3及以下的文獻中記載的方法、以及對這些方法進行了適當修正的方法。
[0052][非專利文獻4]RezaniaA,Bruin JE,Arora P,Rubin A,Batushansky I ,AsadiA,0'Dwyer S,Quiskamp N,Mojibian M,Albrecht T,Yang YH,Johnson JD,KiefferTJ.Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro fromhuman pluripotent stem cells.Nat B1technol 2014;32:1121-1133.
[0053][非專利文獻5]HrvatinS,O'Donnell Cff1Deng F,Millman JR,Pagliuca Fff,Di1r1 P,Rezania A,Gifford DK,Melton DA.Differentiated human stem cellsresemble fetal,not adult,Pcells.Proc Natl Acad Sci U S A.1ll,3038-3043(2014)
[0054]例如，在初期階段，優選加入激活素A(Activin A)、Wnt3a，之后還優選加入視黃酸、hedgehog信號抑制劑(例如SANT-1、Cyclopamine-KAAD)、成纖維細胞生長因子。
[0055]此外，分化的過程中，為了模仿生物體內的胰腺發育的過程、獲得具有功能的胰島，還可以在適當時期加入:用于維持未分化性、促進增殖的物質，用于抑制增殖、促進分化的物質，在生物體內的胰臟中表達的蛋白質，用于促進胰島素分泌的物質等。作為所述物質，可以列舉GSK-3P(糖原合成酶激酶_3P，Glycogen Synthase Kinase 3β)抑制劑(例如CHIR99021)、ALK抑制劑(例如SB431542), Notch信號抑制劑(例如DAPT)、TGF0抑制劑(例如LDN193189)、AMPK及BMP信號抑制劑(例如Dorsomorphin)、PKC活化劑(例如Pdbu)、胰島素樣生長因子-1、上皮生長因子、肝細胞生長因子、胰高血糖素樣肽-1、市售的添加劑等。
[0056]培養可以持續至聚集體充分含有胰島素產生細胞的時期，可以例示例如從分化刺激開始起20?40天、優選25?35天的培養期。
[0057]培養溫度優選35?39°C，更優選37°C。培養優選在O2濃度為約5?20%、C02濃度為約5%的常規條件下進行。
[0058]關于培養基，優選定期更換，更優選每天更換。需要說明的是，在用具有微小孔的微孔板進行培養時，可以將微孔板放在培養皿等上，在培養皿中加入培養基，并使培養基滲透到微孔板的孔內。通過這樣操作，還可以容易地進行培養基更換。作為培養液的供給方法，可以使用每隔I天?數天用移液器等更換成新鮮培養液的方法、或將培養基板設置在流路內通過液體栗以一定速度將培養液供給到基板上的方法、或者使栗在規定時間啟動將培養液供給到基板上、然后靜置一定時間的方法等適當的方法。
[0059]分化工序優選使多個培養孔的各孔中所培養的聚集體的大小大致均勻地進行。關于聚集體的大小，在分化誘導開始時，直徑為例如ΙΟΟμπι?500μηι，優選ΙΟΟμπι?400μηι，更優選200μηι?400μηι，進一步優選200μηι?350μηι，更進一步優選250μηι?350μηι。優選聚集體在分化誘導開始后在該培養孔內維持為其分化誘導開始時的大小的0.5?2倍，更優選維持為
0.8?1.5倍。
[0060]用本發明的方法獲得的“模擬胰島”是指如下組織:為人工形成的細胞聚集體，至少包含分泌胰高血糖素的α細胞、分泌胰島素的細胞、和分泌生長抑素的δ細胞，具有與生物體內的胰島類似的三維結構。優選具有葡萄糖響應性的胰島素分泌能力。關于胰島細胞中包含α細胞、辟田胞、及δ細胞這一點，例如，可以分別通過使用針對胰高血糖素、胰島素、及生長抑素的抗體的免疫染色進行確認。細胞還可以通過使用針對C肽的抗體的免疫染色進行檢測。C肽是胰島素的前體即胰島素原被酶分解而形成胰島素時生成的肽。辟田胞還可以通過雙硫腙染色來進行檢測。
[0061]模擬胰島至少包含含有分泌胰高血糖素的α細胞、分泌胰島素的細胞和分泌生長抑素的δ細胞的胰島細胞，進而，還可以包含胰多肽(pancreatic polypeptide，PP)分泌細胞、胰島前體細胞。本說明書中，“胰島前體細胞”是指之后繼續向胰島細胞分化的細胞。胰島前體細胞可以設為例如PDXl (胰腺-十二指腸同源異型盒基因I ,pancreas duodenalhomeobox gene I)陽性、及PTFla(膜腺車專錄因子la，pancreas transcript1n factor la)陽性的細胞。此外，還可以以NKX6.1陽性為指標。還可以以I3DXl陽性且NKX6.1陽性、或PTFla陽性且NKX6.1陽性為指標。
[0062]用本發明的方法獲得的模擬胰島可以優選用于對糖尿病患者的移植治療。此外，本發明的胰島細胞的制造方法還可以用于來自糖尿病(特別是I型糖尿病)患者的誘導多能干細胞。由此獲得的胰島細胞在糖尿病發癥機制的闡明、新藥的探索等各種研究中是有用的。
[0063][實施例]
[0064]以下參照實施例對本發明進行說明，本發明的方式不限于以下的方式。
[0065]1.瓊脂糖微孔的準備
[0066]使用V彳夕口二一乂公司的3D Petri Dish，參照廠家的說明書(http://www.funakosh1.c0.jp/contents/5556)制作瓊脂糖微孔。
[0067]具體而言，按照以下的順序制作瓊脂糖微孔。
[0068]在用于小的細胞聚集體時，使用孔直徑為400μπι、256孔/板的鑄模。此外，在用于大的細胞聚集體(3000個細胞/孔以上)時，使用孔直徑為800μπι、81孔/板的鑄模。
[0069]首先，在鑄模中加入加熱后的瓊脂糖溶液(2.5%瓊脂糖/生理鹽水)。
[0070]然后在室溫下冷卻，待瓊脂糖凝膠化后將瓊脂糖微孔從鑄模取出。
[0071 ]將瓊脂糖微孔轉移到細胞培養用的12孔板，在周圍添加培養基(DMEM/F12)，使其浸漬瓊脂糖微孔。
[0072 ]放入培養箱(37 °C、5 % CO2)中一晚以上，使瓊脂糖板與周圍的培養基達到平衡。
[0073]由此獲得具有256個具有直徑為400μπι、深度為800μπι的圓柱部和半球狀的底部的孔的瓊脂糖微孔(用于大的聚集體時，具有81個直徑為800μπι、深度為800μπι的孔)。
[0074]圖1示出瓊脂糖微孔和孔的形狀。
[0075]2.聚集體形成及分化誘導
[0076]將iPS細胞(253G1，由RikenCell Bank獲得)使用用Geltex(Life Technologies公司)包被的培養容器以E8培養基(Life Technologies公司)培養3?4天。
[0077]在70?80%鋪滿(3>"7/1^工>"卜)的狀態下用TrypLE(Life Technologies公司)剝離細胞，并分離成單個細胞。將細胞懸浮在含有1yM的Y-27632(R0CK抑制劑:和光純藥)的E8培養基中，按照2500細胞/孔、1250細胞/孔或5000細胞/孔接種到上述制備的在12孔板的孔上所設置的256孔的瓊脂糖微孔板中。
[0078]靜置10分鐘以使細胞沉入底部后，在瓊脂糖板的周圍添加培養基(E8培養基+ROCK抑制劑)，連板一起浸漬。在37 °C、5 % CO2的條件下培養24小時以使細胞聚集后，按照圖2的順序進行分化誘導。具體而言，如下所述地隨著時間推移改變培養基組成。每天將培養基吸出、更換。需要說明的是，臨進行分化誘導前的聚集體的大小為約200μπι?約350μπι。需要說明的是，在圖3的剛接種后、O天、3天、10天及20天的下部分的畫像比例尺是共通的。
[0079]第I階段(3天)
[0080]RPMI+1.2g/L NaHC03、0.I %fat_free BSA、1/5000 ITS添加劑、3μΜ CHIR99021、100ng/mL激活素A(Activin A) (CHIR99021僅加在第一天的培養基中)。
[0081 ]第2階段(3天)
[0082]DMEM/F12+0.1 % fat-free BSA+1/5000ITS添加劑+50ng/mL FGF-7
[0083]第3階段(4天)
[0084]DMEM+1%B27添加劑+50ng/mL FGF-7+0.25μΜ SANT-1+Ο.δμΜ LDN193189+2yM視黃酸
[0085]第4階段(3天)
[0086]DMEM+1%B27添加齊?」+0.25μΜ SANT-1+Ο.δμΜ LDN193189+0.2μΜ PdBu(佛波醇-12，13-二丁酸酯，phorbol 12,13-dibutyrate)
[0087]第5階段(7天)
[0088]DMEM+1%B27添加劑+ΙμΜ Alk5抑$丨」劑+0.25μΜ LDN193189
[0089]第6階段(14天)
[0090]DMEM+1%B27 添加劑或 DMEM+10%FBS
[0091]3.結果
[0092]圖3(A)中示出分化誘導過程中的細胞聚集體的樣態(上)及分化34天后從瓊脂糖板回收的細胞聚集體的形態(下)。由此可知:聚集體在分化初期直徑變大，然后直徑逐漸變小、逐漸更緊湊地聚集。此外，圖3(B)示出分化誘導過程中的細胞聚集體的直徑的分布。聚集體的直徑在分化誘導開始時刻(O天)時為約250?350μπι，在分化誘導開始3天后(3天)時變為約350?475μπι、10天后(10天)變為約250?400μπι、20天后(20天)變為約175?350μπι、34天后(34天)變為約200?325μηι。
[0093]圖4示出分化誘導第3天(a)和分化誘導第20天(b)的聚集體的免疫染色的結果。可知:在培養第3天，以90%左右的效率分化為胚體內胚層(S0X17，F0XA2陽性)，在培養第20天，分化為產生胰島素的胰島細胞。
[0094]此外，使用在分化誘導第34天獲得的聚集體考察胰島素分泌情況，可以確認到糖濃度依賴性的胰島素分泌(圖5)。
[0095]圖6示出將細胞初期濃度設為1250細胞/孔、2500細胞/孔、或5000細胞/孔時對分化誘導第18天獲得的胰島細胞聚集體進行細胞存活分析的結果。將活細胞用calcein-AM染色，將死細胞用碘化丙啶(PI)染色。
[0096]其結果是，以1250細胞/孔接種時，聚集體的大部分細胞死亡。以5000細胞/孔接種時，在聚集體中央部多見細胞死亡。另一方面，以2500細胞/孔接種時，基本觀察不到聚集體中央部的細胞死亡。
[0097]由該結果可知，細胞數少時，很多細胞在分化誘導的過程中死亡，相反，當聚集體過大時，氧氣、營養物質無法到達中央部，聚集體中心部的細胞的存活率、分化效率降低，可知對于獲得高活性的胰島細胞而言，細胞的接種濃度在一定的范圍內很重要。
[0098]然后，對于聚集體培養時的分化(本發明的方法)和貼壁培養時的分化(比較例)，比較了分化誘導初期階段(第3天)向胚體內胚層細胞分化的效率。圖7示出對于作為胚體內胚層細胞標志物的S0X17和F0XA2的FACS結果。由該結果可知，聚集體培養時的分化的情況下，向胚體內胚層細胞分化的效率更好。
[0099]此外，對于聚集體培養時的分化(本發明的方法)和貼壁培養時的分化(比較例)，比較了誘導后期階段(第20天)向胰島細胞分化的效率。圖8示出對于作為胰島細胞標志物的I3DXl和C肽(C-peptide)的FACS結果。由該結果可知，聚集體培養時的分化的情況下，向胰島細胞分化的效率更好。
[0100]此外，同樣地對于用本發明的方法獲得的胰島(分化20天后)和貼壁培養下分化而獲得的胰島(比較例:分化20天后)，用定量RT-PCR考察了胰島標志基因的表達。結果如圖9所示。其結果是，胰島素(INS)、胰高血糖素(GCG)、生長抑素(SST)、PDX1、NGN3、PTF1A、Nkx6.1、Nkx2.2中的任一者均是在本發明的方法所獲得的胰島的情況下表達量多，可知在聚集體培養下的分化的情況下，向胰島細胞分化的效率更好。
[0101]需要說明的是，雖然數據中沒有示出，但還獲知在貼壁培養下分化而獲得的胰島中，外分泌標志物的表達也增加。
[0102]由以上可知，根據本發明，通過控制接種細胞數、制作尺寸均勻的細胞聚集體、以在I個孔內保持I個細胞聚集體的狀態(即，不與其它細胞聚集體接觸的狀態)進行分化誘導，從而與以往的貼壁培養下的分化誘導相比，能夠更高效地誘導胰島細胞。
【主權項】
1.一種模擬胰島的制造方法，其包含: 在細胞培養孔內以1500個?5000個/孔來接種多能細胞，制作所述多能細胞的直徑200μπι?350μπι的聚集體的工序;和 在所述細胞培養孔內以非貼壁狀態培養所述聚集體，使其向著包含胰島前體細胞或胰島細胞的細胞分化的工序。2.根據權利要求1所述的模擬胰島的制造方法，其中，所述孔具有半球狀的底部。3.根據權利要求1或2所述的模擬胰島的制造方法，其中，所述孔的容積為0.ΟΟΙμΙ/孔?10μ1/孔。4.根據權利要求1或2所述的模擬胰島的制造方法，其中，所述孔由水凝膠構成。5.根據權利要求1或2所述的模擬胰島的制造方法，其中，在多個孔中使聚集體的尺寸大致均勾地進行分化工序。
【文檔編號】A61L27/38GK106047791SQ201610243260
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年4月18日
【發明人】巖田博夫, 小長谷周平, 平野邦生
【申請人】國立大學法人京都大學, 愛科來株式會社