一種快速提高藻類孢囊產量的方法
【專利摘要】本發明屬于海洋生物技術領域，具體涉及一種快速提高藻類孢囊產量的方法。將處于對數生長期中早期的藻種培養至細沙與培養基混合的體系中，光照培養至平臺期后期，即可獲得大量孢囊。本發明主要通過添加天然的物理介質與藻類共培養，達到加快孢囊形成、有效增加孢囊產量和穩定性的目的。本發明解決了因孢囊量少且形成時間緩慢甚至難以在實驗室產生從而無法開展其亞細胞水平、分子水平上的研究等問題,同時為應用微藻孢囊評價壓艙水處理效果增加了實驗材料的易得性。
【專利說明】
-種快速提高藻類抱囊產量的方法
技術領域
[0001] 本發明屬于海洋生物技術領域，具體設及一種快速提高藻類抱囊產量的方法。
【背景技術】
[0002] 休眠抱囊(Resting cyst)是很多微藻類群特別是甲藻通過有性生殖方式產生的 休眠合子（少數為無性方式），是藻類生活史中的一個重要階段(Dale，1983;Anderson， 2012)。很多海洋微藻尤其是甲藻、針胞藻的繁盛可導致海洋有害藻華化armful algal blooms,HABs)或"赤潮"（Red tide),其中有些種類可W產生各種毒素危及海洋動物甚至人 類健康。由于抱囊在藻類種群的基因重組、抵抗不良環境、藻華的年際爆發與復發、藻種的 地理擴散和生物入侵化allegraeff&Bolch，1991)中起著重要的作用，對抱囊產生的條件和 抱囊本身的研究是海洋生物學和生態學的重要方向。
[0003] 目前國內外對抱囊的研究主要是基于野外沉積物中分離得到的抱囊。研究抱囊的 分離鑒定和形態描述(Anderson, 1988;齊雨藻，1997; Mat suoka, 1998; Weller, 2006;王朝 辟，2003&2011&2014;化叫，2012&2013; Satta，2014 ;Hyeon Ho Shin，2014)、空間分布及擴 散遷移（化llegraeff, 1992 ;Marret, 199化2003; Irwin, 2003; Smayda, 2007;Lacasse, 2013; Satta, 2014;Ma;rtin Jennifer, 2014)、萌發條件和影響因素化okinos&Anderson, 1995 ; Bravo ,2010；Kennaway,2004；Figueroa,2005；Anderson,1979&1980&1985&1987；Tang, 2008)及與赤潮生消的關系（Andersonl978&1989; DALE ,1983 ;Kremp&胎iskanen, 1999; Matsuoka&Fukuyo 2002; Bravo&Figueroa, 2014;Anderson, 2014)等。另外，抱囊由于處于休 眠狀態，且通常具有一層較厚的抱囊壁保護，在各種環境壓力如厭氧、低(高)溫、黑暗、極端 鹽度等條件下能長期存活，因此成為檢測船舶壓艙水(Ships'ballast water)處理效果的 理想實驗材料。鑒于藻類抱囊的實驗室產生過程受眾多環境條件影響，常常很難穩定、快速 地獲得所需要的抱囊數量，而通過收集海洋沉積物的抱囊又設及用船、特殊取泥設備、海 況、海洋底質條件、繁復和困難的抱囊分離和鑒定流程等眾多限制條件，使能獲得的抱囊數 量常常無法滿足實驗室和應用的急切需要，比如對抱囊在亞細胞、分子水平上的研究和壓 艙水處理中大量的材料需求。
[0004] 在室內條件下實現基于純培養的抱囊大量生產，一方面有助于研究抱囊形成和萌 發的過程、與有害藻華赤潮生消的關系和在亞細胞、分子水平上探索抱囊形成的誘因及其 分子調控機制，W及設計出可用于野外檢測或鑒定特定甲藻抱囊的探針，另一方面，穩定、 大量、快速的抱囊生產將為發展和應用壓艙水處理技術提供重要的檢測材料。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種快速提高藻類抱囊產量的方法。
[0006] 為實現上述目的，本發明采用技術方案為：
[0007] -種快速提高藻類抱囊產量的方法，將處于對數生長期中早期的藻種培養至細沙 與培養基混合的體系中，光照培養到平臺期后期（約一個半月至兩月左右，成熟抱囊形態、 顏色等隨種類而異），即可獲得大量抱囊。
[0008] 所述培養基為W天然海水或人工海水（鹽度32左右）為基礎介質配制的培養基； 如，W天然海水(鹽度32左右)為基礎介質的f/2培養基或GSe培養基、L1培養基等。
[0009] 所述藻種為皆為已被證實在其生活史中能夠產生休眠抱囊的甲藻；如錐狀斯氏 藻、短溝別什萊藻、哈曼褐多溝藻、亞利山大藻、鏈狀裸甲藻等。
[0010] 所述細沙為經100M1網篩篩選天然海水細沙。
[001。 具體；
[0012] 將處于對數生長期中早期的藻種培養至細沙與培養基混合的體系中，每毫升體系 中培養400-2000個藻種細胞，體系中細沙與培養基的體積比為1:160-620,進而在2TC ± 0.5°C的恒溫光照，光暗比為12L: 12D,光照強度~100皿〇1 photons ? nf2 ? s-i的條件下培 養，培養大致1-2個月，使平板內的抱囊在平臺期后期W接近指數的增長速率增長，即可W 獲得大量抱囊。但培養條件可W根據種類的特殊需求做出相應調整。
[0013] 在上述一定范圍內，抱囊的數量隨細沙量的增加而增加，增長呈正相關關系。因此 通過添加物理介質的方式可W有效加快并增加抱囊的產生。
[0014] 獲得大量抱囊，其計數是在倒置顯微鏡(0LMPUS，1I73型）的十倍物鏡下進行，計數 視野采取從上到下、W "S"形對每個孔內形態完整的抱囊進行計數統計并拍照。
[0015] 所述藻類產抱囊的方法可應用于海洋性微型藻類的實驗室培養或壓艙水處理效 果檢測中。
[0016] 本發明所具有的優點：
[0017] 本發明方法采用添加天然的物理介質與藻類細胞共培養的方式，快藻類抱囊的形 成，在不添加任何化學成分和改變藻生長所需各種理化因子的情況下，簡單有效地提高了 抱囊產量和產速。其中，在錐狀斯氏藻（Scrippsiella trochoidea)中，抱囊產量比同期未 添加細沙組最高提高了 107% ;在短溝別什萊藻(Biecheleria brevisulcata)中，抱囊產量 比同期未添加細沙組最高提高了500%。
[0018] 同時，本發明方法可快速、大量、穩定的生產微藻抱囊，其解決因抱囊量少、不穩定 且形成時間緩慢而影響其研究和應用的問題。并且可應用于海洋性微型藻類的實驗室培養 和壓艙水處理效果檢測和其它應用。
【附圖說明】
[0019] 圖1為本發明實施例中所設置的培養方案。圖中共設置四個組:A、對照組（Og細 沙）；B、0.0Ig細沙組;C、0.02g細沙組;D、0.04g細沙組，每一豎排的=個培養孔為一組，即每 組有=個平行。
[0020] 圖2為本發明在錐狀斯式藻（Scrippsiella trochoidea)中實施后根據統計的抱 囊數繪制的變化曲線圖。
[0021 ]圖3為本發明在短溝別什萊藻(Biecheleria brevisulcata)中實施后根據統計的 抱囊數繪制的變化曲線圖。
【具體實施方式】
[0022]下面結合附圖和實例對本發明作進一步說明，但本發明并不限于W下的實施例內 容。
[0023] 本發明方法在錐狀斯式藻和短溝別什萊藻中進行了實施應用。
[0024] 實施例1
[0025] 方法；
[0026] a:采集天然細沙;沙選取天然海水浴場的細沙，經100WI1網篩篩選(鏡檢下篩孔尺 寸在75-95微米之間），篩選得到的細沙為表面粗糖、具有不規則的形狀。
[0027] 篩選后的細沙經蒸饋水反復沖洗W去除可能存在的底泥;經沖洗后用精密天平分 別稱取不同質量（如O.Olg/cm2等），外層用錫錐紙包好，12rC高壓蒸汽滅菌30min，烘干備 用。
[0028] b:將細沙與純培養的某藻種混合；
[0029] 培養板選用多孔細胞培養板(Corning 3513，NY)，該培養板為聚苯乙締材質，培養 板平底、透明、表面平滑、無菌、無熱原。每個孔直徑22.1mm，高15mm，生長面積3.8cm2,最大 體積約為5.7cm3。實施例中培養所用體積小于5.0cm3。
[0030] 培養板內各成分添加順序依次為對應重量的細沙、4ml f/2培養基、3%的青鏈霉 素混合液(Solarbio)(即0.12ml)、藻液。實驗共設置四個組:A、對照組(Og細沙）；B、0.0Ig細 沙組;C、0.02g細沙組;D、0.04g細沙組，每一豎排的S個培養孔為一組，即每組有S個平行 (參見圖1)。
[0031] 接種的藻類均為接種在100ml錐形瓶內培養約一周，分布在上層的處于對數生長 期的中早期藻液。加入的藻液體積根據最終每孔中藻細胞密度而定，因而在加入原藻液前 需取出適量藻液，經2%體積的Lugol試劑固定后，在顯微鏡下用細胞計數框計數=次，取平 均值并將其換算到12孔培養板中每個孔的細胞密度（即為實驗的起始細胞密度），W此來確 認需加入藻液的體積;即400-2000個細胞/ml最為適宜。
[0032 ] f/2培養基為W天然海水(鹽度32左右)為基礎介質的f/2培養基。
[0033] 實驗所用培養液為國際上實驗室內通用的甲藻培養液，其配制方法:將天然海水 用孔徑為0.22皿的濾膜進行過濾，121°C、0.1 MPa高溫高壓滅菌30min，室溫冷卻后按照f/2 培養基配制方法(Guillard，1975)添加除娃酸鋼W外的四種成分，所用培養液具體組分信 息見表1、2、3。
[0034] 表1 f/2培養基培養基配方 rnmsi
[00
[00
[0040] c.置于光照培養箱內培養一段時間，收集抱囊。
[0041] 將上述體系于室內光照培養箱(CXZ智能型光照培養箱，寧波江南儀器廠），培養溫 度均為21±0.5°C，光照強度為100皿〇1 ? nf2 ? s^，光暗比為12L:12D的條件培養，而后對生 長的抱囊計數
[0042] 計數方法是在倒置顯微鏡(0LMPUS，1I73型）的十倍物鏡下進行，計數視野采取從 上到下、W"S"形對每個孔內形態完整的抱囊進行計數統計并拍照。每組的抱囊數為S個平 行孔內抱囊的平均值。實施例2
[0043] 實驗藻種：錐狀斯式藻（Scrippsiella trochoidea)
[0044] 初始細胞密度:764個/ml
[0045] 培養初始階段每天對板內情況進行觀察，發現抱囊后每隔一天進行一次統計計 數，計數情況見表4及圖2。
[0046] 表4錐狀斯氏藻(Scrippsiella trochoidea)各組別抱囊計數結果(單位:個）
[0047]
[004引實施例3
[0049]實驗藻種：短溝別什萊藻(Biecheleria brevisulcata)
[(K)加]初始細胞密度:2159個/ml
[0051]培養初始階段每天對板內情況進行觀察，發現抱囊后每隔一天進行一次統計計 數，計數情況見表5及圖3。
[0052] 表5短溝別什萊藻(Biecheleria brevisulcata)各組別抱囊計數結果(單位:個）
[0化3]
[0054] 通過連續29天對平板底層的錐狀斯式藻的抱囊進行觀察、計數，從表4和圖2中發 現，對照組中抱囊數量呈現先迅速增長后基本保持穩定的狀態;加入細沙的平板中，0.0 lg 組抱囊數量先呈現迅速增長后緩慢增長的趨勢，0.02g和0.0?組抱囊數量則基本保持指數 增長的狀態，且隨細沙量的增多，抱囊數量增長趨勢越明顯。
[0055] 在對短溝別什萊藻連續20天的觀察、計數后，通過表5和圖3可W發現，未加細沙的 對照組中一直未有抱囊出現；而加入細沙的平板中均有抱囊出現，且數量均呈現出前期迅 速增加而后緩慢減少的趨勢(可能是因為后期平板內細菌增多等原因抱囊破裂）。隨細沙數 量的增多，抱囊在形成速度、數量上都有明顯增長的趨勢。
[0056] 從兩個實施例中可W明顯看出本發明的實際有效性。通過本發明產生的藻類抱 囊，后續可W通過沉降原理或多聚鶴酸鋼（Sodium polytungstate)試劑從細沙中收集抱 。
[0057] 另外，其它生活史中能夠產生休眠抱囊的甲藻，如亞力山大藻、鏈狀裸甲藻、哈曼 褐多溝藻等也適用本發明的培養方法。
[005引本發明主要通過添加天然的物理介質與藻類共培養，達到加快抱囊形成、有效增 加抱囊產量和穩定性的目的。本發明解決了因抱囊量少且形成時間緩慢甚至難W在實驗室 產生從而無法開展其亞細胞水平、分子水平上的研究等問題，同時為應用微藻抱囊評價壓 艙水處理效果增加了實驗材料的易得性。
【主權項】
1. 一種快速提高藻類孢囊產量的方法，其特征在于:將處于對數生長期中早期的藻種 培養至細沙與培養基混合的體系中，光照培養到平臺期后期，即可獲得大量孢囊。2. 按權利要求1所述的快速提高藻類孢囊產量的方法，其特征在于:所述培養基為以天 然海水(鹽度32左右)為基礎介質配制的培養基。3. 按權利要求1所述的快速提高藻類孢囊產量的方法，其特征在于:所述藻種為生活史 中能夠產生休眠孢囊的甲藻。4. 按權利要求1所述的快速提高藻類孢囊產量的方法，其特征在于:所述細沙為經100μ m網篩篩選天然海水細沙。5. 按權利要求1、2、3或4所述的快速提高藻類孢囊產量的方法，其特征在于:將處于對 數生長期中早期的藻種培養至細沙與培養基混合的體系中，每毫升體系中培養400-2000個 藻種細胞，體系中細沙與培養基的體積比為1:160-620,進而在21°C ±0.5°C的恒溫光照，光 暗比為12L: 12D,光照強度~100μ mol photons · nf2 · s^1的條件下培養，使孢囊在平臺期后 期以接近指數的增長速率增長，即可以獲得大量孢囊。6. 按權利要求1所述的快速提高藻類孢囊產量的方法，其特征在于:所述藻類產孢囊的 方法可應用于海洋性微型藻類的實驗室培養或壓艙水處理效果檢測中。
【文檔編號】C12R1/89GK106047786SQ201610412471
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月14日
【發明人】唐贏中, 楊傲傲, 胡章喜
【申請人】中國科學院海洋研究所