一種空間糞產堿菌lct?af1的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一株“神舟十號”飛船返回艙中分離得到的微生物糞產堿菌Alcaligenes faecalis LCT?AF1，其特征在于：糞產堿菌LCT?AF1為革蘭氏陰性，非發酵性的短桿菌；對環氧樹脂、酯類聚氨酯、醚類聚氨酯、硫化天然橡膠與聚乙烯醇聚縮醛5種高分子材料均具有腐蝕能力。糞產堿菌LCT?AF1全基因組序列總長度為3.91 Mbp，GC含量56.00 %，包括3551個編碼序列和65個RNA基因，COG數據庫比對共注釋到22組COG 功能分類。本發明對研究密閉飛行器內微生物種類分布及航天器表面材料安全防護等提供了一定幫助。CGMCC No.1257720160601
【專利說明】
一種空間糞產堿菌LCT-AF1
技術領域
[0001]本發明屬于微生物及生物技術領域，涉及一種新的微生物菌株糞產堿菌LCT-AFl以及其生物學特性、基因組DNA序列，利用生物信息學技術進行了組學分析，獲得其在基因組的特性。
【背景技術】
[0002]隨著人類空間探索活動的日益頻繁，宇宙空間成為了人類活動的一個重要領域。太空密閉艙中存在著特定的微生物群落。雖然每一件物品都經過了嚴格消毒，微生物仍會隨航天員身體、人體分泌物、航空部件等進入太空，并在航天器密閉艙室內形成特定微生物群落，既包括無害微生物，也包括一些致病性和腐蝕性微生物。“和平”號運行十余年來空間站內檢測到234種微生物。太空密閉艙內的特殊環境因素，包括微重力、弱磁場和粒子輻射等，使得微生物會產生變異，導致它們對生存環境的要求很低，更加容易生長和繁殖，某些微生物的腐蝕性會增強。太空密閉艙中腐蝕性微生物的大量繁殖，使得各種航天材料逐漸產生腐蝕，加速航天器件的降解耗損，將可能導致空間站內的設備運行失靈，影響航天器的長期正常運行及其在軌使用壽命，甚至對飛行安全也會造成很大威脅。航天器服役條件惡劣，在軌時間長，而維修條件相對不足，一旦發生微生物腐蝕設備故障，損失不可估量。國外載人航天器在軌經驗和國內地面研究的初步結果表明，微生物會嚴重威脅航天設備安全。開展長期太空密閉艙中微生物對航天器材腐蝕的機理及防控措施研究，深化對載人航天器中微生物風險的認識和加強相關技術儲備，探索更加有效的載人航天器微生物綜合控制措施，為載人航天器的研制和運營提供技術支撐。
[0003]針對空間環境下微生物材料腐蝕研究，目前尚無葡萄球菌的相關報道。
【發明內容】
[0004]在本發明的目的在于提供一種空間糞產堿菌LCT-AFl。對空間菌株進行表型檢測，然后對其進行全基因組測序，闡明該細菌的特性及用途。
[0005]本發明提供的菌株糞產堿菌LCT-AFl，其保藏號為CGMCC N0.12577。
[0006]所述的糞產堿菌LCT-AFl，為革蘭氏陰性，非發酵性的短桿菌，對該菌進行16SrRNA克隆測序鑒定其為糞產堿菌。
[0007]所述的糞產堿菌LCT-AFl，其全基因組序列總長度為3.91 Mbp，GC含量56 %，包括3551個編碼序列和65個RNA基因，COG數據庫比對共注釋到22組COG功能分類。其地面Ig重力對照組菌株經重測序大小為3.895 1?^，6(:含量56.01 %，模擬微重力組菌株經重測序為3.895 Mbp，GC含量56.01 %，而空間飛行組菌株經重測序為3.892 Mbp，GC含量56.01 %。5種高分子材料腐蝕實驗分析發現:LCT-AFl空間飛行組與地面Ig重力對照組菌株對環氧樹脂、酯類聚氨酯、醚類聚氨酯、硫化天然橡膠與聚乙烯醇聚縮醛5種高分子材料均具有腐蝕能力；但空間飛行組菌株對環氧樹脂與醚類聚氨酯的腐蝕能力較地面Ig重力對照組菌株增強。
【附圖說明】
[0008]圖1糞產堿菌LCT-AFl的掃描電鏡圖。
[0009]圖2糞產堿菌LCT-AFl的進化樹分析圖。
[0010]圖3糞產堿菌LCT-AFl的菌落平板形態圖。
[0011 ]圖4糞產堿菌LCT-AFl的生物膜形成分析。
[0012]圖5糞產堿菌LCT-AFl在環氧樹脂為唯一碳源培養條件下增長曲線。
[0013]圖6糞產堿菌LCT-AFl在不同條件下對環氧樹脂腐蝕能力的SEM觀察分析。
[0014]圖7糞產堿菌LCT-AFl在酯類聚氨酯為唯一碳源培養條件下增長曲線。
[0015]圖8糞產堿菌LCT-AFl在不同條件下對酯類聚氨酯腐蝕能力的SEM觀察分析。
[0016]圖9糞產堿菌LCT-AFl在醚類聚氨酯為唯一碳源培養條件下增長曲線。
[0017]圖10糞產堿菌LCT-AFl在不同條件下對醚類聚氨酯腐蝕能力的SEM觀察分析。
[0018]圖11糞產堿菌LCT-AFl在硫化天然橡膠為唯一碳源培養條件下增長曲線。
[0019]圖12糞產堿菌LCT-AFl在不同條件下對硫化天然橡膠腐蝕能力的SEM觀察分析。
[0020]圖13糞產堿菌LCT-AFl在聚乙烯醇縮甲醛為唯一碳源培養條件下增長曲線。
[0021]圖14糞產堿菌LCT-AFl在不同條件下對聚乙烯醇縮甲醛腐蝕能力的SEM觀察分析。
[0022]圖15糞產堿菌LCT-AFl的COG功能分析圖。
【具體實施方式】
[0023]下述實施實例中所用的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。
[0024]下述實施實例中所用的材料、試劑，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。
[0025]一、糞產堿菌LCT-AFl的表型
1.菌株來源:對“神舟十號”飛船返回艙內部進行了微生物的采集，選用細菌培養基對樣品進行初篩，然后挑取菌落形態不同的單菌落進行劃線培養，純化到單一菌株后，使用生理鹽水加80%甘油保藏菌種。菌株命名為LCT-AFl，保存于中國普通微生物菌種保藏中心，保藏號為 CGMCC N0.12577ο
[0026]2.LCT-AFl菌株 16S rDNA鑒定:16S rDNA是 16S rRNA序列的基因，長約1.5kb。將已分純的單菌直接經菌液PCR擴增16S rDNA，部分通過菌液PCR較難擴增的單菌經擴大培養后提取基因組后擴增，擴增所用引物序列如下:
SgF: AGAGTTTGATCATGGCTCAGSgR: TAGGGTTACCTTGTTACGACTT
16S rDNA PCR產物用96孔mi I Ipore純化系統純化后準確定量，經ABI 3730x1全自動序列分析儀測序，測序結果使用Sequence scanner、Seqman等序列分析軟件，將兩向測序結果去掉首尾不可信序列后拼接，余下的約1350bp(雙向測序)即用于同源性分析。所得16SrDNA序列在Eztaxon server 2.1數據庫中進行比對，確定菌株大致的分類地位。所有單菌16S序列全部導入seqman，輸出single file(fasta)后，經Mega 5.0軟件cIusterW多重比對，輸出meg文件重新導入構建Neighbor-Joining tree。其中，phylogeny test method為bootstrap參數設置為1000。16s rDNA鑒定結果顯示LCT-AF1與奠產堿菌Alcaligenesaquatilis LMG 229969 (T)的相似性為99.80%(圖2)。
[0027]3.形態學表型與生物被膜實驗:糞產堿菌LCT-AFl樣品進行稀釋涂布，進行革蘭氏染色。LCT-AFl為革蘭氏陰性，非發酵性的短桿菌。將糞產堿菌LCT-AFl單菌落接種至平板上觀察菌落的生長形態，并用掃描電鏡觀察其顯微形態，菌體單個、呈短桿狀或球狀排列(圖1)。糞產堿菌LCT-AFl在軟瓊脂上有明顯的成片生長現象(菌苔)(圖3)。試管法是一種簡單快捷所需試劑和儀器等實驗條件較低的一種生物被膜鑒定方法，被廣泛運用于生物被膜的初步定性檢測。對具有腐蝕突變的糞產堿菌LCT-AFl進行生物被膜相關研究發現:LCT-AFl在太空密封艙或模擬微重力條件下生物膜形成機率增加(圖4)。
[0028]4.腐蝕性實驗:選擇航天器已采用的5種高分子材料環氧樹脂、酯類聚氨酯、醚類聚氨酯、硫化天然橡膠和聚乙烯醇聚縮醛為糞產堿菌LCT-AFl腐蝕特性研究對象。
[0029]分別以這5種高分子材料為唯一碳源對菌株LCT-AFl進行培養，在不同時間點進行取樣并測定培養液在600 nm波長下的吸光度(0D600)，以判斷細菌利用單一高分子材料作為唯一碳源的生長情況。具體操作如下:向100 mL無菌三角燒瓶中倒入40 mL無機鹽基礎培養基，每個培養瓶中加入10個高分子材料試樣，接種5 mL菌懸液，透氣膜封口，放入32°C，相對濕度為75%的恒溫培養箱中。每株菌和每個材料準備3個平行樣品。設置4個時間點:1、3、
6、10周取樣。測定各個時間點培養液600 nm波長下的吸光度，判斷細菌利用高分子材料作為唯一碳源的生長情況。結果(圖5、7、9、11、13)表明在I至10周內，LCT-AFl空間飛行組與對面Ig重力對照組菌株的0D600均大于實驗對照菌株，具有明顯的增長現象。
[0030]高分子材料表面微生物膜和腐蝕形態SEM觀察:將環氧樹脂膜加工成尺寸為1mm(直徑)X0.5_(厚度)圓片;醚類聚氨酯、酯類聚氨酯泡沫和聚乙烯醇縮甲醛泡沫分別加工成10 mm(長)X 10 mm(寬)X 5mm(厚度)的小方塊;硫化天然橡膠膜加工成尺寸為6mm(直徑)X0.5mm(厚度)圓片;所有樣品用丙酮浸泡I天，5%乙醇/水溶液中15min滅菌，無菌水清洗至中性。將不同條件(空間飛行組與地面Ig重力對照組)下培養的菌株LCT-AFl分別接種至5種高分子材料膜表面，在不同時間點對高分子材料膜表面用掃描電子顯微鏡(SEM)進行觀察比較，如圖6、8、10、12、14所示，I至10周內LCT-AFl空間飛行組與地面Ig重力對照組菌株能在5種高分子材料膜表面形成微生物膜，說明LCT-AFl空間飛行組與地面Ig重力對照組菌株均具有降解和腐蝕5種高分子材料的潛力，但對環氧樹脂與醚類聚氨酯的腐蝕能力，LCT-AFl空間飛行組的腐蝕能力較地面Ig重力對照組菌株增強；對硫化天然橡膠與聚乙烯醇縮甲醛的腐蝕能力，兩者沒有明顯區別；對酯類聚氨酯的腐蝕能力，LCT-AFl空間飛行組的腐蝕能力較地面Ig重力對照組菌株減弱。
[0031 ] 二、糞產堿菌LCT-AFl全基因組測序和重測序
采用高通量Solexa測序技術對該樣品的DNA進行Paired-End測序。首先提取細菌的基因組DNA，離心方法收集糞產堿菌LCT-AFl菌體，經過重懸、裂解、酚氯仿抽提、異丙醇沉淀、75%乙醇洗滌、RNase去除RNA和溶解基因組DNA等步驟獲得LCT-AFl的基因組DNA，并檢測其純度使之符合建庫指標。采用超聲法Covaris將大片段基因組DNA隨機打斷并產生一系列DNA片段；然后用T4 DNA Polymerase、Klenow DNA Polymerase和T4 PNK將打斷形成的粘性末端修復成平末端，再通過3’端加堿基“Α”，使得DNA片段能與3’端帶有“Τ”堿基的特殊接頭連接，用電泳法選擇需回收的目的片段連接產物，再使用PCR技術擴增兩端帶有接頭的DNA片段；建立300bp的小片段文庫。對測序得到的原始數據進行過濾及統計；運用SOAPdenovo V1.05軟件和SOAPal i gner/soap2軟件對處理后的reads數據進行組裝。并對基因組和基因區覆蓋度進行評價;采用Glimmerf.0軟件從組裝結果中獲得基因序列并將基因的序列與各數據庫進行比對，得到對應的功能注釋信息。糞產堿菌LCT-AFl，其全基因組序列總長度為3.91 Mbp，GC含量56 %，包括3551個編碼序列和65個RNA基因，COG數據庫比對共注釋到22組COG功能分類(圖15)。其地面Ig重力對照組菌株經重測序大小為3.895 Mbp，GC含量56.01 %，模擬微重力組菌株經重測序為3.895 Mbp，GC含量56.01 %，而空間飛行組菌株經重測序為3.892 Mbp，GC含量56.01 %。
[0032]本發明的特點和應用價值:本研究是我國第一次利用自己研發的空間技術獲得對常用航天高分子材料具有腐蝕性的太空艙定植糞產堿菌LCT-AFl，為研究載人航天器微生物腐蝕提供了寶貴的樣本。同時，我們對這一分離菌進行了全基因組測序，其序列已經測通，從而為更好地揭示其腐蝕機制打下了堅實的基礎。本研究有助于長期太空密閉艙中微生物對航天器材腐蝕的機理及防控措施研究，有助于深化對載人航天器中微生物風險的認識和加強相關技術儲備，有助于探索更加有效的載人航天器微生物綜合控制措施，從而為載人航天器的研制和運營提供技術支撐。
[0033]關于保藏的LCT-AFl菌株說明
A.菌種的保藏單位名稱和地址
名稱:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所
B.交機構保藏的日期 2016年6月I日
C.保藏機構給予的保藏號 CGMCC N0.12577
D.分類命名
奚產喊菌 Alcaligenes faecalis。
【主權項】
1.一種“神舟十號”飛船返回艙中分離得到空間奠產堿菌Alcaligenes faecal is LCT-AFl，其保藏號為:CGMCC N0.12577。2.根據權利要求1所述的糞產堿菌LCT-AFl，其特征在于:革蘭氏陰性，為非發酵性的短桿菌，16S rRNA鑒定為糞產堿菌。3.根據權利要求1所述的糞產堿菌LCT-AFl，其特征在于:其全基因組序列總長度為3.91 Mbp，GC含量56 %，包括3551個編碼序列和65個RNA基因，COG數據庫比對共注釋到22組COG功能分類，其地面Ig重力對照組菌株經重測序大小為3.895 1?^，6(:含量56.01 %，模擬微重力組菌株經重測序為3.895 1?^，6(:含量56.01 %，而空間飛行組菌株經重測序為3.892Mbp，GC 含量 56.01 %。4.根據權利要求1所述的糞產堿菌LCT-AFl，其特征在于:5種高分子材料腐蝕實驗分析發現:LCT-AFl空間飛行組與地面Ig重力對照組菌株對環氧樹脂、酯類聚氨酯、醚類聚氨酯、硫化天然橡膠與聚乙烯醇聚縮醛5種高分子材料均具有腐蝕能力;但空間飛行組菌株對環氧樹脂與醚類聚氨酯的腐蝕能力較地面Ig重力對照組菌株增強。
【文檔編號】C12N1/20GK106047758SQ201610527736
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月7日
【發明人】劉長庭, 張學林, 黃兵, 周宏 , 王俊峰, 郭英華, 姜學革, 劉巖, 徐綢, 余昳, 李佳
【申請人】中國人民解放軍總醫院